NL8320346A

NL8320346A - Nieuwe plasminogeen-activator, werkwijze voor de bereiding daarvan, en thrombolytisch middel dat dit bevat.

Info

Publication number: NL8320346A
Application number: NL8320346A
Authority: NL
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date: 1982-10-29
Filing date: 1983-10-27
Publication date: 1984-09-03
Also published as: SE8403375L; NO842468L; NO166314B; CH660742A5; WO1984001714A1; GB2138824B; GB2138824A; EP0124613A4; FI80597C; NL191755C; IT8323533A0; CA1221029A; IT1169910B; DE3390272T1; DE3390272C2; EP0124613B1; FI842627A; FI842627A0; NL191755B; DK307384A

Description

8320346

- 1 -V

Reg.No. 121.125/jKr/JvdB

Nieuwe plasminogeen-activator, werkwijze voor de bereiding daarvan, en thrombolytisch middel dat dit bevat.

Deze uitvinding betreft een nieuwe plasminogeen-activator uit menselijk weefsel, bijvoorbeeld uit menselijke nieren of bloedvaten, een werkwijze voor de bereiding daarvan, en een thrombolytisch middel dat dit als actieve 5 stof bevat.

Plasminogeen-activatoren kunnen al naar hun herkomst onderscheiden worden in weefsel-activatoren, bloedvat-activatoren, bloed-activatoren, urokinase, en dergelijke. Plasminogeen-activatoren spelen een belangrijke rol 10 bij de fibrinolyse (het oplossen van fibrine) en worden in uiteenlopende zoogdier-organen gevonden. Aan de andere kant is recent veel moeite gedaan om plasminogeen-activatoren uit gekweekte cellen te verkrijgen. Bij dat werk werden als ge-kweektecellen bijvoorbeeld cellen van kwaadaardige gezwellen, 15 van bloedvat-endothelium, van met follikel-stimulerend hor moon gestimuleerde cellen met zetmeel-korrels, en dergelijke gebruikt. Ook zijn biochemische en immunologische eigenschappen van uit weefselhomogenaten, gekweekte cellen en kweekmedia geïsoleerde plasminogeen-activatoren beschreven.

20 Maar de zuivering van plasminogeen-activa tor uit menselijk weefsel is zelden uitgevoerd. Dit schijnt hieraan toe te schrijven te zijn dat het zo moeilijk is voldoende uitgangsmateriaal te krijgen, en daarnaast aan de hydrofobe eigenschappen van de enzymen in het uitgangsmateriaal en 25 de instabiliteit van dergelijke enzymen in buffer, en in sommige gevallen het voorkomen van een onbekend protease tijdens de zuivering. Onder die omstandigheden isoleerden Rijken c.s. uit menselijke uterus een plasminogeen-activator met een molecuulgewicht van 69.000, en ze bevestigden dat de activa-30 tor zowel immunologisch als biochemisch met menselijke bloed-vat-plasminogeen-activator overeenkomt. Bovendien is ook een 8320346 - 2 - andere menselijke bloedvat-plasminogeen-activator met een ander molecuulgewicht dan de eerder genoemde geïsoleerd en geïdentificeerd.

Kwaan c.s. voerden een onderzoek uit op 5 een plasminogeen-activator uit menselijk nierweefsel en ontdekten dat de activator in hoofdzaak in het endothelium van de bloedvaten zit, vooral in het endothelium van aderen (Fed. Proc. 24_, (1965) 387). Ook is door Kucinski c.s. in J. Clin. Invest. 4^7 (1968) 1238-1253, door Bernik c.s. in J. Clin.

10 Invest. 48^ (1969) 1740-1753, door Barlow c.s. in Thromb. Res. ^ (1972) 201-208, door Rsted c.s. in Experientia 3_3_ (1978) 589-590 en door Lewis in Thromb. Haemostas. 42_ (1979) 895-890 vermeld dat zo'n plasminogeen-activator verkregen uit kweken van menselijk nierweefsel immunologisch en fysicochemisch 15 identiek is met urokinase.

Urokinase, dat een uit urine of gekweekte niercellen geïsoleerde plasminogeen-activator is, en streptokinase, dat een uit streptokokken verkregen plasminogeen-activator is, worden tegenwoordig als thrombolytische midde-20 len voor het behandelen van thrombose gebruikt. Maar zowel urokinase als streptokinase zijn verschillend van de normale plasminogeen-activator die men uit bloed krijgt. Deze plas-minogeen-activatoren hebben geen specifieke affiniteit voor fibrine. Daardoor zijn de resultaten verkregen bij het ge-25 bruik van urokinase en streptokinase bij de behandeling van thrombose niet in alle aspecten volledig bevredigend. Om de gewenste effecten te bereiken is het nodig er betrekkelijk grote hoeveelheden van toe te dienen. Maar massale toediening brengt gevaarlijke bijwerkingen zoals het in oplossing gaan 30 van fibrinogeen en interne bloedingen met zich mee. Er is dus een sterke vraag naar de ontwikkeling van een geneesmiddel dat op betrekkelijk grote schaal bereid kan worden, betrekkelijk weinig bijwerkingen heeft en een hoog thrombus-oplossend vermogen vertoont.

35 Ten gevolge van intensief speurwerk op B 3 ? 0 3 k £ _> — · · ·" : - - 3 - de weefsel-plasminogeen-activator die uit menselijke nieren en menselijke bloedvate geïsoleerd en gezuiverd is hebben de uitvinders dezes verrassenderwijs een plasminogeen-activator gevonden met eigenschappen die aanzienlijk verschillen van die 5 van het urokinase uit menselijke nieren of menselijke bloedvaten, hoewel men geloofde dat urokinase de voornaamste uit menselijke nieren en menselijke bloedvaten beschikbare plasminogeen-activator is. Bij verder onderzoek naar de diverse aspecten van deze plasminogeen-activator bleek ook dat hij 10 een sterk thrombus-oplossend vermogen vertoont, waarmee de uitvinding voltooid was.

Een doel van deze uitvinding is een nieuwe plasminogeen-activator te verschaffen. Een ander doel van deze uitvinding is een nieuwe werkwijze voor het bereiden van de 15 nieuwe plasminogeen-activator te verschaffen. Nog een ander doel van deze uitvinding is een nieuw thronibolytisch middel te verschaffen met een sterke thrombolytische werking.

De plasminogeen-activator, die een bestanddeel van het thrombolytische middel volgens deze uitvinding is, 20 heeft de volgende kenmerkende eigenschappen: (1) Het voornaamste eiwitband die men bij elektroforese over een natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide-gel ziet heeft een molecuulgewicht van ongeveer 70.000 ± 5000, (2) De voornaamste band bij isoëlektrisch punt-elektroforese 25 heeft een pi tussen 7 en 9; (3) De plasminogeen-activator heeft de immunologische eigenschap niet geadsorbeerd te worden bij affiniteitschromatogra-fie over anti-urokinase-igG-Sepharose, en (4) De plasminogeen-activator hydrolyseert 30 H-D-valyl-L-leucyl-L-lysine-p-nitroanilide (dihydrochloride) en H-D-isoleucyl-L-propyl-L-arginine-p-nitroanilide-(dihydrochloride) , maar hydrolyseert Boc-L-valyl-L-prolyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide, carbpbenzoxy-L-fenylalanyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide, L-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginine-4-35 methylcoumaryl-7-amide en glutaryl-glycyl-L-arginine-4- 8320346 - 4 - methylcoumaryl-7-amide niet.

De bovengenoemde plasminogeen-activator kan bij voorkeur de volgende eigenschappen vertonen: (1) men kan het met een 1-2 M NH^SCN-oplossing (pH = 7,4) 5 uit weefsels of bloedvaten extraheren en in aanwezigheid van 0,1 % Tween 80 e.d. zuiveren, (2) het wordt praktisch in zijn geheel geadsorbeerd aan een fibrine-Sepharose-kolom en met een 2 M NH^SCN-oplossing geëlueerd, en 10 (3) het is bij bewaren op 4°C in een buffer met pH = 7,4 zelfs 2 weken stabiel.

