NO173287B - Fremgangsmaate for rensing av enkeltkjedet og dobbeltkjedet vevplasminogenaktivator - Google Patents
Fremgangsmaate for rensing av enkeltkjedet og dobbeltkjedet vevplasminogenaktivator Download PDFInfo
- Publication number
- NO173287B NO173287B NO87871883A NO871883A NO173287B NO 173287 B NO173287 B NO 173287B NO 87871883 A NO87871883 A NO 87871883A NO 871883 A NO871883 A NO 871883A NO 173287 B NO173287 B NO 173287B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- tpa
- column
- chain
- molecular weight
- daltons
- Prior art date
Links
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 title claims description 89
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 title claims description 89
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 title claims description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 38
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 title description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 14
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 108010043984 Erythrina caffra trypsin inhibitor Proteins 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 68
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 35
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 34
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 20
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 16
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 14
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 238000007805 zymography Methods 0.000 description 12
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 11
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 11
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 11
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 11
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 11
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 10
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 8
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 7
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 7
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N sulfanyloxyethane Chemical compound CCOS FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219769 Erythrina latissima Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006193 diazotization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N phthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000219766 Erythrina Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000975003 Homo sapiens Kallistatin Proteins 0.000 description 1
- 101001077723 Homo sapiens Serine protease inhibitor Kazal-type 6 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229940122920 Kallikrein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 102100025421 Serine protease inhibitor Kazal-type 6 Human genes 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- CWGJBBRZFIPXNZ-UHFFFAOYSA-N [C-]#N.Br Chemical compound [C-]#N.Br CWGJBBRZFIPXNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N ammonium thiocyanate Chemical compound [NH4+].[S-]C#N SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L barium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ba+2] WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- ADJASNRUORTBEM-UHFFFAOYSA-N boric acid;butanedioic acid Chemical compound OB(O)O.OC(=O)CCC(O)=O ADJASNRUORTBEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGFMTHGYKYEDHF-UHFFFAOYSA-L disodium 2-hydroxy-2-oxoacetate Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)C(O)=O.[O-]C(=O)C([O-])=O WGFMTHGYKYEDHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical group OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005554 pickling Methods 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 1
- -1 polyethylene glycidyl methacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000004323 potassium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 description 1
- QTYWBJZOZDYCGB-UHFFFAOYSA-L potassium;sodium;2-carboxybenzoate;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].[K+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O QTYWBJZOZDYCGB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M sodium acetic acid acetate Chemical compound [Na+].CC(O)=O.CC([O-])=O BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KMPHTYSTEHXSTL-UHFFFAOYSA-M sodium;2-hydroxypropanoate;2-hydroxypropanoic acid Chemical compound [Na+].CC(O)C(O)=O.CC(O)C([O-])=O KMPHTYSTEHXSTL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150010939 tpa gene Proteins 0.000 description 1
- SPOMEWBVWWDQBC-UHFFFAOYSA-K tripotassium;dihydrogen phosphate;hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].OP(O)([O-])=O.OP([O-])([O-])=O SPOMEWBVWWDQBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K trisodium;dihydrogen phosphate;hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)([O-])=O.OP([O-])([O-])=O LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- YNIRKEZIDLCCMC-UHFFFAOYSA-K trisodium;phosphate;hydrate Chemical compound [OH-].[Na+].[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O YNIRKEZIDLCCMC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for rensing av enkeltkjedet og/eller dobbeltkjedet vevplasminogenaktivator (heretter angitt som sc-tPA og dc-tPA) fra en blanding inneholdende sc-tPA og/eller dc-tPA.
tPA (vevplasminogenaktivator) er et protein som produseres i et vev i et høyere dyr som tjener til å aktivere plasminogen, en forløper for plasmin som er kjent for å være et proteolyttisk enzym spesifikt for fibrin, og som nå er bragt i fokus som et potensielt trombolyttisk middel.
tPA har to molekylærformer, enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA, med samme molkylvekt (ca. 70.000 daiton)
og erholdes som en blanding i vanlige prosedyrer for tPA-produksjon. En dobbeltkjedet form har ca. 10 ganger høyere aktivitet for aktivering av plasminogen enn en enkeltkjedet form (Europa-patentpublikasjon nr. 112122A). Imidlertid er det kjent at sc-tPA har sterkere bindingskapasitet til fibrin enn dc-tPA, og så snart det er bundet til fibrin, omdannes det raskt til dc-tPA (D.C. Rijken et al., J. Biol. Chem. 257, 2920-2925, 1982). For å oppnå en effektiv be-handling av trombosis med tPA, må følgelig en øket bindingskapasitet av tPA til fibrin ved koaguleringen av blod erholdes under anvendelse av en tPA-blanding inneholdende en forøket mengde av sc-tPA, eller ved anvendelse av et preparat bare inneholdende sc-tPA.
Under disse omstendigheter og for å undersøke egen-skapene og funksjonene av tPA mer detaljert, har det vært et stort behov for forbedrede metoder for erholdelse av utelukkende den enkeltkjedede form, og for isolering av den enkeltkjedede og dobbeltkjedede form fra en blanding derav.
En tidligere kjent metode for fremstilling av tPA omfatter eksempelvis dyrkning av celler som er opprinnelig i stand til å produsere tPA eller manipulert til å bære tPA-genet, hvoretter tPA isoleres fra de resulterende dyrkede celler og/eller fra dyrkningssupernatanten. Eksempelvis beskriver ovenfor angitte Europa-patentpublikasjon nr. 112122A en metode for rensing av tPA under anvendelse av en
Erythrina trypsin-inhibitor (heretter angitt som ETI),
eller en immobilisert Kunits-inhibitor som produseres i frøene av Erythrina latissima og andre Erythrina-planter og som virker som en inhibitor overfor trypsin, plasmin og tPA, men ikke overfor urokinase. Ved denne metode ble imidlertid en separat isolering av sc-tPA fra dc-tPA ikke tatt i be-traktning.
