CH660742A5

CH660742A5 - Plasminogen-aktivator, verfahren zu seiner herstellung und diesen enthaltendes thrombolytisches agens.

Info

Publication number: CH660742A5
Application number: CH3063/84A
Authority: CH
Inventors: Seishi Takahashi; Kazushi Morimoto; Yoshikazu Fujisawa; Fumiaki Ikeda
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date: 1982-10-29
Filing date: 1983-10-27
Publication date: 1987-06-15
Also published as: GB8414992D0; GB2138824A; DK307384D0; CA1221029A; EP0124613B1; IT1169910B; SE8403375D0; SE8403375L; DK169686B1; DE3390272C2; NL191755C; NO842468L; FI842627A; EP0124613A1; FI80597B; NL8320346A; IT8323533A0; FI842627A0; NO166314C; NO166314B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen neuen Plasminogen-20 Aktivator, der aus menschlichem Gewebe, beispielsweise aus einer menschlichen Niere oder einem Blutgefäss gewonnen wird, auf sein Herstellungsverfahren und auf ein dieses als aktiven Bestandteil enthaltendes thrombolytisches Agens. Plasminogen-Aktivatoren können je nach ihrer Herkunft 25 in Gewebe-, Gefass-, Blut-, Urokinase- und ähnliche Aktivatoren eingeteilt werden. Plasminogen-Aktivatoren spielen in fibrinolytischen (Fibrin zersetzenden) Aktivitäten eine grosse Rolle und man findet sie in einer Vielfalt von Organen von Säugetieren. Andererseits wurde kürzlich viel Arbeit gelei-30 stet, um Plasminogen-Aktivatoren aus kultivierten Zellen zu gewinnen. In der genannten Arbeit wurden als kultivierte Zellen beispielsweise Zellen von bösartigen Tumoren, Blut-gefäss-Endothelium, stimulierte Makrophagen, granulare durch follikelstimulierende Hormone stimulierte Stärke-Zel-35 len und ähnliche Zellen verwendet. Berichtet wurde auch über biochemische und immunologische Eigenschaften von Plasminogen-Aktivatoren, die von Homogenaten von humoralen Geweben, kultivierten Zellen und Kulturmedien gewonnen werden.

40 Die Reinigung von aus menschlichem Gewebe gewonnenen Plasminogen-Aktivator wurde jedoch selten durchgeführt. Dies scheint der Schwierigkeit zugeschrieben zu werden, das Ausgangsmaterial in genügender Menge zu erhalten, und zudem auf die hydrophobe Eigenschaft der im Aus-45 gangsmaterial enthaltenen Enzyme, auf die Instabilität solcher Enzyme in einem Puffer und in einigen Fällen auf die Existenz einer unbekannten Protease im Laufe seiner Reinigung. Unter diesen Umständen haben Rijken et al vom menschlichen Uterus einen Plasminogen-Aktivator gewon-50 nen, der ein Molekulargewicht von 69 000 aufweist, und sie haben bestätigt, dass der Aktivator dem menschlichen vaskulären Plasminogen-Aktivator sowohl immunologisch als auch biochemisch ähnlich ist. Zudem wurde ein anderer menschlicher vaskulärer Plasminogen-Aktivator auch ge-55 wonnen und identifiziert, der ein Molekulargewicht aufweist, das von demjenigen des vorgenannten, vom menschlichen Uterus gewonnenen Plasminogen-Aktivator verschieden ist.

Kwaan et al haben einen von menschlichem Nierengewebe gewonnenen Plasminogen-Aktivator erforscht und sie ha-6o ben festgestellt, dass der Aktivator hauptsächlich im Endo-thelium von Blutgefässen und insbesondere im Endothelium von Venen enthalten ist [Fed. Proc. 24, 387 (1965)]. Es wurde auch von Kucinski et al [J. Clin. Invest. 47,1238-1253 (1968)], von Bernik et al [J. Clin. Invest. 48, 1740-1753 es (1969)], von Barlow et al [Thromb. Res. 1,201-208 (1972)], von Asted et al [Experimentia 33,589-590 (1978)] und von Lewis (Thromb. Haemostas. 42, 895-890 (1979)] berichtet, dass ein solçher von der Kultur von menschlichen Nierenge

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webe erhaltener Plasminogen-Aktivator immunologisch und physiochemisch der Urokinase identisch ist.

Aus «Blood & Vessel» 13J3 (Sept. 1982) 347-350 ist eine Reinigung und Charakterisierung von humanem vaskulärem Plasminogen-Aktivator bekannt. Das durch Elektrophorese festgestellte scheinbare Molekulargewicht dieses bekannten Plasminogen-Aktivators beträgt jedoch nur 55 000, während das Molekulargewicht des beanspruchten Plasminogen-Aktivators 70 000 ± 5 000 beträgt.

Aus «Biochimica et Biophysica Acta» 717/2 (August 1982) 327-336 ist ein Verfahren zur Herstellung eines Plasminogen-Aktivators aus humaner Niere bekannt. Dieses Verfahren ist zwar dem beanspruchten Verfahren ähnlich, nach dieser bekannten Lehre wird jedoch eine L-Argininme-thylester-Sepharose-Kolonne anstelle der Zinkchelat-Sepha-rose-Kolonne gemäss Verfahrensschritt (c) des beanspruchten Verfahrens verwendet. Zudem beträgt das Molekulargewicht des so bekannten Plasminogen-Aktivators nur 54 000.

Aus «Biochimica et Biophysica Acta» 621 (1980)

241-254 ist eine Reinigung und Charakterisierung von humanem vaskulärem Plasminogen-Aktivator aus der vaskulären Verzweigung der Beine von humanen Leichen bekannt. Dieses Dokument offenbart jedoch nicht den beanspruchten Plasminogen-Aktivator.

Aus «Biochimica et Biophysica Acta» 580 (1979)

140-153 ist ein Plasminogen-Aktivator mit einem Molekulargewicht von 69 000 bekannt, das aus humanem Uterus-Gewebe gewonnen wurde. In diesem Dokument sind jedoch die Quelle und das Herstellungsverfahren anders als bei der vorliegenden Erfindung.

Aus «The Journal of Biologivcal Chemistry» 256/13 (10. Juli 1981) 7035-7041 ist ein Plasminogen-Aktivator mit einem Molekulargewicht von etwa 72 000 bekannt, das jedoch aus humanem Melanomzellen gewonnen wurde, während der erfindungsgemässe Plasminogen-Aktivator aus normalen Zellen von humanen Nieren oder aus vaskulären Gefässen gewonnen wird.

Aus «The Journal of Biologivcal Chemistry» 255/8 (25. April 1980) 3665-3672 ist die immunologische Dosierung und Immunoadsorption von durch humane Zellen sekretier-ten Urokinase-ähnlichen Plasminogen-Aktivatoren bekannt. Dieses Dokument offenbart jedoch nichts über den beanspruchten Plasminogen-Aktivator.

Aus «The Journal of Biological Chemistry» 254/6 (25. März 1979) 1998-2003 ist ein humaner vaskulärer Plasmino-gen-Aktivator aus Leichenbeinen-Perfusat mit einem Molekulargewicht von 70 000-75 000 und einem isoelektrischen Punkt von 7,8-8,8 bekannt, dessen Herstellungsverfahren jedoch anders ist als das Herstellungsverfahren, mit welchem der erfindungsgemässe Plasminogen-Aktivator gewonnen wird.

Urokinase, welche ein von Urin oder von kultivierten Nierenzellen gewonnener Plasminogen-Aktivator ist, und Streptokinase, welche ein von Streptococci gewonnener Plas-minogen-Aktivator ist, werden gegenwärtig als thrombolytisches Agens zur Behandlung von Thrombose verwendet. Sowohl Urokinase als auch Streptokinase sind jedoch vom normalen aus Blut gewonnenen Plasminogen-Aktivator verschieden. Diese Plasminogen-Aktivatoren haben keine spezifische Affinität zum Fibrin. Daher waren die bei der Verwendung von Urokinase und Streptokinase zur Behandlung von Thrombose erreichten Resultate nicht in jeder Beziehung ganz zufriedenstellend. Um die gewünschten Resultate zu erzielen ist es nötig, Urokinase oder Streptokinase in verhältnismässig grossen Mengen zu verabreichen. Massive Verabreichung verursacht jedoch gefährliche Nebeneffekte wie das Auflösen von Fibrinogen und interne Blutungen. Daher besteht ein grosser ungedeckter Bedarf an der Entwicklung eines Arzneimittels, das in ziemlich grossem Umfang hergestellt werden kann und wenig Nebeneffekte sowie eine hohe thrombusauflösende Aktivität aufweist.

5 Als Resultat einer intensiven Forschung über den aus menschlichen Nieren und menschlichen Blutgefässen gewonnenen und gereinigten Gewebe-Plasminogen-Aktivator haben die Erfinder überraschenderweise einen Plasminogen-Aktivator gefunden, der Eigenschaften aufweist, die von de-10 nen der aus menschlichen Nieren oder menschlichen Blutgefässen gewonnenen Urokinase bedeutend verschieden sind, obwohl gemeint wurde, dass Urokinase der hauptsächlich aus menschlichen Nieren und menschlichen Blutgefässen gewinnbare Plasminogen-Aktivator ist. Im Laufe einer weite-15 ren Forschung über den Plasminogen-Aktivator von verschiedenen Standpunkten aus wurde auch gezeigt, dass der Plasminogen-Aktivator eine starke thrombusauflösende Wirkung aufweist, wodurch die vorliegende Erfindung fertig war.

