JPS5980613A - 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明ｄ１、ヒトの組織、たとえばヒト腎臓や血管から
得られる新規なプラスミノーゲン・アクチベ−タ及びそ
の製造方法に関する、。

プラスミノ−ｉン・アクチベータは、その由来にもとす
いて組織アクチベータ（ｔｉｓｓｕｅ　ａｃｔｉ−ｖａ
ｔｏｒ　）、面管アクチベータ（Ｖ；１ｓｃｕｌａｌ’
　　ａＣＬＩ−ｖａｌｏｒ　）、＋ｆ１［アクチベータ
（＋）＋００（Ｉ　ａｃｔｉｖａｂｏ）及びウロギナー
セ（ｕｒｏｋｉｎａｓｃ　）などに分類される。ゾラス
ミノ−ゲン・アクチベータはフイツク／を分解する作用
に重我な役割を果たすもので、広く咄乳動物の血管に分
布している。一方、最近に主ってプラスミノーゲン・ア
クチベータ全培養細胞より生成するｌ１Ｊｆ究が精力的
に行なわれている。

こｉｔらの（ｉＪｌ究においては、培養細胞として、た
とえｄ゛悪（ＪＩｇ　＋１１陽１細胞、血管内皮細胞、
刺激されだマク「ｊファー・／、卵胞刺激ポルモノによ
り刺激されたでん粉粒状細胞等が用いられている。また
体液組Ａｊ＆ホモ／ネート、培養細胞及び培養媒体から
分離されたプラスミノーゲン・アクチベータの生化学的
、免疫学的性質等も報告されている。

シカしながら、ヒト糸旧成プラスミノーグツ・〕゛クク
チベー精製はあまり行なわれていない。これは出発物質
の十分な華の入手の１□１旧；１１さに加え、これに含
有される酵素の疎水的性質、比活性の低さ、緩慎ｊ液中
での酵素の不安定さ、時として硝４１ｉ４中の未知のグ
ロテアーセの存在などのり山によるものと考えられる。

このような昔風にあっ℃、Ｈｉｊｋｃｎらは、分子量６
９．０００のヒト子宮プラスミノーゲ／・アクチベータ
を分離し、このアクチベータがヒト血管アクチベータと
免疫学的に及び生化学的に類似していることをイイイ′
認している、１また、これとは異った分子量を有すると
１・血管アクチベータも分離確認されている。

Ｋｗａ　ａｎら（Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　２４．３８７
　（１９６５）　）　ｌｄ、’ヒト腎臓絹織グラスミノ
ーゲン・アクチベークの研究を行ない、アクチベータが
主として面盾′内皮細胞、とくに静脈の内皮細胞に存在
していることを見出した。そして、Ｋｕｃｉｎｓｋｉら
（、Ｔ、ＣＩｉ＋１゜丁ｎｖｃｓｔ　　　４７　、　１
２３８ｉ２５ろ（１９６８）　　）　　、　Ｂｃｒｎｉ
ｋら（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、１１．ｎｖｅｓｌ　４Ｂ、　１７
４０−１７５３（１９６９）　）、Ｂａｒｌｏｗら（Ｔ
　ｈ　ｒ　Ｔ３＋浦、Ｔ（（！Ｓ、工、　２０１−２０
８（１９７２））、ＡｓＬｃｃｌら（１！：ｘｌ＞ｅｒ
　ｉｍｃｎＬ　ｉａ　３３　、５８９−５９０（１９７
Ｂ）　）、及びＬｅＷＩ　Ｓ　（ＴＩＴ　Ｉ’０ｌｌＴ
ｌ’ｌ　、　ＨａｅｌｌｌＯ８ｔ　；ＩＳ　、　４２　
、８９５−８９０（１９７９））らは、このようなヒト
腎臓組織の培養によりＴＩＴられるプラスミノーゲン・
アクチベータはつ「Ｊギナ−ゼと免疫学的及び物理化学
的に同一であると報告している。

不発１υノ者らは、ヒト腎ｊ凪およびヒト血嘗・から分
１加イ′６製した組織プラスミノーゲ／・アクチベータ
の鞘力的な解明を行った結果、）＜２．　＜へきことに
従ｔ　＋（ｊ−１：、としてウロキナーセしか見い出さ
れないとさｉｌてきだヒト腎臓又はヒト血慣なとのつ［
ｌｆｆキナーセと全く異々る性質を有するアクチベータ
を見い出し本発明を完成するに至λヶものである。

すなわら、本発明に係る冶規なアクチベータは、（１）
ナトリウムードテンルザルフェ−１・・ボリーノ′りＩ
Ｊ　ルアミドゲル電気泳動法により一本のタン白バンド
を示し、みかけの分子量が約７０，０００±５０　Ｏ０
であり、 （２）等電点電気泳動法による主・＜７１・のｐｌが７
〜（３）、１ｉｆｔ織あるいは血管から１乃＠　２　Ｎ
ｎ４ｓｃ＋ｖで抽出へ あるいｌｄ：　ｌｌ’ｌｉ流され、０１％トウイー７８
０■の存７１下で精製可能であり、 （４）抗つロキナーセＩｇＧ−セファロースｊＭ　和１
１りｒｖマトグラノイーにより吸着されない免疫学的性
１＋！Ｌを有し、 （５）ノイブリンセノアロースカラムに実′肯的に全て
吸着され、かつ２ＭのＮ　Ｈ、、Ｓ　ＣＮにより溶出さ
れる性質を有し、 （６）　ｎ　−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイツルー　１．−リ
ジン−ｐ−−４ｏアニリド７ヒドロクロリド及び）Ｉ　
−−−ＩＪ−イソロイシル〜Ｔ、　−７’ロリルーアル
ギニン−ｐ−二）・ロアニリド・ジヒドロクロリドに加
水分角イ活性を示し、ＢＯＣ−Ｌ−バリル−Ｉ、−プロ
リル−Ｌ−アルキニン−４−メチルクマリル　７−アミ
ド、カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニル’−ｆ　ラニルー
Ｌ−アルギニンー４−メチルクマリル−７−アミＩ・、
Ｉ＋−プロリル−Ｌ−フェニルアラニル−アルキニン−
４−メチルクマリル−７−−アミド、グルタリル−グリ
／ルーム−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミ
ドに加水分解活性を示さない性質を崩し、 （７）　ｐ＋−＋　７．４の緩衝溶液中４℃で２週間後
も安定である特徴を有するものである。

