DE3390272T1 - Neuer Plasminogen-Aktivator, Verfahren zu seiner Herstellung und denselben enthaltendes thrombolytisches Mittel - Google Patents
Neuer Plasminogen-Aktivator, Verfahren zu seiner Herstellung und denselben enthaltendes thrombolytisches MittelInfo
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Description
Neuer Plasminogen-Aktivator, Verfahren zu seiner Herstellung
und denselben enthaltendes thrombolytisches Mittel.
Die Erfindung betrifft einen neuen Plasminogen-Aktivator,
der von einem menschlichen Gewebe, z.B. einer menschlichen
Niere oder einem menschlichen Blutgefäß, abgeleitet ist, ein Verfahren zu seiner Herstellung und ein thrombolytisches
Mittel, das diesen Plasminogen-Aktivator als einen aktiven Bestandteil enthält.
Plasminogen-Aktivatoren können entsprechend ihrer Herkunftsquellen in Gewebe-Aktivatoren, Gefäß-Aktivatoren, Blut-Aktivatoren,
Urokinase und dergleichen eingeteilt bzw. klassifiziert werden. Plasminogen-Aktivatoren spielen eine
wichtige Rolle bei fibrinolytischen (Fibrin-zersetzenden) Vorgängen, und sie werden in einer Vielzahl von Organen
von Säugetieren gefunden. Andererseits sind in letzter Zeit viele Arbeiten durchgeführt worden, um Plasminogen-Aktivatoren
aus künstlich gezüchteten Zellen zu erhalten. Bei diesen Arbeiten wurden als gezüchtete Zellen beispielsweise
bösartige (maligne) Tumorzellen, Blutgefäßendothel, stimulierter
Makrophag oder stimulierte Phagozyten, granulierte Stärkezellen, die durch Follikel stimulierendes Hormon stimuliert
worden sind, und dergleichen verwendet. Es sind auch biochemische und immunologische Eigenschaften von
Plasminogen-Aktivatoren berichtet worden, die von humoralen
Gewebe-Homogenaten (humoralen homogenisierten Geweben), gezüchteten Zellen und Kulturmedien isoliert worden waren.
Jedoch ist die Reinigung von Plasminogen-Aktivator aus
menschlichem Gewebe selten durchgeführt worden. Dies scheint der Schwierigkeit, das Ausgangsmaterial in einer ausreichenden
Menge erhalten zu können, zuzuschreiben zu sein und
liegt außerdem an der hydrophoben Eigenschaft von Enzymen, die in dem Ausgangsmaterial enthalten sind, und der Instabilität
derartiger Enzyme in einem Puffer und in einigen Fällen an dem Vorhandensein unbekannter Protease im Verlauf
seiner Reinigung. Unter diesen Umständen isolierten Rijken et al. menschlichen Uterus-Plasminogen-Aktivator mit einem
Molekulargewicht von 69000 und bestätigten, daß der Aktivator sowohl immunologisch als auch biochemisch dem menschlichen
Vaskular-Plasminogen-Aktivator ähnlich ist. Weiterhin wurde auch ein anderer menschlicher Vaskular-Plasminogen-Aktivator
mit einem Molekulargewicht, das von dem des vorgenannten menschlichen Uterus-Plasminogen-Aktivators verschieden
ist, auch isoliert und identifiziert.
Kwaan et al. führten eine Untersuchung über einen Plasminogen-Aktivator
durch, der von menschlichem Nierengewebe abgeleitet war, und zeigten, daß der Aktivator grundsätzlich
in dem Endothel von Blutgefäßen, insbesondere in dem Endothel von Venen, vorhanden ist (Fed. Proc. 24, 387 (1965)). Es
wurde auch von Kucinski et al. (J. Clin. Invest. 47, 1238-1253 (1968)), Bemik et al. (J. Clin.Invest. 48, 1740-1753 (1969)),
Barlow et al. (Thromb. Res. 1, 201-208 (1972)), Rsted et al.
(Experimentia 33, 589-590 (1978)) und Lewis (Thromb.Haemostas.
42, 895-890 (1979)) berichtet, daß ein derartiger Plasminogen-Aktivator, der von der Kultivierung menschlichen Nierengewebes
erhalten worden ist, immunologisch und physiochemisch
identisch zu Urokinase ist.
Urokinase, die ein Plasminogen-Aktivator ist, der von Urin oder kultivierten (gezüchteten) Nierenzellen isoliert worden
ist, und Streptokinase, die ein Plasminogen-Aktivator ist, der von Streptokokken aufgesammelt worden ist, werden zur
Zeit als thrombolytisches Mittel für den Zweck der Behandlung von Thrombose verwendet. Jedoch sind sowohl Urokinase
als auch Streptokinase beide von dem normalen Plasminogen-Aktivator verschieden, der von Blut aufgesammelt und
gewonnen ist. Diese Plasminogen-Aktivatoren haben keinerlei spezifische Affinität zu Fibrin. Deshalb sind die Ergebnisse,
die bei der Verwendung von Urokinase und Streptokinase bei der Behandlung von Thrombose erzielt wurden, nicht in jeder
Hinsicht vollständig zufriedenstellend. Um gewünschte Wirkungen zu erhalten, ist es notwendig, sie in relativ großen
Mengen zu verabreichen. Derartige starke massive Verabreichung verursacht jedoch gefährliche Nebenwirkungen wie die
Auflösung oder Zerteilung von Fibrinogen und inneres Bluten. Es besteht deshalb ein starker Bedarf nach der Entwicklung
eines Arzneimittels, das in relativ großem Maßstab hergestellt werden kann, geringe Nebenwirkungen besitzt und eine
hohe Thrombus (Blutgerinnsel) auflösende Wirkung besitzt.
Als Ergebnis einer intensiven Untersuchung über Gewebe-Plasminogen-Aktivatoren,
die von menschlichen Nieren und menschlichen Blutgefäßen isoliert und gereinigt wurden, haben die
Erfinder der vorliegenden Erfindung überraschenderweise einen
Plasminogen-Aktivator mit Eigenschaften gefunden, die merklich von denjenigen der Urokinase, die von menschlichen Nieren
oder menschlichen Blutgefäßen abgeleitet ist, verschie-
den sind, obgleich angenommen worden war, daß nur Urokinase
der grundsätzliche Plasminogen-Aktivator ist, der von menschlichen
Nieren und menschlichen Blutgefäßen erhältlich ist. Im Verlauf einer weiteren Untersuchung über den Plasminogen-Aktivator
von verschiedenen Standpunkten hat sich auch gezeigt, daß der Plasminogen-Aktivator eine starke Thrombus
auflösende Wirkung besitzt, was zur Fertigstellung dieser Erfindung geführt hat.
Eine Aufgabe dieser Erfindung ist es, einen neuen Plasminogen-Aktivator zu schaffen.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Herstellung des neuen Plasminogen-Aktivators zu
schaffen.
Es ist weiterhin Aufgabe dieser Erfindung, ein neues thrombolytisches
Mittel zu schaffen, das starke thrombolytische Wirkung besitzt.
Der Plasminogen-Aktivator, der ein Bestandteil des thrombolytischen
Mittels gemäß dieser Erfindung ist, hat die folgenden charakteristischen Eigenschaften:
(1) Das Haupt-Proteinband, gemessen durch die Natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-Elektrophorese,
besitzt ein Molekulargewicht von etwa 70000 + 5000;
(2) Das Hauptband bei der isoelektrischen Punkt-Elektrophorese besitzt einen pi von 7 bis 9;
(3) Der Plasminogen-Aktivator hat die immunologische Eigenschaft, nicht durch Anti-Urokinase igG-Sepharose Affinitätschromatographie unadsorbiert zu bleiben, und
(4) Der Plasminogen-Aktivator hydrolysiert H-D-VaIy1-L-leucyl-
L-lysin-p-nitroaniliddihydrochlorid und H-D-Isoleucyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroaniliddihydrochlorid
1 ·* ,· aber er hydrolysiert nicht Boc-L-valyl-L-prolyl-L-arginin-4-methyl·
cumary1-7-amid, Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginin^-
methylcumary1-7-amid, L-Prolyl-L-phenylalanyl-L-arginin-4-
2)
methylcumary1-7-amid und Glutaryl-glycyl-L-arginin-4-
methylcumary1-7-amid und Glutaryl-glycyl-L-arginin-4-
methylcumaryl-7-amid.
Anmerkung;
' Im japanischen Text fälschlich als "H-D-Isoleucyl-L-prolyl-arginin-p-nitroan^lliddihydrochlorid"
angegeben.
Im japanischen Text fälschlich als "L-Prolyl-L-phenyl-
alanyl-arginin-4-methylcumary1-7-amid" angegeben.
Der obige Plasminogen-Aktivator kann vorzugsweise die folgenden
verschiedenartigen Eigenschaften aufweisen:
(1) er ist extrahierbar oder ausspülbar aus einem Gewebe oder Blutgefäß mit einer 1-2 Mol NH4SCN-Lösung (pH 7,4) und reinigbar
in Anwesenheit von 0,1% Tween 80 oder dergleichen;
(2) er adsorbiert praktisch vollständig auf einer Fibrin-Sepharose-Säule
und wird mit einer 2 Mol NH.SCN-Lösung eluiert, und
(3) er ist stabil selbst über 2 Wochen, wenn er bei 4°C in einem Puffer mit pH 7,4 gelagert wird.
