JP2507339B2 - 粗ｔＰＡの精製方法 - Google Patents
粗ｔＰＡの精製方法Info
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
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- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
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Description
【発明の詳細な説明】 （発明の目的と産業上の利用分野） 本発明は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tP
A）の精製法に関する。さらに詳しくは、特に種々のtPA
の分子種やその外の蛋白質である不純物を含む粗製のtP
Aをヒドロキシアパタイトと接触させ、この後特定の緩
衝液を用いることにより分子量約７万ダルトンのtPAを
分離精製して得る方法に関する。
A）の精製法に関する。さらに詳しくは、特に種々のtPA
の分子種やその外の蛋白質である不純物を含む粗製のtP
Aをヒドロキシアパタイトと接触させ、この後特定の緩
衝液を用いることにより分子量約７万ダルトンのtPAを
分離精製して得る方法に関する。
（従来の技術と発明が解決した問題点） ヒドロキシアパタイトをtPAの精製に適用することそ
れ自体は、特開昭61-76419において公知である。即ち、
この先行技術とは、tPAを含む液からtPAを得るに際し、
上記液をヒドロキシアパタイトに吸着させ、ついでtPA
を吸着したヒドロキシアパタイトからアンモニアを含有
する水によってtPAを溶出する方法である。しかしなが
らこの溶出する条件はtPAの安定性に影響を与える。
れ自体は、特開昭61-76419において公知である。即ち、
この先行技術とは、tPAを含む液からtPAを得るに際し、
上記液をヒドロキシアパタイトに吸着させ、ついでtPA
を吸着したヒドロキシアパタイトからアンモニアを含有
する水によってtPAを溶出する方法である。しかしなが
らこの溶出する条件はtPAの安定性に影響を与える。
本発明の特徴はこの公知の方法とは異なり、粗tPA特
には抗ヒトtPA抗体と反応する分子種で種々である不純
物の中から選択的に分子量約７万ダルトンのtPAを取得
することができる。
には抗ヒトtPA抗体と反応する分子種で種々である不純
物の中から選択的に分子量約７万ダルトンのtPAを取得
することができる。
つまりtPAを生産する細胞を培養し、tPAを得ようとす
る際、その培養液中には抗ヒトtPA抗体と反応する蛋白
質として分子量３万から4.5万ダルトンのもの、５万か
ら８万ダルトンのもの及び10万ダルトン以上のものが挟
雑してくる。
る際、その培養液中には抗ヒトtPA抗体と反応する蛋白
質として分子量３万から4.5万ダルトンのもの、５万か
ら８万ダルトンのもの及び10万ダルトン以上のものが挟
雑してくる。
本発明はこれら多種類のtPA分子量種のものやこの外
の不純たんぱくを含む液の中から分子量約７万ダルトン
のtPAを分離精製することができる方法である。
の不純たんぱくを含む液の中から分子量約７万ダルトン
のtPAを分離精製することができる方法である。
ヒドロキシアパタイトが蛋白質の精製に用いられるこ
とも知られているが、本発明で特定する緩衝液を用いて
多種類のtPA分子量種の中からある特定のtPA分子量種を
分離する方法については報告がない。
とも知られているが、本発明で特定する緩衝液を用いて
多種類のtPA分子量種の中からある特定のtPA分子量種を
分離する方法については報告がない。
（発明の構成） tPAとは、高等動物の組織で産生され、フィブリンに
特有な分解酵素であるプラスミンの前駆物質であるプラ
スミノーゲンを賦活化させる蛋白質である。
特有な分解酵素であるプラスミンの前駆物質であるプラ
スミノーゲンを賦活化させる蛋白質である。
本発明に言う粗tPAとは、ヒトメラノーマ細胞培養
液、ヒト正常細胞培養液及び遺伝子組み換え技法を用い
てヒトtPA遺伝子を組み込んだ細胞の培養液を含んでい
る。またtPAを含む液としては、上記培養液を部分精製
された液をも意味する。
液、ヒト正常細胞培養液及び遺伝子組み換え技法を用い
てヒトtPA遺伝子を組み込んだ細胞の培養液を含んでい
る。またtPAを含む液としては、上記培養液を部分精製
された液をも意味する。
（問題点を解決する為の手段） 本発明者らは、pH変化に伴うtPAのヒドロキシアパタ
イトへの吸着の強さが、pHが低い程吸着力が高まり、ま
た同じpHの場合、tPA分子量種のうち分子量が大きいも
のほど強く吸着されることを知り、pH及び塩濃度を変化
させ、多種類のtPA分子量種の中から特に分子量約７万
ダルトンのtPAを精製する本発明の方法を見出した。
イトへの吸着の強さが、pHが低い程吸着力が高まり、ま