本発明に係る新規なアクチベータの製造方法はヒト腎臓
から常法によυ血液凝固物、結合組織、脂１ｅ↓等を除
去した後、緩衝液で抽出でき、また、血管からＩＪＨ４
ＳＣＮによるγ（Ｖｊ流によって抽出しつる。

次いて該抽出液をイオン交換体を保持するカラム、金瞑
ギレート）ｌラム、Ｌ−アルキニン、あるいは、アルキ
ニンｒｉ４４体を担体に結合したカラム、血球凝集素を
担体に結合したカラム、又（ｄこれらを組み合せた複数
のカラムに通じて精製することを特徴とするものである
。

本発明に係る新規なアクチベータは、血栓溶解作用をも
つ医薬としてすでに開発されているウロキナーセの免疫
学的欠点を補い、有用な血栓溶解剤を提供するものであ
る。。

以下に本発明に係る方法及びこオとにより得られる新規
なアクチベータの性質について詳細に説明する。とくに
断らない限り、全ての操作は４℃で行なった。

実施例１ 腎臓からのプラスミノーゲン・アクチベータの半青製 （１）プラスミノーゲン・アクチベータの抽出感染症状
のないヒト腎臓をへ７０℃に保育しておく。血液凝固物
、結合組織及び脂質を機１成的に除去した後、−１５℃
のアセトンを加えて腎臓をホモゲナイザ−ですりつぶし
た。）跡凋液を一１５℃で３０分かき壕ぜてから、−２
０℃に静置し、７た。

表面浮遊物をデカンチルジョンにより取り除き、−１５
℃のアセトンで脱脂を繰り返したのち、懸濁液をδｊ過
した。ｌｊ過ケーキを一２０℃のアセトンで洗浄し、乾
燥した。次に脱脂粉末＋００９を、１）Ｈ７，Ｏ−７，
４の０．０２ＭＴロ５−ＨＣｔで緩衝させた１ＭのＮＨ
４５Ｃ！Ｎの１ｔに懸濁しかき捷ぜた。遠心分Ｎ１によ
り抽出液と沈ｌ殿′吻とに分け、沈澱′吻は同じ溶液１
ｔで用抽出し、抽出液を合して粗抽出物を得た。

（２）　１月号ΔＥ−セファロースクロマトグラフィー
（１）で得た粗抽出液を等鼠のｐＨ７，０〜７４の０．
０２　ＭＴｒｉｓ−ＪＩＣｔで希釈し、０．０２　％ト
ウィーン８０及び０２５ＭのＮｆ（４ＳＣ１’ｌを含有
する０、０２　Ｍ　Ｔ　目ｓ−Ｉコ（］ｔでイ衡にさせ
てあるＤ　Ｅ　ｆｉ、　Ｅ−セファロースのカラムにこ
の試オニ）１を通し／こ。通過液を集めて、これにＮ、
ＣＡを加え、最終濃度を１．０　Ｍとし、１）ト■を１
Ｎの＋−＋ＣＺて７４に？Ｊ１４節した。

（５）　ｉｌＩ鉛ギレ−トセファロ−ス・クロマ１〜グ
ラフイ（２）で得／こ通過液を、１．０　Ｍの１愉Ｃ１
）　　０．２５　ＭのＮＨ，，５ＣＩ４．０．０２　Ｍ
　＋−ウィーン８０を含有するｐＩ（７０の０．０２　
Ｍ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌで平衡にさぜた亜鉛ギレート
セファロースのカラムに通した。溶出ｉＷのタン白質（
Ｉ□■度が０．０１　ｍｇ／Ｆｎｌ！以下になる才でコ
Ｆ衡溶液で洗浄したのち、カラムをさらに、ＮＨ，ＳＣ
Ｎを含有しない０．１５ＭのＮａＣｔを含む平衡溶液と
同じ緩衝液で６．〆了１した。次いで、０．０５Ｍイミ
ダン゛−ルによりカラムを洗浄し、この洗浄液中に組織
アクチベータを溶出した。クロマトグラフィのプロフィ
ールを第１図に示す。

（４）コンカナバリンＡ−セファロースクロマ）・グラ
フィ （３）で得た組織アクチベータフラク／ヨンをコンカナ
バリンＡ−セファロ−スカラノ・に通した。カラム（は
、０．１５　Ｍ　Ｎａｃｚ　、　　０．０２１　ｌ−ウ
ィーン８ｏを含有するｐＨ７，４の００２ＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｔで平衡にしておく。溶出ｆ夜のタン白質（製度
がベースラインに、達する捷で平衡溶液で洗浄したのち
、組織アクチヘータヲ０．５　Ｍα−Ｄ−メチルマンノ
ザイドを含む平衡溶液で浴出した。アクチベータ・フラ
クションは合して、ｐＨをに＋酸で４５に調節Ｌ７だ。

クロマ１゛グラフイーのプロフィールを第２図に示す。

Ｈｉｊｋｅｎ　ら（Ｂｉｏｃｂｉｎ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ａｃｔａ、５８０，１４０−１５３　（１９７９）　）
は、α−Ｄ−メチルマンノサイド（０−０，６Ｍ　）の
線状勾配溶出液は、ヒト子宮組織からプラスミノーゲン
・アクチベータを精製する場合に有効であると報告して
いる。α−■）−メチルマンノザイド（ｏ−ｏ、　ｓ　
ｒ、ｉ　）の線上勾配溶出液を用いると、アクチベータ
活性の溶出プロフィールに５、タン白質のそれと一致し
た。はとんど／Ｉ≧てのプラスミノーゲン・アクチベー
タの溶出点ｄ５．０．３５Ｍα−署〕−メチルマンノザ
イドイマ１近にあり、Ｒｉ　ｊｋｅｎらにより報告され
ている溶出点よりもやや高くなっていた。

（５）　ＣＭ−−セファロース　クロマ１〜グラフイ（
４）で１′ＩＩた糸１］織アクチベータフラク／ヨンを
ＣＭ−セフブロースのカラムに通した。カラムは０．１
５ＭのＮ；ｌＣｔと０．０２係トウイ−ン８０を含むｌ
ｌｌ−１４，５の０．０２　Ｍ　ｌ’ｎ’ｌ酸緩衝液で
平衡にしておく。

