NO166314B

NO166314B - Fremgangsmaate for fremstilling av en plasminogenaktivatoravledet fra human nyre.

Info

Publication number: NO166314B
Application number: NO84842468A
Authority: NO
Inventors: Seishi Takahashi; Kazushi Morimoto; Yoshikazu Fujisawa; Fumiaki Ikeda
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date: 1982-10-29
Filing date: 1984-06-19
Publication date: 1991-03-25
Also published as: GB8414992D0; GB2138824A; DK307384D0; CA1221029A; EP0124613B1; IT1169910B; SE8403375D0; SE8403375L; DK169686B1; DE3390272C2; NL191755C; NO842468L; FI842627A; EP0124613A1; FI80597B; NL8320346A; IT8323533A0; CH660742A5; FI842627A0; NO166314C

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en plasminogenaktivator avledet fra human nyre.

Kjent teknikk

Plasminogenaktivatorer kan klassifiseres alt etter deres kilder i vevaktivatorer, vaskulære aktivatorer, blod-aktivatorer, urokinase og lignende. Plasminogenaktivatorer spiller en viktig rolle i fibrinolytisk (fibrin-spaltende) aktiviteter og finnes i et utall av organer i pattedyr. På den annen side er et stort arbeid i det siste blitt nedlagt for å oppnå plasminogenaktivatorer fra dyrkede celler. I de ovenfor angitte arbeider har det som dyrkede celler vært anvendt f.eks. ondartede tumorceller, blodkarendotelium, stimulert makrofag, granulære stivelsesceller stimulert med follik-kelstimulerende hormon o.l. Det er også blitt rapportert biokjemiske og immunologiske egenskaper av plasminogenaktivatorer isolert fra humorale vevhomogenater, dyrkede celler og kulturmedia.

Rensingen av human vevplasminogenaktivator er imidlertid sjelden blitt utført. Dette synes å tilskrives vanskeligheten med å oppnå utgangsmaterialer i en tilstrekkelig mengde, og ennvidere den hydrofobe egenskap av enzymene inneholdt i utgangsmaterialet og ustabiliteten av slike enzymer i buffer, og i enkelte tilfeller, nærvær av ukjent protease under renselsesforløpet. Under disse omstendigheter isolerte Rijken et al human uterus plasminogenaktivator med en molekylvekt på 69 000 og fastslo at aktivatoren både immunologisk og biokjemisk var lik human vaskulær plasminogenaktivator. I tillegg er en annen human vaskulær plasminogenaktivator med en molekylvekt som er forskjellig fra den ovenfor angitte humane uterus plasminogenaktivator blitt isolert og identifisert.

Kwaan et al utførte en undersøkelse på en plasminogenaktivator avledet fra humant nyrevev og fastslo at aktivatoren er tilstede prinsipielt i endoteliet av blodkar, spesielt i endoteliet av vener (Fed. Proe. 24, 387 (1965)). Det er også blitt rapportert av Kucinski et al (J. Clin. Invest. 47, 1238-1253 (1968)), Bernik et al (J. Clin. Invest. 48, 1740-1753 (1969)), Barlow et al (Thromb. Res. 1, 201-208 (1972)), Åsted et al (Experimentia 33, 589-590 (1978)) og Lewis (Thromb. Haemostas. 42, 895-890 (1979)) at en slik plasminogenaktivator erholdt fra dyrkning av humant nyrevev er identisk immunologisk og fysiokjemisk med urokinase.

Urokinase som er en plasminogenaktivator isolert fra urin eller dyrkede nyreceller, og streptokinase som er en plasminogenaktivator oppsamlet fra streptokokker anvendes for tiden som et trombolytisk middel med det formål å behandle trombose. Både urokinase og streptokinase er imidlertid forskjellig fra den normale plasminogenaktivator som oppsamles fra blod. Disse plasminogenaktivatorer har ikke noen spesifikk affinitet overfor fibrin. Resultatene erholdt fra anvendelse av urokinase og streptokinase ved behandling av trombose var således ikke fullt ut tilfredsstillende i ethvert hen-seende. For å oppnå ønskede effekter er det nødvendig å admi-nistrere disse i relativt store mengder. Imidlertid fremkaller massiv administrering slike alvorlige bivirkninger som oppløs-ning av fibrinogen og indre blødning. Det foreligger således et sterkt behov for utvikling av et legemiddel som kan fremstilles i relativ stor målestokk, som har få bivirkninger og som utviser høy trombus-oppløsende aktivitet.

Som et resultat av en intensiv forskning over vevplasminogenaktivatoren isolert og renset fra humane nyrer og humane blodkar er det overraskende funnet en plasminogenaktivator som har egenskaper som er signifikant forskjellige fra egenskapene til urokinase avledet fra humane nyrer eller humane blodkar, selv om det er blitt antatt at urokinase er den eneste prinsipielle plasminogenaktivator som er tilgjengelig fra humane nyrer og humane blodkar. Under den videre under-søkelse over plasminogenaktivatoren fra forskjellige synspunkt er det også blitt fastslått at plasminogenaktivatoren har sterk trombose-oppløsende effekt.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Et mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av en plasminogenaktivator fra human nyre med følgende karakteristiske egenskaper:

(1) Hovedproteinbåndet målt ved natriumdodecylsul-fat-polyacrylamidgelelektroforese har en molekylvekt på 70 000 5 000; (2) hovedbåndet ved isoelektrisk punkt-elektroforese har en pl på 7 til 9; (3) plasminogenaktivatoren har den immunologiske egenskap at den ikke blir adsorbert ved anti-urokinase igG-Sepharose-affinitetskromatografi; og (4) plasminogenaktivatoren hydrolyserer H-D-valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroaniliddihydroklorid og H-D-isoleucyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroaniliddihydroklorid, men hydrolyserer ikke boc-L-valyl-L-prolyl-L-arginin-4-methylcoumary1-7-amid, carbobenzoxy-L-fenylalanyl-L-arginin-4-methylcoumaryl-7-amid, L-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginin-4-methylcoumaryl-7-amid og glutaryl-glycyl-L-arginin-4-methylcoumary1-7-amid.

Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at

(i) en human nyre underkastes en ekstraksjon med en amnion-iumthiocyanatløsning bufret med tris-HCl tii en pH i området 7,0 til 7,4; (ii) ekstraktet fra (i) føres gjennom en DEAE-Sepharose-kolonne ved pH 7,0 til 7,4; (iii) de erholdte eluater f ra (ii) føres gjennom en Sink-Chelat-Sepharose-kolonne ved pH 6,5 - 7,4; (iv) de fibrinolytisk aktive fraksjoner fra (iii) føres gjennom en concanavalin A-Sepharose-kolonne ved pH 7,0-7,5; (v) de erholdte vevsaktivator-inneholdende fraksjoner fra (iv) føres gjennom en CM-Sepharosekolonne ved pH 4,0 - 5,0; (vi) en konsentrert prøve av vevsaktivatoren fra (v) føres gjennom en Sephacryl S-200 kolonne ved pH 7,0 - 7,5;

for å rense og konsentrere plasminogenaktivatoren.

Den nye plasminogenaktivator er i stand til å supplere de immunologiske ulemper som urokinase er beheftet med som allerede er blitt utviklet som et legemiddel med trombus-oppløsende aktivitet, og kan således anvendes som en aktiv bestanddel i et trombolytisk middel med sterk trombolytisk effekt.

Kort beskrivelse av tegningene

I tegningene angir figur 1 en sinkchelat-sepharose-kromatogram av en plasminogenaktivator erholdt i eksempel 1 (3);

figur 2 er et concanavalin A-Sepharose-kromatogram

av en plasminogenaktivator erholdt i eksempel 1 (4);

figur 3 er et CM-Sepharose-kromatogram av en plasminogenaktivator erholdt i eksempel 1 (5);

figur 4 viser resultatene av Sephacryl S-200 gelfiltrering av én plasminogenaktivator erholdt i eksempel 1 (6);

figur 5 illustrerer SDS-polyacrylamidgelelektroforese av en plasminogenaktivator fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, hvilken plasminogenaktivator er blitt isolert fra nyrer. Bokstavene A, B, C og D svarer henholdsvis til aktivatoren ekstrahert fra nyrene og deretter renset, en aktivator ekstrahert fra vaskulære vegger og deretter renset, en aktivator utskilt fra dyrket normalt •humant diploid, og en kommersielt tilgjengelig urokinase-prøve;

figur 6 angir identifiseringsresultater av plasminogenaktivatorer fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som på forhånd var blitt underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Bokstavene A og B svarer til en renset plasminogenaktivator erholdt i eksempel 1 (6), mens bokstavene C og D svarer til et urent ekstrakt erholdt i eksempel 1 (3). En polyacrylamidgel ble anvendt for å oppnå plasminogenaktivatorene A og C, mens en fibrin-agarosegel ble anvendt for å tilveiebringe plasminogenaktivatorene B og D.

figur 7 er affinitetskromatogrammer av urokinase og en plasminogenaktivator fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fra en nyre, begge erholdt ved anvendelse av antiurokinase IgG-Sepharose-kolonner;

figur 8 viser elueringskurver, hver erholdt ved eluering av en plasminogenaktivator, fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, en bestanddel av et trombolytisk middel i henhold til den metode beskrevet i eksempel 5;

figur 9 er et diagram hvori den trombolytiske aktivitet av et trombolytisk middel fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen sammenlignes med aktiviteten av urokinase. Kurve (a) svarer til det trombolytiske middel,

kurve (b) svarer til urokinase og kurve (c) svarer til urokinase til hvilket det trombolytiske middel var tilsatt 10 timer senere; og

figur 10 illustrerer skjematisk den trombolytiske effekt av et trombolytisk middel fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen overfor trombose i mennesker og forskjellige dyr. Kurver (a), (b), (c), (d) og (e) tilsvarer menneske, ape, kanin, hund og rotte.

B est måte for utførelse av oppfinnelsen

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og egenskapene av den nye aktivator erholdt ved fremgangsmåten vil i det etterfølgende bli beskrevet i detalj. Med mindre annet er angitt ble alle prosedyrer utført ved 4°C.

Eksempel 1

Rensing av plasminogenaktivator erholdt fra nyre:

(1) Ekstraksjon av plasminogenaktivator:

Etter mekanisk fjerning av blodklumper, bindevev og lipider fra en human nyre som var fri for ethvert infek-sjonssymptom (som var blitt lagret ved -70°C) ble aceton ved

-15°C tilsatt og nyren ble malt ned i en homogenisator. Suspensjonen ble omrørt ved -15°C i 30 minutter og fikk deretter stå ved -20°C. Overflatebelegget ble fjernet ved dekantering og avfetningen ble gjentatt med aceton ved -15°C. Den resulterende suspensjon ble deretter filtrert. Filterkaken ble

vasket med aceton ved -20°C og ble deretter tørket. Deretter ble 100 g av det således avfettede pulver suspendert i 1 liter 1-mol NH4SCN-løsning bufret med en 0,02-mol tris-HCl-løsning ved pH 7,0 - 7,4. Den resulterende suspensjon ble omrørt. Suspensjonen ble separert i et ekstrakt og et bunnfall ved sentrifugering. Bunnfallet ble ekstrahert igjen med den samme 1 liter 1-mol NH^SCN-løsning. Ekstraktene ble kombinert under dannelse av et råekstrakt.

(2) DEAE-Sepharose-kromatografi:

Råekstraktet erholdt ved den ovenfor beskrevne prosedyre (1) ble fortynnet med den samme mengde av en 0,02-mol tris-HCl-løsning med pH 7,0 - 7,4. Den således fremstilte prøve ble ført gjennom en DEAE-Sepharose-kolonne som var blitt ekvilibrert med en 0,02%-ig løsning av et ikke-ionisk over-flateaktivt middel, dvs. Tween 80 og en 0,02-mol tris HC1-løsning som inneholdt 0,25 mol NH^SCN. Avløpene fra kolonnen ble kombinert, til hvilke NaCl ble tilsatt for å bringe slutt-konsentrasjonen til 1,0 mol. pH på løsningen ble justert til 7,4 med 1N-HC1.