20 Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen neuen Plasminogen-Aktivator, ein neues Verfahren zur Gewinnung des neuen Plasminogen-Aktivators und ein neues thrombolytisches Agens mit starker thrombolytischer Wirkung zu schaffen.

25 Der Plasminogen-Aktivator, der ein Bestandteil des er-findungsgemässen thrombolytischen Agens ist, weist folgende kennzeichnende Eigenschaften auf:

(1) das durch Elektrophorese auf einem Natriumdodecyl-sulfat- Polyacrylamid- Gel erhaltene Hauptband des Proteins weist ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 70 000 ± 5 000 auf;

(2) das durch Elektrophorese am isoelektrischen Punkt erhaltene Hauptband weist ein pl im Bereich von 7 bis 9 auf;

(3) der Plasminogen- Aktivator weist die immunologische Eigenschaft auf, durch Anti- urokinase-IgG- Sepharose-Affinität- Chromatographie nicht desorbiert zu werden; und

(4) der Plasminogen- Aktivator hydrolysiert H-D-valyl-L-leucyl-L- lysin-p- nitroanilid- dihydrochlorid und H-D-

40 isoleucyl-L- prolyl-L- arginin-p- nitroanilid- dihydrochlorid, aber er hydrolysiert nicht Boc-L- valyl-L- prolyl-L- arginin-4- methylcumaryl- 7-amid, Carbobenzoxy-L- phenylala-nyl-L- arginin-4- methylcumaryl-7- amid, L-prolyl-L- phe-nylalanyl-L- arginin-4- methylcumaryl-7- amid und Glut-45 aryl- glycyl-L- arginin-4- methylcumaryl-7- amid.

Der genannte Plasminogen-Aktivator weist vorzugsweise folgende verschiedene Eigenschaften auf:

(1) er kann aus einem Gewebe oder Blutgefäss durch eine 1- bis 2-molige Lösung von NH4SCN (pH 7,4) extrahiert

50 oder perfundiert und in Gegenwart von 0,1 %igem Polyoxy-äthylen-(20)-sorbitan- monooleat (Tween 80) oder ähnlichem Stoff gereinigt werden;

(2) er wird praktisch vollständig in einer mit Fibrin-Se-pharose geladenen Säule adsorbiert und durch eine 2-molige

55 Lösung von NH4SCN eluiert;

(3) er ist bei Aufbewahrung bei 4 °C in einem Puffer von pH 7,4 auch während zwei Wochen stabil.

Der neue erfindungsgemässe Plasminogen-Aktivator wird gewonnen durch Extraktion aus einer menschlichen 6o Niere oder aus einem menschlichen Blutgefäss mit einer Am-moniumthiocyanat-Lösung und danach Leiten des resultierenden Extraktes zum Reinigen desselben durch eine Säule, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einer mit einem lonenaustauchmaterial, einer mit einem Metallchelat, einer 65 mit L-arginin oder mit einer an einem Träger gebundenen L-arginin- Verbindung, einer mit einem an einem Träger gebundenen Hemagglutinin und einer mit einem Molekularsieb-Eigenschaften aufweisenden Träger geladenen Säule be30

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steht, oder durch eine Kombination von aus der genannten Gruppe ausgewählten Säulen.

Der neue erfindungsgemässe Plasminogen-Aktivator ist fähig, die immunologischen Nachteile von Urokinase, die bereits als Arzneimittel mit thrombusauflösender Wirkung entwickelt wurde, zu überragen und kann daher als aktiver Bestandteil eines thrombolytischen Agens mit starker throm-bolytischer Wirkung verwendet werden.

Fig. 1 zeigt ein Zinkchelat-Sepharose-Chromatogramm eines Plasminogen-Aktivators, der nach Beispiel l-(3) gewonnen wurde;

Fig. 2 zeigt ein Concanavalin-A-Sepharose-Chromato-gramm eines Plasminogen-Aktivators, der nach Beispiel l-(4) gewonnen wurde;

Fig. 3 zeigt ein CM-Sepharose-Chromatogramm eines Plasminogen-Aktivators, der nach Beispiel l-(5) gewonnen wurde;

Fig. 4 zeigt Resultate der Filtration eines Plasminogen-Aktivators, der nach Beispiel l-(5) gewonnen wurde, auf einem Sepharyl-S-200-Gel;

Fig. 5 zeigt eine Elektrophorese eines erfindungsgemäs-sen, aus Nieren gewonnenen Plasminogen-Aktivators auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel. Die Buchstaben A, B, C und D entsprechen jeweils dem aus Nieren gewonnenen und danach gereinigten Aktivator, einem aus Blutgefäss-Wandun-gen gewonnenen und danach gereinigten Aktivator, einem von kultivierten normalen menschlichen Diploidzellen sekre-tierten Aktivator und einer im Handel erhältlichen Urokina-se-Probe.

Fig. 6 zeigt Resultate der Identifikation von erfindungs-gemässen Aktivatoren, die im voraus durch Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel behandelt wurden. Die Buchstaben A und B entsprechen jeweils einem gereinigten nach Beispiel l-(6) gewonnenen Aktivator, während die Buchstaben C und D jeweils einem rohen nach Beispiel l-(3) gewonnenen Aktivator entsprechen. Zum Gewinnen der Plasminogen-Aktivatoren A und € wurde ein Polyacrylamid-Gel verwendet, während zum Gewinnen der Plasminogen-Aktivatoren B und D ein Polyacrylamid-Gel verwendet wurde;

Fig. 7 zeigt Affinitäts-Chromatogramme von Urokinase und von aus Nieren gewonnenem erfindungsgemässem Plas-minogen-Aktivator, beide unter Verwendung von mit Anti-urokinase-IgG-Sepharose geladenen Säulen gewonnen;

Fig. 8 zeigt Elutionskennlinien, die jeweils durch Elution eines Plasminogen-Aktivators als Bestandteil eines erfin-dungsgemässen thrombolytischen Agens nach dem im Beispiel 5 beschriebenen Verfahren gewonnen wurden;

Fig. 9 zeigt ein Diagramm, in welchem die thrombolyti-sche Wirkung eines erfindungsgemässen thrombolytischen Agens mit derjenigen von Urokinase verglichen wird. Die Kennlinie (a) entspricht dem erfindungsgemässen thrombolytischen Agens, die Kennlinie (b) entspricht Urokinase und die Kennlinie (c) entspricht Urokinase, welcher das erfindungsgemässe thrombolytische Agens nach 10 Stunden zugesetzt wurde; und

Fig. 10 zeigt in einem Diagramm die thrombolytischen Wirkungen eines erfindungsgemässen thrombolytische Agens gegen Thrombose beim Menschen und bei verschiedenen Tieren. Die Kennlinien (a), (b), (c), (d) und (e) entsprechen jeweils dem Menschen, dem Affen, dem Kaninchen, dem Hund und der Ratte.

Das erfindungsgemässe Verfahren und die Eigenschaften des neuen, nach dem Verfahren gewonnenen Aktivators werden im nachstehenden in ihren Einzelheiten beschrieben. Wenn nichts anderes angegeben wird, wurden alle Verfahrensschritte bei 4 °C ausgeführt.

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Beispiel 1

Reinigung des aus Nieren gewonnenen Plasminogen-Aktivators:

(1) Extraktion des Plasminogen-Aktivators:

5 Nach mechanischer Entfernung von Blutgerinnsel, Bindegewebe und Lipiden aus einer menschlichen Niere, die frei von infektiösen Symptomen war (und bei — 70 °C aufbewahrt wurde), wurde Aceton bei —15 °C zugesetzt und die Niere in einem Homogenisator zerrieben. Die Suspension 10 wurde bei — 15 °C während 30 Minuten gerührt und danach bei —20 °C ruhen gelassen. Der Überstand wurde durch Dekantieren entfernt und die Entfettung mit Aceton bei —15 °C wiederholt. Die resultierende Suspension wurde dann filtriert. Der Filterkuchen wurde mit Aceton bei 15 _20 °C gewaschen und dann getrocknet. Danach wurden 100 g des so entfetteten Pulvers in 1 Liter einer 1-moligen Lösung von NH4SCN, die mit einer 0,02-moligen Lösung von 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol (TRIS) und HCl auf pH 7,0-7,4 gepuffert wurde, suspendiert. Die resultierende Suspension wurde gerührt. Die Suspension wurde durch Zentrifugation in einen Extrakt und ein Präzipitat getrennt. Das Präzipitat wurde wieder mit derselben 1-Liter-Menge der 1-moligen Lösung von NH4SCN extrahiert. Die Extrakte wurden zu einem rohen Extrakt vereinigt.

(2) Chromatographie auf Diäthylaminoäthyl (DEAE)-Sepharose

Der nach dem vorangehenden Verfahren (1) erhaltene rohe Extrakt wurde mit derselben Menge einer 0,02-moligen 30 Lösung von 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol (TRIS) und HCl mit pH 7,0-7,4 verdünnt. Die so zubereitete Probe wurde durch eine mit Diäthylaminoäthyl(DEAE)-Se-pharose geladene Säule geleitet, die mit einer 0,02%igen Lösung eines nichtionischen oberflächenaktiven Agens, bei-3S spielsweise mit Polyoxyäthylen-(20)-sorbitan-monooleat (Tween 80) und einer 0,02-moligen Lösung von 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol (TRIS) und HCl, die eine 0,25-molige Lösung von NH4SCN enthielt, ausgeglichen wurde. Die Effluenten der Säulen wurde vereinigt und es 40 wurde NaCl zugesetzt, um eine 1,0-molige Endkonzentration zu erreichen, deren pH mit HCl IN auf 7,4 justiert wurde.