Ved en tidligere kjent metode for fremstilling av sc-tPA tilsettes en proteinaseinhibitor slik som "Aprotinin" til et dyrkningsmedium for å undertrykke omdannelse av tPA fra enkeltkjedet til dobbeltkjedet form (D.C. Rijken et al., J. Biol. Chem. 256, 7035-7041, 1981).
Ved en annen metode for rensing av sc-tPA anvendes et immobilisert monoklonalt antistoff som adsorberer spesifikt sc-tPA (katalog fra BioPool, Sverige). Denne metode er imidlertid dårligere enn metoden med ETI vedrørende kapasitet til adsorbering av tPA og stabiliteten av den kolonne som anvendes. Enn videre og ufordelaktig kan denne metode ikke fjerne en urenhet som er et protein med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og som potensielt virker som et antigen for å reagere med et anti-humant tPA-antistoff.
Under forløpet for forskjellige undersøkelser med hensyn til metoder for rensing av tPA fra et urent tPA-preparat ved tPA-produksjon, har fire av foreliggende oppfinnere innlevert en patentsøknad for en oppfinnelse som omfatter en metode for isolering og fjerning av et protein som har en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og som reagerer med et anti-humant tPA antistoff produsert i et dyrkningsmedium inneholdende kalvefosterserum, og en metode for dyrkning av transformerte celler produsert ved genmanipulering, og selektiv separering av humant celleavledet tPA fra vertcelleavledet tPA (norsk patentsøknad 863095).
Under forløpet for grundige undersøkelser med hensyn til forskjellige karakteristika av sc-tPA og dc-tPA har enn videre foreliggende oppfinnere funnet at disse to former av tPA varierer i affinitet med ETI, og har nå fullført fore-
liggende oppfinnelse som et resultat av denne observasjon.
Et mål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en metode for isolering av sc-tPA og dc-tPA effektivt og lett fra en blanding derav.
Et annet mål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en metode for isolering av sc-tPA fra et urent tPA-preparat som inneholder sc-tPA og/eller dc-tPA.
Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte for separat rensing og separering av enkeltkjedet vevplasminogenaktivator (tPA) og dobbeltkjedet tPA fra en blanding inneholdende begge, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: (a) en blanding inneholdende enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA bringes i nær kontakt med en kolonne som bærer en immobilisert Erythrina trypsin-inhibitor som et affinitetsmiddel for å absorbere angitte tPA på angitte kolonne; (b) kolonnen behandles med et elueringsmiddel som har en pH varierende fra 4,5 til 6,0 for selektivt å eluere enkeltkjedet tPA; og (c) kolonnen behandles med et elueringsmiddel som har en pH lavere enn 4,5, for selektivt å eluere dobbeltkjedet tPA; hvori angitte elueringsmidler inneholder benzamidin eller arginin i en konsentrasjon på minst 1 mM.
Oppfinnelsen angår enn videre en fremgangsmåte for rensing og separering av enkelt-kjedet tPA fra en blanding inneholdende enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at den omfatter trinn for å bringe angitte blanding i nær kontakt med en kolonne som bærer en immobilisert Erythrina trypsin-inhibitor som et affinitetsmiddel for å absorbere angitte blanding av tPA på angitte kolonne og deretter selektivt eluere angitte enkelt-kjedet tPA som er blitt absorbert på kolonnen med et elueringsmiddel som har en pH varierende fra 4,5 til 6,0, hvori angitte elueringsmiddel inneholder benzamidin eller arginin i en konsentrasjon på minst 1 mM.
Foreliggende oppfinnelse er anvendbar uavhengig av type av celler for å fremstille tPA. Nærmere bestemt kan sc-tPA og/eller dc-tPA isoleres fra hvilke som helst av pattedyrceller slik som melanomaceller og humane, normale celler, eller fra celler med inkorporert humant tPA-gen ved genmanipulering. I tillegg gjør oppfinnelsen det mulig å
isolere og rense sc-tPA og dc-tPA fra et serumtilsatt medium såvel som fra et serumfritt medium, dvs. uavhengig av en bestanddel av dyrkningsmediet.
Ifølge et annet trekk ved oppfinnelsen kan den ovenfor angitte prosedyre for isolering og rensing mer effektivt utføres ved tilsetning av et amidinderivat eller et guanidin i
derivat slik som arginin og benzamidin, som et additiv til elueringsmidlet. Eksempelvis kan et elueringsmønster med tilstrekkelig skarpe aktivitetstopper for tPA alltid erholdes under forskjellige elueringsbetingelser som innbefatter variasjoner i kolonnestørrelse og lignende.
Foretrukne eksempler på en bærer for ETI-immobilisering ifølge oppfinnelsen innbefatter uløselig agarose, dextran, cellulose, polyacrylamid og polyethylenglycidyl-metacrylatpolymer. Foretrukne eksempler for metoder for ETI-immobilisering innbefatter konvensjonelt kjente metoder slik som en metode for binding av ETI til en bærer som er preaktivert med cyanogenbromid, en carbo-imido-koblingsmetode hvori en fri aminogruppe er bundet til en fri carboxyl-gruppe, og en glutaraldehyd-koblingsmetode hvori en aminogruppe er bundet til en bærer på forhånd omdannet til en aminoalkylform. Et annet eksempel på en immobilisert ETI-bærer er en som er perjodataktivert, hvori en aldehydgruppe dannet deri, reagerer med en aminogruppe i ETI ved en pH mellom 4 og 6, under dannelse av en Schiff-base, og som deretter reduseres med natriumborhydrid eller natriumcyanbor-hydrid. Et materiale for en bærer kan enn videre omdannes til et hydrazid-succinylderivat hvori en carboxylligand skal bindes til en aminogruppe gjennom EDC (l-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid) eller ved diazonisering. Cellulose-fibre og partikler omdannes til hydrazidderivater og kan
anvendes i henhold til metoden ifølge Parikh et al.