寸ず、平衡溶液で洗ａ１シたのち、同じ緩衝液中で、０
１５Ｍ〜１．０　ＭのＮａＣｔの直線的に増加する濃瓜
で、カラムを展開した。組織アクチベータは、０４５Ｍ
のＮ、、ｃｌ　（ｉ近に溶出した。溶出プロフィールを
第５図に示す。組織アクチベータは平衡溶液中ＣＭ−七
ファロースに吸着され、負荷したタン白質の約５０〜６
０％がカラムを通過した。組織アクチベータは、０．４
５　ＭのＮ５ｃｔ　ＰＩ近に溶出され、これ１／ｉ用い
たタン白質の約４０％の溶出に相当し、比活性は約２４
倍増加した。アクチベータ・フラクションを集めて、Ｄ
ｉａｆｌｏ膜ＰＭ１０（アミコノＪｉ製）を用いて限外
１過し、濃縮した。アクチベータ試料の緩衝液交換をセ
ファテックスＧ−２５（ファルマンア刺製）カラム上で
行なつ７乞。カラノ、は、１．０　ＭのＮＨ４，ＳＣＮ
を含有するＬ）Ｉ（７，４の０．０２　ＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＩで平衡にしておき、これと同じ緩ｎ１ｉＪ液で展開
した。溶出したタン白質フラクションを合わせて］）ｉ
ａｆｌｏ膜ＰＭＩＯを用いて限外１’過により濃縮した
。

（６）セフアクリルＳ　−２００ゲルｆｉ過絹織アクチ
ベータの濃縮試料を１．０　Ｍのｌ’１ｌ１４８Ｃ↑ぐ
を含有するｐＨ７，４の００２ＭのＴ　ｒ　ｉ　ｓ−Ｈ
Ｃｌで平衡にしたセフアクリルＳ−２００（ファルマノ
ア社製）のカラムに通した。

組織アクチベータのフラクションである妨過孜ば、−７
０℃に保存した。溶出プロフィールを第４図に示す。

実施例２ 面管山来プラスミノーゲン・アクチベータの精製 下肢血管を緩衝化生食（ｐＨ７，４）で洗浄後、１Ｍの
＋ｖｔｉ、５ｃＮＫで血管壁よりプラスミノーゲン・ア
クヂベータを抽出し、５０係硫安塩析後アルキニン一ヒ
フアロースクロマトヲ行すった。プラスミノーゲン・ア
クチベータは、アルキニン−セファロースに強い親和性
を示し、０．５Ｍアルギニンにて溶出され、この方法で
比活性は約６倍高められた。

次にプラスミノーゲン・アクチベ−りの疎水的十土り々
ヲｆｌＪＪＪＩＬテ、フェニル−セファロースクロマト
を行ない、吸着したプラスミノーゲン・アクチベータを
５０％エチレングリコールもしり仁１．１係トリトンＸ
−１００にて溶出した。プラスミノーゲン・アクチベー
タは、この方法により比活性が約８倍高められた。

次に、七フアクリルＳ−２００クロマトにより最初の通
過液に殆んどのタン白質が溶出されるが、プラスミノー
ゲン・アクチベータは分子４４約７０．［１００の部に
溶出され、この段階で比活Ｋｌは約２２倍高められた。

Ｍ　後Ｋ　’ｔ　フィブリン・セファロースクロア　１
・を行なった。ヒト血管プラスミノーゲン・アクヂベー
タはノイブリ／・セファロースに強い親ｉｌｌ　トｌ：
ｆ有し、比活性は約１３倍高められた。

以上の方法により得られた各段階ての比活性、精製度、
回収率を第１表に示す。

最終品の比活性は約４５．０００−８０．０００１ＬＩ
　、／ｍ９タン白、回収率は約２０−４０％であった。

精製血管プラスミノーゲン・アクチベータのＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳急派によるみかけの分子量は
杓７０，０００でこのタン白バントｔｉＰＡＳ染色に陽
性であつ７ケので基本的には１本鎖よりなる糖タン白質
であると考えられる。Ｓ　］）　Ｓ　−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動後のゲルをスライスしてプラスミノー
ゲン・アクヂベータ活性の分布を調べた結果、プラスミ
ノーゲン・アクチベータ活性＆；Ｉ：　、このタン白バ
ントに全く一致ｊ〜でいた。

本発明に係る血管プラスミノ−ゲ／・アクチベータの主
バンドの等電点（ｐＪ）は７８であつ／こ。

抗ウロキナーゼＩｙＧを用いて、本発明に係るゾラスミ
ノ−ゲンとウロギナーセの抗原性を比較すると、珀１管
プラスミノーゲン・アクチベータは、抗つロキナーセ■
ｙＧによりその活性ｄ、全く阻害さレス、また抗つロキ
ナーゼＩｇＧ−セファロースに対して全く親和性を示さ
なかった。

精製面管プラスミノーゲ／・アクチベータを抗原として
得だ抗血管プラスミノーゲン・アクチベータＴ、ｌ／Ｇ
は、血管ゾラスミノ−ケン・アクチベータの活性ケ阻害
するが、ウロキナーゼ活性なま阻害しなかった。抗血管
プラスミノーゲン・アクチベータ及び抗つロキナーセ血
清を用いて、両−アクチベータの抗原性を免疫二重拡散
法にて検索した結果、ウロキナーゼ、血管プラスミノー
ゲン・アクチベータは、それぞれ抗つロキナーセ、抗血
管プラスミノーゲン・アクチベータ血清との間に１本の
沈降線を生じるが、両者の間に沈降線の交叉（は認めら
れない。

以上の結果から、本発明に係る血管プラスミノ−・ケン
・アクチベータは免疫学的にウロキナーゼと異なってい
ることがわかる３゜ Ｔ　ａ　ｄ　ｄのフィブリノリンス・オートグラフィの
フィブリン膜中に抗血管プラスミノーゲン・アクチベー
タＴｇＧを加えると静脈内膜及び外膜の栄養面管に認め
られたプラスミノーゲン・アクチベータ活性は抑制され
た。