(3) Chromatographie auf Zinkchelat-Sepharose

Die nach dem vorangehenden Verfahren (2) erhaltenen 4S Effluente wurden durch eine mit Zinkchelat-Sepharose geladene Säule geleitet, die mit einer 0,002-moligen Lösung von 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol (TRIS) und HCl, die ein pH von 7,0 aufwies und 1,0 Mol NaCl, 0,25 Mol NH4SCN und 0,02 Mol Polyoxyäthylen-(20)-sorbitan-mo-50 nooleat (Tween 80) enthielt, ausgeglichen wurde. Danach wurde die Säule mit der genannten Ausgleichlösung gewaschen, bis die Konzentration der Proteine im Eluat auf 0,01 mg/ml sank. Anschliessend wurde die Säule mit einem Puffer, dessen Zusammensetzung mit der Ausnahme, dass 55 der Puffer kein NH4SCN, sondern 0,15 Mol NaCl enthielt, gleich derjenigen der genannten Ausgleichlösung war, weiter gewaschen. Dann wurde die Säule mit einer 0,05-moligen Imidazol-Lösung gewaschen, wodurch der Gewebe-Aktivator in die Waschlösung eluiert wurde. Das Profil der resultie-60 renden Chromatogramme ist in Fig. 1 dargestellt.

(4) Chromatographie auf Concanavalin-A-Sepharose

Fraktionen des Gewebe-Aktivators, die nach dem vorangehenden Verfahren (3) gewonnen wurden, wurden durch eine mit Concanavalin-A-Sepharose geladene Säule geleitet.

65 Diese Säule wurde im voraus mit einer 0,02-moligen Lösung von 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol (TRIS) und HCl, die ein pH von 7,4 aufwies und 1,15 Mol NaCl sowie 0,02 Mol Polyoxyäthylen-(20)-sorbitan-monooleat (Tween

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80) enthielt, ausgeglichen. Nach wiederholtem Waschen der Säule mit der Ausgleichlösung, bis die Konzentration der Proteine im Eluat die Basislinie erreichte, wurde der Gewe-be-Aktivator mit einer Ausgleichlösung eluiert, die 0,5 Mol a-D-methylmannosid enthielt. Die den Aktivator enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und das pH der resultierenden Lösung wurde mit Essigsäure auf 4,5 justiert. Das Profil des resultierenden Chromatogramms ist in Fig. 2 dargestellt. Rijken et al haben berichtet, dass ein Eluent a-D-methylmannosid mit linearem Gradient (0-0,6 Mol) zum Gewinnen eines Plasminogen-Aktivators aus Gewebe des menschlichen Uterus wirksam ist [Biochim. Biophys. Acta 580, 140-153 (1979)]. Wenn als Eluent a-D-methylmannosid mit linearem Gradient verwendet wurde, war das Elutionsprofil der Wirkung des Aktivators in Übereinstimmung mit demjenigen des Proteins. Fast alle Elutionspunkte des Plasminogen-Aktivators waren nahe den Elutionspunkten der 0,35-moligen Lösung von a-D-methylmannosid und daher etwas höher als diejenigen, von denen Rijken et al berichtet haben.

(5) Chromatographie auf CM-Sepharose

Fraktionen des Gewebe-Aktivators, die nach dem vorangehenden Verfahren (4) gewonnen wurden, wurden durch eine mit CM-Sepharose geladene Säule geleitet. Diese Säule wurde im voraus mit einer 0,02-moligen Pufferlösung von Essigsäure, die ein pH von 4,5 aufwies und 0,15 Mol NaCl sowie 0,02 Mol Polyoxyäthylen-(20)-sorbitan-monooleat (Tween 80) enthielt, ausgeglichen.

Zunächst wurde die Säule mit der Ausgleichlösung gewaschen, dann wurde die Säule mit der gleichen Ausgleichlösung entwickelt, mit der Ausnahme, dass die NaCl-Konzen-tration linear von 0,15 Mol bis 1,0 Mol angehoben wurde. Der Gewebe-Aktivator wurde in Nähe einer 0,45-moligen NaCl-Konzentration eluiert. Das Elutionsprofil ist in Fig. 3 dargestellt. Der Gewebe-Aktivator wurde auf der CM-Sepharose in der Ausgleichlösung adsorbiert und etwa 50-60% der geladenen Proteine wurden durch die Säule geleitet. Der Gewebe-Aktivator wurde in Nähe einer 0,45-moligen NaCl-Konzentration eluiert. Dies entspricht einer Elution von etwa 40% der verwendeten Proteine. Die spezifische Wirkung wurde etwa um den Faktor 2,4 erhöht. Die den Aktivator enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und einer Ultrafiltration durch eine Diaflo-Membrane PM 10 (ein Produkt der Amicon Corporation) unterzogen, um sie zu konzentrieren. Der Austausch der Aktivatorprobe mit einem Puffer wurde in einer Sephadex G-25 Säule (ein Produkt der Pharmacia AB) durchgeführt. Die Säule wurde im voraus mit einer 0,02-moligen Lösung von 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol (TRIS) und HCl, die ein pH von 7,4 aufwies und 1,0 Mol NH4SCN enthielt, ausgeglichen. Die Säule wurde dann mit einem der Ausgleichlösung identischen Puffer entwickelt. Die Fraktionen, welche die so eluierten Proteine enthielten, wurden vereinigt und dann einer Ultrafiltration durch eine Diaflo-Membrane PM 10 unterzogen, um sie zu konzentrieren.

(6) Filtration auf Sepharyl-S-200-Gel 5 Eine konzentrierte Probe des Gewebe-Aktivators wurde durch eine mit Sepharyl-S-200-Gel (ein Produkt der Pharmacia AB) geladene Säule geleitet, die im voraus mit einer 0,02-moligen Lösung von 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol (TRIS) und HCl, die ein pH von 7,4 aufwies und 1,0 Mol NH4SCN enthielt, ausgeglichen wurde.

Effluente, die Fraktionen des Gewebe-Aktivators waren, wurden bei —70 °C gelagert. Das Elutionsprofil ist in Fig. 4 15 dargestellt.

Beispiel 2

Reinigung von aus Blutgefäss gewonnenem Plasminogen-Aktivator:

20 Nach dem Waschen eines Blutgefässes des Beins mit einer gepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,4) wurde der Plasminogen-Aktivator aus der Gefasswandung mit einer 1-moligen Lösung von NH4SCN extrahiert. Nach dem Salzen des Extrakts mit einer 50%igen Ammoniumsulfatlö-25 sung wurde die resultierende Lösung auf Arginin-Sepharose chromatographiert. Der Plasminogen-Aktivator zeigte eine starke Affinität zur Arginin-Sepharose und wurde mit einer 0,5-moligen Arginin-Lösung eluiert. Seine spezifische Aktivität wurde dadurch um etwa einen Faktor 6 erhöht. 3o Unter Verwendung der hydrophoben Eigenschaften des Plasminogen-Aktivators wurde das Eluat auf Phenyl-Sepha-rose chromatographiert. Der so adsorbierte Plasminogen-Aktivator wurde mit einer 50%igen Lösung von Äthylengly-col oder mit einer 1 %igen Lösung eines nichtionischen ober-35 flächenaktiven Agens, nämlich Triton X-100, eluiert. Die spezifische Aktivität des Plasminogen-Aktivators wurde dadurch um etwa einen Faktor 8 erhöht.

Die meisten Proteine wurden in frühen Effluenten durch die Chromatographie auf Sepharyl-S-200-Gel eluiert. Der 40 Plasminogen-Aktivator wurde in Fraktionen eluiert, die einem Molekulargewicht von etwa 70 000 entsprachen. In diesem Stadium war die spezifische Aktivität um etwa einen Faktor 2,2 erhöht worden.

Schliesslich wurde der Plasminogen-Aktivator auf Fi-45 brin-Sepharose chromatographiert. Der von menschlichen Blutgefässen gewonnene Plasminogen-Aktivator hatte eine starke Affinität zur Fibrin-Sepharose und seine spezifische Aktivität wurde um etwa einen Faktor 1,3 erhöht.

Die spezifische Aktivität, der Reinigungsgrad und die so prozentuale Wiedergewinnungsrate sind in der Tabelle I für jede der verschiedenen im vorangehenden beschriebenen Stadien dargestellt.

Tabelle 1

Reinigung von Gewebe-Plasminogen-Aktivator aus Blutgefässen Reinigungsstadium

1. Perfusion

2. Aussalzen mit Ammoniumsulfat

3. Arginin-Sepharose

4. Phenyl-Sepha-rose

5. Sephacryl-S-200

6. Fibrin-Sepha-

Gesamte Aktivität (iE) 73,900 75,400

Spezifische Aktivität (iE)

5,4 400

Reinigungsgrad

1

74

Wiedergewinnungsrate (%) 100 102

72,400

2,300

426

96

48,800

19,300

3,574

66

31,000 28,000

42,000 57,400

7,796 10,630

42 38

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Die spezifische Aktivität des am Ende erhaltenen Plasminogen-Aktivators betrug etwa 45 000-80 000 IE (Internationale Einheiten) /mg Protein und dessen Wiedergewinnungsrate liegt im Bereich von etwa 20 bis 40%.