た同じpHの場合、tPA分子量種のうち分子量が大きいも
のほど強く吸着されることを知り、pH及び塩濃度を変化
させ、多種類のtPA分子量種の中から特に分子量約７万
ダルトンのtPAを精製する本発明の方法を見出した。
本発明の実施について更に詳しく説明すると、ヒドロ
キシアパタイトに吸着させる為に、被処理液は弱酸性乃
至弱アルカリ性になるように予め調整しておくほうがよ
い。
キシアパタイトに吸着させる為に、被処理液は弱酸性乃
至弱アルカリ性になるように予め調整しておくほうがよ
い。
pHの調整にはリン酸塩緩衝液を使用するのが好まし
く、リン酸塩濃度が0.05M以下としてpHは６〜８にされ
るのが好ましい。
く、リン酸塩濃度が0.05M以下としてpHは６〜８にされ
るのが好ましい。
pH調整の為には他の緩衝液を使用してもよい。
この条件で不純物を含むtPA液をヒドロキシアパタイ
トと接触させるとほとんどすべての分子量種のtPAはそ
れに吸着される。
トと接触させるとほとんどすべての分子量種のtPAはそ
れに吸着される。
次にリン酸塩濃度が0.02〜0.05M以下でpH6以上７未満
の緩衝液で洗うことにより分子量３万〜４万ダルトンの
tPAが溶出される。
の緩衝液で洗うことにより分子量３万〜４万ダルトンの
tPAが溶出される。
その後更に、リン酸塩濃度が0.03以上0.06M未満でpH
7.0〜9.0の緩衝液で洗うことにより分子量４万から７万
までのtPAが溶出される。
7.0〜9.0の緩衝液で洗うことにより分子量４万から７万
までのtPAが溶出される。
次にリン酸塩濃度が0.06〜0.25MでpH6.0〜9.0の緩衝
液で分子量約７万のtPAが溶出される。
液で分子量約７万のtPAが溶出される。
尚、リン酸塩濃度が0.1〜0.4MでpH6.0〜10.0の緩衝液
では分子量10万以上のtPAが溶出される。
では分子量10万以上のtPAが溶出される。
以上が本発明の構成に係わる技術上の知見の概要であ
る。
る。
本発明では公知技術とは異なり、tPAの溶離溶媒にア
ンモニアを使用しなくても、本精製方法によりtPAを活
性を基準として90〜100％回収することができる。
ンモニアを使用しなくても、本精製方法によりtPAを活
性を基準として90〜100％回収することができる。
実施例１ ボウズ（Bowes）メラノーマ細胞を10％熱不活性化胎
児牛血清（FCS,56℃、30分間）と補充したRPMI-1640組
成培養媒体中で培養後、培養物を一度洗い、血清を含ま
ない媒体中で24時間培養後、媒体を集め新しい媒体を加
えた。
児牛血清（FCS,56℃、30分間）と補充したRPMI-1640組
成培養媒体中で培養後、培養物を一度洗い、血清を含ま
ない媒体中で24時間培養後、媒体を集め新しい媒体を加
えた。
収穫液2lに硫酸アンモニウムを300g/lの割合で加えた
後、pH7.0に調整し、４℃で一晩放置した。
後、pH7.0に調整し、４℃で一晩放置した。
生じた沈澱を遠心して集め、0.01Mリン酸緩衝液（pH
6.0）に溶解後、この緩衝液に対して透析し脱塩した。
この液を0.01Mリン酸緩衝液（pH6.0）に平衡化したヒド
ロキシアパタイトカラム5mlに適用した。
6.0）に溶解後、この緩衝液に対して透析し脱塩した。
この液を0.01Mリン酸緩衝液（pH6.0）に平衡化したヒド
ロキシアパタイトカラム5mlに適用した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解
活性を測定したが検出されなかった。
活性を測定したが検出されなかった。
吸着した蛋白質は、0.03Mリン酸緩衝液（pH6.0）を用
い溶出した。
い溶出した。
溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を
測定すると適用した活性の２％を示した。
測定すると適用した活性の２％を示した。
この画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後の
ザイモグラフィーで調べると、プラスミノーゲンアクチ
ベーターとして３万〜４万ダルトンの範囲にバンドが認
められた。
ザイモグラフィーで調べると、プラスミノーゲンアクチ
ベーターとして３万〜４万ダルトンの範囲にバンドが認
められた。
次に0.05MpH7.5のリン酸緩衝液でカラムを洗った。溶
出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を測定
すると適用した活性の３％を示した。この画分をSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後のザイモグラフ上で４
万から７万ダルトン近傍までの範囲にバンドがプラスミ
ノーゲンアクチベーターとして認められた。
出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を測定