血管プラスミノーゲン・アクチベータの種々のインヒビ
ターによる活性抑制を調べた結果、ンイソプロピルフル
オロフオスフエ−１−（５ｍＭ）によシワ８係、Ｌ−ア
ルギニ７（０，１Ｍ）により２０係の活性阻害が認めら
れたが、トう／ロール（５０に、ＩＵ／ｍｌり、ヨード
アセトアミド（’１０ｍＭ　）およびソイビン・トリプ
ンンインヒビタ−（５ｏ１ｔＶ／ｍｌ！　）による影響
は見られなかった。これは、本発明に係る血管プラスミ
ノーゲン・アクチベークがウロキナーゼと同様にセリン
・グロテアーゼに楓することを示している。

実施例ろ 組織プラスミノーゲン・アクチベータの分析及びその結
果 （１）とくに断らない限シ、プラスミノ−ケン・アクチ
ベータは、Ｉｍｍｕｎｏ　ｃｈｃｍｉ　ｓ　ｔｒｙ　９
　、７０９−７２３（１９７２）に示されているフィブ
リン寒天５１′板法を用いて分析した。組織アクチベー
タのフィブリン溶解活性をウロキナーゼと比較し、国際
単位（ＵＫＩＵ）でこれを表わした。連続希釈液（ｓｅ
ｒｉａｌｄｉｌｕｔｉｏｒ＋ｓ　　）の活性を示す標準
曲線は、本発明に係るゾラスミノーゲン・アクチベータ
もウロキナーゼも、溶解面積（Ｉｙｔｉｃ　；、１ｒｃ
ａ　）　７０−２４０７〃ｍ２の範囲内では直線であシ
、それぞれの酵素の希釈度に比例した。しかし、組織ア
クチベータの標べＣ４曲線の勾配は、ウロキナーゼの場
合とは、完全にＣＪ一致しなかった。組織アクチベータ
の活性は、＋２０−２００　ｌｌｌ７１′の範囲内の希
釈試オ・Ｉの溶解面積（ｌｙｔｉｃ　ａｒｅａ　）の測
定により決定した。Ｉ　Ｊ−Ｕ／ｍｅウロキウロキナー
ゼ１０μｌの溶解面積は１５６＋＋＋ｍ２であつ／こ。

フィブリン・寒天平版法のｒｌ］ＪＪｌ性は一１６％で
ある３、組織、アクチベー夕の酵素活性をつ「Ｊキナ　
−ヒの酵素？ｉ’ｉ　ｌ／ｌユによって標準化１〜、い
くつかの精製段階ののちに、回収率とＩＩ　Ｋ　Ｉ　Ｕ
　／　ｍｅに幻する組織アクチベ〜りの比活性を測定［
７た。

非特１゛！−的ノイブリン溶ｔ’Ｐｆ活性は、グラスミ
ノーゲ／を含−まないフィブリン・寒天平板上で測定し
／ζ。

ある場合には、セルロースナイトレートディスクプした
　　■　−フィブリンモノマーを用いる方法を採用した
（　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｅ；ｌｌ　Ｆ
ｉｌ）ｒｉｎ−ｏｌｙｓｉｓ　　ａｎｄ　　Ｔｈｒｏ＋
ｎｂｏｌｙｓｉｓ　　ｖｏｌ　　　３，　　５３９−５
４６（　　１　　９７Ｂ　　）　　、　　　Ｒａｖｃｎ
　　Ｐｒｅｓｓ　　、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　）　
　。

ヒトプラスミノ−ケンのないフィブリノーゲンは、Ｈａ
ｗｋｅｒ　　ら　（　　Ｊ．ＣＩ　ｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ
　、２９　、４９５　　−　　５０１　　（１９７６）
）の方法により放射した。標識基′＾の比活性は、０．
０　１　８　Ｉｌｌ　Ｃ　ｉ　７ｍｇフィブリノ−ケン
だった。

試料混合！吻を６７℃で保温し、１１］ｒ、７１１「に
５０μｔザンブリングして放出］２５１を自動ガノマ言
］数計でｄ１１１定した。組織アクチベータとウロキナ
ーゼの希釈液の活性は１２５丁　　の放出を引き３ラシ
て、全放射活性の放出の条として表わし／乙。

（２）抗つロギナーゼ１７（」−セファロースカラム」
−二の親和クロマトグラフィ ウロキナーゼ抗血清は、高純度ヒトウロキナーゼ（ＭＷ
．　３５０００　、比活性２０２４００１ＴＪ／ｉｌ＋
９）　１　ｍ！Ｊを皮−トに免疫されたヤギから得たも
のである。用いられたウロキナーゼの（票品は、８１）
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価し／
こものと同一たり／こ。

抗つ「ｊギナ−セ血清ＰＪ、二市免疫拡故分析を用いる
と、ウロキナーセ抗原に交］するム、降線は一本であっ
た。抗つロキナーセヤキ４０ｔ　ｍと非免疫ヤギ抽清の
Ｉｙθフラク／ヨン超：、ろろ％飽和アンモニウムザル
フエー１・で沈７１瞬させることによって製３貰し、こ
れをさらにｌ）　Ｋ　Ａ　Ｅ　−−ヒファロースクロマ
トクラフィーでギ＾′製のた。

ノイブリン平板に加えられた抗ウロキナーゼ１７Ｇ　（
５０ｐ’ｊ／ｎｔｅ　）は、抗／ｉ％　（５，０ＯＯＩ
ＬＴ／Ｉｘｅ）として用いられ／こ市販のウロキナーセ
標品の活性を完全にＩＳ１害しメこ。これらのｌ’ｙＧ
膿品（２０ＩＩＩｉ７／ｌｌ１ｌＶ）は、抗ヤキ血消つ
ザギ血清を用いて免疫電気泳動法を適用するとこれによ
り単一の沈降線を示した。

抗つロキナーゼ又Ｃよ正常Ｉ％標品５０　ｍｇｉＬ、ｃ
ｕａｔｒｃｃａｓ；＋５（ＪｙＢｉｏｌ、ｃｈｃｍ、２
４５．ろ０５９−６０６５（１９７０））の方法にした
がい、臭化ンアノゲンー活性化セファロースＣ、Ｌ−４
Ｂ　１５ｍｌ！とカップルさせた。ゲルを１．０　Ｍの
）ｒＪａｃｌを含有するｐＨ７４の０．０２ＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣＬの少くとも２０倍ゲル容積で洗浄した。組織
アクチベ　タとウロキナーゼのクロマトグラフを図−７
に示す。