Der neue Plasminogen-Aktivator gemäß dieser Erfindung wird hergestellt, indem Blutklumpen, Bindegewebe,Lipoide und dergleichen
von einer menschlichen Niere nach einem Verfahren, das per se zum Stand der Technik gehört, entfernt werden
und das entstehende Nierengewebe einer Extraktionsbehandlung mit einem Puffer unterworfen wird oder bewirkt wird, daß eine
NH4SCN-Lösung ein Blutgefäß durchtränkt oder durchströmt, um
das Blutgefäß einer Extraktion zu unterwerfen; und dann der
so erhaltene Extrakt durch eine Säule geleitet wird, die aus
der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Säule, die mit einem Ionenaustauschmaterial beladen ist, einer Metallchelat-Säule,
einer Säule, die mit L-Arginin oder einem Arginin-Derivat, gebunden auf einem Träger, beladen ist,
einer Säule, die mit einem Hämagglutinin, gebunden auf einem Träger, beladen ist, <C und einer Säule, die mit einem Träger
mit Molekularsiebeigenschaften beladen ist, ^-'oder einer
Kombination von Säulen, die aus dieser Gruppe ausgewählt ist, um den Extrakt zu reinigen.
Der neue Plasminogen-Aktivator der vorliegenden Erfindung
ist in der Lage, die immunologischen Nachteile von Urokinase, die bereite als ein Arzneimittel mit Thrombus lösender Aktivität
entwickelt worden ist, zu beseitigen, und kann somit als ein aktiver Bestandteil eines thrombolytisehen Mittels
mit starker thrombolytischer Wirkung verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen; In den Zeichnungen zeigen:
Figur 1 ein Zinkchelat -Sepharose-Chromatogramm eines Plasminogen-Aktivators, der in Beispiel 1-(3)
erhalten worden ist;
Figur 2 ein Concanavalin A-Sepharose-Chromatogramm eines Plasminogen-Aktivators, der in Beispiel 1-(4)
erhalten worden ist;
Figur 3 ein CM-Sepharose-Chromatogramm von einem Plasminogen-Aktivator,
der in Beispiel 1-(5) erhalten worden ist;
/<£-,? fehlt im japanischen Text
Figur 4 Ergebnisse der Sephacryl S-200 GeIfiltrierung eines
Plasminogen-Aktivators, der in Beispiel 1-(6) erhalten worden ist;
Figur 5 stellt die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese eines
Plasminogen-Aktivators gemäß dieser Erfindung dar, wobei dieser Plasminogen-Aktivator von Nieren isoliert
worden war. Die Buchstaben A, B, C und D entsprechen
in dieser Reihenfolge dem Aktivator, der von den Nieren extrahiert und dann gereinigt worden
war, einem Aktivator, der von Gefäßwänden oder Vaskularwänden extrahiert und dann gereinigt worden
war, einem Aktivator, der von kultiviertem oder gezüchtetem normalem Humandiploid abgesondert worden
war, und einer kommerziell erhältlichen Urokinaseprobe;
Figur 6 zeigt Identifizierungsergebnisse von Plasminogen-Aktivatoren
gemäß dieser Erfindung, die vorher SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophoresen
unterworfen worden waren. Die Buchstaben A und B entsprechen einem
gereinigten Plasminogen-Aktivator, der in Beispiel 1-(6) erhalten worden war, während die Buchstaben
C und D einem Rohextrakt entsprechen, der in Beispiel
1-(3) erhalten worden war. Es wurde ein PoIyacrylamidgel verwendet, um die Plasminogen-Aktivatoren
A und C zu erhalten, während ein Fibrin-Agarose-Gel verwendet wurde, um die Plasminogen-Aktivatoren
B und D herzustellen;
Figur 7 sind Affinitätschromatograinme von Urokinase und
einem von Nieren herrührendem Plasminogen-Aktivator gemäß dieser Erfindung, die beide unter Verwendung
von Anti-Urokinase IgG-Sepharose-Säulen erhalten worden waren;
Figur 8 zeigt Elutionskurven, die beide durch Eluieren
eines Plasminogen-Aktivators, eines Bestandteils eines thrombolytisehen Mittels gemäß dieser Erfindung,
nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren erhalten worden waren;
Figur 9 ist ein Diagramm, in dem die thrombolytische Aktivität eines thrombolytisehen Mittels gemäß dieser
Erfindung mit derjenigen von Urokinase verglichen wird. Die Kurve (a) entspricht dem thrombolytisehen
Mittel gemäß dieser Erfindung, die Kurve (b) entspricht Urokinase und die Kurve (c) entspricht Urokinase,
zu der das thrombolytische Mittel dieser
Erfindung 10 Stunden später hinzugegeben worden war, und
Figur 10 erläutert schematisch die thrombolytisehen Wirkungen eines thrombolytisehen Mittels gemäß dieser
Erfindung gegen Thrombose von Menschen und verschiedenen Tieren. Die Kurven (a), (b), (c), (d)
und (e) entsprechen in dieser Reihenfolge dem Menschen, Affen, Kaninchen, Hund und der Ratte.
Im folgenden werden das Verfahren dieser Erfindung und die Eigenschaften des neuen durch das Verfahren erhaltenen Aktivators
im einzelnen beschrieben. Wenn nichts anderes speziell angegeben ist, wurden alle Verfahren bei 4 C durchgeführt.
Reinigung von Plasminogen-Aktivator, der von Nieren erhalten wurde:
(1) Extraktion von Plasminogen-Aktivator: Nachdem Blutklumpen, Bindegewebe und Lipoide von einer mensch-
- y - ίο.
lichen Niere, die frei von irgendwelchen infektiösen Symptomen
war (und die bei -7O°C gelagert worden war), mechanisch entfernt worden waren, wurde Aceton mit -15°C hinzugegeben,
und die Niere wurde dann in einem Homogenisator kleingemahlen. Die Suspension wurde bei -15°C 30 Minuten lang gerührt
und dann bei -20°C stehen gelassen. Das auf der Oberfläche Schwimmende wurde durch Dekantieren entfernt, und das Entfetten
wurde mit Aceton von -15°C wiederholt. Die entstandene
Suspension wurde dann filtriert. Der Filtrierkuchen wurde mit Aceton von -2O°C gewaschen und dann getrocknet.
Danach wurden 100 g des so entfetteten Pulvers in 1 Liter einer 1-Mol NH4SCN-Losung suspendiert, die mit einer 0,02
Mol Tris-HCl-Lösung mit pH 7,0 bis 7,4 gepuffert war. Die entstandene Suspension wurde gerührt. Die Suspension wurde
in einen Extrakt und einen Niederschlag durch Zentrifugieren getrennt. Der Niederschlag wurde wieder mit dem gleichen
1 Liter der 1-Mol NH.SCN-Lösung extrahiert. Die Extrakte
wurden kombiniert, um ein Rohprodukt zu erhalten.
(21 DEAE-Sepharose-Chromatographie:
Das in dem vorstehend beschriebenen Verfahren (1) erhaltene
Rohprodukt wurde mit der gleichen Menge einer 0,02-Mol Tris-HCl-Lösung mit pH 7,0 bis 7,4 verdünnt. Die so hergestellte
Probe wurde durch eine DEAE-Sepharose-Säule geleitet, die mit einer 0,02% Lösung eines nicht-ionischen oberflächenaktiven
Mittels, d.h. Tween 80 und einer 0,02-Mol Tris-HCl-Lösung, die 0,25 Mol NH4SCN enthielt, äquilibriert
worden war. Die Auslaufströme der Säule wurden kombiniert,
wozu NaCl hinzugegeben wurde, um zu bewirken, daß die Endkonzentration 1,0 Mol war. Ihr pH wurde auf 7,4 mit 1N-HC1
eingestellt.
(3) Zinkchelat-Sepharose-Chromatographie:
Die bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren (2) erhaltenen Auslaufströme wurden durch eine Zinkchelat-Sepharose-
Säule geleitet, die mit einer 0,002-Mol Tris-HCl-Lösung,
die einen pH von 7,0 besaß und 1,0 Mol NaCl, 0,25 Mol NH4SCN
und 0,02 Mol Tween 80 enthielt, äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit der vorstehenden Äquilibrierungslösung
gewaschen, bis die Konzentration von Proteinen in dem Eluat bis auf 0,01 mg/ml gesenkt worden war. Danach wurde die
Säule weiter mit einem Puffer gewaschen, dessen Zusammen^-
setzung identisch zu der der obigen Äquilibrierungslösung war mit der Ausnahme, daß der Puffer kein NH4SCN sondern
0,15 Mol NaCl enthielt. Die Säule wurde dann mit einer 0,05 Mol Imidazol-Lösung gewaschen, um dadurch den Gewebe-Aktivator
in die Waschflüssigkeiten zu eluieren. Das Profil
des entstandenen Chromatogramms ist in Figur 1 dargestellt.
(4) Concanavalin A-Sepharose-Chromatrographie:
Fraktionen des Gewebe-Aktivators, die in dem vorstehend beschriebenen
Verfahren (3) erhalten worden waren, wurden durch eine Concanavalin A-Sepharose -Säule geleitet. Die
Säule war vorher mit einer 0,02-Mol Tris-HCl-Lösung äquilibriert
worden, die einen pH von 7,4 besaß und 0,15 Mol NaCl und 0,02% Tween 80 enthielt. Nachdem die Säule wiederholt
mit der Äquilibrierungslösung gewaschen worden war, bis die Konzentration an Proteinen in dem Eluat die Grundlinie
erreichte, wurde der Gewebe-Aktivator mit einer Äquilibrierungslösung eluiert, die 0,5 Mol <*-D-Methylmannosid
enthielt. Fraktionen, die den Aktivator enthielten, wurden kombiniert, und der pH der entstandenen Lösung wurde mit
Essigsäure auf 4,5 eingestellt. Das Profil des entstandenen Chromatogramms ist in Figur 2 dargestellt. Rijken et al.
berichteten, daß ein Elutionsmittel mit linearem Gradienten von oc -D-Methylmannosid (0 bis 0,6 Mol) wirksam ist,
wenn ein Plasminogen-Aktivator von menschlichem Uterusgewebe isoliert wird (Biochim Biophys. Acta: 580, 140-153
(1979)). Wenn das Elutionsmittel mit linearem Gradienten von (X -D-Methylmannosid verwendet wurde, war das Elutions-
- 9X.
profil der Aktivator-Aktivität in Übereinstimmung mit demjenigen
von Proteinen. Fast all die Punkte der Elution des Plasminogen-Aktivators waren nahe den Punkten der Elution der
0,35-Mol o^-D-Methyimannosid-Lösung und lagen somit etwas
höher als diejenigen, die von Rijken et al. berichtet wurden.