De nieuwe plasminogeen-activator volgens deze uitvinding wordt bereid door bloedstolsels, bindweefsel, lipiden e.d. op in de techniek bekende wijze uit een menselijke 15 nier te verwijderen en het overblijvende nierweefsel te extraheren met een buffer of een NH^SCN-oplossing door een bloedvat te laten lopen zodat dit vat geëxtraheerd wordt, en het aldus verkregen extract te leiden door een kolom ionenuit-wisselend materiaal, een kolom metaal-chelaat, een met 20 L-arginine of aan een drager gebonden arginine-derivaat beladen kolom of een kolom hemagglutinine-aan-drager of een combinatie van kolommen uit deze groep, opdat het gezuiverd wordt.

De nieuwe plasminogeen-activator volgens deze uitvinding is in staat de immunologische beperkingen van 25 urokinase, dat reeds als geneesmiddel met thrombus-oplossend vermogen ontwikkeld is, te overwinnen, en dus kan het gebruikt worden als werkzaam bestanddeel van een thrombolytisch middel met sterke thrombolytische werking.

In de tekeningen is 30 figuur 1 een chromatogram van een plasminogeen-activator over een kolom zinkchelaat/Sepharose, gerealiseerd in voorbeeld 1 (3) , figuur 2 een chromatogram van een plasminogeen-activator over een kolom concanavaline A/Sepharose, gerealiseerd in voor-35 beeld 1(4), 8320346 Λ - 5 - figuur 3 een chromatogram van een plasminogeen-activator over een kolom CM-Sepharose gerealiseerd in voorbeeld 1(5), figuur 4 het resultaat van een gelfiltratie van een plasminogeen-activator over Sephacryl S-200, gerealiseerd in voor 5 beeld 1(6), figuur 5 het resultaat van gelelektroforese van een volgens de uitvinding uit nieren geïsoleerde plasminogeen-activator over SDS-polyacrylamide. De letters A, B, C en D geven respectievelijk aan de uit de nieren geëxtraheerde en daarna 10 gezuiverde activator, een uit bloedvatwanden geëxtraheerde en daarna gezuiverde activator, een door gekweekte, normale menselijke diploïde cellen uitgescheiden activator, en een in de handel verkrijgbaar monster urokinase.

Laat figuur 6 de resultaten van het identificeren van plasmi-15 nogeen-activatoren volgens de uitvinding zien die vooraf elektroforese over SDS-polyacrylamide ondergaan hadden. De letters A en B komen overeen met de volgens voorbeeld 1(6) verkregen gezuiverde plasminogeen-activator terwijl letters C en D overeenkomen met het in voorbeeld 1(3) verkregen ruwe 20 extract. Een polyacrylamidegel werd gebruikt voor het verkrijgen van plasminogeen-activatoren A en C en een fibrine-agarosegel voor het verkrijgen van activatoren B en D.

Laat figuur 7 affiniteitschromatogrammen van urokinase en uit nieren afkomstige plasminogeen-activator volgens de uit-25 vinding zien, beide over kolommen van anti-urokinase-IgG-Sepharose,

Laat figuur 8 elutiegrafieken zien verkregen bij het elueren van een plasminogeen-activator en van een thrombolytisch middel volgens deze uitvinding, op de wijze beschreven in 30 voorbeeld 5,

Is figuur 9 een diagram waarin de thrombolytische werking van een thrombolytisch middel volgens deze uitvinding vergeleken wordt met die van urokinase. Lijn (a) betreft het thrombolytische middel volgens de uitvinding, lijn (b) be-35 treft urokinase en lijn (c) betreft urokinase waaraan 10 uur 8320346 * - 6 - later het thrombolytische middel volgens deze uitvinding toegevoegd was,

Laat figuur 10 schematisch de thrombolytische werkingen van een thrombolytisch middel volgens deze uitvinding op de 5 thrombose van mens en diverse diersoorten zien. Lijnen (a), (b), (c), (d) en (e) betreffen respectievelijk mens, aap, konijn, hond en rat.

De werkwijze volgens deze uitvinding en de eigenschappen van de nieuwe daarmee verkregen activator 10 zullen nu in detail beschreven worden. Tenzij anders aangegeven gebeurden alle bewerkingen bij 4°C.

Voorbeeld 1

Zuivering van uit de nier verkregen plas- minogeen-activator 15 (1) Extractie_van_de plasminogeen-activator_:

Nadat uit een menselijke nier, die vrij van infectiesymptomen was en bij -70°C bewaard was gestold bloed, bindweefsel en lipiden verwijderd waren werd bij 45°C aceton toegevoegd en werd de nier in een homogenisator goed 20 vermalen. De suspensie werd 30 minuten op -15°C geroerd en daarna liet men hem bij -20°C staan. Wat naar boven kwam drijven werd door afschenken verwijderd en het ontvetten werd met aceton van -15°C herhaald. De verkregen suspensie werd toen gefiltreerd. De filterkoek werd met aceton van -20°C gewassen 25 en dan gedroogd. Daarna werd 100 g van het aldus ontvette poeder in 1 liter 1 M NH^SCN-oplossing gesuspendeerd, die met 0,02 M tris-HCl op pH 7,0-7,4 gebufferd was. De verkregen suspensie werd geroerd en door centrifugeren gescheiden in een extract en een neerslag. Dit neerslag werd weer met 30 1 liter van dezelfde 1 M NH^SCN-oplossing uitgetrokken. De extracten werden gecombineerd.

(2) Chromatografie_over DEAE-Sepharose

Het bij (1) verkregen ruwe extract werd 35 met een zelfde hoeveelheid 0,02 M tris-HCl-oplossing met pH

8320346 4 - 7 - 7,0-7,4 verdund. Dit mengsel ging door een kolom DEAE-Sepharose die in evenwicht gebracht was met een 0,02 % oplossing van een niet-ionogene oppervlak-actieve stof, te weten met Tween 80in esn oplossing van 0,02 M tris-HCl en 0,25 M NH^SCN. Wat uit de 5 kolom kwam werd gecombineerd en hieraan werd NaCl toegevoegd tot een eindconcentratie van 1,0 M. De pH werd met 1 N HCl op 7,4 ingesteld.

(3) Chromatografie over een kolom zinkchelaat/Sepharose 10 Het bij (2) verkregen effluent werd geleid door een kolom zinkchelaat/Sepharose die in evenwicht gebracht was met een 0,002 M tris-HCl-oplossing met pH 7,0 welke 1,0 M NaCl, 0,25 M NH^SCN en 0,02 M Tween 80 bevatte. Na het uitwassen van de kolom met deze evenwichtoplossing werd geëlu-15 eerd tot de eiwit-concentratie in het eluaat beneden 0,01 mg/ml gebracht was. Daarna werd de kolom verder uitgewassen met een buffer met dezelfde samenstelling behalve dat hij geen NH^SCN en 0,15 M NaCl bevatte. Daarna werd de kolom gewassen met een 0,05 M imidazool-oplossing, waarbij de weefselactivator ge-20 elueerd werd. Het profiel van dit chromatogram ziet men in figuur 1.

(4) Chromatografie over een kolom concanavaline A/Sepharose

Fracties van de weefselactivator die zoals beschreven onder (3) verkregen waren werden door een kolom 25 concanavaline A/Sepharose geleid. De kolom was eerst in evenwicht gebracht met een 0,02 M tris-HCl-oplossing met pH 7,4 die 0,15 M NaCl en 0,02 % Tween 80 bevatte. De kolom werd herhaaldelijk uitgewassen met de evenwichtsoplossing totdat de eiwit-concentratie in het eluaat de basislijn bereikte, 30 daarna werd de weefselactivator geëlueerd met een evenwichtsoplossing die ook 0,5 M a-D-methylmannoside bevatte. Fracties die de activator bevatten werden gecombineerd en de pH van die oplossing werd met azijnzuur op 4,5 ingesteld. Het profiel van het nu verkregen chromatogram ziet men in figuur 2.