（３）ｆｌｕ織−アクチベータとウロキナーゼのフィブ
リノ・セフアローズへの吸着 前述のＣｕａｔｒｅｃａｓａｓの方法にしたがい、ヒト
プラスミノーゲンのないフイブリノ−ゲ７２００１１１
ｇを臭化ンアノンエンー活性化セファ「１−スＣｉ、、
４１３２０ｍｇにｌ’）Ｈ８，３でカップルさせた。カ
ップルされたフィブリノ−ケンは、ひきつつき、Ｈｅｅ
ｌｌｌｔ２ら（Ｔｈ−ｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、２，１３７−
１４３（１９７３）　　）の力ｌ去によりトロンビン（
Ｉ　Ｕｎ　ｉ　ｔ／　７　）を加えて活性化（〜、次に
０．１５ＭのＮ、ＯＡ　、、　０．１　％　ｌ−リｌ−
ンｘ−１［］０．１μＭアプロチニン（バイエル社製）
を含有するｐｉ（７，４の０．０２　ＭのＴｒｉｓ−Ｈ
（：！ｔで洗ａ子した。カラムに充てんされたゲルを緩
衝液中２ｔΔのＮ　Ｈ４Ｓ　Ｃ１，１で洗浄し、次いで
１０培容量の緩衝液で洗浄した。

緩衝液中のウロキナーゼあるいは組織゛アクチベータの
標品（実施例１の（６）の段階から得たもの）をカラム
に加えた。洗浄後カラムに２ＭのＮＨ４ＳＣＮを通１〜
て溶出した。溶出液のプロティン濃度と呈色基質（Ｃｈ
ｒｏｒｎｏｇｃｎｉｃ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ）　Ｓ−２
２８８を用いる方法によりプラスミノーゲ／・アクチベ
ータ活性を１１１１定した。

（４）その他の方ｌＬ タン白魚の定置（は、標準タン白質として牛のＪｆｎｌ
占アルブミンを１月いるＩ−＋ＯＷ　ｌ’　ｙら（Ｊ、
Ｂｉｏｌ　、ＣＣ１１ｅ。

１９ろ、　２６５−２７５　（１９５１）　）の方法を
用いて行なった。１〜ウイーン８０中の可溶化タン白質
は、遠心分肉１１により沈降物を除去したのち、５ｈｉ
ｎら（Ｊ、１３ｉｃｌ　、Ｃｈｃ＋ｒ＋、２４９．７９
ＣＩ２−７９１　＋　　（１９７４）　　）　　の方法
で定（Ｃ４シた。場合によりフッ［オレザミンを用いる
）ｆへ度のよい方法（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｃ…、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ。

１５５．２１５−２２０　（１９７３）　）を用いた。

セファクリルＳ　−２００クロマトグラフィの後付られ
る溶出液は、日立スペクトロフメトメータＭｏｄｅｌ　
２００−２０ｆｌイ・］きのＬＫＢ　Ｕｖｉ　１ｃｏｒ
ｄ　ｌｌ検出器及び記録言１を用いて監視し／こ。

５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル和：気泳動は、Ｗｅｂ
ｅ＋　　ら　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｏｈｅｍ、２４４．４４
０６−４４１２　　　　（１９７２））の方法により行
なった。タン白質試別は、室温で６０分間１．０　％　
Ｓ　］）　Ｓ中でインギーベ−Ｉ−ｔ、、次に５％ボリ
アクリルアεドゲル中で′小；気泳動させた。場合によ
りタン白質は１％２−メルカプトエタノールで還元した
。ゲルはタン白質をクマ／−ブリリアントブルーで着色
するか、糖タン白質を過ヨウ素ｆ、哲−ンノフ試薬で脇
色した。

プラスミノーゲ／アクチベータ活性を測定するだめに、
平板ゲルのンステムで５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を５％ボリアクリルア＜）ゲルで行なった。電
気泳動させたのち、平板ゲルを、０．５　Ｍ　Ｎａ０ｔ
２　％　ｈウィーン８ｏを含有するｐＨ７，４の０．０
１　Ｍ　リン酸緩衝液で室温で２時間洗浄し、０２％ヒ
トフィブリノーゲノ、（プラスミノーゲン−リッチ又は
フリー）及びｏ５単位トロンビ／を含有する１係アガロ
ースゲルにより重層した。常湿室中で１〜７時間６７℃
でインキ−ベートした後、アガロースとポリアクリルア
ミドケルをクマシーブリリ゛アントブルーで着色した。

タン白質のみかけの分子量は前述のＷｅｂｅｒらの方法
にしたがい、標準タン白質の移動度を比較することによ
り（同定した。

精製した組織−アクチベータの等電点の測（市は、８　
Ｍ尿素１％両性毛７ｉ１’ｊ質を含有する７５係ポリア
クリルアミドゲル中で、Ｍｅｒｔｚら（Ｂｉ　ｏｃｈｅ
ｍ。

Ｂｉｏｐｌ＋ｙｓ、Ｒｃｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、４９　、８
４−９１　（１９７２）　）の方法を用いて行なった。

試別は、２ｍＭの　Ｉｎ　１）ＴＡ及び１％両性市解質
を含有する８　Ｍ尿素中で可溶化しプこ。［）■１ばＦ
ｉｎｌａｙｓｏｎら（Ａｎａ　ｌ　、１３ｉ　ｏｔ：ｌ
＋ｃｍ４０、２９２−３１１　（１９７１）　）の方法
によって決シｉ４した。

不肖製した組織アクチベータは、口、　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ
７００２％トウイン８０を含有するｐＨ８０の［＋、０
２　Ｍのへ Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ−ＨＣｌ中の組織アクチベータ試別５０
μを及び同じ緩衝液中の基質２．　Ｏｕｔｌを添加する
ことにより、各種の螢光基質でテストした。螢光基質と
しでは次のものを用いた。

Ｊ３（ＩＣ−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルキニ
ン−４−メチルクマリル−７−アミトカルホベンソ゛キ
ン−Ｉ」−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニン−４−メ
チルクマリル−７−アミド Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニルアラニル−■−７−アルギ
ニンー４−メチルクマリル−７〜アミドクｆｉｖり’）
ルークリシル−し−プ′ルギニノー４−メチルクマリル
−７−アミド ／−アミノ−４−メチルクマリｙ　（ＡＭＣ）の初期放
出は、島津螢光スペクトロフ第１・メータ、距）ｃｌｃ
ｌＲＦ−５２０中で、６７℃で螢光計を用いて測定した
。