(5) CM-Sepharose-Chromatographie:
Gewebe-Aktivator enthaltende Fraktionen, die in dem vorstehenden Verfahren (4) erhalten worden waren, wurden durch
V-- eine CM-Sepharose-Säule geleitet. Die Säule war vorher mit
einem O,O2-M Essigsäurepuffer äquilibriert worden, der einen
pH von 4,5 besaß und'0,115-Mol NaCl und 0,02% Tween 80 enthielt.
Nachdem die Säule mit der Äqüilibrierungslösung zuerst gewaschen
worden war, wurde die Säule mit der gleichen Äquilibrierungslösung
entwickelt mit der Ausnahme, daß die Konzentration von NaCl linear von 0,15 Mol auf 1,0 Mol erhöht wurde.
Der Gewebe-Aktivator wurde nahe einer NaCl-Konzentration von 0,45 Mol eluiert. Das Elutionsprofil ist in Figur 3
dargestellt. Der Gewebe-Aktivator wurde auf der CM-Sepharose in der Äquilibrierungslösung adsorbiert und etwa 50
bis 60% der geladenen Proteine wurden durch die Säule hindurchlaufen gelassen. Der Gewebe-Aktivator wurde nahe einer
NaCl-Konzentration von 0,45 Mol eluiert. Dies ist äquivalent zu etwa 40% Elution der verwendeten Proteine. Die
spezifische Aktivität wurde um etwa das 2,4-fache erhöht. Fraktionen, die den Aktivator enthielten, wurden miteinander
kombiniert und einer Ultrafiltrierung durch eine Diaflo-Membran PM 10 (Produkt von Amicon Corporation) unterworfen,
um sie dadurch zu konzentrieren. Der Austausch der Aktivatorprobe mit einem Puffer wurde auf einer Sephadex G-25
(Produkt von Pharmacia AB)-Säule durchgeführt. Die Säule
war vorher mit einer 0,02-Mol Tris-HCl-Lösung äquilibriert
worden, die einen pH von 7,4.besaß und 1,0 Mol NH4SCN enthielt.
Die Säule wurde mit einem Puffer entwickelt, der identisch zu der Äquilibrierungslösung war. Fraktionen, die
die so eluierten Proteine enthielten, wurden miteinander kombiniert und dann einer Ultrafiltrierung durch eine Diaflo-Membran
PM 10 unterworfen, um sie zu konzentrieren.
(6) Sephacryl S-200 Gel-Filtrierung:
Eine konzentrierte Probe von dem Gewebe-Aktivator wurde durch eine Sephacryl S-200 (Produkt von Pharmacia AB)-Säule
laufen gelassen, die vorher mit einer 0,02-Mol Tris-HCl-Lösung äquilibriert worden war, die einen pH von 7,4 besaß
und 1,0 Mol NH4SCN enthielt.
Die Auslaufströme, die Fraktionen des Gewebe-Aktivators
waren, wurden bei -70(
in Figur 4 angegeben.
in Figur 4 angegeben.
waren, wurden bei -70°C gelagert. Das Elutionsprofil ist
Reinigung von Plasminogen-Aktlvator, der von Blutgefäßen
abgeleitet wurde.
Nach dem Waschen eines Beinblutgefäßes mit einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung (pH 7,4) wurde der Plasminogen-Aktivator
von der Vaskularwand mit einer 1-Mol NH4SCN-Lösung extrahiert. Nach dem Aussalzen des Extraktes
mit einer 50% Ammoniumsulfatlösung wurde die entstandene Lösung der Arginin-Sepharose-Chromatographie unterworfen.
Der Plasminogen-Aktivator zeigte starke Affinität zu der Arginin-Sepharose und wurde mit einer 0,5-Mol Arginin-Lösung
eluiert. Seine spezifische Aktivität wurde auf die
vorstehende Weise um das etwa 6-fache vergrößert.
Unter Ausnutzung der hydrophoben Eigenschaft des Plasminogen-Aktivator
s wurde das Eluat einer Phenyl-Sepharose-Chromatographie
unterworfen. Der so adsorbierte Plasminogen-Aktivator wurde mit einer 50% Ä'thylenglycol-Lösung oder
einer 1% Lösung eines nicht-ionischen oberflächenaktiven
Mittels, und zwar Triton X-100 eluiert. Die spezifische
Aktivität des Plasminogen-Aktivators wurde um etwa das 8-fache auf diese Weise vergrößert.
Die meisten der Proteine wurden in früheren Auslaufströmen durch die Sephacryl S-200 Gel-Chromatographie eluiert.
Der Plasminogen-Aktivator wurde in Fraktionen eluiert, die ei nem Molekulargewicht von etwa 70000 entsprachen. Bei dieser
Stufe war die spezifische Aktivität um etwa das 2/2-fache vergrößert worden.
Schließlich wurde der Plasminogen-Aktivator der Fibrin-Sepharose-Chromatographie
unterworfen. Der von menschlichen Blutgefäßen abgeleitete Plasminogen-Aktivator hatte starke
Affinität zu der Fibrin-Sepharose, und seine spezifische Aktivität wurde um etwa das 1,3-fache vergrößert.
Die spezifische Aktivität, Reinigung und der erreichte Prozentsatz der Rückgewinnung bei den einzelnen verschiedenen
Stufen bei dem vorstehend beschriebenen Vorgehen sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Reinigung von Gewebe-Plasminogen-Aktivator von Blutgefäßen.
Reinigung von Gewebe-Plasminogen-Aktivator von Blutgefäßen.
Reinigungsstufe | Durchströmen | Totale Akti vität (UKIU) |
Spezifische Aktivität (UKIU/mg) |
Reinigungs grad |
Prozentsatz der Rückgewinnuno (%) |
1. | Aussalzen mit Ammoniumsulfat |
73900 | 5,4 | 1 | 100 |
2. | Arginin-Sepharose | 75400 | 400 | 74 | 102 |
3. | Phenyl-Sepharose | 72400 | 2300 | 426 | 96 |
4. | Sephacryl S-200 | 48800 | 19300 | 3574 | 66 |
5. | Fibrin-Sepharose | 31000 | 42000 | 7796 | 42 |
6. | 28000 | 57400 | 10630 | 38 |
-Ah,
Die spezifische Aktivität des endgültigen Plasminogen-Aktivators war etwa 45000 bis 80000 IU/mg Proteine und sein
Prozentsatz der Rückgewinnung reichte von etwa 20% bis 40%.
Das scheinbare Molekulargewicht des gereinigten Vaskular-Plasminogen-Aktivators
war etwa 70000, gemessen durch die SDS Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese. Sein Proteinband war
positiv gegen das PAS-Färben, und es wird grundsätzlich angenommen, daß der Plasminogen-Aktivator ein Glycoproteid
ist, das aus einer einzigen Kette besteht. Das Gel wurde nach der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese in Scheiben
geschnitten, um die Verteilung der Aktivität des Plasminogen-Aktivators zu untersuchen. Als Ergebnis wurde gefunden,
daß die Aktivität des Plasminogen-Aktivators vollständig konsistent mit der des Proteinbandes war.
Der isoelektrische Punkt (pi) des Hauptbands des Vaskular-Plasminogen-Aktivators
gemäß dieser Erfindung war 7,8.
Unter Verwendung von Anti-Urokinase IgG wurde die Antigenwirkung des Plasminogen-Aktivators dieser Erfindung mit
der von Urokinase verglichen. Die Aktivität des Vaskular-Plasminogen-Aktivators wurde überhaupt nicht durch die
Anti-Urokinase IgG gehemmt und zeigte keinerlei Affinität zu der Anti-Urokinase IgG-Sepharose.
Ein Antivaskular-Plasminogen-Aktivator, der unter Verwendung
des gereinigten Vaskular-Plasminogen-Aktivators als einem Antigen erhalten worden war, hemmte die Aktivität
des Vaskular-Plasminogen-Aktivators, hemmte jedoch nicht die Aktivität von Urokinase. Unter Verwendung des Antivaskular-Plasminogen-Aktivators
und Anti-Urokinase-Serum wurden die Antigenwirkungen von beiden Aktivatoren nach dem
Doppel-Immunodiffusionsverfahren untersucht. Als Ergebnis
entwickelten Urokinase und Vaskular-Plasminogen-Aktivator
- Tl-
beide individuell eine einzige Ausfällungskurve zwischen sich und ihrer entsprechenden Anti-Urokinase und Antivaskular-Plasminogen-Aktivatorserum.
Es wurde jedoch keine Querverbindung zwischen den Ausfällungskurven beobachtet.
Aus den vorstehenden Ergebnissen wird geschlossen, daß der Vaskular-Plasminogen-Aktivator gemäß dieser Erfindung immunologisch
von Urokinase verschieden ist.