(3) Sinkchelat-Sepharose-kromatografi:

El uåtene erholdt ved den ovenfor beskrevne prosedyre (2) ble ført gjennom en sinkchelat-Sepharose-kolonne som var blitt ekvilibrert med en 0,002-mol tris-HCl-løsning som hadde en pH på 7,0 og inneholdt 1,0 mol NaCl, 0,25 mol NHjSCN og 0,02 mol Tween 80. Etter vasking av kolonnen med den ovenfor angitte ekvilibreringsløsning inntil konsentrasjonen av proteiner i eluatet var redusert til 0,01 mg/ml ble kolonnen ytterligere vasket med en buffer hvis sammensetning var identisk med den ovenfor angitte ekvilibreringsløsning med det unntak at bufferen ikke inneholdt NH^SCN, men 0,15 mol NaCl. Kolonnen ble deretter vasket med en 0,05-mol imidazolløsning og vevaktivatoren ble derved eluert i vaskeløsningen. Profilen av det resulterende kromatogram er vist i figur 1.

(4) Concanavalin A-Sepharose-kromatografi:

Fraksjoner av vevaktivatoren som var blitt erholdt ved den ovenfor beskrevne prosedyre (3) ble ført gjennom en concanavalin A-Sepharose-kolonne. Kolonnen var på forhånd blitt ekvilibrert med en 0,02-mol tris-HCl-løsning som hadde en pH på 7,4 og inneholdt 0,15 mol NaCl og 0,02% Tween 80. Etter gjentagen vasking av kolonnen med ekvilibreringsløsningen inntil konsentrasjonen av proteiner i eluatet hadde nådd basis-linjen ble vevaktivatoren eluert med en ekvilibrerende løsning som inneholdt 0,5 mol a-D-methylmannosid. Fraksjoner inneholdende aktivator ble kombinert og pH på den resulterende løsning ble justert til 4,5 med eddiksyre. Profilen av det resulterende kromatogram er vist i figur 2. Rijken et al rapporterte at et lineært gradientelueringsmiddel av a-D-methyLmannosid (0 - 0,6 mol) er effektivt ved isolering av en plasminogenaktivator fra human uterus-vev (Biochim Biophys. Acta: 580, 140-153 (1979)). Når det lineære gradientelueringsmiddel av a-D-methylmannosid ble anvendt var elueringsprcfilen av aktivatoraktiviteten i overensstemmelse med den av proteiner. Praktisk talt alle elueringspunkter av plasminogenaktivatoren var nær elueringspunktene av den 0,35-mol o.-D-methylmannosid-løsning og noe høyere enn de som er rapportert av Rijken et al.

(5) CM-Sepharose-kromatografi:

Vevaktivator-holdige fraksjoner erholdt ved den ovenfor beskrevne prosedyre (4) ble ført gjennom en CM-Sepharosekolonne. Kolonnen var på forhånd blitt ekvilibrert med en 0,02M eddiksyrebuffer som har en pH på 4,5 og som inneholdt 0,15 mol NaCl og 0,02% Tween 80.

Etter vasking av kolonnen med ekvilibreringsiøsnin-gen ble kolonnen fremkalt med den samme ekvilibreringsløsning med det unntak at konsentrasjonen av NaCl var lineært øket fra 0,15 mol til 1,0 mol. Vevaktivatoren ble eluert nær en NaCl-konsentrasjon på 0,45 mol. Elueringsprofilen er illustrert i figur 3. Vevaktivatoren ble adsorbert på CM-Sepharo-sen i ekvilibreringsløsningen og ca. 50-60% av de ladde proteiner fikk passere gjennom kolonnen. Vevaktivatoren ble eluert nær en NaCl-konsentrasjon på 0,45 mol. Dette er ekvi-valent med ca. 40% eluering av de anvendte proteiner. Den spesifikke aktivitet ble øket ca. 2,4 ganger. Fraksjoner inneholdende aktivatoren ble kombinert og underkastet en ultrafiltrering gjennom en Diaflo-membran PM 10 for å konsentrere denne. Utveksling av aktivatorprøven med en buffer ble ut-ført på en Sephadex G-25-kolonne.

Kolonnen var på forhånd blitt ekvilibrert med en 0,02-mol tris-HCl-løsning som hadde en pH på 7,4 og inneholdt 1,0 mol NH4SCN. Kolonnen ble fremkalt med en buffer som var identisk med ekvilibreringsløsningen. Fraksjoner som inneholdt de således eluerte proteiner ble kombinert og deretter underkastet en ultrafiltrering gjennom en Diaflo-membran PM 10 for å konsentrere løsningen.

(6) Sephacryl S-200 gelfiltrering:

En konsentrert prøve av vevaktivatoren ble ført gjennom en Sephacryl S-200-kolonne som på forhånd var blitt ekvilibrert med en 0,02-mol tris-HCl-løsning som hadde en pH på 7,4 og inneholdt 1,0 mol NH4SCN.

Eluatene, som var fraksjoner av vevaktivatoren ble lagret ved -70°C. Elueringsprofilen er vist i figur 4.

Eksempel 2

Analyse av vevplasrninogenaktivator og resultater:

(1) Med mindre annet er angitt ble hver plasminogenaktivator analysert ved fibrin-agarplatemetoden beskrevet i Immunochemistry 9, 709-723 (1972). Den fibrinolytiske aktivitet av vevaktivatoren ble sammenlignet med den av urokinase og ble uttrykt i den internasjonale enhet (UKIU). Standard-kurvene som viser aktiviteten av seriefortynninger av både

plasminogenaktivator fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og urokinase var rette i det lytiske areal på 70 - 24 0 mm 2. Imidlertid var gradienten for standardkurven av vevaktivatoren ikke fullstendig i overensstemmelse med den for

urokinase. Aktiviteten av vevaktivatoren ble bestemt ved måling av de lytiske arealer av fortynnede prøver innen området 120 - 200 mm 2. Det lytiske areal av 10 ul eller 1 IU/ml urokinase var 156 mm ' 2. Reproduserbarheten ved fibrin-agarplatemetoden var _+ 6%. Den enzymatiske aktivitet av vevaktivatoren ble standardisert ved den enzymatiske aktivitet av urokinase og den prosentvise gjenvinning av vevaktivatoren og dens spesifikke aktivitet vedrørende UKIU/ml ble målt etter hver av flere rensetrinn.