螢光計は３　Ｆ３　Ｑ　１１１’ｎで励起４６０ｎ　Ｉ
ｎで放出するようセノトシ、０１係４つＭＳＯ中のＡＭ
Ｃの０．２　Ｍ溶液が１０相対螢光単位を力えるよう調
節した。精製糺Ａｉｔアクチベータの加水分解活性は、
組織アクチベータ試刺２００μｔ、　　Ｑ、　Ｉ　Ｍ　
ＮａＣ１，０，０２％トウィーン８０を含有するｐＨ８
０の０．１ＭのＴｒｉｓ−■（Ｃｔ２００μｔＩ　ろ１
１］ＭのＳ−，２２５１又はｉｌｎＭのＳ−２２８８の
２００／ｌｔを加えることにより、呈色基質を用いて測
定１〜だ。Ｐ−二トロアニリンの初期放出は、ガラスセ
ル中４０５　ｎ用でろ７℃で分光光度言１を用いて測定
１〜だ。加水分解活性の初期速度Ｉ」、呈色基質につい
ては△ｒｎ　Ａ　／ＩＴＩ　ｉ　＋１で、螢光基質につ
いては６％　７ｍ　ｉ　ｎで表現した。ンイソグロビル
フルメロノメスフエ−１・、ヨードアセトアミドントリ
グノノインヒビター、ＩＪ−アルギニン゛アグロチニン
で処理したときの組織アクチベータの阻害効果ｄ．罷色
基質Ｓ−２２８８で試験１〜だ。糖製組織アクチベータ
試イ′」は、阻害剤を加えて６７℃、１時間インキーベ
ー１・した。混合物から２００ｐｔとりたし、緩衝液２
００７ｚｔ，基質１ｔｎＭを加えた。

△Ａ／ｌｌｌｉｎの値を比較することにより、各試薬の
阻害効果をｉｉｌｌｌ定しだ。

（５）実ノＫＩＬ例１の方法により精製し、実施例２で
述べた分析力法全用いて精製物を分４７ｒｌ，た結果を
第２表に示す。

実施例４ 本発明の＆ｌ　Ｉ　織プラスミノーケン・アクチベ〜り
の１′１質 （１）分′ｒ−，ｆｊ’： 実施例１（６）から得られる精製組織アクチベ〜りを、
５ｌ）Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定
した結果、腎由来のアクブベータは約１φＷ７２に、血
管のそれは約１ψＷ７０にであった。

これらの組織゛アクブベータは、糖鎖の存在ｒ５　ｉｆ
＜す過ヨウ素酸−７ソフ試薬に陽性だった。例えは、腎
アクチベータの場合、粗抽出物と軸装組織７′クチベ〜
りをＳ　］）　］Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気急派
より分析′シ、次にゲルをフィブリン−寒天平板に展開
すると、精製Ｉ〜だ組織アクブベータの単一バンドの電
気泳動の移動度は、粗抽出物の主なフィブリン溶解帯の
移動度と同一だった。こえＬは、みかけの分子量が７０
，０００であることを示している（第６図）。溶解帯は
フィブリン−寒天平板のプラスミノーゲンの存在に依存
した。

これらの知見から、ヒト腎１に７ｃ組織からの粗抽出物
は、プラスミノーゲン・アクブベータを含有し、このプ
ラスミノーゲン・アクブベータは、みかけの分子量−約
７０，０００のものを主成分としていることがわかる。

同降な実験を血管由来のアクブベータを用いて行ったと
ころ、その分子■は約７０，０００と推定された。

（２）等重点 精製アクチベ〜りの等電点は、その主ピークが腎由来の
ものが８２に１血管由来のそノ１が７８を示した。等電
点を測定したのち、薄膜ゲル（厚ｉ、　５　Ｉｎｍ　）
のフィブリン−寒天平板上のアクチベータ活ｉ生をｄ１
１］定すると、アクチベータ活１’、１：１．Ｊ１、等
重点ｐＨ８，２及び７８の周辺にそれ、それ見い出され
た。

（３）組織アクブベータとウロキナーゼとの免疫学上の
相違 １イ１鳳ＭＪ織及び血管壁から得られるアクブベータが
、つａキナーゼと同一の抗ノ京１イ１：をイ１するか否
かを検削するために、実施例１（６）のｈｌＪアクテベ
ータと実施例１（３）のアクブベータの抗ウロキナーゼ
］、’ｙＧ　−−１＝フア「Ｊ−ス親和性クロマトり゛
ラフイ処理により’（１られたタン白質どアクチベータ
活性成分の溶出グ「Ｊフィールをウロキナーゼ′の溶出
グロフイールと比較した。これケ＠７図に示す。第７図
のように、ウロキナーゼは強くカラムに吸収され、はと
んど４≧での負荷した活性は、０．１５ＭのＮ　ａｃ：
　を及び０１％のｌ’ｒ　ｉ　ｔｏｎ　Ｘ　−１００を
含有するｐＨ２，４の０．１ＭグリンンーＨ（、ｔで溶
出された。通過冶液中のタン白質に１、ここで用いた市
販のウロキナーゼに添加されている血清アルブミンたっ
た。一方、精製−アクチベータｄ：ノノラムを通過し、
吸着されず、１１１１２／ｌのグリ／〕ｈ　液では、タ
ン白も活性も溶出されなかつン′ξ。実施例１（ろ）で
得られる部分精製標品を同じカジノ、に負荷すると、負
荷活性の約１５係がカラ・、に吸着され、ｌ）Ｈ２，４
のグリシノ（容１夜に冶１１旨！；ｉ、／こ３、これら
の知見にもとうき、本発明に係るアクブーく一タン」、
免疫学的にウロキナーゼに類（１：ｔ　１．、、でいな
いπ１１織−アクブベータであり、腎；賊からｒ！ｊ　
’Ｌ〕する相抽出り吻シこシ；ｊ２、少：１）成分とし
２てつ１１ギナ−七’Ｋ　＆：Ｊ、ウロキナーゼ１５９
アクチベ−タタ含んでいることかわかる。一方、Ｉｍ管
壁アクチベ−タに対する抗血清は腎アクチベータと良く
交叉反応を起こし、両者が免疫学的にも類似しているこ
とを示唆している。