35 Rijken c.s. vermelden dat elutie met een lineaire gradiënt 0320348 - 8 -4t aan α-D-methylmannoside (van O tot 0,6 M) doeltreffend is bij het isoleren van een plasminogeen-activator uit menselijk uterusweefsel (Biochim. Biophys. Acta 580 (1979) 140-153).

Toen de lineaire gradiënt-elutie met α-D-methylmannoside toe-5 gepast werd was het elutieprofiel van de activator in overeenstemming met dat van het eiwit. Bijna alle elutiepunten van de plasminogeen-activator waren nabij de elutiepunten van de 0,35 M α-D-methylmannoside-oplossing en dus iets hoger dan vermeld door Rijken c.s.

10 (5) Chromatografie over CM-Sepharose_

De aldus onder (4) verkregen activator bevattende fracties werden door een kolom CM-Sepharose geleid. De kolom was vooraf in evenwicht gebracht met een 0,02 M azijnzuur-buffer met pH 4,5 die 0,15 M NaCl en 0,02 % Tween 15 80 bevatte.

Na uitwassen van de kolom met de even-wichtsoplossing werd de kolom met dezelfde oplossing ontwikkeld, behalve dat de NaCl-concentratie daarvan lineair verhoogd werd van 0,15 M tot 1,0 M. De weefselactivator werd in 20 de buurt van 0,45 M NaCl geëlueerd. Het elutieprofiel ziet men in figuur 3. De weefselactivator werd uit de evenwichtsoplos-sing aan de kolom CM-Sepharose geadsorbeerd en men liet ongeveer 50-60 % van het opgebrachte eiwit door de kolom gaan.

De weefselactivator werd geëlueerd bij een NaCl-concentratie 25 van 0,45 M. Dit komt overeen met ongeveer 40 % van het ingezette eiwit. De specifieke activiteit werd met een factor van ongeveer 2,4 verhoogd. Fracties die de activator bevatten werden gecombineerd en ondergingen samen ultrafiltratie door een Diaflo membraan PM 10 (van de firma Amicon) waardoor ze 30 geconcentreerd werden. De uitwisseling van het monster activator met buffer gebeurde op een kolom Sephadex G-25 (van de firma Pharmacia AB). Die kolom was vooraf in evenwicht gebracht met een 0,02 M tris-HCl-oplossing met pH 7,4 die 1,0 Μ NH.SCN bevatte. De kolom werd ontwikkeld met een buf-4 35 fer die identiek was aan de evenwichtsoplossing. Fracties die 8320346 4 - 9 - het aldus geëlueerde eiwit bevatten werden gecombineerd en ondergingen ultrafiltratie door een Diaflo membraan PM 10 waardoor ze geconcentreerd werden.

(6) Gelfiltratie over Sephacryl S-200_ 5 Een geconcentreerd monster van de weef- selactivator werd door een kolom Sephacryl S-200 (produkt van de firma Pharmacia AB) die vooraf in evenwicht gebracht was met een 0,02 M tris-HCl-oplossing met pH 7,4 die 1,0 M NH^SCN bevatte.

10 Fracties die de weefselactivator bevatten werden bij -70°C bewaard. Het elutieprofiel ziet men in figuur 4.

Voorbeeld 2

Zuivering van uit bloedvaten verkregen 15 plasminogeen-activator

Nadat een been-bloedvat met gebufferde fysiologische zout-oplossing (pH 7,4) uitgewassen was werd de plasminogeen-activator met een 1 M NH^SCN-oplossing uit de vaatwanden geëxtraheerd. Na uitzouten van het extract met 20 50 % ammoniumsulfaat-oplossing werd deze oplossing over een kolom arginine-Sepharose gechromatografeerd. De plasminogeen-activator vertoonde een sterke affiniteit voor het arginine-Sepharose en werd met een 0,5 M arginine-oplossing geëlueerd. De specifieke activiteit werd op die wijze ongeveer met een 25 factor 6 verhoogd.

Gebruikmakende van de hydrofobe aard van de plasminogeen-activator onderging het eluaat nu chromato-grafie over fenyl-Sepharose. De aldus geadsorbeerde plasmino-geenactivator werd met 50 % ethaandiol-oplossing of met 30 1 % oplossing van een niet-ionogene oppervlak-actieve stof (namelijk Triton X-100) geëlueerd. De specifieke activiteit van de plasminogeen-activator werd op die wijze ongeveer 8 maal verhoogd.

Het meeste eiwit was bij de gelchromato-35 grafie over Sephacryl S-200 eerder geëlueerd. De plasminogeen- 1320346 - 10 -«c activator werd geëlueerd met de fracties die overeenkomen met een molecuulgewicht van ongeveer 70.000. In dit stadium was de specifieke activiteit met een factor van ongeveer 2,2 verhoogd.

5 Tenslotte onderging de plasminogeen- activator chromatografie over fibrine-Sepharose. De plasmino-geen-activator uit menselijke bloedvaten vertoonde een sterke affiniteit voor het fibrine-Sepharose en de specifieke werking werd op die wijze met een factor van ongeveer 1,3 verhoogd.

10 De specifieke activiteit, mate van zuive ring en rendement na elk der diverse trappen staan in tabel 1.

r-» /ΤΛ : γ :J ".

&. 'v' ’ - W

- 11 - Λ 4-1

G

CD O CM 10 CO 04 CO

β o\° o o σ o ^ o

CD --- T-H .—I

Ό

• G

c o) O) tó 4-1 s>

'O

CD

0-------

i—I

Λ 4-1

r4 I

3 cn tn

M G

0 -H

4-1 U v-( 10 IQ O

(Ö CD Ti O' Ol σϊ O

> > cO a lti io -r4 -H fd · · · 4-> G £ o c~~ o

ü NO «H

Cd

G

0)________

CD

O

G

H CD 4-> -—

S Μ Ή O

cn CD CD B ^ <H (ö t4 4-> \ * i—1 44 -H W O O oooo

Hft -Η > H O OOOO

CD I U'H ^ O O O 'ï ,q .-i (D 4-i M ....

ro cd a υ o cMcricMr'

E-IW W (β ^ ^H^LD

44 CD CD

> _______

G

fti 4-1

> -H

CD O O OOOO

O 4-1— O O OOOO

G dl Ή W Ol ^fCOOO

r4 i—I C> H * · ....

M (d -H 0144 04 CO "H CO

cü 4J 4-) W Γ' r» Γ'^ροο > O ü o r4 E-1 fO '—" G-------

IS] CD

cn cd o cn

4-1 ^4 CD O O

cd cd cn o M

D «1 £ Om rö ai 44 a i4 i & a b h cd cd co a

Cd G CO 43 CD

h G cn i a η ω

4-1 CD CD B CD CD >, I

cn t4 4->GGwwcü

tr> cn g -ri -H i o G

G G O G G H cd ·Η

-Η a N O ·Η j* 43 G

>4 !4 -P S O G a Λ CD CD ·Η B S4 CD CD -Η > a o <d c a ω a

•H

G · ....

N t-4 on o in io 8320346 - 12 -ê

De specifieke activiteit van de uiteindelijke plasminogeen-activator was ongeveer 45.000-80.000 IE per mg eiwit en het rendement varieerde van ongeveer 20 % tot 40 %.

5 Het schijnbare molecuulgewicht van de gezuiverde bloedvat-plasminogeen-activator was ongeveer 70.000 (gemeten door gelelektroforese over SDS-polyacrylamide) . De eiwit-band reageerde positief op kleuren met PAS en men gelooft dat de plasminogeen-activator in wezen een 10 glycoproteïne met één enkele keten is. Na gelelektroforese over SDS werd het gel in plakjes gesneden om de verdeling van de werking van de plasminogeen-activator te onderzoeken. Hierbij werd gevonden dat de werkzaamheid van de plasminogeen-activator geheel overeenkwam met de eiwit-band.

15 Het isoëlektrische punt (pi) van de hoofd band van de bloedvat-plasminogeen-activator volgens deze uitvinding was 7,8.