(Methods in Enzymology, 3j4, 77-102, red.; W.B. Jakobi og Wilcheck, Academic Press, N.Y.). Polyacrylamidpartikler kan bindes direkte ved en glutar-adelhyd-koblingsmetode eller via diazonisering av et p-aminobenz-amidoethylderivat eller
et hydrazidderivat.
Elueringsmidler for anvendelse for eluering av tPA
i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatter syreløs-ninger med pH-verdier under 6, vannløselige saltløsninger og bufferløsninger.
Foretrukne eksempler på en slik syreløsning innbefatter den inneholdende minst én syre valgt fra gruppen av syrer omfattende typisk sitronsyre, oxalsyre, melkesyre, ravsyre, eddiksyre, fthalsyre, glutaminsyre, asparaginsyre, adipinsyre, fosforsyre og saltsyre.
Foretrukne eksempler på en vannløselig saltløsning innbefatter vandige løsninger inneholdende minst ett salt valgt fra gruppen bestående av salter omfattende typisk natriumklorid, kaliumklorid, lithiumklorid, ammoniumklorid, bariumklorid, calciumklorid, magnesiumklorid, natriumsulfat, ammoniumsulfat, kaliumnitrat, kaliumthiocyanat, natrium-thiocyanat, ammoniumthiocyanat.
Enn videre innbefatter foretrukne eksempler på en bufferløsning en natriumfosfatbuffer, en kaliumfosfatbuffer, en "Veronal-buffer, blandinger i en kombinasjon slik som natriumfosfat-fosforsyre, kaliumfosfat-fosforsyre, sitronsyre-natriumcitrat, ravsyre-borat, melkesyre-natriumlactat, eddiksyre-natriumacetat, oxalsyre-natriumoxalat, glycin-saltsyre og kaliumhydrogenfthalat-natriumhydroxyd.
Disse elueringsmidler kan ytterligere inneholde ett eller flere vannløselige, organiske løsningsmidler.
Foretrukne konsentrasjoner av et additiv bestående
av et amidinderivat eller et guanidinderivat for anvendelse ved eluering av tPA varierer fra 1 mM til en maksimal løse-lighet derav. Eksempelvis ved en pH mellom 4,5 og 6,0, idet en anvendbar konsentrasjon reduseres i proporsjon med at pH nærmer seg 4,5, mens en høyere konsentrasjon er nødvendig når pH nærmer seg 6,0.
En utførelsesform av oppfinnelsen omfatter å kjøre
en cellekultursupernatant inneholdende humant tPA gjennom en ETI-kolonne for å adsorbere tPA, uønskede proteiner fjernes
ved vaskning, sc-TPA gjenvinnes deretter fra kolonnen under
anvendelse av et elueringsmiddel med en pH varierende fra 4,5 til 6,0 med et additiv, hvoretter dc-tPA gjenvinnes ved å forandre pH på elueringsmidlet til under 4,5.
Det er kjent for fagmannen at et amidinderivat eller et guanidinderivat binder konkurrerende til et aktivt senter av en trypsin-lignende proteinase for å dissosiere et enzym-inhibitorkompleks. Imidlertid er det en fullstendig ny teknikk å anvende dette fenomen i et spesifikt middel slik som isolering av sc-tPA og dc-tPA under de mest egnede betingelser for isolering.
Hvis et utgangsmateriale som skal behandles ifølge oppfinnelsen eventuelt inneholder en liten mengde av uønskede substanser slik som trypsin-lignende enzymer etc., kan disse substanser adsorberes til eller desorberes fra ETI og virke som interfererende faktorer ved renseprosessen ifølge oppfinnelsen. Om nødvendig, anbefales følgelig en forbehand-ling for fjerning av disse uønskede substanser.
Denne fjerningsprosedyre utføres under anvendelse
av en immobilisert soyabønne trypsin-inhibitor (heretter angitt som STI), eller en annen Kunits-type-inhibitor som produseres i soyabønnefrø og har en lignende molekylvekt som ETI og en aminosyresekvens som er homolog med ETI til 80% eller mere.
STI er meget lik ETI i sin spesifisitet, men inhi-berer ikke tPA. En kombinert anvendelse av disse to inhibi-torer resulterer i en selektivitet som er sammenlignbar med den som oppnås under anvendelse av et immobilisert anti-humant tPA monoklonalt antistoff. Denne prosedyre omfatter å kjøre en cellekultursupernatant inneholdende humant tPA gjennom en immobilisert STI-kolonne for å binde og fjerne en del av en liten mengde av uønskede proteinaser innbefattet i kultursupernatanten, hvoretter et resulterende avløp kjøres gjennom en immobilisert ETI-kolonne for å binde tPA, ETI-kolonnen vaskes for å fjerne uønskede proteiner, hvoretter sluttelig sc-tPA og dc-tPA isoleres og renses separat ved forandring av pH-verdiene på eluatene.
Ifølge et viktig trekk ved oppfinnelsen er det til-veiebragt en metode som er anvendbar uavhengig av type av celler som inneholder tPA. Nærmere bestemt gjør oppfinnelsen det mulig å isolere og rense sc-tPA og/eller dc-tPA fra en hvilken som helst type av celler slik som melanomaceller, humane, normale celler og celler transformert med humant tPA-gen ved genmanipulering. I tillegg gjør oppfinnelsen det også mulig å isolere og rense sc-tPA og/eller dc-tPA
fra en serumtilsatt kultursupernatant såvel som fra en serum-fri kultursupernatant, dvs. uavhengig av en bestanddel av dyrkningsmediet.
Ifølge et annet glimrende trekk ved oppfinnelsen
er den tilveiebragte metode anvendbar ved et hvilket som helst ønsket trinn ved isolering og rensing av sc-tPA og/eller dc-tPA i forskjellige behandlinger av, eller pre-parative prosedyrer for tPA. Eksempelvis utføres isolering og rensing av ønsket sc-tPA og/eller dc-tPA ved dyrkning av celler som er i stand til å produsere tPA, hvoretter den resulterende blanding avledet fra dyrkningen, behandles med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. En blanding avledet fra dyrkningen, betyr et urent ekstrakt av dyrkede celler, en cellefri dyrkningssupernatant eller et bearbeidet materiale av disse. Hvilke som helst av disse velges etter behov.