Als der Antivaskular-Plasminogen-Aktivator IgG zu einer Fibrinmembran in Todd'scher Fibrinolyseautographie hinzugegeben wurde, wurde die Aktivität des Plasminogen-Aktivators,
die in vegetativen Blutgefäßen von inneren und äußeren Membranen einer Vene beobachtet worden war, unterdrückt.
Die Unterdrückung der Aktivität des Vaskular-Plasminogen-Aktivators
wurde unter Verwendung einer Vielzahl von Inhibitoren untersucht. Als Ergebnis wurden Aktivitätshemmungen von 98% bzw. 20% entsprechend durch Diisopropylfluor-phosphat
(5 mM) bzw. L-Arginin (0,1 M) beobachtet. Es wurden keine Änderungen durch Trasylol (50 KlU/ml),
Jodacetamid (10 mM) und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor
(50 μg/ml) beobachtet. Dies zeigt an, daß der Vaskular-Plasminogen-Aktivator
gemäß dieser Erfindung ähnlich wie Urokinase zu Serin-Protease gehört.
Analyse von Gewebe-Plasminogen-Aktivator und Ergebnisse:
(1) Wenn nichts anderes speziell angegeben ist, wurde jeder Plasminogen-Aktivator durch das Fibrin-Agar-Plattenverfahren
analysiert, das in Immunochemistry 9, 709-723 (1972)
beschrieben ist. Die fibrinolytische Aktivität des Gewebe-Aktivators wurde mit derjenigen von Urokinase verglichen
und wurde in Werten der internationalen Einheit (UKIU) aus-
gedrückt. Die Standardkurven, die die Aktivität von Reihenverdünnungen
sowohl von Plasminogen-Aktivator dieser Erfindung als auch Urokinase zeigen, waren gerade in dem Gebiet
2 des Iytisehen Bereichs von 70 bis 240 mm . Der Gradient der
Standardkurve des Gewebe-Aktivators war jedoch nicht vollständig übereinstimmend mit dem von Urokinase. Die Aktivität
des Gewebe-Aktivators wurde bestimmt, indem die Iytischen Bereiche von verdünnten Proben innerhalb des Gebietes
von 120 bis 200 mm gemessen wurden. Der lytische Bereich von 10 μΐ oder 1 IU/ml Urokinase war 156 mm . Die Reproduzierbarkeit des Fibrin-Agar-Plattenverfahrens war + 6%.
Die enzymatische Aktivität des Gewebe-Aktivators wurde durch die enzymatische Aktivität von Urokinase standardisiert,
und der Prozentsatz der Rückgewinnung des Gewebe-Aktivators und seine spezifische Aktivität relativ zu UKIU/ml wurden
nach jeder einzelnen von verschiedenen Reinigungsstufen gemessen.
Die nicht-spezifische Fibrin auflösende Aktivität wurde auf einer Fibrin-Agar-Platte gemessen, die frei von jeglichem
Plasminogen war.
In einigen Fällen wurde die Messung nach dem Verfahren durch-
125
geführt, bei dem I-Fibrin-Monomer, eingefangen in einer Zellulose-Nitrat-Scheibe ("Selectgun" Type-ΒΑ; Porendurchmesser: 0,2 μπι) , verwendet wurde (Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, 539-546 (1978J, Raven Press, New York). Fibrinogen, das kein menschliches Plasminogen enthielt, wurde durch das Verfahren bestrahlt, das von Hawker et al. vorgeschlagen worden ist (J.Clin. Pathol. 29, 495-501 (1976)). Die spezifische Aktivität des markierten Substrats war 0,018 mCi/mg Fibrinogen. Eine Probenmischung wurde bei 37°C incubiert, und eine 50 μΐ Portion wurde nach jeder ersten und siebenten Stunde pro-
geführt, bei dem I-Fibrin-Monomer, eingefangen in einer Zellulose-Nitrat-Scheibe ("Selectgun" Type-ΒΑ; Porendurchmesser: 0,2 μπι) , verwendet wurde (Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, 539-546 (1978J, Raven Press, New York). Fibrinogen, das kein menschliches Plasminogen enthielt, wurde durch das Verfahren bestrahlt, das von Hawker et al. vorgeschlagen worden ist (J.Clin. Pathol. 29, 495-501 (1976)). Die spezifische Aktivität des markierten Substrats war 0,018 mCi/mg Fibrinogen. Eine Probenmischung wurde bei 37°C incubiert, und eine 50 μΐ Portion wurde nach jeder ersten und siebenten Stunde pro-
125 benweise entnommen. Freigesetztes I wurde durch einen
automatischen Gammazähler gemessen. Die Aktivität der einzelnen Verdünnungen des Gewebe-Aktivators und von Urokinase
wurde ausgedrückt in Werten des Prozentsatzes von freige-
125
setztem I relativ zu der gesamten Radioaktivität, indem
setztem I relativ zu der gesamten Radioaktivität, indem
125
das freigesetzte I subtrahiert wurde.
das freigesetzte I subtrahiert wurde.
(2) Affinitätschromatographie auf Anti-Urokinase IgG-Sepharose-Säule:
Das Urokinase-Antiserum wurde von einer Ziege erhalten, die
durch eine subcutane Verabreichung von 1 mg menschlicher Urokinase hoher Reinheit (Molekulargewicht 33000; spezifische
Aktivität: 202400 IU/mg) immunisiert worden war. Die
vorstehend angewendete Urokinaseprobe war die gleiche wie diejenige, die vorstehend nach der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
analysiert worden war.
Das Anti-Urokinase-Serum zeigte nur eine Ausfällungskurve,
als sie nach der Doppel-Immunodiffusionsanalyse geprüft wurde. IgG-Fraktionen von Anti-Urokinase-Ziegenserum und
nicht immunisiertes Ziegenserum wurden durch Ausfällen mit einer gesättigten 33% Ammoniumsulfat-Lösung hergestellt.
Sie wurden weiter durch DEAE-Sepharose-Chromatographie ge- ^ reinigt.
Die Anti-Urokinase IgG (50 pg/ml), die zu einer Fibrinplatte hinzugegeben wurde, hemmte vollständig die Aktivität
der kommerziellen Urokinaseprobe, die als ein Antigen (5000 IU/ml) verwendet worden war. Diese IgG-Proben (20
mg/ml) entwickelten individuell eine einzige Ausfällungskurve, als die Immunoelektrophorese unter Verwendung von
Anti-Ziegenserum und -Kaninchenserum angewendet wurde.
50 Milligramm der Anti-Urokinase oder normaler IgG-Probe
wurden mit 15 ml cyanogenbromidaktivierter Sepharose CL-4B
in Übereinstimmung mit dem von Cuatrecasas vorgeschlagenen
Verfahren gekuppelt (J. Biol.Chem. 245, 3059-3065 (197O)). Das Gel wurde mit einer 0,02-Mol Tris-HCl-Lösung, die einen
pH von 7,4 besaß und 1,0 Mol NaCl enthielt, mit einem Volumen von wenigstens dem 20-fachen des Volumens des Gels
gewaschen. Chromatogramme des Gewebe-Aktivators und von Urokinase sind in Figur 7 dargestellt.
(3) Adsorption des Gewebe-Aktivators und von Urokinase auf Fibrin-Sepharose:
Nach dem vorstehend angegebenen Verfahren von Cuatrecasas
wurden 200 mg Fibrinogen, das frei von menschlichem Plasminogen war, bei pH 8,3 mit 20 g Cyanogenbromid aktivierter
Sepharose CL4B gekuppelt. Das so gekuppelte Fibrinogen wurde dann durch eine Zugabe von Thrombin (1 Einheit/ml
oder Unit/ml) in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das von
Reeme et al. vorgeschlagen wurde (Thromb. Res.2, 137-143
(1973), aktiviert. Danach wurde es mit einer 0,02-Mol Tris-HCl-Lösung,
die einen pH von 7,4 besaß und 0,15 Mol NaCl, 0,1% Triton X-100 und 1 Mikromol Aprotinin (Produkt von
Bayer AG) enthielt, gewaschen. Das Gel, das in der Säule beladen worden war, wurde mit 2 Mol NH4SCN, gelöst in einem
Puffer, gewaschen, woraufhin die Zugabe einer Urokinase oder einer Gewebe-Aktivatorprobe (die von der Stufe (6)
von Beispiel 1 erhalten worden war) in einem Puffer zu der Säule folgte. Nach dem Waschen der Säule wurde die Säule
mit einer 2 Mol NH4SCN-Lösung eluiert. Die Aktivität des
Plasminogen-Aktivators wurde in Übereinstimmung mit einem Verfahren gemessen, bei dem die Konzentration der Proteine
in dem Eluat und ein chromogenes Substrat S-2288 verwendet
wurden.
(4) Andere Verfahren:
Die quantitativen Analysen von Proteinen wurden unter Verwendung des Verfahrens durchgeführt, das von Lowry et al.
vorgeschlagen worden war, bei dem Rinderserumalbumin als
ein Standardprotein verwendet wurde (J. Biol. Chem. 193,
275 (1951)). Löslich gemachte Proteine in Tween 80 wurden quantitativ durch das von Shiu et al. (J.Biol.Chem. 249,
7902-7911 (1974) vorgeschlagene Verfahren analysiert, nachdem das Sediment durch Zentrifugaltrennung entfernt worden
war. In einigen Fällen wurde ein genaueres Verfahren angewendet, bei dem Fluorescamin verwendet wurde (Arch. Biochem.
Biophys. 155, 213-220 (1973)). Nach der Sephacryl S-200-Chromatographie
erhaltene Eluate wurden unter Verwendung eines LKB-Uviicord II Detektors und Recorders überwacht,
wobei der Detektor mit einem Hitachi Spektrophotometer Modell 200-200 ausgestattet war.