すると適用した活性の３％を示した。この画分をSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後のザイモグラフ上で４
万から７万ダルトン近傍までの範囲にバンドがプラスミ
ノーゲンアクチベーターとして認められた。
続いて0.2M程度pH7.0程度のリン酸緩衝液でヒドロキ
シアパタイトカラムからの溶離を行なった。
シアパタイトカラムからの溶離を行なった。
溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を
測定すると適用した活性の85％を示した。
測定すると適用した活性の85％を示した。
この画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後の
ザイモグラフィーで調べると、分子量約７万のバンドが
プラスミノーゲンアクチベーターとして認められた。
ザイモグラフィーで調べると、分子量約７万のバンドが
プラスミノーゲンアクチベーターとして認められた。
残りの吸着蛋白は0.4Mリン酸緩衝液（pH7.5）を用い
溶出した。
溶出した。
溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を
測定すると適用した活性の５％を示した。
測定すると適用した活性の５％を示した。
この画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後の
ザイモグラフィーで調べると、分子量７万を越え分子量
10万ダルトン以上のものがプラスミノーゲンアクチベー
ターとして認められた。
ザイモグラフィーで調べると、分子量７万を越え分子量
10万ダルトン以上のものがプラスミノーゲンアクチベー
ターとして認められた。
実施例２ 人胎児包皮細胞培養液〔10％熱不活性化（56℃、30分
間）胎児牛血清及びアプロチニン（20KIU/ml）を含む〕
2lをTween80（0.02％）で安定化後、抗ヒトウロキナー
ゼカラムに適用した。
間）胎児牛血清及びアプロチニン（20KIU/ml）を含む〕
2lをTween80（0.02％）で安定化後、抗ヒトウロキナー
ゼカラムに適用した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解
活性を測定した。カラムに適用された活性の約60％が認
められた。
活性を測定した。カラムに適用された活性の約60％が認
められた。
この画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後の
ザイモグラフィーで調べると、分子量約３万〜15万ダル
トンの範囲で多種類のバンドがプラスミノーゲンアクチ
ベーターとして認められた。
ザイモグラフィーで調べると、分子量約３万〜15万ダル
トンの範囲で多種類のバンドがプラスミノーゲンアクチ
ベーターとして認められた。
これらのバンドは抗ヒトウロキナーゼ処理で影響をう
けず、抗ヒトtPA抗体処理をするとバンドが見られなく
なることからtPAと認めた。
けず、抗ヒトtPA抗体処理をするとバンドが見られなく
なることからtPAと認めた。
この液に硫酸アンモニウムを300g/lの割合で加えた後
pH7.0に調整し、４℃で一晩放置した。
pH7.0に調整し、４℃で一晩放置した。
生じた沈澱を遠心して集め、0.03Mリン酸緩衝液（pH
6.8）に対して透析し、脱塩した。
6.8）に対して透析し、脱塩した。
この液を0.03Mリン酸緩衝液（pH6.8）で平衡化したヒ
ドロキシアパタイトカラム5mlに適用し、流出液を集
め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を測定す
ると適用した活性の約２％を示した。この画分をSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後のザイモグラフィーで
調べると、tPAとして３万〜４万ダルトンの範囲にバン
ドが認められた。
ドロキシアパタイトカラム5mlに適用し、流出液を集
め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を測定す
ると適用した活性の約２％を示した。この画分をSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後のザイモグラフィーで
調べると、tPAとして３万〜４万ダルトンの範囲にバン
ドが認められた。
次に0.05Mリン酸緩衝液（pH7.8）でカラムを洗浄し
た。溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性
を測定すると適用した活性の５％を示し、４万から７万
ダルトンまでの間の分子量のものがザイモグラフ上で認
められた。
た。溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性
を測定すると適用した活性の５％を示し、４万から７万
ダルトンまでの間の分子量のものがザイモグラフ上で認
められた。