Andre viktige trekk ved oppfinnelsen fremgår fra
den etterfølgende beskrivelse av utførelsesformer for rensing av humant tPA.
Eksempel 1;
En kolonne som bærer et immobilisert affinitetsmiddel, ETI eller STI, for anvendelse i de etterfølgende eksempler, ble fremstilt på følgende måte.
I henhold til metoden ifølge Joubert et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 362, 531-538, 1981) ble frø av Erythrina latissima oppsamlet og preparert. Malte og av-fettede frø fikk stå over natten ved 10°C i en 0,5 M NaCl-løsning for ekstraksjon. Løsningen med frøene ble sentri-fugert for å oppsamle supernatant, og den beregnede substans ble oppsamlet fra supernatanten ved ammoniumsulfatutfelling. Det således fremstilte materiale ble underkastet kromatografi suksessivt på Sephadex<®> G-50 (Pharmacia Fine Chemicals), DEAE-cellulose (Phoenix Chemicals) og DEAE-Sepharose<®>
(Pharmacia fine Chemicals). Det resulterende, rensede preparat utviste et enkelt bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 22.000 dalton når det ble underkastet elektro-forese i en 15% polyacrylamidgel inneholdende 0,1% natrium-dodecylsulfat (SDS).
26 mg av dette rensede preparat ble bundet til 5 ml bromcyanid-aktivert agarose (Sepharose<®>, Pharmacia Fine Chemicals), ble ekvilibrert med en fosfatbuffer, pH 7,4, inneholdende 0,4 M NaCl, 0,1% Triton<®> X-100 (Wako Jun-yaku Co., Japan) og 0,02% natriumazid som stabilisator, og ble sluttelig forpakket i en engangs plastsprøyte under dannelse av en 5 ml kolonne (heretter angitt som ETI-Sepharose<®->kolonne). 25 mg kromatografisk rent STI (fra Sigma Co.) ble bundet til 5 ml bromcyanid-aktivert agarose, ble ekvilibrert med en fosfatbuffer, pH 7,4, inneholdende 0,4 M NaCl og 0,1% Triton<®> X-100, og ble sluttelig pakket i en engangs plastsprøyte under dannelse av en 5 ml kolonne (heretter angitt som STI-Sepharose<®->kolonne). Eksempel 2; 2 1 av en kultursupernatant av humane melanomaceller (Bowes, ATCC CRL 1224 G361) inneholdende 10% varme-inaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 20 KIU (kalli-krein-inhibitoreriheter)/ml"Aprotiniri<1> ble stabilisert med 0,02% Tween<®> 80 (Wako Jun-yaku Co., Japan) og 0,4 M NaCl,
og ble underkastet STI-Sepharose<®->kolonnen.
Avløpet fra STI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt.
Ca. 98% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist. Av-løpet ble stabilisert med 1,0 M NaCl (sluttkonsentrasjon) og ble deretter underkastet en ETI-Sepharose<®->kolonne.
Avløpet fra ETI-kolonnen ble oppsamlet, og den
plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt.
Ca. 10% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist. Ved zymografi med et anti-humant tPA-antistoff etter SDS-polyacrylamidgelelektroforese utviste avløpet to fraksjoner med hensyn til plasminogenaktivator, en med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton, og den andre med en molekylvekt på 70.000 dalton. Etter å ha kjørt hele avløpet gjennom kolonnen, ble kolonnen vasket med 20 ganger kolonnevolumet av en væske inneholdende 1,0 M NaCl og 0,2% Tween<®> 80. Den gjenvundne væske hadde ca. 5% av den aktivitet som ble til-ført kolonnen, og utviste to plasminogenaktivatorfraksjoner ved zymografi, en med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og den andre med en molekylvekt på 70.000 dalton.
Proteiner adsorbert på kolonnen, ble eluert under anvendelse av en lineær pH-gradient fra 5,5 til 3,0 under anvendelse av 0,2 M sitronsyrebuffere inneholdende 0,15 M NaCl.
Ved denne eluering ble to aktivitetstopper observert, en topp eluert ved pH mellom 5,2 og 4,5, og den andre ved pH mellom 4,5 og 3,7. Disse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Aktiviteten av disse kombinerte fraksjoner var ca. 80-85% av aktiviteten tilført kolonnen.
Etter reduksjon med (3-mercaptoethanol ble disse to fraksjoner underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese og deretter en sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at fraksjonen eluert ved pH-området varierende fra 5,2 til 4,5, utviste et bånd med en molekylvekt på 70.000 dalton eller relativt langsommere vandrende bånd på gelen etter reduksjonen, mens fraksjonen eluert ved pH varierende fra 4,5 til 3,7, utviste et bånd med en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton, men båndet med en molekylvekt på 70.000 dalton forsvant etter reduksjonen. Ut fra dette resultat ble det tPA som ble eluert med bufferen ved en pH mellom 5,2 og 4,5, identifisert som sc-tPA, og det tPA som ble eluert ved pH mellom 4,5 og 3,7, ble identifisert som dc-tPA.
Eksempel 3; 2 1 av en kultursupernatant av humane foster-forhudsceller ("Flow" 7000 (Flow Laboratories Inc., USA)) inneholdende 10% varmeinaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 20 KIU/ml "Aprotinin" ble stabilisert med 0,02% Tween<®> 80 og 0,4 M NaCl og ble underkastet en STI-Sepharose<®->kolonne på samme måte som beskrevet i eksempel 2.
Avløpet fra STI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt. Ca. 98% av den aktivitet som ble tilført kolonnen, ble påvist. Avløpet ble stabilisert med 1,0 M NaCl (sluttkonsentrasjon) og ble deretter underkastet en ETI-Sepharose<®->kolonne.