Den ikke-spesifikke fibrin-oppløsende aktivitet ble målt på en fibrin-agarplate som var fri for ethvert plasminogen.

I enkelte tilfeller ble målingen utført i henhold 1 25

til standardmetoden som anvender I-fibrinmonomer innhyllet i en cellulosenitratskive ("Selectgun" Type-BA, porediameter:

0,2 um) (Progress in Chemical Fibrinolysis and jThrombolysis, vol. 3, 539-546 (1978), Raven Press, New York). Fibrinogen som ikke inneholdt noe humant plasminogen ble bestrålet ved metoden foreslått av Hawker et al (J. Clin. Pathol. 29, 49 5-501 (1976)). Den spesifikke aktivitet av det merkede substrat var 0,018 mCi/mg fibrinogen. En prøveblanding ble inkubert ved 37°C og en 50 ul porsjon ble tatt ut ved den første og syvende time. Frigitt 1 25I ble målt med en automatisk gamma-teller. Aktiviteten av hver av fortynningene av vevaktivato-1 25 ren og urokinase ble uttrykt i prosent frigitt I i forhold til den totale radioaktivitet ved å subtrahere den frigitte 1 25r (2) Affinitetskromatografi på anti-urokinase IgG-Sepharose-kolonne: Urokinaseantiserumet ble erholdt fra en geit som var blitt immunisert ved en subkutan administrering av 1 mg høyrenset human urokinase (molekylvekt 33 000, spesifikk aktivitet: 202 400 IU/mg). Den ovenfor anvendte urokinase-prøve var den samme som var analysert ovenfor i henhold til SDS-polyacrylamidgelelektroforesen.

Anti-urokinaseserumet utviste bare én utfellingskurve når det ble undersøkt i henhold til den doble immuno-diffusjonsanalyse. IgG-fraksjoner av anti-urokinase-geite-. serum og uimmunisert geiteserum ble fremstilt ved utfelling med en mettet 33%-ig ammoniumsulfatløsning. De ble renset ytterligere ved DEAE-Sepharosekromatografi.

Anti-urokinase IgG (50 ug/ml) tilsatt til en fibrinplate inhiberte fullstendig aktiviteten av den kommersielle urokinaseprøve som ble anvendt som et antigen (5000 IU/ml). Disse IgG-prøver (20 mg/ml) fremkalte individuelt en enkel utfellingskurve når immunoelektroforesen ble anvendt under anvendelse av antigeiteserum og kaninserum.

50 mg av anti-urokinasen eller normal IgG-prøve ble koblet med 15 ml cyanogenbromid-aktivert Sepharose CL-4B i henhold til metoden foreslått av Cuatrecasas (J. Bio. Chem. 245, 3059-3065, (1970)). Gelen ble vasket med en 0,02-mol

tris-HCl-løsning som hadde en pH på 7,4 og som inneholdt 1,0 mol NaCl, i et volum på minst 20 ganger volumet av gelen. Kromatogrammer av vevaktivatoren og urokinase er vist i figur 7 . (3) Adsorpsjon av vevaktivatoren og urokinase på fibrin-Sepharose: I henhold til den ovenfor angitte Cuatrecasas-metode ble 200 mg fibrinogen som var fri for humant plasminogen koblet ved pH 8,3 til 20 g cyanogenbromid-aktivert Sepharose CL-4B. Det således koblede fibrinogen ble deretter aktivert ved tilsetning av thrombin (1 enhet/ml) i henhold til metoden foreslått av Reeme et al (Thromb. Res. 2, 137-14 3

(1973)). Deretter ble den vasket med en 0,02-mol tris-HCl-løsning som hadde en pH på 7,4 og som inneholdt 0,15 mol NaCl, 0,1% Triton X-100 og 1 ymol Aprotinin. Gelen som var blitt fylt i kolonnen ble vasket med 2 mol NH^SCN oppløst i en buffer, etterfulgt av tilsetning av en urokinase eller vev-aktivatorprøve (som var erholdt fra trinn (6) i eksempel 1 )• i en buffer til kolonnen. Etter vasking av kolonnen ble denne eluert med en 2-mols NH^SCN-løsning. Aktiviteten av plasminogenaktivatoren ble målt i henhold til en metode som anvendte konsentrasjonen av proteiner i eluatet på et kromogent substrat S-2288.

(4) Andre metoder:

Kvantitative analyser av proteiner ble utført under anvendelse av metoden foreslått av Lowry et al, hvilken metode anvendte okseserumalbumin som et standardprotein (J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951)). Oppløseliggjorte proteiner i Tween 80 ble kvantitativt analysert ved metoden foreslått av Shiu et al (J. Biol. Chem. 249, 7902-7911 (1974)), etterat sedimentet var fjernet ved sentrifugalseparasjon. I enkelte tilfeller ble det anvendt en mer nøyaktig metode som gjør bruk av fluorescamin (Arch. Biochem. Biophys. 155, 213-220