続いて吸着蛋白を0.25Mリン酸緩衝液（pH6.0）を用い
て溶離した。溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン
溶解活性は適用した活性の約80％を示し、その分子量は
約７万ダルトンであることがザイモグラフ上で認められ
た。
て溶離した。溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン
溶解活性は適用した活性の約80％を示し、その分子量は
約７万ダルトンであることがザイモグラフ上で認められ
た。
残りの吸着蛋白は0.3Mリン酸１水素２ナトリウム−カ
セイソーダ緩衝液（pH10.0）で溶出した。
セイソーダ緩衝液（pH10.0）で溶出した。
溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を
測定すると適用した活性の約10％を示し、その分子量は
約７万ダルトン及び10万ダルトン以上であるバンドがザ
イモグラフ上で認められた。
測定すると適用した活性の約10％を示し、その分子量は
約７万ダルトン及び10万ダルトン以上であるバンドがザ
イモグラフ上で認められた。
実施例３ ヒトtPA遺伝子を組み込んだチャイニーズハムスター
卵母（CHO）細胞（CHO K1 ATCC CCL 61）培養液〔10％
熱不活性化（56℃、30分間）胎児牛血清及びイプロチニ
ン（40KIU/ml）を含む〕2lをTween80（0.02％）で安定
化後、リン酸でpH5.0に調整した。
卵母（CHO）細胞（CHO K1 ATCC CCL 61）培養液〔10％
熱不活性化（56℃、30分間）胎児牛血清及びイプロチニ
ン（40KIU/ml）を含む〕2lをTween80（0.02％）で安定
化後、リン酸でpH5.0に調整した。
この液を、0.15M食塩及びTween80（0.02％）を含む0.
05Mリン酸２水素１ナトリウム（pH5.0）で平衡化したカ
ルボキシメチル（CM）セファロースカラム50mlに適用し
た。
05Mリン酸２水素１ナトリウム（pH5.0）で平衡化したカ
ルボキシメチル（CM）セファロースカラム50mlに適用し
た。
吸着した蛋白を含む樹脂を0.05M食塩を含む0.05Mリン
酸緩衝液（pH6.4）で洗浄後、0.5M食塩を含む0.05Mリン
酸緩衝液（pH6.4）でtPAを溶出した。溶出液のプラスミ
ノーゲン依存フィブリン溶解活性を測定すると適用した
活性の約85％が回収された。
酸緩衝液（pH6.4）で洗浄後、0.5M食塩を含む0.05Mリン
酸緩衝液（pH6.4）でtPAを溶出した。溶出液のプラスミ
ノーゲン依存フィブリン溶解活性を測定すると適用した
活性の約85％が回収された。
この画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後の
ザイモグラフィーで調べると、分子量約３万〜15万の範
囲で多種類のバンドがtPAとして認められた。
ザイモグラフィーで調べると、分子量約３万〜15万の範
囲で多種類のバンドがtPAとして認められた。
この溶出液は、硫酸アンモニウムを300g/lの割合で加
えた後pH7.0に調整し、４℃で一晩放置した。
えた後pH7.0に調整し、４℃で一晩放置した。
生じた沈澱を遠心して集め、0.05Mリン酸緩衝液（pH
6.0）に対して透析し、脱塩した。
6.0）に対して透析し、脱塩した。
この液に硫酸アンモニウムを300g/lの割合で加えた
後、４℃で一晩放置した。
後、４℃で一晩放置した。
生じた沈澱を遠心して集め、0.03Mリン酸緩衝液（pH
6.5）に対して透析し、脱塩した。
6.5）に対して透析し、脱塩した。
この液を0.05Mリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化したヒ
ドロキシアパタイトカラム5mlに適用し、流出液を集
め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を測定す
ると適用した活性の約３％を示した。この画分をSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後のザイモグラフィーで
調べると、プラスミノーゲンアクチベーターとして３万
〜４万ダルトンのバンドが認められた。
ドロキシアパタイトカラム5mlに適用し、流出液を集
め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を測定す
ると適用した活性の約３％を示した。この画分をSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後のザイモグラフィーで
調べると、プラスミノーゲンアクチベーターとして３万
〜４万ダルトンのバンドが認められた。
次に0.03Mリン酸緩衝液（pH8.0）でカラムを洗浄した
ところ、適用した活性の７％が測定され、分子量４万〜
７万のバンドがザイモグラフ上で認められた。続いて0.