Met anti-urokinase IgG werd de antigene werking van de plasminogeen-activator volgens de uitvinding 20 vergeleken met die van urokinase. De werking van de bloedvat-plasminogeen-activator werd helemaal niet geremd door het anti-urokinase IgG en vertoonde geen affiniteit voor anti-urokinase-IgG-Sepharose.

Met behulp van de gezuiverde bloedvat-25 plasminogeen-activator werd een antigeen daartegen verkregen dat de werking van deze activator remde maar de werking van urokinase niet remde. Met deze antistof tegen bloedvat-plasminogeen-activator en serum tegen urokinase werden de antigene werkingen van beide activatoren met de techniek van 30 dubbele immunodiffusie bestudeerd. Het bleek dat zowel urokinase als bloedvat-plasminogeen-activator ieder voor zich met een anti-serum één enkel neerslag gaven. Er werd geen versmelting van de neerslagkrommen waargenomen.

Uit het bovenstaande begrijpt men dat 35 de bloedvat-plasminogeen-activator volgens deze uitvinding 8320346 - 13 - 4 immunologisch van urokinase verschilt.

Toen het IgG tegen bloedvat-plasminogeen-activator bij een fibrinolyse-autografie volgens Todd toegevoegd werd aan een f ibrine-membraan werd de werking van de 5 plasminogeen-activator, waargenomen in de vegetatieve bloedvaten van binnen- en buitenmembranen van een ader, onderdrukt. De onderdrukking van de werking van de bloedvat-plasminogeen-activator werd met uiteenlopende remstoffen onderzocht. Remmingen van 98 % en 20 % werden waargenomen met respectieve-10 lijk 5 mM diïsopropylfluorfosfaat en 0,1 M L-arginine. Geen veranderingen zag men met Trasylol (50 KIE/ml), joodaceet-amide (10 mM) en trypsine-remmer uit sojabonen (50 ^ïg/ml).

Dat betekent dat de bloedvat-plasminogeen-activator volgens deze uitvinding evenals urokinase tot de serine-proteasen 15 behoort.

Voorbeeld 3

Onderzoek van de weefsel-plasminogeen-activator en uitkomsten.

(1) Tenzij uitdrukkelijk anders aangegeven 20 werd elke plasminogeen-activator onderzocht met de in Immuno-chemistry 9^ (1972) 709-723 beschreven fibrine-agarplaat-methode. De fibrinolytische werking van de weefselactivator werd vergeleken met die van urokinase en uitgedrukt in termen van internationale eenheden (UKIE). De standaardkrommen 25 die de werking van serieverdunningen van zowel plasminogeen- activator volgens deze uitvinding en van urokinase lieten zien waren recht in het traject van 70-240 mm2 lysis. Maar de gradiënt van de standaardcurve van de weefsel-activator was niet helemaal in overeenstemming met die van het urokinase.

30 De werking van de weefsel-activator werd bepaald door bij verdunde monsters de lysis-gebieden binnen het traject van 120-200 mm2 op te meten. Met 10 ^il of 1 iE/ml urokinase was de lysis 156 mm2 . De reproduceerbaarheid van de fibrine-agarplaat-methode was ca 6 %. De enzymatische werking van de 35 weefselactivator werd gestandaardiseerd tegen de enzymatische 8320346 . - 14 - werking van het urokinase en na elk der diverse zuiverings- stappen werden het percentage dat van de weefsel-activator teruggewonnen was en zijn werking in UKIE/ml gemeten.

Het niet-specifieke fibrine-oplossende 5 vermogen werd gemeten op een fibrine-agarplaat die vrij van elk plasminogeen was.

In sommige gevallen gebeurde de meting 125 op de methode met J fibrine-monomeer dat in een schijf cellulosenitraat ("Selectgun" Type-BA, porie-diameter 0,2 ^im) 10 ingesloten zit / Progress in Chemical Fibrinolysis and

Thrombolysis, deel 3, (1978) 539-546, Raven Press, New York_/. Fibrinogeen dat geen menselijk plasminogeen bevatte werd uitgestraald met de door Hawker c.s. voorgestelde methode (J. Clin. Pathol. 29^ (1976) 495-501) . De specifieke werking 15 van het gemerkte substraat was 0,018 mCi/mg fibrinogeen.

Een monster mengsel werd bij 37°C geïncubeerd en na 1 uur en na 7 uur werden monsters van 50 ul getrokken. Vrijgekomen 125 J werd met een automatische γ-teller gemeten. De werking van beide verdunningen van weefsel-activator en urokinase 125 20 werden uitgedrukt als procent vrijgekomen J ten opzichte 125 van de totale radioactiviteit, door er het vrijgekomen J van af te trekken.

(2) Affiniteitschromatografie over een kolom anti-urokinase-IgG-Sepharose 25 Het antiserum tegen kinase werd verkregen uit een geit die geïmmuniseerd was door een subcutane toediening van 1 mg zeer zuiver menselijk urokinase (MG 33.000, specifieke activiteit 202.400 IE/mg). Dit urokinase was uit hetzelfde monster als het bovengenoemde voor de gelelektro-30 forese over SDS-polyacrylamide.

Het serum tegen urokinase vertoonde bij dubbele immunodiffusie-analyse slechts één precipitatielijn. IgG-fracties van geitenserum tegen urokinase en van serum uit een niet geïmmuniseerde geit werden bereid door neerslaan 35 uit een verzadigde 33 % ammoniumsulfaat-oplossing. Ze werden 8320346 - 15 - verder gezuiverd door chromatografie over DEAE-Sepharose.

Het anti-urokinase-IgG (50 jig/ml) remde bij toevoegen aan een fibrine-plaat de werking van een handelsmonster urokinase dat als antigeen gebruikt was (5000 IE/ml) 5 volledig. Deze monsters IgG (20 mg/ml) gaven enkelvoudige precipitatie-lijnen toen de immunoëlektroforese toegepast werd op antiserum uit geit en konijn.

Van het anti-urokinase of het normale IgG-monster werd 50 mg gekoppeld aan 15 ml met broomcyaan 10 geactiveerde Sepharose CL-4B, op de wijze beschreven door

Cuatrecasas in j. Biol. Chem. 245 (1970) 3059-3065. Het gel werd uitgewassen met ten minste 20 vol.dln 0,02 M tris-HCl-oplossing met pH = 7,4 die 1,0 M NaCl bevatte. Chromatogram-men van weefsel-activator en urokinase zijn in figuur 7 afge-15 beeld.

(3) Adsorptie van de weefsel-activator en urokinase aan fibrine-Sepharose. _ _______

Met de bovengenoemde methode van Cuatrecasas werd 200 mg fibrinogeen vrij van menselijk plasmi-20 nogeen bij pH 8,3 aan 20 g met broomcyaan geactiveerde

Sepharose Q1-4B gekoppeld. Het aldus aangehechte fibrinogeen werd toen geactiveerd door toevoeging van thrombine (1 Eenheid/ ml) met de methode voorgesteld door Reeme c.s. (Thromb. Res. 2^ (1973) 137-143). Daarna werd het uitgewassen met een 0,02 M 25 tris-HCl-oplossing met pH 7,4 die 0,15 M NaCl, 0,1 % Triton X-100 en 1 ^imol Aprotinine (produkt van de firma Bayer AG) bevatte. Het gel werd in een kolom gebracht en uitgewassen met 2 M NH^SCN in een buffer, en vervolgens werd een monster urokinase of een monster weefsel-activator (verkregen bij 30 stap (6) van voorbeeld 1) in een buffer op de kolom gebracht.

Na uitwassen van de kolom werd hij met 2 M NH^SCN-oplossing geëlueerd. De werking van de plasminogeen-activator werd gemeten volgens de methode waarbij men de concentratie aan eiwit in het eluaat en een chromogeen substraat S-2288 toepast. 35 p 3 ?. P ;m b - 16 - (4) Andere methoden

De kwantitatieve eiwit-bepalingen gebeurden met de methode van Lowry c.s., met runder-serumalbumine als standaard (J. Biol. Chem. 193 (1951) 265-275). In Tween 5 80 tot oplossing gebrachte eiwitten werden kwantitatief be paald met methode van Shiu c.s. (J. Biol. Chem. 249 (1974) 7902-7911) , nadat het neerslag door centrifugeren verwijderd was. In sommige gevallen werd een nauwkeuriger methode met behulp van fluorescamine toegepast (Arch. Biochem. Biophys.