Avløpet fra ETI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt. Ca. 45% av aktiviteter- tilført kolonnen, ble påvist. Ved zymografi med et anti-iiumant tPA-antistoff etter SDS-polyacrylamidgelelektroforese utviste avløpet flere fraksjoner eller bånd for plasminogenaktivator, noen få bånd tilnærmet en molekylvekt på 100.000 dalton, flere bånd tilnærmet 50.000 til 70.000 dalton og ett bånd tilnærmet 35.000 dalton.
ETI-Sepharose<®->kolonnen ble vasket med 20 ganger kolonnevolumet av 0,1 M NH4HC03, pH 7,5, inneholdende 1,0 M NaCl og 0,2% Tween<®> 80. Den gjenvundne væske hadde ca. 5% av den aktivitet som ble tilført kolonnen og utviste samme zymografiske bånd som ovenfor beskrevet.
Eluering ble utført på samme måte som beskrevet i eksempel 2, med det unntak at buffere inneholdende 0,15 M NaCl og 0,1 M glycin, pH 4,5 og pH 3,5, ble anvendt.
Som et resultat ble et elueringsmønster likt det i eksempel 2, observert. Aktiviteten av de kombinerte fraksjoner var ca. 40-50% av aktiviteten tilført til kolonnen. 1-sse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Etter reduksjon med |3-mercaptoethanol ble disse to fraksjoner underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese og deretter sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at fraksjonen eluert med pH 4,5 buffer, hadde en molekylvekt på 70.000 dalton og utviste ingen forandring i molekylvekt eller relativt langsommere vandrende bånd på gelen etter reduksjonen, mens fraksjonen eluert med pH 3,5 buffer, utviste et bånd for en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton, men ikke noe bånd svarende til et bånd for en molekylvekt på 70.000 dalton etter reduksjonen. Ut fra dette resultat ble det tPA som ble eluert ved pH 4,5, identifisert som sc-tPA, og det tPA som ble eluert ved pH 3,5, ble identifisert som dc-tPA.
Eksempel 4:
2 1 av en kultursupernatant av muse-fribroblastceller transformert med humant tPA-gen (norsk patentsøknad nr. 864742) supplert med 2% varme-inaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 20 KIU/ml"Aprotinin", ble stabilisert med 0,02% Tween<®> 80 og 0,4 M NaCl og ble underkastet en STI-Sepharose<®->kolonne.
Avløpet fra STI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt. Ca. 98% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist. Av-løpet ble stabilisert med 1,0 M NaCl (sluttkonsentrasjon)
og ble deretter underkastet en ETI-Sepharose<®->kolonne.
Avløpet fra ETI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt. Ca. 10% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist. Ved zymografi med et anti-humant tPA-antistoff etter SDS-polyacrylamidgelelektroforese utviste avløpet to fraksjoner for plasminogenaktivator, en med en molekylvekt på 110.000 20.000 dalton, og den andre med en molekylvekt på 70.000 dalton. Etter at alt av avløpet var kjørt gjennom kolonnen, ble kolonnen vasket med 20 ganger kolonnevolumet av en væske inneholdende 2,0 M NaCl og 0,2% Tween<®> 80. Den gjenvundne væske hadde ca. 5% av den aktivitet som ble tilført kolonnen, og utviste to plasminogen-aktivatorfraksjoner ved zymografi, en med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og den andre med en molekylvekt på 70.000 dalton.
Proteiner adsorbert på kolonnen, ble eluert med
0,2 M natriumfosfatløsninger inneholdende 0,15 M NaCl, pH 4,5
og pH 3,5. Elueringsmønsteret likt det i eksempel 2, ble erholdt. Aktiviteten av de resulterende kombinerte to fraksjoner var ca. 80% av aktiviteten tilført kolonnen. Disse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese.
Etter reduksjon med |3-mercaptoethanol ble disse to fraksjoner underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese og deretter sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at eluatet med pH 4,5-løsning utviste et bånd med en molekylvekt på 70.000 dalton og således ingen forandring i molekylvekt eller relativt langsommere vandrende bånd på. gelen etter reduksjonen, mens eluatet med pH 3,5-løsning utviste et bånd med en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton, men ikke noe bånd svarende til båndet med en molekylvekt på
70.000 dalton etter reduksjonen. Ut fra dette resultat ble det bekreftet at det tPA som ble eluert ved pH 4,5, er sc-tPA, og det tPA som ble eluert ved pH 3,5~, var dc-tPA.
Eksempel 5; 2 1 av en kultursupernatant av humane melanomaceller (Bowes, ÅTCC CRL 1224 G361) inneholdende 10% varme-inaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 20 KIU/ml"Aprotinin" ble stabilisert med 0,02% Tween<®> 80 og 1 M NaCl og ble underkastet en ETI-Sepharose<®->kolonne.
Avløpet fra kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt. Ca. 10% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist. Ved zymografi med et anti-humant tPA-antistoff etter SDS-polyacrylamidgel-elektrof orese utviste avløpet to fraksjoner for plasminogenaktivator, en med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og den andre med en molekylvekt på 70.000 dalton.
Etter at alt av avløpet var kjørt gjennom kolonnen, ble kolonnen vasket med 20 ganger kolonnevolumet av en væske inneholdende 2 M NaCl. og 0,2% Tween<®> 80. Den gjenvundne væske hadde ca. 5% av den aktivitet som ble tilført kolonnen og utviste to plasminogenaktivatorfraksjoner ved zymografi, en med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton,
og den andre med en molekylvekt på 70.000 dalton.
Proteiner adsorbert på kolonnen, ble eluert ved anvendelse av en lineær pH-gradient fra 6,5 til 3,0 under anvendelse av 0,2 M "Veronal" buf fere inneholdende 0,2 M benzamidin og 0,15 M NaCl.
Ved denne eluering ble to aktivitetstopper observert, en topp eluert ved pH varierende fra 6,0 til 4,5 og den andre ved pH varierende fra 4,5 til 3,5. Disse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Aktiviteten av disse kombinerte fraksjoner var ca. 80-85% av aktiviteten tilført kolonnen.