Das scheinbare Molekulargewicht des gereinigten, aus Blutgefässen gewonnenen Plasminogen-Aktivators betrug etwa 70 000, gemessen durch Elektrophorese auf SDS-Poly-acrylamid-Gel. Sein Protein-Band war positiv gegenüber dem Färben mit p-Aminosalicylsäure (PAS) und der Plasmi-nogen-Aktivator wird grundsätzlich als ein aus einem einzigen Strang bestehenden Glycoprotein betrachtet. Das Gel wurde nach der Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamid-Gel in Scheiben zerschnitten, um die Verteilung der Aktivität des Plasminogen-Aktivators zu erforschen. Als Resultat wurde gefunden, dass die Aktivität des Plasminogen-Aktivators vollständig mit derjenigen des Protein-Bandes in Übereinstimmung war.

Der isolelektrische Punkt (pl) des Hauptbandes des erfindungsgemässen vaskulären Plasminogen-Aktivators betrug 7,8.

Unter Verwendung von Anti-Urokinase-IgG wurde die Antigen-Wirkung des erfindungsgemässen Plasminogen-Ak-tivators mit derjenigen von Urokinase verglichen. Die Aktivität des vaskulären Plasminogen-Aktivators wurde überhaupt nicht durch Anti-Urokinase-IgG inhibiert und zeigte keinerlei Affinität zu Anti-Urokinase-IgG-Sepharose.

Ein antivaskularer Plasminogen-Aktivator, der durch Verwendung des gereinigten vaskulären Plasminogen-Aktivators als Antigen erhalten wurde, inhibierte die Aktivität des vaskulären Plasminogen-Aktivators, inhibierte jedoch nicht die Aktivität von Urokinase. Durch Verwendung des antivaskularen Plasminogen-Aktivators und von Anti-Uro-kinase-Serum wurden die Antigen-Wirkungen der beiden Aktivatoren nach dem Verfahren der Doppel-Immunodiffu-sion erforscht. Als Resultat entwickelten sowohl Urokinase als auch vaskulärer Plasminogen-Aktivator jeweils eine einzelne Fällungskennlinie untereinander und ihren entsprechenden Anti-Urokinase- und Antivaskular-Plasminogen-Aktivator-Serum. Es wurde jedoch keine Vernetzung zwischen den Fällungskennlinien beobachtet.

Aus den vorangehend beschriebenen Resultaten ergibt sich, dass der erfindungsgemässe Plasminogen-Aktivator immunologisch von Urokinase verschieden ist.

Als der antivaskulare Plasminogen-Aktivator-IgG bei einer Fibrinolyse-Autographie nach Todd einer Fibrinmembran zugesetzt wurde, wurde die in vegetativen Blutgefässen der inneren und äusseren Membranen einer Vene beobachtete Aktivität des Plasminogen-Aktivators aufgehoben. Die Aufhebung der Aktivität des vaskulären Plasminogen-Aktivators wurde unter Verwendung einer Vielfalt von Inhibitoren erforscht. Als Resultat wurden mit Diisopropylfluoro-phosphat (5 mM) und mit L-arginin (0,1 M) Aktivitäts-Inhibitionen von jeweils 98% und 20% beobachtet. Mit Aproti-nin (=Trasylol; 50 KIE/ml; KIE = Kallikrein Inaktivator Einheit), Jodoacetamid (10 mM) und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (50 microgramm/ml) wurde keine Änderung beobachtet. Dies zeigt, dass der erfindungsgemässe vaskuläre Plasminogen-Aktivator wie Urokinase zu den Serum-Pro-teasen gehört.

Beispiel 3

Analyse von Gewebe-Plasminogen-Aktivator und Resultate:

(1) Sofern nichts anderes angegeben wird, wurde jeder Plasminogen-Aktivator nach dem in «Immunochemistry» 9, 709-723 (1972) beschriebenen Fibrin-Agar-Verfahren analysiert. Die fibrinolytische Aktivität des Gewebe-Aktivators wurde mit derjenigen von Urokinase verglichen und in Internationalen Einheiten (IE) ausgedrückt. Die Standardkennlinien, welche die Aktivität der Reihe von Dilutionen des erfindungsgemässen Plasminogen-Aktivators und von Urokinase darstellen, waren im Bereich einer lytischen Fläche von 70-240 mm2 gerade. Der Gradient der Standardkennlinie des Gewebe-Aktivators war jedoch nicht ganz in Übereinstimmung mit demjenigen von Urokinase. Die Aktivität des Gewebe-Aktivators wurde durch Messen der lytischen Flächen von verdünnten Proben im Bereich von 120-200 mm2 bestimmt. Die lytische Fläche von 10 microliter oder 1 IE/ml Urokinase betrug 156 mm2. Die Wiederholbarkeit des Fi-brin-Agar-Plattenverfahrens betrug ±6%. Die enzymatische Aktivität des Gewebe-Aktivators wurde in bezug auf die enzymatische Aktivität von Urokinase normiert und es wurden die prozentuale Wiedergewinnungsrate des Gewebe-Aktivators und seine spezifische Aktivität pro IE/ml nach jedem von mehreren Reinigungsstadien gemessen. 20 Die unspezifische fibrinauflösende Aktivität wurde auf einer Fibrin-Agar-Platte, die von Plasminogen frei war, gemessen.

In einigen Fällen wurde die Messung nach dem Verfahren durchgeführt, das in einer Cellulosenitrat-Scheibe («Se-25 lectgun» Typ BA; Porendurchmesser 0,2 micrometer) gefangenes ,25I-Fibrin-Monomer verwendet [Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, 539-546 (1978), Raven Press, New York]. Fibrinogen, das kein menschliches Plasminogen enthielt, wurde nach dem von Hawker et al 30 vorgeschlagenen Verfahren [J. Clin. Pathol. 29, 495-501 (1976)] bestrahlt. Die spezifische Aktivität des markierten Substrats betrug 0,018 mCi/mg Fibrinogen. Ein Probengemisch wurde bei 37 °C gebrütet und eine Portion von 50 microliter wurde als Probe nach der ersten und nach der siebten 35 Stunde entnommen. Das abgegebene I25I wurde mit einem automatischen Gammazähler gemessen. Die Aktivität jeder der Dilutionen von Gewebe-Aktivator und von Urokinase wurde durch Abziehen des abgegebenen 125I in Prozenten des auf die gesamte Radioaktivität bezogenen, abgegebenen 125I 40 ausgedrückt.

(2) Affinität-Chromatographie in einer mit Anti-Urokinase-IgG-Sepharose geladenen Säule:

Das Urokinase-Antiserum wurde von einer Ziege gewonnen, die durch eine subcutane Verabreichung von 1 mg 45 hochreiner menschlicher Urokinase (Molekulargewicht 33 000; spezifische Aktivität 202 400 IE/mg) immunisiert worden war. Die im vorangehenden verwendete Urokinase-Probe war die gleiche wie die zuvor durch Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamid-Gel analysierte.

so Das Anti-Urokinase-Serum wies nur eine Fällungskennlinie auf, wenn es gemäss der Doppel-Immunodiffusion-Analyse untersucht wurde. IgG-Fraktionen von Anti-Uroki-nase-Ziegenserum und von Serum einer nicht immunisierten Ziege wurden durch Fällen mit einer gesättigten 33%igen 55 Ammoniumsulfat-Lösung hergestellt. Sie wurden durch Chromatographie auf Diäthylaminoäthyl(DEAE)-Sepharose weiter gereinigt.

Das einer Fibrin-Platte zugesetzte Anti-Urokinase-IgG (50 microgramm/ml) inhibierte die Aktivität der Probe von 6o handelsüblicher Urokinase, die als Antigen (5 000 IE/ml) verwendet wurde, vollständig. Diese IgG-Proben (20 mg/ml) entwickelten jeweils eine einzelne Fällungskennlinie, wenn sie unter Verwendung von Anti-Ziegen- und Kaninchen-Se-, rum der Immunoelektrophorese ausgesetzt wurden. 65 50 mg der Anti-Urokinase oder der normalen IgG-Probe wurden gemäss dem von Cuatrecasas vorgeschlagenen Verfahren [J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970)] mit 15 ml von mit Cyanogenbromid aktivierter Sepharose CL-4B gekop

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pelt. Das Gel wurde mit einer 0,02-moligen Lösung von 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol (TRIS) und HCl, die ein pH von 7,4 aufwies und 1,0 Mol NaCl enthielt, gewaschen, wobei das Volumen der Lösung mindestens das Zwanzigfache des Volumens des Gels betrug. Chromato-gramme von Gewebe-Aktivator und von Urokinase sind in Fig. 7 dargestellt.

(3) Adsorption von Gewebe-Aktivator und von Urokinase auf Fibrin-Sepharose;

Entsprechend dem im vorangehenden erwähnten Verfahren nach Cuatrecasas wurden 200 mg Fibrinogen, das von menschlichem Plasminogen frei war, bei pH 8,3 mit 20 g von mit Cyanogenbromid aktivierter Sepharose CL-4B gekoppelt. Das so gekoppelte Fibrinogen wurde dann durch Zusetzen von Thrombin (1 IE/ml) gemäss dem von Reeme et al vorgeschlagenen Verfahren [Thromb. Res. 2, 137-143 (1973)] aktiviert. Danach wurde es mit einer 0,02-moligen Lösung von 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol (TRIS) und HCl gewaschen, die ein pH von 7,4 aufwies und 0,15 Mol NaCl, 0,1% Triton X-100 und 1 microMol Aproti-nin (ein Produkt der Beyer AG) enthielt. Das in der Säule geladene Gel wurde mit 2 Mol einer Lösung von NH4SCN in einem Puffer gewaschen, worauf eine beim Stadium (6) des Beispiels 1 erhaltene Probe von Urokinase oder von Ge-webe-Aktivator in einem Puffer der Säule zugesetzt wurde. Nach dem Waschen der Säule wurde diese mit einer 2-moli-gen Lösung von NH4SCN eluiert. Die Aktivität des Plasminogen-Aktivators wurde nach einem Verfahren gemessen, das die Konzentration an Protein im Eluat und ein chromo-genes Substrat H-D-isoleucyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroani-lid-dihydrochlorid (S-2288) verwendete.