Die SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese wurde nach dem von
Weber et al. vorgeschlagenen Verfahren (J. Biol. Chem. 244, 4406-4412 (1972) durchgeführt. Jede Proteinprobe wurde bei
Raumtemperatur 30 Minuten lang in einer 1,0% SDS-Lösung incubiert und dann der Elektrophorese in einem 5% Polyacrylamidgel
unterworfen. In einigen Fällen wurden Proteine mit einer 1% Lösung von 2-Mercaptoäthanol reduziert. Das Gel
färbte ein Protein mit Coomassie Brilliant Blue oder ein
Glycoproteid mit Perjodsäure-Schiffschem Reagens. Um die Aktivität des Plasminogen-Aktivators zu messen, wurde die
SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese in einem 5% Polyacrylamid-Gel
in Übereinstimmung mit dem Slabgelsystem durchgeführt.
Nach dem Durchführen der Elektrophorese wurde das Slabgel bei Raumtemperatur 2 Stunden lang mit einem 0,01
Mol Phosphorsäurepuffer gewaschen, der einen pH von 7,4 besaß und 0,5 Mol NaCl und 2% Tween 80 enthielt. Das Gel
wurde dann mit einem 1% Agarosegel, das 0,2% menschliches Fibrinogen (entweder reich an oder frei von Plasminogen)
und 0,5 Einheiten (Unit) Thrombin enthielt, aufgeschichtet. Die Inhalte wurden dann 1 bis 7 Stunden bei 37°C in eine
Kammer mit konstanter Feuchtigkeit incubiert, und das Agarosegel und das Polyacrylamidgel wurden mit Coomassie
Brilliant Blue gefärbt. Das scheinbare Molekulargewicht des
Proteins wurde gemessen, indem seine Beweglichkeit mit der Beweglichkeit des Standardproteins nach dem vorstehend bereits
erwähnten, von Weber et al. vorgeschlagenen Verfahren verglichen wurde.
Die Messung des isoelektrischen Punktes des so gereinigten Gewebe-Aktivators wurde in einem 7,5% Polyacrylamidgel, das
8 Mol Harnstoff und 1% eines Ampholyts enthielt, nach dem Verfahren durchgeführt, das von Mertz et al. vorgeschlagen
worden war (Biochem. Biophys. Res. Commun. 49, 84-91 (1972)). Die Probe wurde in einer 8 Mol Harnstofflösung löslich gemacht,
die 2 Millimol EDTA und 1% Ampholyt enthielt. Ihr
pH wurde durch das von Finlayson et al. vorgeschlagene Verfahren (Anal. Biochem. 40, 292-311 (1971) bestimmt.
Der so. ,gereinigte Gewebe-Aktivator wurde mit verschiedenen
Fluoreszenzsubstraten nach Zugabe von 50 μΐ der Gewebe-Aktivatorprobe
in einer 0,02-Mol Tris-HCl-Lösung, die einen
pH von 8,0 besaß und 0,1 Mol NaCl und 0,02% Tween 80 enthielt,
und 2,0 ml des Substrats in dem gleichen Puffer getestet. Die folgenden Materialien wurden als Fluoreszenzsubstrate verwendet:
Boc-L-valyl-L-prolyl-L-arginin-4-methyl-cumary1-7-amid;
Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginin^-methylcumaryl-?-
amid;
L-Prolyl-L-phenylalanyl-L-arginin^-methylcumaryl^-
amid, und
Glutaryl-glycyl-L-arginin^-methylcumaryl^-amid.
Die anfängliche Freisetzung von 7-Amino-4-methylcumarin (AMC)
wurde mittels eines Fluorometers bei 37°C in einem Shimadzu
:" "* " '* 339Ö272
-23.
Fluorospektrophotometer Modell RF-520 gemessen. Das Fluorometer war in solch einer Weise eingestellt worden, daß eine
Strahlung von Licht mit 380 nm ein angeregtes Fluoreszenzlicht mit 460 nm emittieren konnte. Das Fluorometer war auch
so eingestellt, daß eine 0,2-Mol AMC-Lösung in einer 0,1% DMSO-Lösung eine relative Fluoreszenzeinheit von 1,0 lieferte.
Die hydrolytische Aktivität des gereinigten Gewebe-Aktivators wurde mit einem chromogenen Substrat gemessen,
nachdem 200 μΐ einer Gewebe-Aktivatorprobe, 200 μΐ einer
0,1-Mol Tris-HCl-Lösung, die einen pH von 8,0 besaß und 0,1
Mol NaCl und 0,02% Tween 80 enthielt, und 200 μΐ einer 3-Millimol S-2251-Lösung oder eine 1-Millimol S-2288-Lösung
zugegeben worden war. Die Anfangsfreisetzung von p-Nitroanilin wurde mit einem Spektrophotometer bei 405 nm
und 370C in einer Glaszelle gemessen. Die Anfangsgeschwindigkeit der hydrolytischen Aktivität wurde in Werten von
AmA/min für das chromogene Substrat und Δ %/min für das
Fluoreszenzsubstrat ausgedrückt. Die Inhibitor-Wirkungen des Gewebe-Aktivators wurden mit dem chromogenen Substrat
S-2288 getestet, als er jeweils mit Diisopropylfluorophosphat, Jodacetamid, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor und L-Arginin-Aprotinin
behandelt wurde. Die gereinigten Gewebe-Aktivatorproben wurden bei 37°C 1 Stunde lang incubiert,
nachdem die Inhibitoren in sie hineingegeben worden waren. Ein 200 μΐ Anteil wurde aus jeder Mischung herausgenommen,
woraufhin eine Zugabe von 200 μΐ eines Puffers und 1 Millimol
des Substrats folgte. Durch Vergleich der A A/min-Werte
miteinander wurde die Hemm- oder Inhibitorwirkung jedes einzelnen Reagens gemessen.
(5) Proben wurden nach dem Verfahren von Beispiel 1 gereinigt und dann nach dem analytischen Verfahren, das in Beispiel
2 beschrieben ist, analysiert. Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2
Reinigung des von Nieren erhaltenen Gewebe-Plasminogen-Aktivators.
Reinigung des von Nieren erhaltenen Gewebe-Plasminogen-Aktivators.
Reinigungsschritt | NH^SCN-Extraktion | Gesamtakti vität (ÜKIÜ) |
Spezifische Aktivität (UKIU/mg) |
Reinigungs grad |
Rückgewinnungs- prozentsatz |
1. | DEAE-Sepharose | 8600 | 0,8 | 1 | 100 |
2. | Arginin-Sepharose | 7800 | 2,0 | 2,4 | 90 |
3. | Concanavalin A-Sepharose |
6200 | 300 | 357 | 72 |
4. | CM-Sepharose | 4300 | 5280 | 6286 | 50 |
5. | Sephacryl S-200 | 3500 | 12300 | 14600 | 41 |
6. | 2700 | 25700 | 30600 | 31 |
Eigenschaften des Gewebe-Plasminogen-Aktivators dieser Erfindung:
(1) Molekulargewicht:
Das Molekulargewicht des in Beispiel 1-(6) erhaltenen gereinigten Gewebe-Aktivators wurde durch die SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
gemessen. Als Ergebnis wurde gefunden, daß das Molekulargewicht des von der Niere herrührenden
Aktivators etwa 72000 und das von dem Vaskular-Aktivators etwa 70000 war. Diese Gewebe-Aktivatoren waren positiv
gegen das Perjodsäure-Schiffsehe Reagens, was dadurch
das Vorhandensein von Zuckerketten anzeigte. Im Falle des von der Niere herrührenden Aktivators war beispielsweise
die Beweglichkeit der Hauptbande des gereinigten Gewebe-Aktivators, wie sie durch die Elektrophorese gemessen wurde,
identisch zu der Beweglichkeit der Hauptbande des aufgelösten Fibrins eines Rohextrakts, als der Rohextrakt und gereinigter Gewebe-Aktivator jeweils durch die SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
analysiert wurden, und die entstandenen Gele waren jeweils auf Fibrin-Agar-Platten entwickelt. Dies
zeigt an, daß das scheinbare Molekulargewicht 70000 war (vergleiche Figur 6). Das Band des aufgelösten Fibrins wurde
dem Vorhandensein von Plasminogen in der Fibrin-Agar-Platte zugeschrieben.
Von den vorstehenden gefundenen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß der Rohextrakt, der von menschlichem Nierengewebe
erhalten wurde, einen Plasminogen-Aktivator enthält und der Plasminogen-Aktivator prinzipiell aus etwas mit
einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 70000 besteht. Es wurde auch ein ähnliches Experiment unter Verwendung
eines Aktivators durchgeführt, der von einem Blutgefäß abgeleitet war. Sein Molekulargewicht wurde auf etwa 70000
geschätzt.
(2) Isoelektrische Punkte;
Als isoelektrische Punkte von gereinigten Aktivatoren erschienen die Haupt-Peaks bei 8,2 im Falle eines von Nieren
herrührenden Aktivators und bei 7,8 im Falle eines Aktivators, der von einem Blutgefäß abgeleitet war. Nach der Messung
eines jeden isoelektrischen Punktes wurde seine Aktivität auf einer Fibrin-Agar-Platte gemessen, die in der
Form eines Dünnfilmgels vorlag (Dicke: 1,5 mm). Es wurde gefunden, daß die Aktivität der Aktivatoren jeweils nahe
ihrer isoelektrischen Punkte lag, d.h. pH 8,2 und 7,8.