Etter reduksjon med p-mercaptoethanol ble disse to fraksjoner underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese
og deretter en sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at fraksjonen eluert ved pH varierende fra 6,0 til 4,5, utviste et bånd med en molekylvekt på 70.000 dalton og således ingen forandring i molekylvekt eller relativt langsommere vandrende bånd på gelen etter reduksjonen, mens fraksjonen eluert ved pH varierende fra 4,5 til 3,5, utviste et bånd med en molekylvekt tilnærmet 30.000 til 40.000 dalton, men båndet med en molekylvekt på 70.000 dalton forsvant etter reduksjonen. Ut fra dette resultat ble det tPA som ble eluert med bufferen ved en pH mellom 6,0 og 4,5, identifisert som sc-tPA, og det tPA som ble eluert ved pH mellom 4,5 og 3,5, ble identifisert som dc-t<p>A.
Eksempel 6; 2 1 av en kultursupernatant av humane foster-forhudsceller ("Flow" 7000) inneholdende 10% varme-inaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 20 KIU/ml "Aprotinin" ble stabilisert med 0,02% Tween<®> 80 og 1 M NaCl og ble underkastet en ETI-Sépharose<®->kolonne.
Avløpet fra ETI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt. Ca. 45% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist.
Ifølge zymografi med et anti-humant tPA-antistoff etter SDS-polyacrylamidgelelektroforese utviste avløpet fle re fraksjoner eller band for plasminogenaktivator, noen få bånd med molekylvekter tilnærmet lik 100.000 dalton, flere bånd med molekylvekter tilnærmet lik 50.000 til 70.000 dalton og ett bånd med en molekylvekt tilnærmet lik 35.000 dalton.
ETI-Sepharose<®->kolonnen ble deretter vasket med
20 ganger kolonnevolumet av 0,1 M dinatriumfosfat-natrium-hydroxydbuffer, pH 9,5, inneholdende 2,0 M NaCl. Den gjenvundne væske hadde ca. 5% av aktiviteten tilført kolonnen og utviste samme bånd som beskrevet ovenfor ved zymografi.
Eluering ble utført med 0,1 M natriumfosfat-forsyreløsning inneholdende 0,3 M arginin og 0,15 M NaCl (pH 5,5) og 0,2 M sitronsyrebuffer (pH 3,0) inneholdende 0,15 M NaCl.
Som et resultat av dette ble to fraksjoner erholdt fra eluatet med buffere med forskjellige pH-verdier. Aktiviteten av de kombinerte fraksjoner var ca. 40-50% av aktiviteten tilført kolonnen. Disse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamid-gelelektrof orese .
Etter reduksjon med (3-mercaptoethanol ble disse fraksjoner underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese og deretter en sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at eluatet med en pH 5,5 buffer utviste et bånd med en molekylvekt på 70.000 dalton og således ingen forandring i molekylvekt eller relativt langsommere vandrende.bånd på gelen etter reduksjonen, mens eluatet med pH 3,0 buffer utviste et bånd med en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton, men båndet svarende til båndet med en molekylvekt på 70.000 dalton forsvant etter reduksjonen.
Ut fra dette resultat ble det tPA som ble eluert ved 5,5, identifisert som sc-tPA, og det tPA som ble eluert ved 3,0, ble identifisert som dc-tPA.
Eksempel 7:
2 1 av en kultursupernatant av muse-fibroblastceller transformert med humant tPA-gen (norsk patentsøknad nr.
864742) supplert med 2% varme-inaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 20 KIU/ml "Aprotinin" ble stabilisert med 1 M NaCl og underkastet en ETI-Sepharose<®->kolonne.
Avløpet fra ETI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt.
Ca. 10% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist. Ved zymografi med et anti-humant tPA-antistoff etter SDS-polyacrylamidgelelektroforese utviste avløpet to fraksjoner for plasminogenaktivator, en med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og den andre med en molekylvekt på ca. 70.000 dalton. Etter at alt av avløpet var kjørt gjennom kolonnen, ble kolonnen vasket med 20 ganger kolonnevolumet av 2 M NaCl-løsning. Den gjenvundne væske hadde ca. 5% av aktiviteten tilført til kolonnen og utviste to bånd for plasminogenaktivator ved zymografi, et med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og det andre med en molekylvekt på ca. 70.000 dalton.
Proteiner adsorbert på kolonnen ble deretter eluert med 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 6,0) inneholdende 0,5 M benzamidin og 0,15 M NaCl og 0,1 M sitronsyrebuffer (pH 3,0) inneholdende 0,15 M NaCl. To forskjellige fraksjoner ble erholdt i to forskjellige eluater. Aktiviteten av de kombinerte resulterende to fraksjoner var ca. 80% av aktiviteten tilført til kolonnen. Disse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese.
Etter reduksjon med [3-mercaptoethanol ble disse to fraksjoner underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese og deretter en sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at eluatet med pH 6,0 buffer utviste et bånd med en molekylvekt på ca. 70.000 dalton og således ingen forandring i molekylvekt eller relativt langsommere vandrende bånd på gelen etter reduksjonen, mens eluatet med pH 3,0 buffer utviste et bånd med en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton, men ikke noe bånd svarende til en molekylvekt på 70.000 dalton etter reduksjonen. Ut fra dette resultat ble det tPA som ble eluert ved pH 6,0, identifisert som sc-tPA og det tPA som ble eluert ved 3,0, ble identifisert som dc-tPA.
Eksempel 8; 2 1 av en kultursupernatant av kinesiske hamster-ovarieceller transformert med humant tPA-gen (CHO-celle C127I, ATCC CRL 1616) supplert med 10% varme-inaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 40 KIU/ml "Aprotinin" ble stabilisert med 1 M NaCl og underkastet en 5 ml ETI-Sepharose<®->kolonne som var blitt ekvilibrert med 0,05 M natriumfosfatbuffer (pH 7,5) inneholdende 1,0 M NaCl. Kolonnen ble deretter vasket med 0,05 M Na2HP04 (pH 9,5) inneholdende 2,0 M NaCl og 10 mM arginin.