10 155 (1973) 213-220). Bij chromatografie over Sephacryl S-200 verkregen eluaten werden doorgemeten met een LKB Uviicord II detector en recorder, welke detector aangesloten was op een Hitachi Spectrofotometer Model 200-200.

De gelelektroforse over SDS-polyacryl-15 amide werd uitgevoerd op de wijze voorgesteld door Weber c.s. (J. Biol. Chem. 244 (1972) 4406-4412). Elk eiwitmonster werd bij kamertemperatuur 30 minuten in een 1,0% SDS-oplos-sing geïncubeerd en onderging dan elektroforese over een 5 % polyacrylamide-gel. In sommige gevallen werden de eiwitten 20 met een 1 % 2-mercaptoëthanol-oplossing gereduceerd. In het gel werd eiwit aangekleurd met Brilliant-blauw van Coomassie en het glycoproteine met het perjoodzuur-reagens van Schiff. Als men de activiteit van de plasminogeen-activator wilde meten gebeurde de elektroforese over SDS-polyacrylamide vol-25 gens het slabgel-systeem over een 5 % polyacrylamide-gel.

Na de elektroforese werd het slabgel 2 uur bij kamertemperatuur uitgewassen met 0,01 M fosfaat-buffer met pH 7,4 die 0,5 M NaCl en 2 % Tween 80 bevatte. Het gel werd dan afwisselend met plakken 1 % agarose-gel dat 0,2 % menselijk 30 fibrinogeen ('of rijk aan 'of vrij van plasminogeen) en 0,5 eenheid thrombine bevatte. Het geheel werd dan 1-7 uur in een kamer van 37°C en constante vochtigheid geïncubeerd en agarose en polyacrylamide werden daarna met Coomassie‘s Brilliant-Blauw gekleurd. Het schijnbare molecuulgewicht van 35 het eiwit werd gemeten door zijn beweeglijkheid te verge- 8320346 v - 17 - lijken met die van een standaard eiwit, zulks volgens de bovengenoemde methode van Weber c.s.

Het meten van het isoëlektrische punt van de aldus gezuiverde weefsel-activator gebeurde in een 7,5 % 5 polyacrylamide-gel dat 8 M ureum en 1 % amfolyt bevatte, volgens de methode van Mertz c.s. (Biochem. Biophys. Res. Commun.

49 (1972) 84-91). Het monster werd tot oplossing gebracht in een 8 M ureumoplossing die 2 mM EDTA en 1 % amfolyt bevatte.

De pH werd gemeten met de methode van Finlayson c.s. (Anal.

10 Biochem. 40 (1971) 292-311).

De aldus gezuiverde weefsel-activator werd met diverse fluorescerende substraten beproefd door 50 ^il monster weefsel-activator in 0,02 M tris-HCl-oplossing met pH 8,0 die 0,1 M NaCl en 0,02 % Tween 80 bevatte toe te 15 voegen aan 2,0 ml substraat in dezelfde buffer. De volgende materialen werden als fluorescerende substraten gebruikt:

Boc-L-Valyl-L-prolyl-L - arginine-4-methylcoumaryl-7-amide Carbobenzoxy-L-fenylalanyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide, 20 L-Prolyl-L-fenylalanyl-L-arginine-4-methylcoumaryl- 7-amide, en

Glutaryl-glycyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide.

Het beginnende vrijkomen van 7-amino-4-methylcoumarine (AMC) werd fluorimetrisch bij 37°C gemeten 25 in een Shimadzu Fluorspectrofotometer Model RF-520. De fluorimeter was zodanig ingesteld dat met een straling van 380 nm fluorescentie van 460 nm te meten was. De fluorimeter werd ook zodanig ingesteld dat een 0,2 M AMC-oplossing in 0,1 % DMSO-oplossing een arbitraire fluorescentie-eenheid 30 van 1,0 gaf. De hydrolytische werking van de gezuiverde weefsel-activator werd gemeten aan een chromogeen substraat door 200 jil monster weefsel-activator te mengen met 200 jü. 0,1 M tris-HCl-oplossing met een pH van 8,0 die 0,1 M NaCl en 0,02 % Tween 80 bevatte en met 200 jxl oplossing die 3 mM aan 35 S-2251 en 1 mM aan S-2288 was. Het beginnende vrijkomen van 8320346 - 18 - p-nitroaniline werd in een spectrofotometer bij 405 nm en 37°C in een glazen cel gemeten. Het begintempo van de hydroly-tische werking werd uitgedrukt in AmA/min. voor het chromo-gene substraat en in A%/min. voor het fluorescerende sub-5 straat. De remmende werkingen van de weefsel-activator na behandeling met diïsopropylfuorfosfaat, joodaceetamide, trypsine-remmer uit sojabonen en L-arginine-aprotinine werden met het chromogene substraat S-2288 beproefd. Monsters gezuiverde weefsel-activator werden 1 uur bij 37°C geincubeerd na- 10 dat de remstoffen er aan toegevoegd waren. Uit elk monster werd een monster van 200 ƒ11 genomen, en dat werd gemengd met 200 ^il buffer die 1 mM substraat bevatte. Door de AA/min.-waarden met elkaar te vergelijken konden de remmende werkingen van de diverse reagentia gemeten worden.

15 (5) Monsters werden op de wijze van voor beeld 1 gezuiverd en dan met de in voorbeeld 2 beschreven methoden onderzocht. De resultaten hiervan staan in tabel 2.

20

f* 3 ? P S si. R

- 19 - μ

G

0) —

g ο\° O O CM O <H *H

a> ·—· o cnr'Ln *3* cn Ό ^

G

Cl) tó

G

ω

G I

0) ra G (Τ'

G G

•H

μ g ^ •H CU 'd

G > CÖ <-( CN CO OO

•H (0 LD CD O O

G G G CO CM CO CO

0 N (T ...

μ CO cf O

G t-ι CO

> Ή μ------- u (ö Q) μ .—.

1 M -G tr

G 0) G S

CU -Η μ \ CD O

(1) IG -G W

(T -G > H o CM O O OO

O O -H O CO O O

G Cl μ Si co cm co C' H ft U G ...

S m ui ^ in cm LH

0) tH cm

G

H

ft-------

CM I

rH

t-ι G

G cn μ μ μ

G G -G

EH G G

S μ^οοοο oo

G-HHO OOO OO

G Η ï> h co co cn cn m p- G G -G .... . .

> μ μ W CO γ^ιΟ'νΓ co cm 0 ü o (T G ^

G

•H

G

> _______ •rH '

G

N

G

U)

G O I

•G G ri! O

μ G G O

u ra μ g cm

G 0 ft G G I

ft g G g -G ra m

G μ G M rG O

μ X μ I G G G H

ra G ft g > ra g >i

ra i g c g o μ G

Ir s m-GöGftu

G U I G G G G G

-G m w -G o μ cn μ G ^CtnGftia

G ffi HGOGSG

> g DCawaw

•H

3 .... · N t—i CN ΟΊ ^ \f) ΚΩ - 20 -

Voorbeeld 4

Eigenschappen van de weefsel-plasmino-geen-activator volgens deze uitvinding.