15Mリン酸緩衝液（pH7.8）で吸着した蛋白を溶離した。
溶出液の活性は適用した活性の約80％を示し、分子量約
７万ダルトンのバンドがザイモグラフ上で認められた。
ところ、適用した活性の７％が測定され、分子量４万〜
７万のバンドがザイモグラフ上で認められた。続いて0.
15Mリン酸緩衝液（pH7.8）で吸着した蛋白を溶離した。
溶出液の活性は適用した活性の約80％を示し、分子量約
７万ダルトンのバンドがザイモグラフ上で認められた。
残りの吸着蛋白は0.5Mリン酸緩衝液（pH7.8）で溶出
した。溶出液の活性は適用した活性の約10％を示し、分
子量約７万及び10万ダルトン以上のものがザイモグラフ
上で認められた。
した。溶出液の活性は適用した活性の約10％を示し、分
子量約７万及び10万ダルトン以上のものがザイモグラフ
上で認められた。
実施例４ ヒトtPA遺伝子を組み込んだマウス線維芽細胞（特願
昭60-264918）培養液〔２％、C127細胞、熱不活性化（5
6℃、30分間）胎児牛血清及びアプロチニン（40KIU/m
l）を含む〕2lをTween80（0.02％）で安定化した。
昭60-264918）培養液〔２％、C127細胞、熱不活性化（5
6℃、30分間）胎児牛血清及びアプロチニン（40KIU/m
l）を含む〕2lをTween80（0.02％）で安定化した。
この液を、0.15M食塩及びTween80（0.02％）を含む0.
05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で平衡化した抗ヒトtPA
抗体セファロースカラム50mlに適用した。
05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で平衡化した抗ヒトtPA
抗体セファロースカラム50mlに適用した。
吸着した蛋白は2.0M食塩及びTween80（0.2％）を含む
0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で洗浄後、2.0Mチオシ
アン酸アンモニウム及びTween80（0.02％）を含む0.05M
グリシン塩酸緩衝液を用い溶離した。
0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で洗浄後、2.0Mチオシ
アン酸アンモニウム及びTween80（0.02％）を含む0.05M
グリシン塩酸緩衝液を用い溶離した。
溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を
測定すると適用した活性の約90％を示した。
測定すると適用した活性の約90％を示した。
この画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後の
ザイモグラフィーで調べると、分子量約３万〜15万ダル
トンの範囲で多種類のバンドがtPAとして認められた。
ザイモグラフィーで調べると、分子量約３万〜15万ダル
トンの範囲で多種類のバンドがtPAとして認められた。
この液に硫酸アンモニウムを300g/lの割合で加えた
後、pH7.0に調整し４℃で一晩放置した。
後、pH7.0に調整し４℃で一晩放置した。
生じた沈澱を遠心して集め、0.04Mリン酸緩衝液pH7.6
に透析し脱塩した。
に透析し脱塩した。
この液を0.04Mリン酸緩衝液（pH7.6）で平衡化したヒ
ドロキシアパタイトカラム（5ml）に適用した後、平衡
化に用いた緩衝液でカラムを洗浄した。
ドロキシアパタイトカラム（5ml）に適用した後、平衡
化に用いた緩衝液でカラムを洗浄した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解
活性を測定すると適用した活性の約５％を示し、分子量
約３万〜７万ダルトンの範囲にバンドがザイモグラフ上
で認められた。
活性を測定すると適用した活性の約５％を示し、分子量
約３万〜７万ダルトンの範囲にバンドがザイモグラフ上
で認められた。
吸着した蛋白は0.25Mリン酸緩衝液（pH6.0）で溶離し
た。溶出液の活性は適用した活性の約90％であり、、分
子量約７万ダルトンのバンドがザイモグラフ上で認めら
れた。
た。溶出液の活性は適用した活性の約90％であり、、分
子量約７万ダルトンのバンドがザイモグラフ上で認めら
れた。
さらに、0.5Mリン酸緩衝液（pH7.8）でカラムを洗浄
すると、適用した活性の約５％が測定され、分子量約７
万及び10万ダルトン以上のバンドがザイモグラフ上で認
められた。
すると、適用した活性の約５％が測定され、分子量約７
万及び10万ダルトン以上のバンドがザイモグラフ上で認
められた。
実施例５ ヒトtPA発現プロモーターとしてヒトサイトメガロウ
イルス（HCMV）を用い、ヒトtPA遺伝子を組み込んだヒ
ト胎児羊膜細胞（FL,ATCC CCL−62）培養液〔２％熱不
活性化（56℃,30分間）胎児牛血清及びアプロチニン（2
0KIU/ml）含む〕2lに硫酸アンモニウム300g/lの割合で
加えた後に、pH7.0に調整し４℃で一夜放置した。
イルス（HCMV）を用い、ヒトtPA遺伝子を組み込んだヒ
ト胎児羊膜細胞（FL,ATCC CCL−62）培養液〔２％熱不
活性化（56℃,30分間）胎児牛血清及びアプロチニン（2
0KIU/ml）含む〕2lに硫酸アンモニウム300g/lの割合で
加えた後に、pH7.0に調整し４℃で一夜放置した。
生じた沈澱を遠心して集め、0.04Mリン酸緩衝液pH8.0
に透析し脱塩した。
に透析し脱塩した。
この液を0.04Mリン酸緩衝液（pH8.0）で平衡化したヒ
ドロキシアパタイトカラム（5ml）に適用した後、平衡
化に用いた緩衝液でカラムを洗浄した。
ドロキシアパタイトカラム（5ml）に適用した後、平衡
化に用いた緩衝液でカラムを洗浄した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解