Hele avløpet fra ETI-kolonnen hadde ca. 10% av den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet som ble til-ført kolonnen og utviste ved zymografi et bånd med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og et bånd med en molekylvekt på ca. 70.000 dalton.
Proteiner adsorbert på kolonnen, ble først eluert med 0,05 M Na2HP04~NaOH buffer (pH 4,5) inneholdende 0,01 M arginin og 0,1 M NaCl. Den fibrinolyttiske aktivitet av eluatet var ca. 60% av aktiviteten tilført kolonnen. Proteiner gjenværende på kolonnen, ble eluert med 0,1 M sitronsyrebuffer (pH 3,0) inneholdende 0,1 M NaCl. Ca. 25% av aktiviteten tilført kolonnen, ble gjenvunnet. Disse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese.
Etter reduksjon med 3-mercaptoethanol ble eluat-fraksjonene underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese og deretter en sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at eluatet med pH 4,5-bufferen utviste et bånd med en molekylvekt på ca. 70.000 dalton og således ingen forandring i molekylvekt eller relativt langsommere vandrende bånd på gelen etter reduksjon, mens eluatet med pH 3,0 buffer utviste et bånd med en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton, men båndet med en molekylvekt på ca. 70.000 dalton forsvant etter reduksjonen. Ut fra dette resultat ble det bekreftet at det tPA som ble eluert ved pH 4,5, var sc-tPA, og det
tPA som ble eluert ved pH 3,0, var dc-t PA.
Ut fra forsøksresultatene ble en relasjon mellom pH og konsentrasjonen av arginin for eluering av sc-tPA fastslått som følger. Ved pH 4,5, 1 mM - 50 mM; ved pH 5,0, 0,03 M eller mer; ved pH 5,5, 0,10 M eller mer; og ved pH 6,0, 0,2 M eller mer.
Eksempel 9; 1 mol NaCl (sluttkonsentrasjon) ble tilsatt til 2 1 av en kultursupernatant av humane amniotiske fosterceller (FL, ATCC CCL-62) transformert med humant tPA-gen assosiert med humant cytomegalovirus (HCMV) som en promoter for human tPA-ekspresjon. Cellekultursupernatanten ble deretter underkastet rensing av enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA under anvendelse av en ETI-kolonne på samme måte som beskrevet i eksempel 8.
Den fibrinolyttiske aktivitet av fraksjonene eluert ved 4,5 og 3,0, var ca. 70% og ca. 15% av den som ble til-ført kolonnen.
Eksempel 10;
Vertceller, Saccharomyces cerevisiae, transformert med humant tPA-gen, ble dyrket etter konvensjonell metode (Principles and Practice of Recombinant DNA Research with Yeast in the Molecular Biology of Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression, s. 603-636, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).
Cellene ble brutt opp med glassperler og fikk ned-senkes i 0,05 M natriumfosfatbuffer (pH 7,5) inneholdende 1 M NaCl og 0,02% Tween<®> 80 for ekstraksjon. Det filtrerte ekstrakt ble underkastet rensing av tPA på samme måte som beskrevet i eksempel 6.
Eluatet med pH 5,5 buffer hadde en molekylvekt på 70.000 dalton som ikke ble forandret ved reduksjon som utført i de ovenfor angitte eksempler 2 - 8, og utviste en aktivitet på 85% av den som ble tilført kolonnen. Eluatet med pH 3,0 buffer forandret sin molekylvekt (70.000 dalton) ved reduksjon, dvs. et bånd med en molekylvekt på 70.000 dalton forsvant, og et bånd med en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton fremkom i stedet. Ca. 10% av aktiviteten tilført kolonnen, ble observert i dette eluat.
Claims (2)
1. Fremgangsmåte for separat rensing og separering av enkeltkjedet vevplasminogenaktivator (tPA) og dobbeltkjedet tPA fra en blanding inneholdende begge, karakterisert ved at den omfatter trinnene: (a) en blanding inneholdende enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA bringes i nær kontakt med en kolonne som bærer en immobilisert Erythrina trypsin-inhibitor som et affinitetsmiddel for å absorbere angitte tPA på angitte kolonne; (b) kolonnen behandles med et elueringsmiddel som har en pH varierende fra 4,5 til 6,0 for selektivt å eluere enkeltkjedet tPA; og (c) kolonnen behandles med et elueringsmiddel som har en pH lavere enn 4,5, for selektivt å eluere dobbeltkjedet tPA; hvori angitte elueringsmidler inneholder benzamidin eller arginin i en konsentrasjon på minst 1 mM.