(4) Andere Verfahren:

Die quantitative Analyse von Proteinen wurde nach dem von Lowry et al vorgeschlagenen Verfahren durchgeführt, das Albumin vom Rinderserum als Standardprotein verwendet [J. Biol. Chem. 193,265-275 (1951)]. In Polyoxyäthylen-(20)-sorbitanmonooleat (Tween 80) gelöste Proteine wurden quantitativ nach dem von Shiu et al vorgeschlagenen Verfahren analysiert [J. Biol. Chem. 249, 7902-7911 (1974)], nachdem das Sediment durch Zentrifugieren abgeschieden wurde. In einigen Fällen wurde ein präziseres Verfahren angewendet, das Fluorescamin benutzt [Arch. Biochem. Biophys. 155,213-220 (1973)]. Mit der Chromatographie auf Sepha-ryl S-200 erhaltene Eluate wurden untersucht, wobei ein Detektor- und Registriergerät LKB Uviicord II verwendet wurde und der Detektor mit einem Spektrophotometer Hitachi Modell 200-200 ausgerüstet war.

Die Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamid-Gel wurde nach dem von Weber et al vorgeschlagenen Verfahren durchgeführt [J. Biol. Chem. 244, 4406-4412 (1972)]. Jede Protein-Probe wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten in einer l,0%igen Lösung von SDS gebrütet und dann der Elektrophorese in einem 5%igen Polyacrylamid-Gel unterzogen. In einigen Fällen wurden die Proteine mit einer l%igen Lösung von 2-mercaptoäthanol reduziert. Das Gel färbte ein Protein mit Coomassie Brilliant Blue oder ein Gly-coprotein mit Perjodsäure-Schiff-Reagens. Zum Messen der Aktivität des Plasminogen-Aktivators wurde die Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamid-Gel in einem 5%igen Poly-acrylamid-Gel nach dem Gelscheiben-System durchgeführt. Nach dem Durchführen der Elektrophorese wurde die Gelscheibe bei Raumtemperatur während 2 Stunden mit einem 0,01-moligen Phosphorsäure-Puffer gewaschen, der ein pH von 7,4 aufwies und 0,5 Mol NaCl sowie 2% Polyoxyäthy-len-(20)-sorbitan-monooleat (Tween 80) enthielt. Das Gel wurde dann mit einem l%igen Agrose-Gel, das 0,2% menschliches Fibrinogen (entweder reich an oder frei von

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Plasminogen) und 0,5 IE Thrombin enthielt, gestapelt. Der Inhalt wurde während 1-7 Stunden bei 37 C in einer Kammer unter konstanter Feuchtigkeit gebrütet, und die Agaro-se- und Polyacrylamid-Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt. Das scheinbare Molekulargewicht des Proteins wurde entsprechend dem im vorangehenden erwähnten, von Weber et al vorgeschlagenen Verfahren durch Vergleichen seiner Mobilität mit der Mobilität des Standardproteins gemessen.

Die Messung des isoelektrischen Punktes des so gereinigten Gewebe-Aktivators wurde in einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel durchgeführt, das 8 Mol Harnstoff und 1 % eines Ampholyten enthielt, entsprechend dem von Metz et al vor-geschlagenen Verfahren [Biochem. Biophys. res. Commun. 49, 89-91 (1972)]. Die Probe wurde in einer 8-moligen Harnstoff-Lösung gelöst, die 2 mMol Äthylendiamin-tetraessig-säure (EDTA) und 1% eines Ampholyts enthielt. Ihr pH wurde nach dem von Finlayson et al vorgeschlagenen Verfahren bestimmt [Anal. Biochem. 40, 292-311 (1971)].

Der so gereinigte Gewebe-Aktivator wurde mit verschiedenen fluoreszierenden Substraten untersucht, nachdem 50 microliter der Gewebe-Aktivator-Probe einer 0,02-moligen Lösung von 2-amino-2- hydroxymethyl-1,3- propandiol 25 (TRIS) und HCl, die ein pH von 8,0 aufwies und 0,1 Mol NaCl sowie 0,02% Polyoxyäthylen-(20)- sorbitan- mono-oleat (Tween 80) und 2,0 ml des Substrats im gleichen Puffer enthielt, zugesetzt wurden. Als fluoreszierende Stoffe wurden folgende Substrate verwendet:

30 Boc-L-valyl-L- prolyl-L- arginin-4- methylcumaryl-7-amid;

Carbobenzoxy-L- phenylalanyl-L- arginin-4- methylcumaryl -7-amid;

L-prolyl-L- phenylalanyl-L- arginin-4- methylcumaryl-7-35 amid; und

Glutaryl- glycyl-L- arginin-4- methylcumaryl-7- amid.

Die anfängliche Abgabe von 7-amino-4- methylcumarin (AMC) wurde mit einem Fluorometer, nämlich bei 37 °C mit einem Fluorospektrophotometer Shimadsu Modell RF-520 40 gemessen. Das Fluorometer wurde so eingestellt, dass eine Lichtstrahlung bei 380 nm eine Emission von angeregtem Fluoreszenzlicht bei 460 nm bewirkte. Das Fluorometer wurde auch so eingestellt, dass eine 0,2-molige Lösung von 7-amino-4- methylcumarin (AMC) in einer 0,1 5-igen Lö-45 sung von Dimethylsulfoxyd (DMSO) eine relative Fluoreszenzeinheit von 1,0 ergab. Die hydrolytische Aktivität des gereinigten Gewebe-Aktivators wurde mit einem chromoge-nen Substrat gemessen, nachdem 200 microliter der Gewebe-Aktivator- Probe, 200 microliter einer 0,1-moligen Lösung so von 2-amino-2- hydroxymethyl-1,3- propandiol (TRIS) und HCl, die ein pH von 8,0 aufwies und 0,1 Mol NaCl sowie 0,02% Polyoxyäthylen-(20)- sorbitan- monooleat (Tween 80) enthielt, und 200 microliter einer 0,003-moligen Lösung von H-D-valyl-L- leucyl-L- lysin-p- nitroanilid- dihydrochlorid 55 (S-2251) oder einer 0,001-moligen Lösung von H-D-valyl- L-leucyl-L- lysin-p-nitroanilid- dihydrochlorid (S-2288) zugesetzt wurden. Die anfängliche Abgabe von p-nitroanilin wurde mit einem Spektrophotometer bei 405 nm und 37 C in einer Glaszelle gemessen. Die Anfangsgeschwindigkeit der 60 hydrolytischen Aktivität wurde in AmA/min für das chromo-gene Substrat und in A %/min für das fluoreszierende Substrat ausgedrückt. Die Inhibitionswirkungen des Gewebe-Aktivators wurden mit dem chromogenen Substrat H-D-isoleucyl-L- prolyl-L- arginin-p- nitroanilid- dihydrochlorid (S-2288) 65 untersucht, wobei der Gewebe-Aktivator jeweils mit Diiso-propyl-fluorophosphat, Jodoacetamid, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor und L-arginin-aprotinin behandelt wurde. Die gereinigten Aktivator-Proben wurden nach dem Zusetzen der

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Inhibitoren bei 37 °C während 1 Stunde gebrütet. Eine Portion von 200 microliter wurde jeder Mischung entnommen, worauf 200 microliter eines Puffers und 1 mMol des Substrats zugesetzt wurden. Durch Vergleich der Werte von A A/ min untereinander wurde die Inhibitionswirkung jedes Reagens gemessen.

(5) Proben wurden nach dem Verfahren des Beispiels 1 gereinigt und dann gemäss dem im Beispiel 2 beschriebenen Analyseverfahren analysiert. Die Resultate sind in der Ta-belle II angegeben.

Tabelle 2

Reinigung von Gewebe-Plasminogen-Aktivator aus Nieren

Reinigungs- Gesamte Akti- Spezifische Ak- Reinigungs- Wiedergewin-

stadium vität(i.E) tivität (i.E) grad nungsrate

1.NH4SCN 8,600 0,8 1 100 Extraktion

2. DEAE-Sepha- 7,800 2,0 2,4 90 rose

3. Arginin-Sepha- 6,200 300 357 72 rose

4. Concanavlin- 4,300 5,280 6,286 50 A-Sepharose

5. CM-Sepharose 3,500 12,300 14,600 41

6. Sephacryl S-200 2,700 25,700 30,600 31

Beispiel 4

Eigenschaften des erfindungsgemässen Gewebe-Plasmi-nogen-Aktivators:

(1) Molekulargewicht:

Das Molekulargewicht des im Beispiel l-(6) gewonnenen gereinigten Gewebe-Aktivators wurde durch Chromatographie auf SDS-Polyacrylamid-Gel gemessen. Das Resultat war ein Molekulargewicht von jeweils 72 000 und 70 000 für den aus Nieren und den aus Blutgefässen gewonnenen Aktivator. Diese Gewebe-Aktivatoren waren positiv gegenüber dem Perjodsäure-Schiff-Reagens, was die Anwesenheit von Zuckerketten bezeugte. Beispielsweise im Fall des aus Nieren gewonnenen Aktivators ist die durch Elektrophorese gemessene Mobilität des Hauptbandes des gereinigten Gewebe-Aktivators der Mobilität des Hauptbandes von aufgelöstem Fibrin eines rohen Extraktes identisch, wobei der rohe Extrakt und der gereinigte Gewebe-Aktivator jeweils durch Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamid-Gel analysiert und die resultierenden Gele jeweils auf Fibrin-Agar-Platten entwickelt wurden. Dies bezeugt, dass das scheinbare Molekulargewicht 70 000 betrug (vgl. Fig. 6). Das Band des aufgelösten Fibrins wurde der Anwesenheit von Plasminogen in der Fibrin-Agar- Platte zugeschrieben.