(3) Immunologische Unterschiede zwischen Gewebe-Aktivatoren und Urokinase:
Um zu untersuchen, ob die Aktivatoren, die jeweils von Nierengewebe bzw. von der Wand eines Blutgefäßes erhalten worden waren, die gleiche Antigenwirkung wie Urokinase besitzen,
wurde das Elutionsprofil von Proteinen, die durch die Anti-Urokinase IgG-Sepharose-affinitätschromatographische
Behandlung des gereinigten Aktivators von Beispiel 1-(6) und des Aktivators von Beispiel 1-(3) erhalten worden waren,
und aktiver Bestandteil des Aktivators mit dem Elutionsprofil von Urokinase verglichen. Ergebnisse sind in Figur
angegeben. Wie aus Figur 7 ersichtlich ist, wurde Urokinase stark auf der Säule adsorbiert, und fast die gesamte beladene
Aktivität wurde mit einer 0,1-Mol Glycin-HCl-Lösung,
die 0,15 Mol NaCl und 0,1% Triton X-100 enthielt, eluiert.
Das in den Auslaufströmen enthaltene Protein war Serumalbumin,
das in die käufliche Urokinase, die in diesem Experiment verwendet wurde, inkorporiert worden war. Andererseits
wurde der gereinigte Aktivator durch die Säule geleitet. Er wurde jedoch nicht adsorbiert/ und weder Protein
noch Aktivität wurde mit einer Glycin-Lösung von pH 2,4 eluiert. Als die teilweise gereinigte Probe, die in Beispiel
1-(3) erhalten worden war, in die gleiche Säule ge-
339Ü272
gössen wurde, wurden etwa 15% der durchgeströmten Aktivität
auf der Säule adsorbiert und mit einer Glycin-Lösung von pH 2,4 eluiert. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse muß
angenommen werden, daß der Plasminogen-Aktivator dieser Erfindung ein Gewebe-Aktivator ist, der immunologisch von
der Urokinase verschieden ist, und der von Nieren erhaltene Rohextrakt enthält als einen geringfügigen Bestandteil
Urokinase oder einen Urokinase ähnlichen Aktivator. Andererseits durchlief das Antiserum für den Aktivator, das von
der Wand des Blutgefäßes erhalten worden war, eine leichte Querverbindungs- oder Vernetzungsreaktion, wodurch angezeigt
wurde, daß sie auch vom immunologischen Standpunkt ähnlich sind.
(4) Affinität von Gewebe-Aktivatoren zu Fibrin-Sepharose:
Die Affinität jeweils von Urokinase und einem Gewebe-Aktivator
zu unlöslich gemachtem Fibrin-Monomer wurde unter Verwendung von Fibrin-Sepharose^Säulen untersucht.
Der Gewebe-Aktivator gemäß dieser Erfindung (Beispiel 1-(6)) wurde in seiner Gesamtheit auf der Fibrin-Sepharose-Säule
adsorbiert. Er wurde dann mit einer 2-Mol NH.SCN-Lösung
eluiert, und wenigstens 90% der gesamten durchgeströmten Aktivität wurde zurückgewonnen. Andererseits wurden fast
die gesamten aktiven Bestandteile von Urokinase durch die Säule strömen gelassen. Die Aktivität des Aktivators wurde
auf diese Weise nicht in dem Eluat gefunden, das mit einer 2-Mol NH,SCN-Lösung von der Säule erhalten worden war. Wie
vorstehend erwähnt wurde, besitzt der Gewebe-Aktivator dieser Erfindung, der von menschlichen Nieren erhalten worden
war, starke Affinität zu Fibrin-Sepharose.
(5) Spezifisches von synthetischen Substraten gegenüber Gewebe-Aktivatoren:
Es wurde das spezifische Verhalten bestimmter synthetischer Substrate zu dem in Beispiel 1-(6) erhaltenen Aktivator
untersucht. Die folgenden Substrate wurden verwendet.
Für Plasmin: H-D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroaniliddihydrochlorid
(S-2251);
Für natürliches Thrombin: Boc-L-valyl-L-prolyl-L-arginin-4-methylcumary1-7-amid
(3O9 3-V);
Für Plasma: Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginin-4-methylcumary1-7-amid
(3095-V);
Für Urinkallikrein: L-Prolyl-L-phenylalanyl-L-arginin-4-methylcumary1-7-amid
(3096-V);
Für Urokinase: Glutamyl-glycyl-L-arginin^-methylcumaryl-?-
amid (3097-V) und
Für Gewebe-Plasminogen-Aktivator: H-D-Isoleucyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroaniliddihydrochlorid
(S-2288).
Der Gewebe-Aktivator dieser Erfindung zeigte keine hydrolytische
Aktivität zu irgendwelchen Substraten, die andere als S-2251 und S-2288 waren. Die Aktivität (100 UKIU/ml)
des Gewebe-Aktivators gemäß dieser Erfindung war 88 ΔmA/min
gegen S-2251 und 70 ΔmA/min gegen S-2288.
Der Aktivator dieser Erfindung zeigte einige charakteristische Eigenschaften, wenn er mit bestimmten Inhibitoren behandelt
wurde. Die Amid zersetzende Aktivität des Aktivators dieser Erfindung gegen S-2288 wurde nicht gehemmt,
wenn 50 KIU/ml Aprotinin, 10 Millimol Jodacetamid oder
50 ug/ml Sojabohnentrypsin als ein Inhibitor verwendet wurde,
Er wurde jedoch bis zu 26% durch 100 Millimol L-Arginin und bis zu 98% durch 5 Millimol Diisopropylfluorphosphat
gehemmt.
(6) Stabilität:
Im Falle des Plasminogen-Aktivators gemäß dieser Erfindung wurde überhaupt keine Aktivitätsverminderung beobachtet,
selbst nicht 2 Wochen später, wenn er bei 4°C in einem Puffer von pH 7,4 gelagert wurde. Das gleiche Ergebnis
wurde auch erhalten, selbst wenn 1 Mol NH4SCN, 0,02% Tween
80 oder 0,1 Mol NaCl in den Puffer inkorporiert wurden.
Die Stabilität des Plasminogen-Aktivators dieser Erfindung
wurde bei 4°C 24 Stunden lang in Puffern untersucht, die pH-Niveaus in dem Bereich von 1 bis 10 hatten und 0,5 Mol
NaCl und 0,02% Tween 80 enthielten. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß der Plasminogen-Aktivator dieser Erfindung
innerhalb des pH-Bereiches von 2 bis 10 stabil war, aber eine Aktivitätsverringerung von 70% trat bei pH 1,0 auf.
Wie im einzelnen beschrieben worden ist, ist der Aktivator dieser Erfindung ein neuer Plasminogen-Aktivator, der von
Urokinase verschieden ist und eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Wiederherstellung eines Gewebes, einschließlich
der Zersetzung von Fibrinablagerungen auf inneren und äußeren Vaskularwänden an einem zerstörten Teil, spielt.
Es ist unnötig zu bemerken, daß der neue Plasminogen-Aktivator gemäß dieser Erfindung von verschiedenen Organen
von Säugetieren isoliert werden kann. Alle Plasminogen-Aktivatoren
müssen als unter den Umfang dieser Erfindung fallend angesehen werden, unabhängig von ihren Herkunftsquellen, so lange sie Eigenschaften besitzen, die für den
Plasminogen-Aktivator dieser Erfindung charakteristisch sind.
In Übereinstimmung mit dem vorstehend beschriebenen Herstellungsverfahren
für den Aktivator, wobei sich die Erfindung auch auf dieses Verfahren bezieht, kann der Gewebe-Aktivator
in einer hoch gereinigten Form isoliert werden. Der Gewebe-Aktivator weist eine hohe spezifische Aktivität
vom 30000 bis 45000-fachen der spezifischen Aktivität einer menschlichen Niere auf, die mit Aceton getrocknet
worden ist.
Das thrombolytische Mittel gemäß dieser Erfindung wird
deutlich verständlich aus den folgenden Beispielen. Es sollte jedoch im Gedächtnis behalten werden, daß der
Plasminogen-Aktivator, der als ein Bestandteil verwendet wird, von normalen Zellen abgeleitet worden ist. Es ist
bekannt, daß ein Plasminogen-Aktivator, der von bösartigen oder malignen Tumorzellen herrührt, thrombolytische
Aktivität besitzt. Es wird jedoch angenommen, daß die Sicherheit eines thrombolytisehen Mittels gemäß dieser
Erfindung bereits aufgrund seines Ursprungs gewährleistet ist, wenn man im Hinblick auf seine Art der Anwendung als
ein Arzneimittel, das Menschen verabreicht werden soll, die verschiedenen potentiellen Risiken bei seiner Verabreichung
über eine lange Zeitdauer oder in hohen Dosierungen in Betracht zieht.
Da der Plasminogen-Aktivator als ein Bestandteil eines
thrombolytisehen Mittels gemäß dieser Erfindung eine spezifische
Affinität, die von derjenigen von Urokinase verschieden ist, aber ähnlich zu derjenigen des normalen
von Blut erhaltenen Plasmlnogen-Aktivators ist, zu Fibrin besitzt, kann das thrombolytische Mittel vollständig zufriedenstellende
Ergebnisse hervorbringen, wenn es für die Behandlung von Thrombose angewendet wird. Zusätzlich
ist das thrombolytische Mittel gemäß dieser Erfindung frei
von solchen Nebenwirkungen wie innerem Bluten und Anaphy-
laxie-Schock. Demzufolge ist das Thrombus auflösende Mittel
gemäß dieser Erfindung ein äußerst wirksames therapeutisches Arzneimittel.