(1) Molecuulgewicht 5 Het molecuulgewicht van de volgens voor beeld 1(6) verkregen, gezuiverde weefsel-activator werd gemeten door gelelektroforese over SDS-polyacrylamide. Gevonden werd dat het molecuulgewicht van activator uit de nier en die uit bloedvaten respectievelijk 72.000 en 70.000 was. Deze 10 weefsel-activatoren reageerden positief op het perjoodzuur- reagens van Schiff, wat de aanwezigheid van suiker-groepen aangeeft. In het geval van uit nieren afkomstige activator bijvoorbeeld was de door elektroforese gemeten beweeglijkheid van de hoofdband van de gezuiverde weefsel-activator iden-15 tiek met de beweeglijkheid van de hoofdband van opgelost fibrine van een ruw extract, indien dat ruwe extract en de gezuiverde weefsel-activator beide door gelelektroforese over SDS-polyacrylamide onderzocht en de gelen tegen fibrine-agar-platen aan ontwikkeld waren. Dat geeft aan dat het molecuul-20 gewicht 70.000 (zie figuur 6). De band van het opgeloste fibrine werd toegeschreven aan de aanwezigheid van plasmino-geen in de fibrine-agarplaat.

Uit de bovenstaande vondsten begrijpt men dat het ruwe extract uit menselijk nierweefsel een plas-25 mlnogeen-activator bevat en dat deze in hoofdzaak een molecuulgewicht van ongeveer 70.000 heeft. Een zelfde proef werd ook uitgevoerd met een uit bloedvaten afgeleide activator.

Zijn molecuulgewicht werd bepaald op ongeveer 70.000.

(2) Isoëlektrische punten 30

Als isoëlektrische punten van gezuiverde activatoren verschenen de hoofdpieken van activator uit nieren en uitbloedvaten op resp. 8,2 en 7,8. Na het meten van het isoëlektrische punt werd de activiteit gemeten op een fibrine-agar-plaat in de vorm van een dunne film (1,5 mm 35 dikte). De activiteiten van de activatoren werden in de buurt 8320346 - 21 - van hun isoëlektrische punten gevonden, te weten bij pH = 8,2 en 7,8.

(3) Immunologische verschillen tussen de weefsel-activato-ren en urokinase 5 Om na te gaan of de activatoren, respec tievelijk uit nierweefsel en uit bloedvaten verkregen, dezelfde antigene werking hebben als urokinase werd het elutie-profiel van eiwitten, verkregen bij affiniteitschromatografie van de volgens voorbeeld 1(6) en voorbeeld 1(3) gezuiverde 10 activatoren en van de actieve bestanddelen van die activatoren vergeleken met het elutieprofiel van urokinase. De uitkomsten hiervan staan in figuur 7. Zoals men uit figuur 7 ziet wordt urokinase sterk aan de kolom geadsorbeerd en bijna alle ingebrachte werking werd geëlueerd met een 0,1 M glycine-15 HCl-oplossing die 0,15 M NaCl en 0,1 % Triton X-100 bevatte.

Het eiwit in het effluent was serumalbumine dat bij deze proef in het urokinase van handelskwaliteit zat. Anderzijds ging de gezuiverde activator zonder meer door de kolom. Het werd niet geadsorbeerd en noch eiwit noch activiteit werd met 20 een glycine-oplossing met pH 2,4 geëlueerd. Toen het gedeeltelijk gezuiverde, in voorbeeld 1(3) verkregen monster op dezelfde kolom gebracht werd adsorbeerde ongeveer 15 % van de opgebrachte activiteit aan de kolom en werd het met een glycine-oplossing met pH 2,4 geëlueerd. Op basis van deze vondsten 25 ziet men gemakkelijk in dat de plasminogeen-activator volgens de uitvinding een weefsel-activator is die immunologisch van urokinase verschilt en het ruwe extract uit nieren bevat als ondergeschikt bestanddeel urokinase of een urokinase-achtige activator. Anderzijds vertoonde het antiserum voor 30 de activator uit bloedvatwanden gemakkelijk een kruisreactie wat aangeeft dat zij uit immunologisch oogpunt aan elkaar verwant zijn.

(4) Affiniteit van de weefsel-activatoren voor fibrine-Sepharose 35 De affiniteit van urokinase en een weef- 8320346 - 22 - sel-activator voor niet opgelost fibrine-monomeer werden beide onderzocht met behulp van kolommen fibrine-Sepharose.

De weefsel-activator volgens voorbeeld 1(6) van de uitvinding werd in zijn geheel aan de kolom fibrine-5 Sepharose geadsorbeerd. Toen werd het geëlueerd met een 2 M NH^SCN-oplossing en ten minste 90 % van de opgebrachte activiteit werd teruggewonnen. Aan de andere kan kon praktisch de gehele activiteit van het urokinase ongehinderd door de kolom gaan. De activiteit van de activator werd dus niet 10 gevonden in het eluaat dat met een 2 M NH^SCN-oplossing verkregen werd. Zoals reeds eerder gezegd heeft de uit menselijke nieren verkregen weefsel-activator volgens de uitvinding een sterke affiniteit voor fibrine-Sepharose.

(5) Specificiteit van synthetische substraten voor weefsel-15 activatoren

De specificiteit van de volgens voorbeeld 1(6) verkregen activator voor bepaalde synthetische substraten werd nagegaan. De volgende substraten werden beproef : 20 Voor plasmine H-D-valyl-L-leucyl-L-lysine- p-nitroanilide-dihydrochloride (S-2251) ; voor natuurlijk thrombine Boc-L-valyl-prolyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide (3093-V); voor plasma carbobenzoxy-L-fenylalanyl-25 L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide (3095-V); voor kallikreine uit urine L-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide (3096-V); voor urokinase glutamyl-glycyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide (3097-V) , 30 en voor plasminogeen-activator uit weefsel H-D-isoleucyl-L-prolyl-L-arginine-p-nitroanilide-dihydrochloride (S-2288).

De weefsel-activator volgens deze uitvinding vertoonde geen hydrolytische werking op andere substra-35 ten dan S-2251 en S-2288. De activiteit van 100 UKIE/ml weef- MO i* v f-vb* *- ( ’ V v ..· - 23 - sel-activator volgens deze uitvinding was 88 AmA/min. op S-2251 en 70 AmA/min. op S-2288.

De activator volgens deze uitvinding vertoonde enige kenmerkende eigenschappen bij behandeling met 5 bepaalde remstoffen. De amide-ontledende werking van de activator volgens de uitvinding op S-2288 werd niet geremd door 50 KIE/ml Aprotinine, 10 mM joodaceetamide of 50 yiq/m.1 tryp-sine uit sojabonen. Wel werd het voor 26 % geremd door 100 mM L-arginine en voor 98 % door 5 mM diisopropylfluorfosfaat.

10 (6) Stabiliteit

Bij de plasminogeen-activator volgens deze uitvinding werd geen achteruitgang in werkzaamheid waargenomen na twee weken bewaren op 4°C in een buffer met pH = 7,4. Hetzelfde resultaat zag men als 1 M NH^SCN, 0,02 % 15 Tween 80 of 0,1 M NaCl in de buffer opgenomen werd.

De stabiliteit van de plasminogeen-activator volgens de uitvinding werd gedurende 24 uur bij 4 °C nagegaan in buffers die pH tussen 1 en 10 vertoonden en 0,5 M NaCl en 0,02 % Tween 80 bevatten. Hierbij werd gevonden dat 20 de plasminogeen-activator volgens de uitvinding stabiel was bij pH tussen 2 en 10 maar bij pH - 1,0 een activiteitsver-lies van 70 % onderging.

Zoals in detail beschreven is speelt de nieuwe plasminogeen-activator, die van urokinase verschilt, 25 een belangrijke rol bij het herstel van weefsel, waaronder ook valt het oplossen van fibrine-afzettingen op binnen- en buitenwanden van bloedvaten in een beschadigd gedeelte.

Het hoeft niet gezegd te worden dat de nieuwe plasminogeen-activator volgens deze uitvinding uit di-30 verse organen van zoogdieren geïsoleerd kan worden. Alle plasminogeen-activatoren moeten geacht worden onder het bereik van deze uitvinding te vallen, ongeacht hun herkomst, zo lang zij de eigenschappen hebben die kenmerkend voor de plasminogeen-activatoren van deze uitvinding zijn.

35 In overeenstemming met de hierboven be- 8320346 - 24 - schreven bereidingswijze van de activator, die ook een aspect van deze uitvinding is, kan de weefsel-activator in zeer zuivere vorm geïsoleerd worden. De weefsel-activator vertoont een specifieke activiteit van wel 30.000-45.000 maal de 5 specificieke werking van met aceton gedroogde menselijke nieren.