2. Fremgangsmåte for rensing og separering av enkelt-kjedet tPA fra en blanding inneholdende enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA,
karakterisert ved at den omfatter trinn for å bringe angitte blanding i nær kontakt med en kolonne som bærer en immobilisert Erythrina trypsin-inhibitor som et affinitetsmiddel for å absorbere angitte blanding av tPA på angitte kolonne og deretter selektivt eluere angitte enkelt-kjedet tPA som er blitt absorbert på kolonnen med et elueringsmiddel som har en pH varierende fra 4,5 til 6,0, hvori angitte elueringsmiddel inneholder benzamidin eller arginin i en konsentrasjon på minst 1 mM.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10320086A JPH0779692B2 (ja) | 1986-05-07 | 1986-05-07 | 一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法 |
| JP18685086 | 1986-08-11 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO871883D0 NO871883D0 (no) | 1987-05-06 |
| NO871883L NO871883L (no) | 1987-11-09 |
| NO173287B true NO173287B (no) | 1993-08-16 |
| NO173287C NO173287C (no) | 1993-11-24 |
Family
ID=26443851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO871883A NO173287C (no) | 1986-05-07 | 1987-05-06 | Fremgangsm}te for rensing av enkeltkjedet og dobbeltkjedet vevplasminogenaktivator |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4898825A (no) |
| EP (1) | EP0245100B1 (no) |
| AU (1) | AU590840B2 (no) |
| CA (1) | CA1284961C (no) |
| DE (1) | DE3780506T2 (no) |
| DK (1) | DK173151B1 (no) |
| FI (1) | FI96211C (no) |
| NO (1) | NO173287C (no) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6001355A (en) * | 1982-12-14 | 1999-12-14 | Dowdle; Eugene Bernard Davey | Pro-tPA for the treatment of thrombosis, embolism and related conditions |
| JP2507339B2 (ja) * | 1986-08-11 | 1996-06-12 | 三井東圧化学株式会社 | 粗ｔＰＡの精製方法 |
| US4898826A (en) * | 1987-12-10 | 1990-02-06 | Invitron Corporation | Method to solubilize tissue plasminogen activator |
| DE3832898A1 (de) * | 1988-09-28 | 1990-04-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Praeparat von in prokaryonten exprimiertem plasminogenaktivator |
| DE3903581A1 (de) * | 1989-02-07 | 1990-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Gewebs-plasminogenaktivator-derivat |
| US5676947A (en) * | 1989-02-07 | 1997-10-14 | Boehringer Manneheim Gmbh | Method for treating thromboembolic conditions using thrombolytically active proteins |
| US6326155B1 (en) | 1995-03-20 | 2001-12-04 | Dyax Corp. | Engineering affinity ligands for macromolecules |
| US5612473A (en) * | 1996-01-16 | 1997-03-18 | Gull Laboratories | Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification |
| US5731186A (en) * | 1996-02-05 | 1998-03-24 | Schering Aktiengesellschaft | Method for the production of rDSPA α1 |
| IL126045A0 (en) * | 1996-03-20 | 1999-05-09 | Dyax Corp | Purification of tissue plasminogen activator (tpa) |
| CN107250375A (zh) * | 2014-11-06 | 2017-10-13 | 科罗拉多州立大学董事会 | 在血栓溶解剂存在下使用粘弹性分析鉴定新疾病状态 |
| US11187710B2 (en) | 2015-06-08 | 2021-11-30 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Time independent viscoelastic analysis parameter for prediction of patient outcome |
| US11169142B2 (en) | 2016-05-11 | 2021-11-09 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Viscoelastic analysis in patients with disease associated with cardiovascular system |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4766075A (en) * | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
| EP0112122B1 (en) * | 1982-12-14 | 1991-08-28 | South African Inventions Development Corporation | Plasminogen activator |
| PH22337A (en) * | 1983-11-21 | 1988-08-12 | Ciba Geigy Ag | Synthesis of fibrinolytic agents by yeast |
| EP0238551A4 (en) * | 1985-09-06 | 1988-02-01 | Codon | METHODS OF RECOVERING A TISSUE PLASMINOGEN ACTIVATOR. |
-
1987
- 1987-04-29 US US07/043,746 patent/US4898825A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-30 CA CA000536036A patent/CA1284961C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-01 AU AU72418/87A patent/AU590840B2/en not_active Ceased
- 1987-05-04 FI FI871948A patent/FI96211C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-05-06 NO NO871883A patent/NO173287C/no unknown
- 1987-05-07 DK DK198702337A patent/DK173151B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-05-07 EP EP87304077A patent/EP0245100B1/en not_active Expired
- 1987-05-07 DE DE8787304077T patent/DE3780506T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4898825A (en) | 1990-02-06 |
| DK233787A (da) | 1987-11-08 |
| FI871948A0 (fi) | 1987-05-04 |
| DK173151B1 (da) | 2000-02-14 |
| FI871948A (fi) | 1987-11-08 |
| FI96211B (fi) | 1996-02-15 |
| AU7241887A (en) | 1987-11-12 |
| EP0245100B1 (en) | 1992-07-22 |
| DE3780506D1 (de) | 1992-08-27 |
| EP0245100A3 (en) | 1988-01-07 |
| NO871883D0 (no) | 1987-05-06 |
| NO173287C (no) | 1993-11-24 |
| CA1284961C (en) | 1991-06-18 |
| DK233787D0 (da) | 1987-05-07 |
| NO871883L (no) | 1987-11-09 |
| AU590840B2 (en) | 1989-11-16 |
| DE3780506T2 (de) | 1993-01-07 |
| FI96211C (fi) | 1996-05-27 |
| EP0245100A2 (en) | 1987-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4752603A (en) | Plasminogen activator and pharmaceutical composition having thrombolytic activity | |
| Chibber et al. | [48] Plasminogen | |
| NO173287B (no) | Fremgangsmaate for rensing av enkeltkjedet og dobbeltkjedet vevplasminogenaktivator | |
| US5141863A (en) | Purification procedure of TPA from crude preparations | |
| EP0238551A1 (en) | Methods for the recovery of tissue plasminogen activator | |
| EP0210870B1 (en) | Method of purifying crude tissue plasminogen activator | |
| CA1258242A (en) | Urokinase zymogen and composition containing the same | |
| EP0276328B1 (en) | Process for separating single-strand human tpa and double-strand human tpa from each other | |
| JPH0694480B2 (ja) | 試薬および方法 | |
| JPH0223158B2 (no) | ||
| Kula et al. | Consecutive use of ω-aminoalkylagaroses. Resolution and purification of clostripain and collagenase from Clostridium histolyticum | |
| NO166314B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av en plasminogenaktivatoravledet fra human nyre. | |
| EP0275282A1 (en) | Process for purifying a plasminogen activator | |
| CA1333163C (en) | Methods for the recovery of tissue plasminogen activator | |
| US5158882A (en) | Method for purifying a crude tissue plasminogen activator preparation | |
| US5139939A (en) | Process for the production of human tissue plasminogen activator and cell strain useful therefor | |
| JPS63317082A (ja) | ｔＰＡの精製 | |
| JP2714817B2 (ja) | ウロキナーゼ前駆体の製造方法 | |
| SU979508A1 (ru) | Способ получени иммобилизованного плазминогена | |
| JPH0779692B2 (ja) | 一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法 | |
| JPS6379593A (ja) | ｔＰＡを精製する方法 |