Das thrombolytisehe Mittel dieser Erfindung kann Patienten
mit geeigneten Dosis-Niveaus verabreicht werden und besitzt Wirksamkeit, die von leichten oder gar keinen Nebenwirkungen
und wirksamer thrombolytischer Aktivität begleitet ist. Und zwar kann das thrombolytisehe Mittel gemäß
dieser Erfindung auf genau die gleiche Weise wie üblicherweise verwendete andere Arzneimittel desselben Typs verabreicht
werden. So kann beispielsweise der Plasminogen-Aktivator,
der ein aktiver Bestandteil ist, in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst werden, die 5%
menschliches Serumalbumin enthält, und kann dann durch Injektion verabreicht werden. Hierbei wird es bevorzugt,
jede Dosierung auf 10000 IU (etwa 100 ug), gemessen in Werten von Urokinase, zu begrenzen.
Das thrombolytisehe Mittel gemäß dieser Erfindung kann
eingesetzt werden* um akute und chronische Thrombusocclusionen oder -verschlüsse von verschiedenen Blutversorgungen
eines Organs oder Gebietes zu behandeln, wie sie in Fällen starker Venenthrombose, Lungenembolie, Myokardinfarkt,
Arterienverschluß, extrakorporalem Kreislauf und arteriovenösem Verschluß der Fall ist.
Das thrombolytisehe Mittel gemäß dieser Erfindung wird im
folgenden spezieller durch die folgenden Beispiele beschrieben.
Isolation und Reinigung des Plasminogen-Aktivators, der den
aktiven Bestandteil des thrombolytischen Mittels dieser Erfindung bildet:
Zu 10Og entfettetem Pulver, das von menschlichen Nieren
mit Aceton hergestellt worden war, wurden 500 ml einer 2-Mol-Lösung Ammoniumthiocyanat hinzugegeben, die mit
einem 0,02-Mol Tris-HCl bei pH 7,4 gepuffert worden war.
Die entstandene Mischung wurde bei 4°C 10 Stunden lang gerührt und dann der Zentrifugaltrennung unterworfen
(x 13000 g; 30 Minuten), um sie in einen Extrakt und eine Ausfällung zu trennen.
Der Extrakt wurde mit 1N-HC1 auf pH 3,0 eingestellt, und die entstandene Ausfällung wurde durch Zentrifugaltrennung
gewonnen (x 13000 g; 30 Minuten). Der Niederschlag
oder die Ausfällung wurde dann in 500 ml eines 0,01 Mol Natriuitiphosphatpuffers (Puffer A) gelöst, der 1 Millimol
EDTA, 0,3 Mol NaCl, 10 KIU/ml Aprotinin, 5 Millimol ε-Aminocapronsäure
und 0,01% Tween 80 enthielt. Danach wurden 100 ml Fibrin-Celite zu dem Puffer hinzugegeben,
und die entstandene Mischung wurde bei 4°C 30 Minuten lang gerührt. Die Mischung wurde dann der Zentrifugaltrennung
unterworfen (x 3000 g; 10 Minuten). Der Niederschlag oder die Ausfällung wurde wieder in 100 ml des
Puffers A suspendiert, und die so hergestellte Lösung wurde in eine Säule mit 4x10 cm gegossen. Die Säule
wurde mit 500 ml des Puffers A gewaschen. Danach wurde der Plasminogen-Aktivator mit dem Puffer A eluiert, der
zusätzlich 0,4 Mol Arginin enthielt. Die EIuate wurden
in 10 ml Fraktionen aufgesammelt. Ergebnisse sind in Figur 8 und Tabelle 3 angegeben. Das vorstehende Reinigungsverfahren
lieferte einen hohen Prozentsatz der Rückgewinnung von etwa 30%. Bei dem Reinigungsverfahren wird die
starke Affinität des Plasminogen-Aktivators, der den Bestandteil des thrombolytisehen Mittels dieser Erfindung
bildet, zu Fibrin ausgenutzt.
Reinigungsschritt | Menge des Pro teins (mg) |
Gesamtakti vität (%) |
Extraktion mit Ammoniumthio- cyanat-Lösung |
4500 | 100 |
Ausfällung mit Säure | 2 800 | 62 |
Reinigung mit Fibrin-Celite | 21 | 29 |
Vergleich der thrombolytisehen Aktivität des thrombolytischen
Mittels dieser Erfindung mit Urokinase:
Die thrombolytische Aktivität des Plasminogen-Aktivatorsr
der ein Bestandteil des thrombolytisehen Mittels dieser Erfindung
ist, wurde mit derjenigen von Urokinase nach dem Schleifen- oder Zirkulationsverfahren von Chandler verglichen.
Das Experiment wurde unter Verwendung von menschlichem Blut durchgeführt, das von einem gesunden freiwilligen
Mann entnommen worden war. 5 ml Blut wurden genau aufgesammelt, wozu 0,5 ml einer 3,1% Natriumcitrat-Lösung hinzugegeben
wurden, um Blutkoagulation zu vermeiden. Dann wurden
125
auch 50 ul I-markiertes Fibrinogen hinzugegeben. Nach gutem Durchmischen wurden 1,5 ml große Portionen der Mischung abgenommen und in ein Tygon-Rohr mit einer Länge von 28 cm und einem inneren Durchmesser von 0,36 cm gegeben,
auch 50 ul I-markiertes Fibrinogen hinzugegeben. Nach gutem Durchmischen wurden 1,5 ml große Portionen der Mischung abgenommen und in ein Tygon-Rohr mit einer Länge von 28 cm und einem inneren Durchmesser von 0,36 cm gegeben,
339Ü272
woraufhin eine Zugabe von 20 Millimol Calciumchlorid folgte.
Dann wurden beide Enden des Rohres miteinander verbunden, um eine Schleife zu bilden. Das schleifenförmig
geschlossene Zirkulationsrohr wurde auf einem Drehtisch befestigt, der mit einem Winkel von 23° geneigt war und
sich mit einer Geschwindigkeit von 17 Upm drehte. Nachdem das Blut bei Raumtemperatur (24 bis 25°C) und über 1 bis
24 Stunden Klumpen bilden konnte, wurde das Rohr geöffnet und eine 10 μΐ große Probe abgenommen. Ihre Radioaktivität
wurde dann gemessen. Danach wurde der Plasminogen-Aktivator zu dem Rohr hinzugegeben, und das Rohr wurde
mit seinen beiden Enden verbunden. Es wurde wieder auf dem Drehtisch gedreht. Nach einer vorherbestimmten Zeit
wurde eine 10 ul große Blutprobe herausgenommen und in Bezug auf die Radioaktivität gemessen. Die Aktivität des
genannten Plasminogen-Aktivators wurde ausgedrückt als die
125
Menge an I, die von Blutklumpen freigegeben wurde und
Menge an I, die von Blutklumpen freigegeben wurde und
in der Blutprobe vorhanden war.
125
Das so zugegebene I-Fibrinogen wurde in das Polymer des Klumpens mit einem Wirkungsgrad von etwa 95 bis 98% inkorporiert. Der Grad der Vernetzung nach 1 Stunde war verschieden von dem nach 24 Stunden. Das heißt, daß teilweise vernetzte .(PXL) Klumpen nach 1 Stunde erhalten wurden und total vernetzte (TXL) Klumpen nach 24 Stunden erhalten wurden. Figur 9 zeigt den Zustand der Auflösung eines PXL-Klumpens durch den Plasminogen-Aktivator, der den aktiven Bestandteil des thromboIytischen Mittels dieser Erfindung bildet, oder durch Urokinase. In Figur 9 entspricht die Kurve (a) dem Plasminogen-Aktivator, während die Kurve (b) der Urokinase entspricht. Diese Kurven zeigen, daß der Plasminogen-Aktivator, der den aktiven Bestandteil des thrombolytisehen Mittels dieser Erfindung bildet, eine hoch wirksame Auflösung im Vergleich zur Urokinase bewirkt.
Das so zugegebene I-Fibrinogen wurde in das Polymer des Klumpens mit einem Wirkungsgrad von etwa 95 bis 98% inkorporiert. Der Grad der Vernetzung nach 1 Stunde war verschieden von dem nach 24 Stunden. Das heißt, daß teilweise vernetzte .(PXL) Klumpen nach 1 Stunde erhalten wurden und total vernetzte (TXL) Klumpen nach 24 Stunden erhalten wurden. Figur 9 zeigt den Zustand der Auflösung eines PXL-Klumpens durch den Plasminogen-Aktivator, der den aktiven Bestandteil des thromboIytischen Mittels dieser Erfindung bildet, oder durch Urokinase. In Figur 9 entspricht die Kurve (a) dem Plasminogen-Aktivator, während die Kurve (b) der Urokinase entspricht. Diese Kurven zeigen, daß der Plasminogen-Aktivator, der den aktiven Bestandteil des thrombolytisehen Mittels dieser Erfindung bildet, eine hoch wirksame Auflösung im Vergleich zur Urokinase bewirkt.
J39Ö272
Wenn der Plasminogen-Aktivator, der den aktiven Bestandteil des thrombolytisehen Mittels gemäß dieser Erfindung
bildet, in der gleichen Menge, wie derjenigen, die in dem System der Kurve (a) verwendet wurde, zu dem System der
Kurve (b) nach 10 Stunden hinzugegeben wurde, wurde fast vollständige Auflösung erreicht (vergleiche Figur 9 (c)).