Aus den vorangehenden Resultaten ergibt sich, dass der rohe Extrakt, der aus menschlichen Nierengewebe gewonnen wurde, einen Plasminogen-Aktivator enthält und dieser hauptsächlich aus demjenigen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 70 000 besteht. Ein ähnliches Experiment wurde auch mit einem aus Blutgefässen gewonnenen Aktivator durchgeführt. Sein Molekulargewicht wurde auf etwa 70 000 geschätzt.

(2) Isoelektrische Punkte:

Wie bei den isoelektrischen Punkten von gereinigten Aktivatoren erschienen die Hauptscheitelpunkte bei 8,2 im Falle eines aus Nieren gewonnenen Aktivators und bei 7,8 im Falle eines aus Blutgefässen gewonnenen Aktivators. Nach der Messung jedes isoelektrischen Punktes wurde seine Aktivität auf einer Fibrin-Agar-Platte, die in der Form eines Dünnschicht-Gels (Dicke: 1,5 mm) war, gemessen. Die Aktivität der Aktivatoren wurde jeweils in Nähe ihres isoelektrischen Punktes gemessen, das heisst bei pl 8,2 und 7,8.

(3) Immunologische Unterschiede zwischen Gewebe-Aktivatoren und Urokinase:

25 Um zu untersuchen, ob die jeweils aus Nierengewebe und aus der Wandung eines Blutgefässes gewonnenen Aktivatoren dieselbe antigene Wirkung wie Urokinase haben, wurden die Elutionsprofile von Proteinen, die durch Behandlung des gereinigten Aktivators nach Beispiel l-(6), des Aktivators 30 nach Beispiel l-(3) und des aktiven Bestandteils des Aktivators durch Antiurokinase-IgG-Sepharose-Affinität-Chromatographie gewonnen wurden, verglichen mit dem Elutionsprofil von Urokinase. Resultate sind in Fig. 7 dargestellt. Wie aus Fig. 7 hervorgeht, wurde Urokinase stark in der 35 Säule adsorbiert und fast die gesamte geladene Aktivität wurde mit einer 0,1-moligen Lösung von Glycin-HCl, die 0,15 Mol NaCl und 0,1% Triton X-100 enthielt, eluiert. Das in den Effluenten enthaltene Protein war Serum-Albumin, das der bei diesem Experiment verwendeten handelsüblichen Urokinase zugesetzt worden war. Andererseits wurde der gereinigte Aktivator durch die Säule geleitet. Es wurde jedoch nicht adsorbiert und weder Protein noch Aktivität wurden mit einer Glycin-Lösung von pH 2,4 eluiert. Wenn die teilweise gereinigte, im Beispiel l-(3) erhaltene Probe in dieselbe Säule eingeleitet wurde, wurden etwa 15% der eingeleiteten Aktivität in der Säule adsorbiert und mit einer Glycin-Lösung von pH 2,4 eluiert. Aufgrund dieser Resultate wird gemeint, dass der erfindungsgemässe Plasminogen-Aktivator ein Gewebe-Aktivator ist, der immunologisch ungleich der Urokinase ist, und dass der rohe, aus Nieren gewonnene Extrakt als Nebenbestandteil Urokinase oder einen Urokinase-ähnlichen Aktivator enthält. Andererseits ging das Antise-rum für den Aktivator, das aus der Wandung von Blutgefässen gewonnen wurde, eine leichte Vernetzungsreaktion ein, was bezeugt, dass sie auch vom immunologischen Standpunkt aus ähnlich sind.

(4) Affinität der Gewebe-Aktivatoren für Fibrin-Sepha-rose

Die Affinität jeweils der Urokinase und eines Gewebe-60 Aktivators für unauflösbares Fibrin-Monomer wurde unter Verwendung von mit Fibrin-Sepharose geladenen Säulen untersucht.

Der erfindungsgemässe Gewebe-Aktivator [Beispiel l-(6)] wurde vollständig auf einer mit Fibrin-Sepharose geladenen «s Säule adsorbiert. Er wurde dann mit einer 2-moligen Lösung von NH4SCN eluiert, und mindestens 90% der gesamten eingeleiteten Aktivität wurden wiedergewonnen. Andererseits wurden fast die gesamten aktiven Bestandteile der Uro-

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kinase durch die Säule durchgelassen. Die Aktivität des Aktivators wurde daher nicht im Eluat gefunden, der mit einer 2-moligen Lösung von NH4SCN von der Säule gewonnen wurde. Wie im vorangehenden erwähnt wurde, weist der erfindungsgemässe, aus menschlicher Niere gewonnene Gewebe-Aktivator eine starke Aktivität für Fibrin-Sepharose auf.

(5) Spezifizität von synthetischen Substraten für Gewebe-Aktivatoren:

Die Spezifizität von gewissen synthetischen Substraten für den im Beispiel l-(6) gewonnenen Gewebe-Aktivator wurde untersucht. Es wurden nachfolgende Substrate verwendet.

Für Plasmin, H-D-valyl- L-leucyl- L-Iysin-p- nitroanilid-dihydrochlorid (S-2251);

Für natürliches Thrombin, Boc-L-valyl- L-prolyl- L-ar-ginin-4- methylcumaryl-7- amid (3093-V);

Für Plasma, Carbobenzoxy-L- phenylalanyl-L- arginin-4-methylcumaryl -7-amid (3095-V);

Für Harn-Kallikrein, L-prolyl- L-phenylalanyl- L-argi-nin -4-methylcumaryl-7- amid (3096-V);

Für Urokinase, Glutaryl- glycyl-L- arginin-4- methylcumaryl- 7-amid (3097-V);

Für Gewebe-Plasminogen-Aktivator, H-D-isoleucyl- L-prolyl-L- arginin-p- nitroanilid- dihydrochlorid (S-2288).

Der erfindungsgemässe Gewebe-Aktivator wies keine hydrolytische Aktivität gegenüber anderen Substraten als H-D-valyl-L-leucyl- L-lysin-p- nitroanilid- dihydrochlorid (S-2251) und H-D-isoleucyl- L-prolyl-L- arginin-p- nitroanilid- dihydrochlorid (S-2288) auf. Die Aktivität (100 IE/ml) des erfindungsgemässen Gewebe-Aktivators betrug 88 AmA/ min gegenüber H-D-valyl -L-leucyl-L- lysin-p- nitroanilid-dihydrochlorid (S-2251) und 70 A mA/min gegenüber H-D-iso-leucyl-L- prolyl-L- arginin-p- nitroanilid- dihydrochlorid (S-2288).

Der erfindungsgemässe Aktivator wies einige charakteristische Eigenschaften auf, wenn er mit gewissen Inhibitoren behandelt wurde. Die Amid-zersetzende Aktivität des erfindungsgemässen Aktivators gegenüber H-D-isoleucyl- L-prolyl-L- arginin- p-nitroanilid- dihydrochlorid (S-2288) wurde nicht inhibiert, wenn 50 KIE/ml Aprotinin (KIE = Kallik-rein Inaktivator Einheit), 10 mMol Jodoacetamid oder 50 microgramm/ml Sojabohnen-Trypsin als Inhibitor verwendet wurden. Er wurde jedoch bis zu 26% durch 100 milliMol L-arginin und bis zu 98% durch 5 milliMol Diisopropyl-fluorophosphat inhibiert.

(6) Stabilität:

Im Falle des erfindungsgemässen Plasminogen-Aktivators wurde sogar nach zwei Wochen Lagerung bei 4 °C in einem Puffer von pH 7,4 gar keine Reduktion der Aktivität festgestellt. Dasselbe Resultat wurde auch erreicht, wenn sogar 1 Mol von NH4SCN, 0,02% Polyoxyäthylen-(20)- sorbitan- monooleat (Tween 80) oder 0,1 Mol NaCl dem Puffer zugesetzt wurden.

Die Stabilität des erfindungsgemässen Plasminogen-Aktivators wurde bei 4 °C während 24 Stunden in Puffern, die pH-Werte im Bereich von 1-10 aufwiesen und 0,5 Mol NaCl sowie 0,02% Polyoxyäthylen- (20)-sorbitan- monooleat (Tween 80) enthielten, untersucht. Als Resultat ergab sich, dass der erfindungsgemässe Plasminogen-Aktivator innerhalb des pH-Bereiches von 2-10 stabil war, dass jedoch eine 70%ige Reduktion der Aktivität bei pH 1,0 stattfand.

Wie im einzelnen beschrieben wurde, ist der erfindungsgemässe Aktivator ein neuer Plasminogen-Aktivator, der von Urokinase verschieden ist und in der Steuerung der Erholung eines Gewebes, inklusiv der Zersetzung von Fibrin-

Ablagerungen auf inneren und äusseren Wandungen von Gefässen an einer beschädigten Stelle, eine wichtige Rolle spielt.