Het thrombolytische middel volgens deze uitvinding wordt natuurlijk duidelijk uit de hierna komende voorbeelden. Men moet echter in gedachten houden dat de plas-10 minogeen-activator die hiervan het bestanddeel was uit normale cellen afkomstig was. Men weet dat een plasminogeen-activator uit cellen van kwaad-aardige gezwellen thrombolytische werking heeft. Maar de veiligheid van een thromboly-tisch middel volgens deze uitvinding wordt geacht reeds door 15 zijn herkomst gewaarborgd te zijn. Indien men, gezien zijn wijze van toepassen als aan mensen te verstrekken geneesmiddel, de diverse mogelijke risico's bij langdurige verstrekking van hoge doses in beschouwing neemt.

Daar de plasminogeen-activator als be-20 standdeel van een thrombolytisch middel volgens de uitvinding een specifieke affiniteit voor fibrine vertoont, die van die van urökinase verschilt maar gelijksoortig is aan die van normale plasminogeen-activator uit bloed, kan het thrombolytische middel bij behandeling van thrombose volledig bevredi-25 gende resultaten geven. Bovendien is het thrombolytische middel volgens de uitvinding vrij van bijwerkingen zoals inwendige bloeding en shock door anafylaxis. Het thrombus-oplos-sende middel volgens de uitvinding is dan ook een uiterst werkzaam geneesmiddel.

30 Het thrombolytische middel volgens de uitvinding kan in geschikte doseringen aan patiënten toegediend worden en heeft een doeltreffende thrombolytische werking die gepaard gaat met weinig of geen bijwerkingen. Het thrombolytische middel volgens de uitvinding kan veelal op 35 dezelfde wijze toegediend worden als de gewoonlijk gebruikte 8320346 - 25 - andere geneesmiddelen van hetzelfde type. Bijvoorbeeld kan de plasminogeen-activator, die een actief bestanddeel heeft, in een fysiologische zout-oplossing met 5 % menselijk serum-albumine opgelost en door injectie toegediend worden. Hier 5 verdient het de voorkeur elke dosering (in termen van urokinase) tot 10.000 IE (ongeveer 100 ^ig) te beperken.

Het thrombolytische middel volgens de uitvinding khn gebruikt worden voor het behandelen van acute en chronische verstoppingen van diverse bloedvaten door bloed-10 stolsels, zoals men dat ziet in gevallen van type veneuze thrombose, longembolie, hartinfarct, slagaderverstopping, buitenlichamelijke bloedsomloop en aderverstopping.

Het thrombolytische middel volgens deze uitvinding wordt hierna door de volgende voorbeelden toege-15 licht.

Voorbeeld 5

Isolering en zuivering van de plasminogeen-activator die het actieve bestanddeel van het thrombolytische middel volgens de uitvinding_is.

20

Aan 100 g met aceton ontvette menselijke nier in poedervorm werd 500 ml 2M ammoniumthiocyanaat-oplos-sing toegevoegd die met 0,02 M tris-HCl op pH = 7,4 gebufferd was. Dit mengsel werd 10 uur op 4°C geroerd en dan door 30 minuten centrifugeren op 13.000 g in extract en sediment gescheiden.

In het extract werd de pH met 1 N HCl op 3,0 ingesteld en het nu optredende neerslag werd door 30 minuten centrifugeren op 13.000 g afgescheiden. Dat neerslag werd in 500 ml 0,01 M natriumfosfaat-buffer (buffer A) opge-30 lost die 1 mM EDTA, 0,3 M NaCl, 10 KIE/ml Aprotinine, 5 mM ε-aminocapronzuur en 0,01 % Tween 80 bevatte. Daarna werd 100 ml fibrine-celiet aan de buffer toegevoegd en dat mengsel werd 30 minuten op 4°C geroerd en dan 10 minuten op 3000 g gecentrifugeerd. Het sediment werd weer in 100 ml buffer A 35 gesuspendeerd en die oplossing werd op een kolom van 4 x 10 cm 8320346 - 26 - gegoten. De kolom werd uitgewassen met 500 ml buffer A. Daarna werd de plasminogeen-activator geëlueerd met buffer A die bovendien 0,4 M arginine bevatte. De eluaten werden in fracties van 10 ml opgevangen. De uitkomsten staan in figuur 8 5 en in tabel 3. Deze zuivering gaf een opbrengst van wel 30 %. Bij deze zuiveringsmethode benut men de sterke affiniteit van de plasminogeen-activator die de actieve stof van het thrombolytische middel volgens de uitvinding is, voor fibrine.

Tabel 3 10 ___

Zuiveringstrap Hoeveelheid Totale eiwit (mg) activiteit ___(%)

Extractie met 15 NH^SCN-oplossing 4.500 100

Neerslaan met zuur 2.800 62

Zuivering met fibrine-celiet 21 29 20 Voorbeeld 6

Vergelijking van de thrombolytische werking van het thrombo- lytische_middel volgens de_uitvinding met urokinase

De thrombolytische werking van de plasminogeen-activator die de werkzame stof van het thrombolytische 25 middel volgens de uitvinding is werd vergeleken met die van urokinase met de methode van Chandler's lus. De proef gebeurde met bloed dat afgetapt was uit een gezonde mannelijke vrijwilliger. Precies 5 ml bloed werd opgevangen waaraan 0,5 ml 3,1 % natriumcitraat-oplossing toegevoegd werd om 125

30 coagulering te voorkomen. Daarna werd ook 50 ^il met J

gemerkt fibrinogeen toegevoegd. Na goed mengen werden 1,5 ml porties van het mengsel in tygon-buizen van 28 cm lengte en 0,36 cm inwendige doorsnede geplaatst, gevolgd door het toevoegen van 20 mM calciumchloride. Daarna werden beide uit-35 einden van de buizen met elkaar verbonden zodat ze een ge- 8320345 - 27 - sloten kring vormden. De gesloten circulatiebuis werd op een draaitafel geplaatst die een hoek 23° maakte en met een snelheid van 17 rpm ronddraaide. Nadat men het bloed 1 tot 24 uur bij kamertemperatuur (24-25°C) had laten stollen werden de 5 buizen geopend en werden monsters van 10 jil genomen. Hiervan werd de radioactiviteit gemeten. Daarna werd de plasminogeen-activator in de buis gebracht en werden de beide uiteinden weer op elkaar aangesloten. Opnieuw werden ze op de draaitafel rondgedraaid. Na bepaalde tijden werden monsters van 10 10 jil genomen en op radioactiviteit geanalyseerd. De activi teit van de plasminogeen-activator werd uitgedrukt in de hoe-125 veelheid J dat uit het bloedstolsel van dat monster vrijkwam.