活性を測定すると適用した活性の約５％を示し、分子量
約３万〜７万ダルトンの範囲にバンドがザイモグラフ上
で認められた。
活性を測定すると適用した活性の約５％を示し、分子量
約３万〜７万ダルトンの範囲にバンドがザイモグラフ上
で認められた。
吸着した蛋白は0.24Mリン酸緩衝液（pH6.0）で溶離し
た。溶出液の活性は適用した活性の約90％であり、分子
量約７万ダルトンのバンドがザイモクラフ上で認められ
た。
た。溶出液の活性は適用した活性の約90％であり、分子
量約７万ダルトンのバンドがザイモクラフ上で認められ
た。
さらに0.5Mリン酸緩衝液（pH7.8）でカラムを洗浄す
ると、適用した活性の約５％が測定され、分子量約７万
及び10万ダルトン以上のバンドがザイモグラフ上で認め
られた。
ると、適用した活性の約５％が測定され、分子量約７万
及び10万ダルトン以上のバンドがザイモグラフ上で認め
られた。
実施例６ ヒトtPA遺伝子を組み込んで形質転換された宿主酵母
細胞（Saccharomyces cerevisiae）は、公知の方法（Pr
inciples and Practice of Recombinant DNA Reserch w
ith Yeast in The Molecular Biology of Yeast Saccha
romyces:Metabolism and Gene Expression,pp 603-636,
Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,
N.Y.（1982））に記載の方法で増殖させた。
細胞（Saccharomyces cerevisiae）は、公知の方法（Pr
inciples and Practice of Recombinant DNA Reserch w
ith Yeast in The Molecular Biology of Yeast Saccha
romyces:Metabolism and Gene Expression,pp 603-636,
Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,
N.Y.（1982））に記載の方法で増殖させた。
細胞はガラスビーズを用いて破砕し、tPAを1.0M食塩
及び0.02％Tween80を含む0.05Mリン酸緩衝液（pH7.5）
で抽出し、濾過して濾液をあつめた。
及び0.02％Tween80を含む0.05Mリン酸緩衝液（pH7.5）
で抽出し、濾過して濾液をあつめた。
この液に硫酸アンモニウムを300g/lの割合で加えた
後、pH7.0に調整し４℃で一夜放置した。
後、pH7.0に調整し４℃で一夜放置した。
生じた沈澱物を遠心して集め、0.04Mリン酸緩衝液（p
H7.6）に透析し脱塩した。
H7.6）に透析し脱塩した。
この液を実施例４に記載のヒドロキシアパタイトカラ
ムによるクロマトグラフィーによりtPAを精製した。
ムによるクロマトグラフィーによりtPAを精製した。
精製したtPAは分子量約７万ダルトンであり、カラム
にかけた活性の約90％が回収された。
にかけた活性の約90％が回収された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 審査官 富永 みどり (56)参考文献 特開 昭55−130918（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−146580（ＪＰ，Ａ) 特公 昭44−8064（ＪＰ，Ｂ２)
Claims (3)
- 【請求項１】分子量３万以上の異なる分子種のtPAを含
む粗tPAをヒドロキシアパタイトに密接に接触させ、そ
の後該ヒドロキシアパタイトを塩濃度が0.02〜0.05Mでp
H6以上７未満の緩衝液で処理して分子量３万乃至4.5万
ダルトンのtPAを含む第１画分を溶出させ、更に塩濃度
が0.03M以上0.06M未満でpH7.0〜9.0の緩衝液で処理して
分子量4.5万乃至約７万ダルトンのtPAを含む第２画分を
溶出させ、更に塩濃度が0.06〜0.25MでpH6.0〜9.0の緩
衝液で処理して分子量約７万ダルトンのtPAを含む第３
画分を溶出させ、更に塩濃度が0.1〜0.4MでpH6.0〜10.0
の緩衝液で処理して分子量10万ダルトン以上のtPAを含
む第４画分を溶出させることにより、選択的に分子量約
７万ダルトンのtPAを取得することを特徴とする粗tPAの
精製方法。 - 【請求項２】緩衝液がリン酸緩衝液であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項に記載の粗tPAの精製方法。 - 【請求項３】溶出に先立って、粗tPAを吸着しているヒ
ドロキシアパタイトをあらかじめ塩濃度が0.06Mを越え
ないリン酸緩衝液で洗浄することを特徴とする特許請求
の範囲第１項に記載の粗tPAの精製方法。
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| JP61186851A JP2507339B2 (ja) | 1986-08-11 | 1986-08-11 | 粗ｔＰＡの精製方法 |
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| ZA875902A ZA875902B (en) | 1986-08-11 | 1987-08-10 | Purification procedure of tpa from crude preparations |
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|---|---|---|---|
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| AU (1) | AU586756B2 (ja) |