（４）組織アクブベータのフィブリ／−セファロース親
和性 ウロキナーゼと組織アクチヘヘタの不溶化フィブリン−
モノマーに対する親和イ１ユをフィブリ／−セファロー
スカラムを用いてしらべた。

本発明に係る組織アクブベータ（′央ｊ′崩例１　（６
）　）　＆；ｔ、全てフィブリン−セファロースカラム
に１７　措’　＠　ｆｌ、２　Ｍ　ＮＲ，ＳＣ！Ｈに溶
出されて、総員イＲＪ活性（７）９ＣＪ％以上を回収し
た。一方、はとんと争てのつ「コキナーセ活性成分は、
カラムを通過し、アクブベーク活性は、２Ｍの■鉗４．
ＳＣＮによるカラムからの溶出液中には見い出せなかっ
た。以上のとおり、ヒト腎臓から得られる本発明の組織
アクナベ−フタ１弓１、フィブリン−セファロースに強
い親、和性を有している。。

（５）細織アクチベータに対する合成基澗の將異性壓施
例１（６）てイ；ｊだアクヂベータに夕・」する合成基
質のへ ！１．′ｌ′異１ノーをしら−＼た。用いた基質Ｃ１、
次のとおりである。

プラスミノに文；］シては、■１−■）−バリル−［Ｊ
−ロイシル−Ｌ−リシン−Ｐ −ニトロアニリドジヒド ロクロライド（Ｓ−２２５１） 天然）・１−１ヒンに対しては、ｒｔｏｃ−１，＋−バ
リル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルキ コン−４−メチル−クマ リル−７−アミド （３０９３−Ｖ　） プラズマに７・」シては、カルボベ／ゾキン−１，−フ
ェニルアラニル−Ｌ−ア ルギコンー４−メチルク マリル−７−アミド （３０９５−■） 尿カリクレインに対しては、１．−プロリル−１，−フ
ェニルアラニル−Ｌ− アルギニン−４−メチル クマリル−７−アミ　１・ （ろ　０　９　６　−　　Ｖ　　） ウロキナーゼに列しては、グルタミル−グリツルー［、
−アルギニン−４− メチルクマリル−７−ア ミ　ド　（ろ　０９７−Ｖ） 組織プラスミノーゲン・アクチベータに対し、ては、Ｈ
−］）−一〜イノロイ／ルー Ｌ−プロリル−Ｌ−アル キニン−１〕−二１＼「１アニ リド／ヒドロクロライド （Ｓ−２２８８） 本発明の組織アクチベータは、Ｓ−２２５１、Ｓ−２２
８８以外のどの基質に対しても水Ｗｆ活性を示さなかっ
た。本発明の組織アクチベータの活１生（１００ＵＫＩ
Ｕ　／ｒｔｄ！　）は、Ｓ−２２５１について８８△Ｉ
ｌ’ｌＡ／　ｍ　ｉ　ｎ、Ｓ−２２８８にっ１ハて７ｏ
△＋ｎＡ／ｉｎ　ｉ　ｎである。

本発明のアクチベータは、阻害剤による処理によっても
特徴が示される。５−２２８８に対する本発明のアクチ
ベータのアミド分触活性Ｑよ、５０ＫＩＵ／　ｍｅ　ノ
ー７プｏ　ｆ−＝　７．１０＋ｎＭ　ヨー　１”７　セ
ト’ｆ　ミド、５０／１７／〃ｌｅノノイヒ−ントリブ
／ノ、ｌ５１１害削の」易合にｔよ観察されなかったが
、１００ｍＭ　ＴＪ−アルギニンで（」、２６％、５１
１１Ｍ　／イソプロビルフルオロノオスフエ−１−では
９Ｂ係、それぞれ阻害された。

（６）安定性 本発明のグラスミノーゲンアクチベータは、ｐｌ（７４
の緩動溶液中では、４℃、２週間後も何らの活１４１低
十−がみられなかった。これは、Ｉ　ＭのＮ１１４ＳＣ
Ｎを看在させても、０．０２係トウイーン８０及び０．
ＩＭのＮ　、、　Ｃｔを存在させても同じ結果だった。

０５　Ｍ　Ｎａｃｚ及び００２％トウィーン８０を含む
緩イ！Ｉｉｊ溶液中、１）Ｈ１〜１０．４℃で２４時間
その安定性を調べた結果、本発明のプラスミノーゲン・
アクチベータは、１〕Ｈ２〜１０の範囲で安定だった。

１）Ｈ１，０では、７０チの活性低下が認められた。

以上、詳細に説明したように、本発明に係るアクチベー
タは、ウロキナーゼとは異なる新規なプラスミノ−ゲン
・アクチベータであって、損傷部位における血管内壁及
び外壁のフィブリン沈ぜきの分解を含む組織回復の制御
に一Φυな役目を果すものである。

いうまでもなく、本発明に係る新規なプラスミノーゲン
・アクチベータは、咄乳動物の各種の器官からも分前し
うるものであって、本シヘ明のプラスミノーゲン・アク
チヘータ固有の性質を其ｆｌｉｆｉする限り、その出所
を問わＶ、本発明のＫ１１ｉ）聞出のものである。

本発明の係るアクチベータの”Ａ、］Ｎ方θモに」：す
、組織アクチベータは、高度に！＋７製されて分１〜１
１することができ、アセトンで乾燥し／こヒト腎１賊の
比ｌｉ’＋性よりも３０．００　Ｄ〜４５，０００倍の
活性増加をみた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実Ｍｌｉ例１（ろ）の亜鉛−ヤレ　Ｉ・セフ
ノ′ロースクロマトグラフィーである。 第２図ケよ、実施例１（４）のコンカッ−・習ンＡ−セ
ファロースクロマトグラフィーである。 第３図は、実施例１（５）のＣＭ−セファ１コースクロ
マトグラフィーである。 第４図Ｃ」１、実１に１１例１（６）の七フアクリルｓ
’２００ゲルン１１過の結果を示すものである。 第５図ｅ：ｊ、本発明の腎）臓から精製し／Ｃプラスミ
ノ　ケン・アクチヘータのＳ　Ｄ　Ｓ−ポリアクリル’
／”ミドゲル電急派動全示−ノーものである。第５図に
おいてΔｄ腎ＩＩ威から、Ｊ３は面イ１てｔ”ｉｒから
そノ１．ぞれ：Ｆｉ’；製１〜だものである。Ｃは培養
したヒト正常２倍体から分泌され／こアクチベータであ
り、Ｄは市販のつ「Ｊギツ−−−−ゼ標品を示す。 ＃（＞６図は、５ｌ）Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を経た後の本発明のプラスミノーゲン・アクチベー
タａ：同定したものである。第６図にお・いて、・１．
Ｉ）は実施例１（６）の和製したプラスミノ−グツ・−
アクヂベータであり、ｃ、ｄは実施例１（３）の相抽出
Ｃ勿である３１寸だ、ａ、ｃはポリアクリルアミドゲル
を用いたものであり、ｌ〕、ｄはノイブリンーアガロー
スゲルを用いたものである１、第７図Ｃよ、抗つロギナ
ーゼＩｙＧ−セファロースカラノ・を用いた場合のウロ
キナーゼと本発明の腎由来のプラスミノーゲンｅアクチ
ベータの親和クロマトグラフィーである　鎮１１１、゛
立−ｍオガ舛七花値丸　　　　三ブト東圧化学株式会社
第　　　４１ソ１ フラク／ｄ　７　Ｎ　。 第　　５１ツ１ 熾６図 ■ Ａ　　　　　　　Ｉ３　　　　　　０　　　　　　　’
１つ第７図 フラクンヨノ廟