Selbstverständlich kann der neue erfindungsgemässe Plasminogen-Aktivator aus verschiedenen Organen von Säugetieren gewonnen werden. Alle Plasminogen-Aktivatoren müssen unabhängig von ihrer Quelle als in den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallend betrachtet werden, sofern sie die Eigenschaften aufweisen, die für den erfindungsgemässen Plasminogen-Aktivator charakteristisch sind.

In Übereinstimmung mit dem im vorangehenden be-schriebenen Herstellungsverfahren, auf welches sich die Erfindung auch bezieht, kann der Gewebe-Aktivator in einer hochreinen Form gewonnen werden. Der Gewebe-Aktivator weist eine spezifische Aktivität auf, die so viel wie 30 000-mal bis 45 000-mal die spezifische Aktivität einer mit Aceton getrockneten menschlichen Niere beträgt.

Das erfindungsgemässe thrombolytische Agens wird selbstverständlich aus den nachfolgenden Beispielen hervorgehen. Es soll jedoch bedacht werden, dass der als Bestandteil verwendete Plasminogen-Aktivator aus normalen Zellen gewonnen wurde. Ein aus bösartigen Tumorzellen gewonnener Plasminogen-Aktivator ist bekannt und hat eine thrombolytische Aktivität. Es wird jedoch gemeint, dass die Sicherheit eines erfindungsgemässen thrombolytischen Agens bereits durch seinen Ursprung gesichert wurde, wenn, angesichts seiner Art der Verabreichung als Arzneimittel für Menschen, diverse potentielle Risiken in seiner Verabreichung über lange Zeitperioden oder in hohen Dosen in Betracht gezogen werden.

Da der Plasminogen-Aktivator als Bestandteil des erfindungsgemässen thrombolytischen Agens eine spezifische Affinität für Fibrin aufweist, die von derjenigen von Urokinase verschieden, jedoch derjenigen des aus Blut gewonnenen normalen Plasminogen-Aktivators ähnlich ist, kann das thrombolytische Agens vollständig zufriedenstellende Resultate bringen, wenn es zur Behandlung von Thrombose verwendet wird. Dazu ist das erfindungsgemässe thrombolytische Agens frei von solchen Nebeneffekten wie interne Blutungen und anaphylaktischer Schock. Folglich ist das erfindungsgemässe Thrombus auflösende Agens ein sehr wirksames therapeutisches Arzneimittel.

Das erfindungsgemässe thrombolytische Agens kann Patienten in geeigneten Dosen verabreicht werden und hat ein Leistungspotential, das von schwachen oder keinen Nebeneffekten und von wirksamer thrombolytischer Aktivität begleitet wird. Das erfindungsgemässe thrombolytische Agens kann nämlich im wesentlichen in gleicher Weise verabreicht werden wie üblich verwendete andere Arzneimittel der gleichen Art. Beispielsweise kann sein aktiver Bestandteil, der Plasminogen-Aktivator, in 5% menschliches Serum-Albumin enthaltende physiologischer Salzlösung gelöst und durch Injektion verabreicht werden. Hierbei wird bevorzugt, jede Dosis auf 10 000 IE (etwa 100 microgramm), gemessen in bezug auf Urokinase, zu beschränken.

Das erfindungsgemässe thrombolytische Agens kann zur Behandlung von akuten und chronischen Thrombusokklu-sionen von verschiedenen vaskulären Blutnetzen verwendet werden, die in Fällen von schwerer Venenthrombose, Lungenembolie, Myokardinfarkt, Arterienokklusion, ausserkör-perlicher Zirkulation und arteriovenöser Okklusion angetroffen werden.

Das erfindungsgemässe thrombolytische Agens wird im nachstehenden spezifisch in den folgenden Beispielen beschrieben.

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Beispiel 5

Gewinnung und Reinigung des Plasminogen-Aktivators als aktiver Bestandteil des erfindungsgemässen thrombolytischen Agens:

Einer Menge von 100 g entfettetem Pulver, das aus menschlichen Nieren mittels Aceton gewonnen wurde, wurden 500 ml einer 2-moligen, auf pH 7,4 durch 0,02 Mol 2-amino- 2-hydroxymethyl-l,3- propandiol (TRIS) und HCl gepufferten Lösung von NH4SCN zugesetzt. Die resultierende Mischung wurde während 10 Stunden bei 4 °C gerührt und dann zentrifugiert (x 13 000 g; 30 Minuten), um in ein Extrakt und ein Präzipitat getrennt zu werden.

Der Extrakt wurde mit HCl IN auf pH 3,0 justiert und das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugieren (x 13 000 g; 30 Minuten) wiedergewonnen. Gelöst wurde dann das Präzipitat in 500 ml eines 0,01-moligen Natriumphosphat-Puffers (Puffer A), der 1 mMol Äthylendiamin-tetraes-sigsäure (EDTA), 0,3 Mol NaCl, 10 KIE/ml Aprotinin (KIE = Kallikrein Inaktivator Einheit), 5 mMol e-aminocapron-säure und 0,01 % Polyoxyäthylen-(20- sorbitan- monooleat (Tween 80) enthielt. Danach wurden 100 ml Fibrin-Kiesel-gur (Fibrin-Celite) dem Puffer zugesetzt und die resultierende Mischung wurde während 30 Minuten bei 4 °C gerührt. Die Mischung wurde dann durch Zentrifugieren (x 3 000 g; 10 Minuten) getrennt. Das Präzipitat wurde erneut in 100 ml des Puffers A suspendiert und die so zubereitete Lösung wurde in eine Säule von 4 x 10 cm eingeleitet. Die Säule wurde mit 500 ml des Puffers A gewaschen. Danach wurde der Plasminogen-Aktivator mit dem Puffer A, der zusätzlich 0,4 Mol Arginin enthielt, eluiert. Die Eluate wurden in Fraktionen von 10 ml gesammelt. Die Resultate sind in Fig. 8 und Tabelle 3 dargestellt. Das vorstehende Reinigungsverfahren ergab eine prozentuale Wiedergewinnung von soviel wie 30%. Das Reinigungsverfahren verwendet die starke Affinität des Plasminogen-Aktivators, als Bestandteil des erfindungsgemässen thrombolytischen Agens, für Fibrin.

Tabelle 3

Reinigungsstadium

Extraktion mit Am-moniumthiocyanat-Lösung Fällung durch Säure

Fällung durch Fi-brin-Kieselgur

Proteinmenge (mg)

4,500

2,800

Gesamte Aktivität i

100

62

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Beispiel 6

Vergleich der thrombolytischen Aktivität des erfindungsgemässen thrombolytischen Agens mit Urokinase:

Die thrombolytische Aktivität des Plasminogen-Aktiva-tors als Bestandteil des erfindungsgemässen thrombolytischen Agens wurde mit derjenigen von Urokinase gemäss dem Verfahren des Rings von Chandler verglichen. Das Experiment wurde mit menschlichem Blut von gesunden männlichen Freiwilligen durchgeführt. Es wurde Blut in einer genauen Menge von 5 ml entnommen, der 0,5 ml einer 3,l%igen Natriumcitrat-Lösung zugesetzt wurden, um die Blutgerinnung zu vermeiden. Dann wurden auch 50 microliter eines mit I25I markierten Fibrinogens zugesetzt. Nach gutem Vermischen wurden Portionen von 1,5 ml entnommen . und in einen Tygon-Schlauch von 28 cm Länge und 0,36 cm Innendurchmesser eingesetzt, worauf noch 20 mMol Calci-umchlorid zugesetzt wurden. Danach wurden die beiden Enden des Schlauches miteinander zur Bildung eines Ringes verbunden. Der ringförmige Schlauch wurde auf einen drehbaren Tisch befestigt, der um 17° geneigt war und mit einer Geschwindigkeit von 17 Umdrehungen pro Minute in Rotation gesetzt wurde. Nachdem man das Blut bei Raumtempe-5 ratur (24-25 °C) während 1 bis 14 Stunden gerinnen liess, wurde der Schlauch geöffnet und eine Probe von 10 microliter entnommen. Deren Radioaktivität wurde dann gemessen. Danach wurde der Plasminogen-Aktivator im Schlauch zugesetzt und dieser wurde an seinen beiden Enden wieder verbunden und auf dem drehbaren Tisch wieder in Rotation gesetzt. Nach einer vorbestimmten Zeit wurde eine Blutprobe von 10 microliter entnommen und deren Radioaktivität gemessen. Die Aktivität des vorstehend genannten Plasmino-gen-Aktivators wurde als Menge des vom Blutgerinnsel abgegebenen und in der Blutprobe vorhandenen 125I ausgedrückt.