(1973)). Eluater erholdt etter Sephacryl S-200-kromatografi ble overvåket under anvendelse av en LKB Uviicord II detektor og skriver, hvilken detektor var utstyrt med et Hitachi spektrofotometer Model 200-200. SDS-polyacrylamidgelelektroforesen ble utført i henhold til metoden foreslått av Weber et al (J. Biol. Chem. 244, 4406-4412 (1972)). Hver proteinprøve ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter i en 1,0% SDS-løsning og ble deretter underkastet elektroforese i en 5% polyacrylamidgel. I enkelte tilfeller ble proteiner redusert med en 1%-ig løsning av 2-mercaptoethanol. Gelen farvet et protein med Coomassie Brilliant Blå eller et glycoprotein med perjodsyre-Schiff's reagens. For å måle aktiviteten av plasminogenaktivatoren ble SDS-polyacrylamidgelelektroforesen utført i en 5% polyacrylamidgel i henhold til plategelsystemet. Etter utførelse av elektroforesen ble plategelen vasket ved romtemperatur i to timer med en 0,01-mol fosforsyrebuffer som hadde en pH på 7,4 og som inneholdt 0,5 mol NaCl og 2% Tween 80. Gelen ble deretter stablet med en 1 % agarosegel som inneholdt 0,2% humant fibrinogen (enten rikt på eller fritt for plasminogen) og 0,5 enhet thrombin. Innholdet ble deretter inkubert i 1-7 timer ved 37°C i et kammer med konstant fuktighet og agarose og polyacrylamidgelen ble farvet med Coomassie Brilliant Blå. Den tilsynelatende molekylvekt av proteinet ble målt ved å sammenligne dets mobilitet med mobiliteten av standardprotei-net i henhold til den ovenfor angitte metode foreslått av Weber et al. Målingen av det isoelektriske punkt for den således rensede vevaktivator ble utført i en 7,5% polyacrylamidgel inneholdende 8 mol urea og 1 % av en amfolytt i henhold til metoden foreslått av Mertz et al (Biochem. Biophys. Res. Commun. 49, 84-91 (1972)). Prøven ble oppløst i en 8-mol urealøsning som inneholdt 2 mmol EDTA og 1% av en amfolytt. Dets pH ble bestemt ved metoden foreslått av Finlayson et al (Anal. Biochem. 40, 292-311 (1971)). Den således rensede vevaktivator ble testet med forskjellige fluorescente substrater etter tilsetning av 50 ul av vevaktivatorprøven i en 0,0 2-mol tris-HCl-løsning med en pH på 8,0 og inneholdende 0,1 mol NaCl og 0,02% Tween 80 og 2,0 ml av substratet i samme buffer. De etterfølgende mate-rialer ble anvendt som fluorescente substrater: Boc-L-Valyl-L-prolyl-L-arginin-4-methylcumaryl-7-amid, Carbobenzoxy-L-fenylalanyl-L-arginin-4-methyl-cumaryl-7-amid,

L-Prolyl-L-fenylalanyl-L-arginin-4-methylcumaryl-7-amid, og

Glutaryl-glycyl-L-arginin-4-methylcumaryl-7-amid.

Begynnelsesfrigivelsen av 7-amino-4-methylcumarin (AMC) ble målt med et fluorometer ved 37°C i et Shimadzu fluorospektrofotometer modell RF-520. Fluorometeret var blitt innstilt på en slik måte at en bestråling av lys på 380 nm ville sende ut et fluorescent lys på 460 nm. Fluorometeret var også justert slik at en 0,2-mol AMC-løsning i en 0,1% DMSO-løsning gav en relativ fluorescent enhet på 1,0. Den hydrolytiske aktivitet av den rensede vevaktivator ble målt med et kromogent substrat, etter tilsetning av 200 yl av en vevaktivatorprøve, 200 yl av en 0,1-mol tris-HCl-løsning méd en pH på 8,0 og inneholdende 0,1 mol NaCl og 0,02% Tween 80, og 200 yl av en 3-mmol S-2251-løsning eller en 1-mmol S-2288-løsning. Begynnelsesfrigivelsen av p-nitroanilin ble målt med et spektrofotometer ved 405 nm og 37°C i en glasscelle. Begynnelseshastigheten av den hydrolytiske aktivitet ble uttrykt i AmA/min. for det kromogene .substrat og A%/min. for det fluorescente substrat. De inhiberende virkninger av vevaktivatoren behandlet henholdsvis med diisopropylfluorfosfat, jodacetamid, soyabønnetrypsininhibitor og L-argininaprotinin ble testet med det kromogene substrat S-2288. De rensede vev-aktivatorprøver ble inkubert ved 37°C i 1 time etter tilsetning av inhibitorene. En 200 yl's porsjon ble tatt ut fra hver blanding, etterfulgt av en tilsetning av 200 yl av en buffer og 1 mmol av substratet. Ved å sammenligne AA/min.-verdiene med hverandre ble den inhiberende effekt av hvert reagens målt.

(5) Prøver ble renset ved metoden ifølge eksempel 1 og ble deretter analysert i henhold til den analytiske metode beskrevet i eksempel 2. Resultatene er oppført i tabell <1>.

Eksempel 3

Egenskaper av vevplasminogenaktivatoren fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen:

(1) Molekylvekt:

Molekylvekten av den rensede vevaktivator erholdt i eksempel 1 (6) ble målt ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Molekylvekten av aktivatoren avledet fra nyre var 70 000. Denne vevaktivator var positiv overfor perjodsyre-Schiff 1s-reagens, som derved indikerte nærvær av sukkerkjeder. Mobiliteten av hovedbåndet av den rensende vevaktivator fra nyre, som målt ved elektroforese, var identisk med mobiliteten av hovedbåndet av oppløst fibrin av etråekstrakt, når råekstraktet og den rensede vevaktivator ble analysert ved SDS-polyacryl-amidgelelektrof oresen og de resulterende geler var fremkalt på fibrin-agarplater. Dette indikerer at den tilsynelatende molekylvekt var 70 000 (se figur 6). Båndet av oppløst fibrin tilskrives nærvær av plasminogen i fibrin-agarplaten.

Fra den ovenfor beskrevne observasjon skal det forstås at råekstraktet erholdt fra humant nyrevev inneholder en plasminogenaktivator og at plasminogenaktivatoren består prinsipielt av én med en tilsynelatende molekylvekt på 70 000.