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １次の特徴を有するプラスｄ）−ゲノ・アクチベータ。 （１）すトリウムドテンルザルフエ−１・−ポリアクリ
   ルアミドゲル電気泳動法により、１本のタノ白１７ｉバ
   ンドを示し、みかけの分子、　、ｉ、（が約＋ ７０、［＋００−５．０［］０であること。 （２）等′１１−Ｉ、点′１］Ｌ気泳動法による主バン
   トのｐ　丁が７〜９の範囲にあること。 （ろ）細織あるいは血管から１〜２Ｍの＋ｉｎ、５ｃＮ
   （ｐＨ７，４）で抽出あるいはｌ＋゛＋ｉ流され、０１
   ％トウイー７８０等の存在下で精製用６ヒであること。 （／ｌ）Ｊ＞’ＣウロキナーゼＩｙＧ−七フ′Ｙロース
   親和性り「１７トグラフイーにより吸頒−されない免疫
   学的性質を有すること。 （５）フィブリン−セファロースカラムに実’＃　的に
   全て吸着され、かつ２ＭのＮＨ，ＳＣＮにより溶出され
   る性質余有すること。 （６）グループ（Ａ）の物質に加水分１１１１ｇ　ｌｉ
   ！′ｌｌ’ｌを示し、グループ（Ｂ）の物質に活性を示
   さない＋１：　’ｍを有′Ｊ−ること。 （グループＡ）Ｈ−ｒ＋−バリル−Ｌ　’−ｒ”インル
   リ　　　　、 −Ｌ　−’）　ンン−１）　−ニトロアニド／ヒドロク
   ロラヘ イト及び、）コーＤ−インロイシル−■・−ゾロリル−
   Ｌ−アルギニン−ｐ−二１〜ロアニリト・ンヒドロクロ
   ライド、（グループＢ　）　　ｐｏｃ　、−Ｔ、−バリ
   ／ｌ／−Ｌ−フロリルーＬ〜アルギニン−４−メチルク
   マリル−７−アミド、カルホベンゾギ：／−１，−フェ
   ニルアラニル−Ｔ、−アルキニン−、４−メチルクマリ
   ル−７−アミド、■、−ゾ「ノリル−１１−フェニルア
   ラニル−】３．−アルギニ／−４−メチルクマリル−７
   −アミド、グルタリル−グリ／ルー　■、−アルキニン
   ー４−メチルクマリル−７−ア、ｌＸｌ・（７）Ｉ翔Ｚ
   ４の綾部ｙ溶液中４℃で２週間後も安定であること。 ２ヒト腎１臓又はヒト血管から常法によりアンモニウム
   チオンアネ−１・の存在下で抽出し、次いで該抽出液を
   イオン交換体を保持するシラス・、金属ギレートカラム
   、Ｌ−アルギニンあるいｄ“アルギニ／誘導体を相体に
   結合したカラム、１ｒ１１球凝集素を４」」体に結合し
   たカラムおよび分子篩能を有Ｉ゛る印体を保持するカラ
   ムから篇はれるカラム又はこれらを組み合せた複数のシ
   ラス・に通じてオ′ｎ製することを特徴とする次の諸性
   Ｔｔを有するプラスミノーゲン・アクヂベータの製造方
   法。 （１）すｌ・リウム・トテシルザルフェ−１・・ポリア
   クリルアミドゲル電気泳動法により１本のタン白バンド
   を示し、みかけの分子１看が、約７０．０［川±５．０
   ００であり、 （２）等電点電気泳動法による主バンドのｐ」が７〜９
   の範囲にあり、 （′５）組織あるいは血管から１乃至２ＭのＮＪＩ、５
   ＣＮ（１）Ｉ（７，４）で抽出あるいはｉｌ’ｌｆ流さ
   れ、０１％のトリトンｘ−ｉｏｏ等の存在下で精製され
   、（４）抗ウロキナーゼ　Ｉｆ／Ｇ−セファロ−スル罰
   性りロマトグラフィーにより吸着されない免疫学的性質
   を有し、 （５）フィブリン−セファロースカラムに実質的に全て
   吸着され、かつ２ＭのＮＨ４ＳＣＮにょ９溶出される性
   質を有し、 （６）Ｉコ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロインルーツノン−１〕
   −二トロアニリドソヒドロクロライド及び［１−Ｄ−イ
   ノ口・１シル−Ｌ−７’ロリルー　Ｌ　−、フルギニン
   ーｐ−二トロアニリド／ヒドロクロライドに加水分解活
   性を示し、ＢＯＣ−Ｌ−バリル−■１−プロリルー１１
   −アルキニン−４−メチルクマリル−７−アミド、カル
   ボキシベ／ゾキ７−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ　　フル
   キニン−４−メチルクマリル−７−アミド、Ｌ−プロリ
   ル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルキニン−４−メチ
   ルクマリル−７−アミド、グルタリル−グリノン−１，
   −アルギニ／−４−メチルクマリル−７−アミドに加水
   分解活性を示さない性質を有し、 （７）　Ｉ）Ｈ７，４の緩衝液中４℃で２週間後も安定
   であること。