Das so zugesetzte 125I-Fibrinogen wurde in das Polymer des Blutgerinnsels mit einem Wirksamkeitsgrad von 95-98% 20 eingebaut. Der Vernetzungsgrad war nach 1 Stunde verschieden vom Vernetzungsgrad nach 24 Stunden. Das heisst, teil-vernetztes (PXL) Blutgerinnsel wurde nach 1 Stunde und vollständig vernetztes (TXL) Blutgerinnsel nach 24 Stunden erhalten. Fig. 9 veranschaulicht das Stadium der Auflösung 25 eines teilvernetzten (PXL) Blutgerinnsels durch den Plasminogen-Aktivator als aktiver Bestandteil des erfindungsgemässen thrombolytischen Agens, oder durch Urokinase. In Fig. 9 entspricht die Kennlinie (a) dem Plasminogen-Aktivator und die Kennlinie (b) der Urokinase. Diese Kennlinien 3o zeigen, dass der Plasminogen-Aktivator als aktiver Bestandteil des erfindungsgemässen thrombolytischen Agens im Vergleich zu Urokinase eine hochwirksame Auflösung bewirkt. Wenn der Plasminogen-Aktivator als aktiver Bestandteil des erfindungsgemässen thrombolytischen Agens dem für die 35 Kennlinie (b) während 10 Stunden verwendeten System in gleicher Menge zugesetzt wurde wie dem für die Kennlinie (a) verwendeten System, wurde eine fast vollständige Auflösung erreicht [vgl. Fig. 9 (c)]. In Fig. 9 stellt jeder Punkt den Mittelwert von dreifachen Messungen dar. Wenn die Kon-40 zentration des Aktivators auf 1 nMol justiert wurde, löste der Aktivator als aktiver Bestandteil des erfindungsgemässen thrombolytischen Agens das teilvernetzte (PXL) Blutgerinnsel in 20 Stunden fast vollständig auf. Im Gegensatz zum Plasminogen-Aktivator wurde Urokinase nur zu etwa 40% 45 eluiert. Wenn der Plasminogen-Aktivator als aktiver Bestandteil des erfindungsgemässen thrombolytischen Agens dem vorstehend genannten System 10 Stunden später zugesetzt wurde, erfolgte eine fast vollständige Abgabe von 125I, was bedeutet, dass der Aktivator eine starke thrombolytische so Wirkung aufweist. Bei einem Experiment, in welchem das vollständig vernetzte (TXL) Blutgerinnsel verwendet wurde, bewirkte Urokinase eine Auflösung von nur 35% auch nach 20 Stunden, während der Plasminogen-Aktivator als aktiver Bestandteil des erfindungsgemässen thrombolytischen Agens 55 eine Auflösung von 90% bewirkte. Zur Kontrolle wurde ein weiteres Experiment ohne jeglichen Zusatz des Plasminogen-Aktivators durchgeführt: Es wurde gar keine Abgabe von 125I detektiert. Daraus ergibt sich, dass die Auflösung des Blutgerinnsels vom Aktivator abhängig war.

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Beispiel 7

Wirkungen des erfindungsgemässen thrombolytischen Agens bei verschiedenen Tieren:

Von verschiedenen Tieren wurde Blut auf dieselbe Weise 65 gesammelt wie im Beispiel 6 und man liess es während 1 Stunde gerinnen. Den Plasminogen-Aktivator als Bestandteil des erfindungsgemässen thrombolytischen Agens liess man auf die teilvernetzte (PXL) Blutgerinnsel in den Plasmen der

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betreffenden Tiere wirken, um die thrombolytische Aktivität des Plasminogen-Aktivators zu untersuchen. In jedem Experiment wurde die Konzentration des Plasminogen-Aktivators auf 20 IE/ml justiert und der Auflösungsgrad des Blutgerinnsels wurde als Menge von 125I, das von den Blutgerinnseln bis 10 Stunden nach Beginn der Reaktion abgegeben wurde, gemessen. In diesem System war der Hintergrund im wesentlichen gleich demjenigen, der ohne Zusetzen des Plasminogen-Aktivators erhalten wurde, und auch 10 Stunden später wurden nur 2-3% vom 125I detektiert. Im Gegensatz dazu wurden 96% desGerinnsels im menschlichen System aufgelöst. Fig. 10 stellt die Resultate dar, die unter Verwendung von Blut vom Menschen und von verschiedenen Tieren durch Bewerten des Auflösungsgrades erhalten wurden. In Fig. 10 veranschaulichen die Kennlinien (a), (b), (c), (d) und (e) die bei Menschen, Affen, Kaninchen, Hunden und Ratten erhaltenen Resultate. Wie in Fig. 10 dargestellt war der Auflösungsgrad je nach Tiergattung verschieden. Der Plasminogen* Aktiva tor wirkt gut im Falle von Affen, ähnlich wie im Falle von Menschen. Der Auflösungseffekt war im Falle von Ratten schlecht. Dies zeigt, dass der erfindunge-mässe thrombolytische Agens ein dem Menschen und dem Affen spezifisches Enzym ist.

C

3 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Plasminogen-Aktivator, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(1) das durch Elektrophorese auf einem Natriumdodecyl-sulfat-polyacrylamid-Gel erhaltene Hauptband des Proteins weist ein scheinbares Molekulargewicht von 70 000 ± 5 000 auf;

(2) das durch Elektrophorese am isoelektrischen Punkt erhaltene Hauptband weist ein pl im Bereich von 7 bis 9 auf;

(3) der Plasminogen-Aktivator weist die immunologische Eigenschaft auf, durch Anti-urokinase-IgG-Sepharose-Affi-nität-Chromatographie nicht desorbiert zu werden; und

(4) der Plasminogen- Aktivator hydrolysiert H-D-valyl-L-leucyl-L- lysin-p- nitroanilid- dihydrochlorid und H-D-isoleucyl-L- prolyl-L- arginin-p- nitroanilid- dihydrochlorid, aber er hydrolysiert nicht Boc-L-valyl- L-prolyl-L- arginin-4-methylcumaryl-7- amid, Carbobenzoxy-L- phenylalanyl-L-arginin-4- methylcumaryl-7- amid, L-prolyl-L- phenylalanyl-L- arginin-4- methylcumaryl-7- amid und Glutaryl- glycyl-L-arginin-4- methylcumaryl- 7-amid.
2. Verfahren zur Gewinnung eines Plasminogen-Aktiva-tors, der folgende Eigenschaften aufweist:

(1) das durch Elektrophorese auf einem Natriumdodecyl-sulfat- polyacrylamid-Gel erhaltene Hauptband des Proteins weist ein scheinbares Molekulargewicht von 70 000 ± 5 000 auf;

(2) das durch Elektrophorese am isoelektrischen Punkt erhaltene Hauptband weist ein pl im Bereich von 7 bis 9 auf;

(3) der Plasminogen- Aktivator weist die immunologische Eigenschaft auf, durch Anti- Urokinase- IgG-Sepharose-Affinität- Chromatographie nicht desorbiert zu werden; und

(4) der Plasminogen- Aktivator hydrolysiert H-D- valyl-L- leucyl-L- lysin-p- nitroanilid- dihydrochlorid und H-D-isoleucyl-L- prolyl-L- arginin-p- nitroanilid- dihydrochlorid, aber er hydrolysiert nicht Boc-L- valyl- L-prolyl-L- argi-nin-4- methylcumaryl-7- amid, Carbobenzoxy-L- phenylala-nyl-L- arginin-4- methylcumaryl-7- amid, L-prolyl-L- phe-nylalanyl-L- arginin-4- methylcumaryl-7- amid und Glutaryl- glycyl-L- arginin-4- methylcumaryl-7- amid, gekennzeichnet durch

Extraktion aus einer menschlichen Niere oder aus einem menschlichen Blutgefäss mit einer Ammoniumthiocyanat-Lösung und danach

Leiten des resultierenden Extraktes zum Reinigen desselben durch eine Säule, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einer mit einem Ionenaustauchmaterial, einer mit einem Metallchelat, einer mit L-arginin oder mit einer an einem Träger gebundenen L-arginin-Verbindung, einer mit einem an einem Träger gebundenen Hemagglutinin und einer mit einem Molekularsieb-Eigenschaften aufweisenden Träger geladenen Säule besteht, oder durch eine Kombination von aus der genannten Gruppe ausgewählten Säulen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch Extraktion aus der menschlichen Niere mit einer Ammonium-thiocyanat-Lösung, die mit 2-amino-2 -hydroxymethyl-1,3-propandiol (TRIS) und HCl auf ein pH im Bereich von 7,0 bis 7,4 gepuffert ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet, durch Extraktion aus dem menschlichen Blutgefäss durch Waschen des menschlichen Blutgefässes mit physiologischer Salzlösung und danach Perfusion der Ammoniumthiocyanat-Lö-sung durch das menschliche Blutgefäss.
5. Thrombotisches Agens, als aktiven Bestandteil einen Plasminogen-Aktivator enthaltend, der folgende Eigenschaften aufweist:

(1) das durch Elektrophorese auf einem Natriumdodecyl-sulfat- polyacrylamid-Gel erhaltene Hauptband des Proteins weist ein scheinbares Molekulargewicht von 70 000 ± 5 000 auf;

(2) das durch Elektrophorese am isoelektrischen Punkt erhaltene Hauptband weist ein pl im Bereich von 7 bis 9 auf;

5 (3) der Plasminogen-Aktivator weist die immunologische Eigenschaft auf, durch Anti- Urokinase- IgG-Sepharose- Affinität- Chromatographie nicht desorbiert zu werden; und

(4) der Plasminogen- Aktivator hydrolysiert H-D- valyl-L-leucyl- L-lysin-p- nitroanilid- dihydrochlorid und H-D-îoisoleucyl-L- prolyl-L- arginin-p- nitroanilid- dihydrochlorid, aber er hydrolysiert nicht Boc-L-valyl- L-prolyl-L- arginin-4-methylcumaryl-7- amid, Carbobenzoxy-L- phenylalanyl- L-arginin-4- methylcumaryl-7- amid, L-prolyl- L-phenylalanyl-L-arginin- 4-methylcumaryl-7- amid und Glutaryl- glycyl-L-15 arginin-4- methylcumaryl- 7-amid.
6. Thrombolytisches Agens nach Anspruch 5, bei welchem der Plasminogen-Aktivator aus normalen diploiden

Zellen stammt.