(2) Isoelektriske punkter:

Som det isoelektriske punkt av rensede aktivatorer fra nyre fremkom hovedtoppene ved 8,2. Etter måling av det isoelektriske punkt ble dens aktivitet målt på en fibrin-agarplate som var i form av en tynn filmgel (tykkelse 1,5 mm). Aktiviteten av aktivatoren ble funnet nær dens isoelektriske punkt, dvs. pH 8,2. (3) Immunologiske forskjeller mellom vevaktivator og urokinase: For å undersøke hvorvidt aktivatoren erholdt fra nyrevev har samme antigenesitet som urokinase, ble elueringsprofilen av proteiner erholdt ved antiurokinase IgG-Sepharose-affinitetskromatografiske behandling av den rensede aktivator ifølge eksempel 1 (6) og aktivatoren ifølge eksempel 1 (3) og aktiv bestanddel av aktivatoren sammenlignet med elueringsprofilen av urokinase. Resultatene er vist i figur 7. Som det fremgår fra figur 7 ble urokinase adsorbert serkt på kolonnen og praktisk talt alt av aktiviteten ble eluert med en 0,1-mol glycin-HCl-løsning som inneholdt 0,15 mol NaCl og 0,1 % Triton X-100. Proteinet inneholdt ieluatene var serumalbumin som var blitt innarbeidet i den kommersielle urokinase anvendt i dette forsøk. På den annen side passerte den rensende aktivator gjennom kolonnen. Den var imidlertid ikke adsorbert og hverken protein eller aktivitet ble eluert med en glycinløsning med pH 2,4. Når den delvis rensede prøve erholdt i eksempel 1 (3) ble helt over i samme kolonne ble ca. 15 % av aktiviteten adsorbert på kolonnen og eluert med en glycinløsning med pH 2,4. På basis av disse observa-sjoner kan det lett forutsies at plasminogenaktivatoren fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er en vevaktivator som er immunologisk ulik urokinase, og at råekstraktet erholdt fra nyrer inneholder som en mindre bestanddel urokinase eller en urokinaselignende aktivator. (4) Affinitet av vevaktivatorer overfor fibrin-Sepharose: Affiniteten av urokinase og en vevaktivator overfor uløseliggjort fibrinmonomerer ble undersøkt under anvendelse av fibrin-Sepharose-kolonner.

Vevaktivatoren ifølge oppfinnelsen (eksempel 1

(6)) ble adsorbert i sin helhet på fibrin-Sepharose-kolonne. Den ble deretter eluert med en 2-mol NH4SCN-løsning og minst 90% av den totale aktivitet ble gjenvunnet. På den annen side fikk praktisk talt alle de aktive bestanddeler av urokinase passere gjennom kolonnen. Aktiviteten av aktivatoren ble således ikke funnet i eluatet erholdt med en 2-mol NH4SCN-løsning fra kolonnen. Som ovenfor angitt har vevaktivatoren fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og som var blitt erholdt fra humane nyrer en sterk affinitet overfor fibrin-Sepharose. (5) Spesifisitet av syntetiske substrater overfor vevaktivatorer: Spesifisiteten av visse syntetiske substrater overfor aktivatoren erholdt i eksempel 1 - (6) ble undersøkt. Følgende substrater ble anvendt. For plasmin, H-D-valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroaniliddihydroklorid (S-2251); for naturlig thrombin, Boc-L-valyl-L-prolyl-L-arginin-4-methyl-coumaryl-7-amid (3093-V); for plasma, carbobenzoxy-L-fenyl-alanyl-L-arginin-4-methylcoumaryl-7-amid (3095-V); for urin-kallikrein, L-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginin-4-methylcoumaryl-7-amid (3096-V); for urokinase, glutamyl-glycyl-L-arginin-4-methylcoumaryl-7-amid (3097-V); og for vevplasminogenaktivator,' H-D-isoleucyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroaniliddihydro-klorid (S-2288).

Vevaktivatoren fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utviste ingen hydrolytisk aktivitet overfor noen av substratene bortsett fra S-2251 og S-2288. Aktiviteten (100 UKIU/ml) av vevaktivatoren ifølge oppfinnelsen var 88 AmA/min. mot S-2251 og 70 AmA/min. mot S-2288.

Aktivatoren fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse utviste enkelte karakteristiske egenskaper når den ble behandlet med visse inhibitorer. Den amid-spaltede aktivitet av'aktivatoren mot S-2288 ble ikke inhibert hvor 50 KIU/ml Aprotinin, 10 mmol jodacetamid eller 50 n g/ml soyabønnetrypsin ble anvendt som inhibitor. Imidlertid ble den inhibert opp til 26 % 100 mmol L-arginin og opp til 98 % med 5 mmol diisoporpylfluorfosfat.

(6) Sabilitet:

Når det gjelder plasminogenaktivatoren fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble ingen aktivitetsreduksjon observert i det hele tatt, selv etter 2 ukers lagring ved 4 °C i en buffer ved pH 7,4. Det samme resultat ble også erholdt selv når 1 mol NH SCN, 0,02 % Tween 80 eller 0,1 mol NaCl vor innarbeidet i bufferen.

Stabiliteten av plasmidogenaktivatoren fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble undersøkt ved 4 °C i 24 timer i buffere som hadde pH-nivåer i området 1-10 og inneholdt 0,5 mol NaCl og 0,02 % Tween 80. Det ble funnet at plasminogenaktivatoren var stabil innen pH-området 2-10, men en aktivitetsreduksjon på 70 % fant sted ved pH 1,0.

Som beskrevet i detalj i det foregående er aktivatoren fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen en ny plasminogenaktivator som er forskjellig fra urokinase og spiller en viktig rolle ved gjenvinningskontrollen av vev, innbefattende spalting av fibrinavsetninger på indre og ytre vaskulære vegger ved en skadet del.

I henhold til den ovenfor beskrevne fremstillings-prosess for aktivatoren kan vevaktivatoren isoleres i en høy-renset form. Vevaktivatoren utviser en spesifikk aktivitet så høy som 30 000 - 45 000 ganger den spesifikke aktivitet av en human nyre tørket med aceton.