In Figur 9 gibt jeder Punkt den Mittelwert von dreifach durchgeführten Messungen wieder. Wenn die Konzentration
— 9
des Aktivators auf 1 χ 10 Mol eingestellt wurde, löste der Aktivator, der der Bestandteil des thrombolytischen Mittels dieser Erfindung war, die PXL-Klumpen fast vollständig nach 20 Stunden. Im Gegensatz zu dem Plasminogen-Aktivator wurde Urokinase nur zu etwa 40% eluiert. Als der Plasminogen-Aktivator, der den aktiven Bestandteil des thrombolytischen Mittels dieser Erfindung bildete, 10 Stunden später in das obige System hinzugegeben wurde, fand
des Aktivators auf 1 χ 10 Mol eingestellt wurde, löste der Aktivator, der der Bestandteil des thrombolytischen Mittels dieser Erfindung war, die PXL-Klumpen fast vollständig nach 20 Stunden. Im Gegensatz zu dem Plasminogen-Aktivator wurde Urokinase nur zu etwa 40% eluiert. Als der Plasminogen-Aktivator, der den aktiven Bestandteil des thrombolytischen Mittels dieser Erfindung bildete, 10 Stunden später in das obige System hinzugegeben wurde, fand
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fast vollständiges Freisetzen von I statt, wodurch angezeigt wurde, daß der Aktivator eine starke thrombolytische
Aktivität besaß. In einem Experiment, bei dem die TXL-Klumpen verwendet wurden, zeigte Urokinase eine Auflösung von nur 35% selbst 20 Stunden später, aber der
Plasminogen-Aktivator, der einen Bestandteil des thrombolytischen Mittels dieser Erfindung bildet, zeigte eine
Auflösung von 90%. Als Kontrolle wurde ein weiteres Experiment durchgeführt, ohne daß der Plasminogen-Aktivator
überhaupt eingegossen wurde. Es wurde überhaupt kein Frei-
125
setzen von I nachgewiesen. Hierdurch ergibt sich, daß das Auflösen von Blutklumpen von dem Aktivator abhängt.
setzen von I nachgewiesen. Hierdurch ergibt sich, daß das Auflösen von Blutklumpen von dem Aktivator abhängt.
Wirkungen des thrombolytischen Mittels dieser Erfindung auf Thrombose bei verschiedenen Tieren:
Es wurde Blut von verschiedenen Tieren auf eine Weise aufgesammelt,
die ähnlich zu der in Beispiel 6 verwendeten war,
. .. J390272
und eine Stunde lang Klumpen bilden gelassen. Der Plasminogen -Aktivator, der den Bestandteil des thrombolytisehen
Mittels dieser Erfindung bildet, wurde auf die teilweise vernetzten (PXL) Klumpen in den Plasmen der jeweiligen
Tiere einwirken gelassen, um so die thrombolytisehe Aktivität
des Plasminogen-Aktivators zu untersuchen. In jedem Experiment wurde die Konzentration des Plasminogen-Aktivators
auf 20 IU/ml eingestellt, und der Grad der Auflösung
der Klumpen wurde in Werten des von den Klumpen frei-
125
gesetzten I bis zu 10 Stunden vom Beginn der Reaktion
gesetzten I bis zu 10 Stunden vom Beginn der Reaktion
gemessen. In diesem System war der Untergrund im wesentlichen gleich demjenigen, der ohne Zugabe des Plasminogen-Aktivators
erhalten worden war, und es wurden nur 2 bis
125
3% I selbst 10 Stunden später nachgewiesen. Im Gegensatz
dazu wurden etwa 96% der Klumpen im menschlichen System aufgelöst. Figur 10 zeigt die Ergebnisse, die durch
Bewerten des Grades der Auflösung unter Verwendung von Blut vom Menschen und von verschiedenen Tieren erhalten
worden waren. In Figur 10 zeigen die Kurven (a), (b), Cc), (d) und (e) die Ergebnisse, die mit Menschenblut, Affenblut,
Kaninchenblut, Hundeblut und Rattenblut erhalten wurden. Wie in Figur 10 gezeigt ist, variierte der Grad
der Auflösung entsprechend der Art des Tieres. Der Plasminogen-Aktivator
arbeitet gut im Fall von Affen, und zwar ähnlich wie im Fall des Menschen. Die auflösende Wirkung
war schlecht im Fall von Ratten. Dies zeigt, daß das thrombolytisehe Mittel dieser Erfindung ein Enzym ist,
das spezifisch für Mensch und Affe ist.
Claims (5)
- Patentansprüche(1) Die Hauptproteinbande/ die durch die Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gel-Elektrophorese erhalten wird, besitzt ein sich ergebendes oder scheinbares Molekulargewicht von etwa 70000 + 5000;(2) Die Hauptbande, die durch die isoelektrische Punkt-Elektrophorese erhalten wird, besitzt einen pi im Bereich von 7 bis 9;(3) Der Plasminogen-Aktivator besitzt die immunologische Eigenschaft, daß er von Anti-Urokinase IgG-Sepharose Affinitätschromatographie nicht unadsorbiert bleibt, und(4) Der Plasminogen-Aktivator hydrolysiert H-D-VaIy1-L-leucyl-L-lysin-p-nitroaniliddihydrochlorid und H-D-Isoleucyl-L-prolyl-L-argininp-nitroaniliddihydrochlorid, aber er hydrolysiert nicht Boc-L-valyl-L-prolyl-L-arginin-4-methylcumaryl-7-amld, Carbobenzöxy-L-phenylalanyl <^-L-arginin-4-methylcumaryl-y>'7-amid, L-Prolyl-L-phenylalanyl-L-ärginin-4-methylcumaryl-7-amid und Glutaryl-glycyl-L-arginin-4-methylcumaryl-7-amid.+ ) "-L-arginin-4-methylcumaryl-11 fehlt in dem japanischen Text.
- 2. Verfahren zum Herstellen eines Plasminogen-Aktivators mit den folgenden charakteristischen Eigenschaften:(1) Die Hauptproteinbande, die durch die Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gel-Elektrophorese erhalten wird, besitzt ein sich ergebendes oder scheinbares Molekulargewicht von etwa 70000 + 5000;(2) Die Hauptbande, die durch die isoelektrische Punkt-Elektrophorese erhalten wird, besitzt einen pi im Bereich von 7 bis 9;(3) Der Plasminogen-Aktivator besitzt die immunologische Eigenschaft, daß er von Anti-Urokinase IgG-Sepharose Affinitätschromatographie nicht unadsorbiert bleibt, und(4)Der Plasminogen-Aktivator hydrolysiert H-D-VaIy1-L-leucyl-L-lysin-p-nitroaniliddihydrochlorid und H-D-Isoleucyl-L-prolyl-L-argininp-nitroaniliddihydrochlorid, aber er hydrolysiert nicht Boc-L-valyl-L-prolyl-L-arginin-4-methylcumaryl-7-amid, Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginin-4-methylcumary1-7-amid, L-Prolyl-L-phenylalanyl-L-arginin-4-methylcumaryl-7-amid und Glutaryl-glycyl-L-arginin-4-methy1cumary1-7-amid,dadurch gekennzeichnet, daß eine menschliche Niere oder menschliches Blutgefäß einer Extraktion mit einer Ammoniumthiocyanat-Lösung unterworfen wird und dann der entstehende Extrakt durch eine Säule, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Säule, die mit einem Ionenaustauschmaterial beladen ist, einer Metallchelatsäule, einer Säule,-Sf.die mit L-Arginin oder einem Arginin-Derivat,beladen ist, gebunden an einen Träger,/einer Säule, die mitenenHämagglutinin, gebunden an einen Träger, und einer Säule, die mit einem Träger mit Molekularsiebwirkung beladen ist, besteht, oder eine Kombination von Säulen, die aus der vorstehenden Gruppe ausgewählt ist, geleitet wird, um ihn zu reinigen.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2 ,dadurch gekennzeichnet , daß die menschliche Niere der Extraktion mit einer Ammoniumthiocyanat-LÖsung, die mit Tris-HCl gepuffert ist, bei einem pH im Bereich von 7,0 bis 7,4 unterworfen wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß das menschliche Blutgefäß der Extraktionsbehandlung durch Waschen des menschlichen Blutgefäßes mit physiologischer Kochsalzlösung und anschließendem Durchströmen der Ammoniumthiocyanat-Lösung durch das menschliche Blutgefäß unterworfen wird.
- 5. Thrombolytisches Mittel, das als einen aktiven Bestandteil einen Plasminogen-Aktivator mit den folgenden charakteristischen Eigenschaften enthält:(1) Die Hauptproteinbande, die durch die Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gel-Elektrophorese erhalten wird, besitzt ein sich ergebendes oder scheinbares Molekulargewicht von etwa 70000 + 5000;(2) Die Hauptbande, die durch die isoelektrische Punkt-Elektrophorese erhalten wird, besitzt einen pi im Bereich von 7 bis 9;(3) Der Plasminogen-Aktivator besitzt die immunologische Eigenschaft, daß er von Anti-Urokinase IgG-Sepharose Affinitätschromatographie nicht unadsorbiert bleibt, und(4) Der Plasminogen-Aktivator hydrolysiert H-D-VaIy1-L-leucyl-L-Iysin-p-nitroaniliddihydrochlorid und H-D-Isoleucyl-L-prolyl-L-arginin p-nltroaniliddihydrochlorid, aber er hydrolysiert nicht Boc-L-valyl-L-prolyl-L-arginin-4-methylcumary1-7-amid, Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginin-4Tmethylcumaryl-7-amid, L-Prolyl-L-phenylalanyl-L-arginin-4-methylcumaryl-7-amid und Glutaryl-glycyl-L-arginin-4-methylcumaryl-7-amid.Thrombolytisches Mittel nach Anspruch 5 , dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen-Aktivator von normalen diploiden Zellen abgeleitet worden ist.Thrombolytisches Mittel nach Anspruch 5 , dadurch gekenn ze i chnet , daß es für die Behandlung von akuten oder chronischen Verschlüssen (Okklusionen) einer Arterie oder Vene durch Thrombus brauchbar ist.
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