125

Het toegevoegde J fibrinogeen werd met 15 een rendement van ongeveer 95-98 % in het polymeer van het stolsel opgenomen. De mate van verknoping na 1 uur was anders dan na 24 uur. D.w.z. na 1 uur had men een gedeeltelijk verknoopt stolsel (DV)en na 24 uur een geheel verknoopt stolsel (HV). Figuur 9 laat de mate van oplossing van DV-stolsel 20 zien met de plasminogeen-activator die de werkzame stof van een thrombolytisch middel volgens de uitvinding is of met urokinase. In figuur 9 komt lijn (a) overeen met de plasminogeen-activator en lijn (b) met urokin&se. Deze lijnen laten zien dat de plasminogeen-activator, die de werkzame stof van 25 een thrombolytisch middel volgens de uitvinding is, vergeleken met urokinase zeer doeltreffend oplost. Als de plasminogeen-activator, die de werkzame stof van een thrombolytisch middel volgens de uitvinding is, in dezelfde hoeveelheid als toegepast in het systeem voor lijn (a) na 10 uur aan het sys-30 teem voor lijn (b) toegevoegd wordt treedt alsnog bijna volledig oplossen op (lijn (c) in figuur 9). In figuur 9 stelt elk punt het gemiddelde van metingen in drievoud voor. Toen -9 de concentratie van de activator op 1 x 10 M ingesteld werd lostte de activator die de werkzame stof m een thrombolytisch 35 middel volgens de uitvinding is het DV-stolsel in 20 uur bijna 8 3 2 0 3 h fs *1 - 28 - volledig op. In tegenstelling tot de plasminogeen-activator werd urokinase voor slechts ongeveer 40 % geëlueerd. Toen de plasminogeen-activator, die de werkzame stof van een thrombo- lytisch middel volgens de uitvinding is, 10 uur later aan het 5 bovengenoemde systeem toegevoegd werd vond een bijna volle- 125 dig vrijkomen van J plaats, wat aangeeft dat de activator een sterke thrombolytische werking heeft. Bij een proef waarbij een HV-stolsel gebruikt werd vertoonde urokinase een oplossing van slechts 35 % na 20 uur, maar de plasminogeen-10 activator die een bestanddeel van een thrombolytisch middel volgens de uitvinding is vertoonde 90 % oplossen. Ter controle werd nog een proef uitgevoerd waarbij helemaal geen plasminogeen-activator gebruikt werd. Er werd nu helemaal geen vrij-125 komen van J waargenomen. Aangetoond is dus dat het oplos-15 sen van het bloedstolsel van die activator afhankelijk is. Voorbeeld 7

Werking van het thrombolytische middel volgens de uitvinding op thrombose bij diverse dieren

Uit diverse dieren werd bloed opgevangen 20 op een zelfde wijze als toegepast in voorbeeld 6, en dat liet men 1 uur stollen. De plasminogeen-activator die de werkzame stof van een thrombolytisch middel volgens de uitvinding is liet men op de gedeeltelijk verknoopte (DV) stolsels in plasma's van de diverse dieren werken om de thrombolytische 25 werking van de plasminogeen-activator tot uiting te laten komen. Bij elke proef werd de concentratie aan plasminogeen-activator ingesteld op 20 IE/ml en werd de mate waarin het stolsel tot oplossing ging gemeten in termen van uit dat stolsel 125 vrijgekomen J in de 10 uur na het begin van de proef. In 30 dit systeem was de achtergrond in hoofdzaak gelijk aan die die zonder toevoegen van plasminogeen-activator optrad, en 125 na 10 uur werd slechts 2-3 % van het J gevonden. Daarentegen ging in het menselijke systeem ongeveer 96 % van het stolsel in oplossing. Figuur 10 laat de uitkomsten zien ver-35 kregen bij het bepalen van de mate van oplossing van stolsels 8320346 - 29 - uit bloed van mens en diverse diersoorten. In figuur 10 tonen lijnen (a) , (b), (c), (d) en (e) de uitkomsten verkregen met bloed uit mens, aap, konijn, hond en rat. Zoals figuur 10 laat zien varieerde de mate van in oplossing gaan met de dier-5 soort. De plasminogeen-activator werkt bij de aap goed, evenals bij de mens. In de rat is het oplossend vermogen gering. Dit laat zien dat het thrombolytische middel volgens de uitvinding een voor mens en aap specifiek enzym is.

10 8320346

Claims

1. Een plasminogeen-activator met de volgende kenmerken: 5 (1) bij gelelektroforese over natriumdodecylsulfaat-polyacryl- amide heeft de voornaamste eiwitband een schijnbaar molecuul-gewicht van ongeveer 70.000 ± 5.000, (2) de bij isoëlektrisch punt-elektroforese verkregen hoofdband heeft een pi binnen het traject van 7 tot 9, 10 (3) de plasminogeen-activator heeft de immunologische eigen schap bij affiniteitschromatografie over anti-urokinase-IgG-Sepharose niet geadsorbeerd te worden, en (4) de plasminogeen-activator hydrolyseert H-D-valyl-L-leucyl-L-lysine p-nitroanilide-dihydro-15 chloride en H-D-isoleucyl-L-prolyl-L-arginine-p-nitroanilide- dihydrochloride; maar hydrolyseert Boc~L_valyl_L_prolyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide, carbobenzoxy-L-fenylalanyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide, L-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide en glutaryl-glycyl-L-20 arginine-4-methylcoumaryl-7-amide niet.

2. Werkwijze voor het bereiden van een plasminogeen-activator met de volgende eigenschappen: (1) bij gelelektroforse over natriumdodecylsulfaat-poly-acrylamide heeft de voornaamste eiwit-band een schijnbaar 25 molecuulgewicht van ongeveer 70.000 ± 5.000, (2) de bij isoëlektrisch punt-elektroforese verkregen hoofdband heeft een pi binnen het traject van 7 tot 9, (3) de plasminogeen-activator heeft de immunologische eigenschap bij affiniteitschromatografie over anti-urokinase-IgG-

30 Sepharose niet geadsorbeerd te worden, en (4) de plasminogeen-activator hydrolyseert H-D-valyl-L-leucyl-L-lysine-p-nitroanilide-hydrochloride en H-D-isoleu-cyl-L-prolyl-L-arginine-p-nitroanilide-hydrochloride; maar hydrolyseert Boc-L-valyl-L-prolyl-L-arginine-4-methylcouma- 35 ryl-7-amide, carbobenzoxy-L-fenylalanyl-L-arginine-4-methyl- 0 3 2 0 5 4 8 1 - 31 - A coumaryl-7-amide, L-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginine-4-methyl-coumaryl-7-amide en glutaryl-glycyl-L-arginine-4-methyl-coumaryl-7-amide niet, waartoe men menselijke nieren of menselijke bloedvaten met 5 een ammoniumthiocyanaat-oplossing extraheert en dan het verkregen extract door een kolom van met ionenwisselaar beladen materiaal, een kolom metaalchelaat, een met L-arginine of arginine-derivaat aan drager gevulde kolom, een met hemag-glutinine aan drager gevulde kolom of een met molecuulzeef 10 gevulde kolom of een combinatie van dergelijke kolommen leidt om dit extract te zuiveren.

3. Werkwijze volgens conclusie 2 waarbij menselijke nieren geëxtraheerd worden met een ammoniumthiocyanaat-oplossing die met tris-HCl tot een pH tussen 7,0 en 15 7,4 gebufferd is.

4. Werkwijze volgens conclusie 2 waarbij menselijke bloedvaten geëxtraheerd worden door ze met fysiologische zout-oplossing te wassen en dan met ammoniumthiocyanaat-oplossing door te spoelen.

5. Thrombolytisch middel dat als werkzaam bestanddeel een plasminogeen-activator met de volgende eigenschappen heeft: (1) bij gelelektroforese over natriumdodecylsulfaat-polyacryl-amide heeft de voornaamste eiwitband een schijnbaar molecuul- 25 gewicht van ongeveer 70.000 ± 5.000, (2) de bij isoëlektrisch punt-elektroforese verkregen hoofdband heeft een pi binnen het traject van 7 tot 9, (3) de plasminogeen-activator heeft de immunologische eigenschap bij affiniteitschromatografie over anti-urokinase-

30 IgG-Sepharose niet geadsorbeerd te worden, en (4) de plasminogeen-activator hydrolyseert H-D-valyl-L-leucyl-L-lysine-p-nitroanilide-dihydrochloride en H-D-iso-leucyl-L-prolyl-L-arginine-p-nitroanilide-dihydrochloride; maar hydrolyseert Boc-L-valyl-L-prolyl-L-arginine-4-methyl- 35 coumaryl-7-amide, carbobenzoxy-L-fenylalanyl-L-arginine-4- 8320346 * * - 32 - * methylcoumaryl-7-amide, L-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide en glutaryl-glycyl-L-arginine-4-methyl-coumaryl-7-amide niet.

6. Thrombolytisch middel volgens conclu-5 sie 5 waarvan de plasminogeen-activator afkomstig was uit normale diploïde cellen.

7. Thrombolytisch middel volgens conclusie 5 dat nuttig is voor de behandeling van acute of chronische bloedstollingen in aderen of slagaderen. 10 8320346