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| FI (1) | FI88308C (ja) |
| NO (1) | NO175011C (ja) |
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| US7544500B2 (en) | 1999-11-13 | 2009-06-09 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Process for the production of a reversibly inactive acidified plasmin composition |
| US6355243B1 (en) | 1999-11-13 | 2002-03-12 | Bayer Corporation | Method of thrombolysis by local delivery of active plasmin |
| US20020064860A1 (en) * | 2000-11-29 | 2002-05-30 | Schering Corporation | Method for purifying adenoviruses |
| JP5624476B2 (ja) | 2008-01-18 | 2014-11-12 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド | アパタイトクロマトグラフィーによるリン酸化生体分子および非リン酸化生体分子の向上した精製法 |
| EP2297317A4 (en) | 2008-06-04 | 2011-12-07 | Talecris Biotherapeutics Inc | COMPOSITION, METHOD AND NECESSARY FOR THE PREPARATION OF PLASMINE |
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| US8895707B2 (en) | 2010-08-18 | 2014-11-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Elution of proteins from hydroxyapatite resins without resin deterioration |
| EP2670704B1 (en) | 2011-02-02 | 2018-12-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Apatite surface neutralization with alkali solutions |
| CN102286449B (zh) * | 2011-05-30 | 2013-04-03 | 云南省地方病防治所 | 鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法 |
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| CN105392569B (zh) | 2014-06-23 | 2019-08-20 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 磷灰石预处理 |
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| CN111909920B (zh) * | 2020-08-24 | 2022-04-15 | 武汉人福药业有限责任公司 | 一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法 |
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| JPS57146580A (en) * | 1981-03-09 | 1982-09-10 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Separation and purification of enzyme in human urine |
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-
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- 1987-08-07 AU AU76666/87A patent/AU586756B2/en not_active Ceased
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- 1987-08-10 ZA ZA875902A patent/ZA875902B/xx unknown
- 1987-08-10 CA CA000544117A patent/CA1302928C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-08-10 FI FI873470A patent/FI88308C/fi not_active IP Right Cessation
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- 1987-08-11 EP EP87307089A patent/EP0256836B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-05-01 US US07/517,383 patent/US5141863A/en not_active Expired - Fee Related
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