Det trombolytiske middel, inneholdende som bestanddel plasminogenaktivatoren fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen illustreres naturlig nok fra de følgende eksempler. Det skal imidlertid bemerkes at plasminogenaktivatoren som ble anvendt som bestanddel var avledet fra normale celler. En plasminogenaktivator fra ondartede tumorceller er kjent for å ha trombolytisk aktivitet. Imidlertid antas sikkerheten med et trombolytisk middel å være sikret på grunn av dets opprinnelse når man - i lys av dets anvendelse som legemiddel til mennesker, tar i betraktning de forskjellige potensielle farer ved administrering over lengere tids-rom eller ved høye doseringsnivåer.

Da den plasminogenaktivator som er en bestanddel av et trombolytisk middel har spesifikk affinitet overfor fibrin som er forskjellig fra affiniteten av urokinase, men lik den av normal plasminogenaktivator erholdt fa blod kan det trombolytiske middel gi fullt ut tilfredsstillende resultater når det anvendes for behandling av trombose. I tillegg er det trombolytiske middel fri for slike bivirkninger som indre blødning og anafylaktisk sjokk. Følgelig er det thrombus-oppløsende middel et ekstremt effektivt terapeutisk legemiddel.

Det trombolytiske legemiddel kan administreres ved egnede doseringsnivåer til pasienter og har en styrke som er ledsaget av ubetydelige eller ingen bivirkninger og som utviser effektiv trombolytisk aktivitet. Det trombolytiske middel kan administrers på samme måte som andre legemidler av samme type. Eksempelvis kan den plasminogene aktivator som er den aktive bestanddel oppløses i fysiologisk salt-vann inneholdende 5 % humant serumalbumin og kan deretter administreres ved injeksjon. Det foretrekkes å begrense hver dose til 10 000 IU (ca. 100 jjg) som målt når det gjelder urokinase.

Det trombolytiske middel kan anvendes for å behandle akutte og kroniske tromber i forskjellige blodkar slik man støter på når det gjelder dyp venøs trombose, pulmonar em-bolisme, myokardial infarkt, arteriell occulsjon, ekstra-korporeal sirkulasjon og arteriovenøs occulosjon.

Det trombolytiske middel illustreres i de etterfølg-ende eksempler.

Eksempel 4

Isolering og rensing av plasminogenaktivatoren fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som utgjør den aktive bestanddel av det trombolytiske middel: Til 100 g avfettet pulver fremstilt fra humane nyrer med aceton ble tilsatt 500 ml av en 2-mol løsning av ammoniumthiocyanat, hvilken løsning var blitt bufret med 0,02 mol tris-HCl ved pH 7,4. Den resulterende blanding ble omrørt ved 4°C i 10 timer og ble deretter underkastet sentrifugalseparasjon (x 13 000 g; 30 minutter) for å separere denne i et ekstrakt og et bunnfall. Ekstraktet ble justert til pH 3,0 med 1N HCl og det resulterende bunnfall ble gjenvunnet ved sentrifugalseparasjon (x 13 000 g; 30 minutter). Bunnfallet ble deretter oppløst i 500 ml av en 0,01-mol natriumfosfatbuffer (buffer A) som inneholdt 1 mmol EDTA, 0,3 mol NaCl, 10 KIU/ml Aprotinin, 5 mmol £-aminocapronsyre og 0,01% Tween 80. Deretter ble 100 ml fibrincelitt tilsatt til bufferen og den resulterende blanding ble omrørt ved 4°C i 30 minutter. Blandingen ble deretter underkastet sentrifugalseparasjon (x 3000 g; 10 minutter). Bunnfallet ble suspendert igjen-i 100 ml buffer A og den således fremstilte løsning ble helt over i en kolonne på 4 x 10 cm. Kolonnen ble"vasket med 500 ml av buffer A. Deretter ble plasminogenaktivatoren eluert med buffer A som i tillegg inneholdt 0,4 mol arginin. Eluatene ble oppsamlet i 10 ml's fraksjoner. Resultatene er vist i figur 8 og i tabell 2. Den ovenfor beskrevne rensemetode gav én prosentvis gjenvinning så høy som 30%. Rensemetoden utnytter den sterke affinitet av plasminogenaktivatoren som utgjør bestanddelen i det trombolytiske middel overfor fibrin.

Eksempel 5

Sammenligning av den trombolytiske aktivitet av det trombolytiske middel med urokinase: Den trombolytiske aktivitet av plasminogenaktivatoren som er en bestanddel av det trombolytiske middel ble sammenlignet med aktiviteten av urokinase i henhold til Chandler's slyngemetode. Forsøket ble utført under anvendelse av humant blod oppsamlet fra friske mannlige givere. 5 ml blod ble nøyaktig oppsamlet til hvilket 0,5 ml av en 3,1 % natrium-citratløsning ble tilsatt for å unngå blodkoagulering. Deretter ble 50 Ji 1 <125>I-merket firbrinogen også tilsatt. Etter grundig blanding ble 1,5 ml's porsjoner av blandingen tatt og anbragt i en tygonslange med en lengde på 28 cm og en indre diameter på 0,36 cm, etterfulgt av tilsetning av 20 mmol calciumklorid. Deretter ble begge ender av slangen koblet til hverandre under dannelse av en slynge. Den slyngede sirkulasjonsslange ble festet på et omdreinings-bord som var skrådd i en vinkel på 2 3° og ble omdreiet i en hastighet på 17 opm. Etterat blodet fikk klumpe seg ved romtemperatur (24 - 25°C) i 1 til 24 timer ble slangen åpnet og en 10 ul's prøve ble oppsamlet. Radioaktiviteten av denne ble deretter målt. Deretter ble plasminogenaktivatoren til-■ satt til slangen og slangen ble sammenkoblet ved begge ender. Den ble igjen omdreiet på omdreiningsbordet. Etter en på ^forhand bestemt tid ble en 10 ul's blodprøve tatt og målt for radioaktivitet. Aktiviteten av den ovenfor angitte plasmino-1 25

genaktivator ble uttrykt som mengden av I frigitt fra blodklumpen og tilstedeværende i blodprøven.

Det således tilsatte 1 25I-fibrinogen ble innarbeidet i polymeren av klumpen med en effektivitet på 95-98 %. Graden av tverrbinding etter én time var forskjellig fra den etter 24 timer. Det vil si at en delvis tverrbundet (PXL) klump ble erholdt etter én time og en fullstendig tverrbundet (TXL) klump ble erholdt etter 24 timer. Figur 9 illustrerer oppløsningstilstanden av en PXL-klump med plasminogenaktivatoren som utgjør den aktive bestanddel i det trombolytiske middel eller urokinase. I figur 9 svarer kurve (a) til plasminogenaktivatoren, mens kurve (b) tilsvarer urokinase. Disse kurver viser at plasminogenaktivatoren som utgjør den aktive bestanddel i det trombolytiske middel fremkaller en meget sterk oppløsning sammenlignet med urokinas. Når plasminogenaktivatoren som utgjør den aktive bestanddel i det trombolytiske middel ble tilsatt i samme mengde som anvent i systemet for kurve (a) til systemet i kurve (b) ble praktisk talt fullstendig oppløsning oppnådd i løpet av 10 timer (se figur 9(c)). I figur 9 representerer hver prikk gjennomsnittet av triple målinger. Når konsentrasjonen av aktivatoren ble

-9

justert 1 x 10 mol oppløste aktivatoren som var bestanddel i det trombolytiske middel PXL-klumpen praktisk talt fullstendig i løpet av 20 timer. I motsetning til plasminogenaktivatoren ble urokinase eluert bare til ca. 40 %. Når plasminogenaktivatoren som utgjør den aktive bestanddel av det trombolytiske middel ble tilsatt 10 timer senere i det oven-

for beskrevne system, fant det sted en praktisk talt full-

125

stendig frigivelse av I som derved indikerte at aktivatoren har en sterk trombolytisk aktivitet. I et forsøk hvori TXL-klumpen ble anvendt utviste urokinase en oppløsning på bare 35 % selv etter 20 timer, men plasminogenaktivatoren som ut-gjør en bestanddel i det trombolytiske middel utviste en oppløsning på 90 %. Som en kontroll ble et ytterligere for-søk utført uten plasminogenaktivator. Frigivelsen av <125>I

ble ikke påvist i det hele tatt. Det er således vist at opp-løsning av blodklumpen avhang av aktivatoren.

Eksempel 6

Effekter av det trombolytiske middel på trombose i forskjellige dyr.

Blod ble samlet fra forskjellige dyr på samme måte

som beskrevet i eksempel 6 og fikk klumpe seg i løpet av én time. Plasminogenaktivatoren som utgjør bestanddelen av det trombolytiske middel fikk virke på de delvis tverrbundne (PXL) klumper i plasmaen i de respektive dyr for å undersøke den trombolytiske aktivitet av plasminogenaktivatoren. I hvert forsøk ble konsentrasjonen av plasminogenaktivatoren justert til 20 IU/ml og graden av oppløsning av klumpen ble målt uttrykt ved <125>I-frigivelse fra klumpene inntil 10 timer fra reaksjonsstart. I dette system var bakgrunnen hovedsake-lig lik den som erholdes uten tilsetning av plasminogenakti-125

vatoren og bare 2-3 % av I ble påvist selv etter 10 timer.

I motsetning til dette ble ca. 96 % av klumpen oppløst i det humane system. Figur 10 illustrerer resultatene erholdt ved vurdering av graden av oppløsning under anvendelse av blod fra mennesker og forskjellige dyr. i figur 10 viser kurvene (a), (b), (c), (d) og (e) resultatene erholdt med menneske-, ape-, kanin-, hund- og rotteblod. Som illustrert i figur 10 varierte graden av oppløsning etter dyrearten. Plasminogenaktivatoren virker bra når det gjelder aper, slik tilfellet er med mennesker. Den oppløsende effekt var liten når det gjelder rotter. Dette indikerer at det trombolytiske middel er et enzym som er spesifikt overfor mennesker og aper.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av en plasminogenaktivator avledet fra human nyre og med følgende karakteristiske egenskaper: (1) hovedproteinbåndet erholdt ved natriumdode-cylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese har en tilsynelatende molekylvekt på 70 000 ± 5 000; (2) hovedbåndet erholdt ved isoelektrisk punkt-elektroforese har en pl i området 7 til 9; (3) plasminogenaktivatoren har den immunologiske egenskap at den ikke blir adsorbert ved anti-urokinase-IgG-Sepharose-affinitetskromatografi; og (4) plasminogenaktivatoren hydrolyserer H-D-valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroaniliddihydroklorid og H-D-isoleucyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroaniliddihydroklorid, men hydrolyserer ikke Boc-L-valyl-L-prolyl-L-arginin-4-methyl-coumaryl-7-amid, carbobenzoxyl-L-fenylalanyl-L-arginin-4-methylcoumaryl-7-amid, L-prolyl-fenylalanyl-L-arginin-4-methylcoumaryl-7-amid og glutaryl-glycyl-L-arginin-4-methyl-coumaryl-7-amid, karakterisert ved at en (i) en human nyre underkastes en ekstraksjon med en ammon-.

iumthiocyanatløsning bufret med tris-HCl til en pH i området 7,0 til 7,4; (ii) ekstraktet fra (i) føres gjennom en DEAE-Sepharose-kolonne ved pH 7,0 til 7,4; (iii) de erholdte eluater f ra (ii) føres gjennom en Sink-Chelat-Sepharose-kolonne ved pH 6,5 - 7,4; (iv) de fibrinolytisk aktive fraksjoner fra (iii) føres gjennom en concanavalin A-Sepharose-kolonne ved pH 7,0-7,5; (v) de erholdte vevsaktivator-inneholdende fraksjoner fra (iv) føres gjennom en CM-Sepharosekolonne ved pH 4,0 - 5,0; (vi) en konsentrert prøve av vevsaktivatoren fra (v) føres gjennom en Sephacryl S-200 kolonne ved pH 7,0 - 7,5; for å rense og konsentrere plasminogenaktivatoren.