DK169680B1 - Fremgangsmåde til adskillelse af vævsplasminogenaktivatorarter - Google Patents

Description

i DK 169680 B1

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til adskillelse af vævspiaminogenaktivator (tPA)-arter med forskellige molekylvægte på ikke mindre end 30.000 dalton i en fraktion (1) indeholdende tPA-arter med en molekylvægt på fra ca. 30.000 - ca. 45.000 dalton, 5 en fraktion (2) indeholdende tPA-arter med en molekylvægt på fra ca.

45.000 til ca. 70.000 dalton, en fraktion (3) indeholdende tPA-arter med en molekylvægt på ca. 70.000 dalton, og en fraktion (4) indeholdende tPA-arter med en molekylvægt på ikke mindre end ca.

100.000 dalton.

10

Anvendelse af hydroxyapatit til oprensning af tPA er i sig selv kendt. Ved en fremgangsmåde anvendes hydroxyapatit til opnåelse af tPA ud fra et tPA-råpræparat, adsorberes tPA til hydroxyapatit og elueres derefter fra det tPA-bærende hydroxyapatit med en ammoniak-15 holdig opløsning (se f.eks. beskrivelsen til offentliggjort JP patent nr. 76419/1986). Under de forhold, der benyttes ved ovennævnte eluering, kan tPA-arter med forskellig molekylvægt ikke adskilles fra hinanden, og endvidere kan aktiviteten af tPA blive reduceret.

20 Når tPA-producerende celler dyrkes for at opnå tPA, har det vist sig, at den resulterende dyrkningsbouillon af proteiner, der er reaktive over for anti-human-tPA-antistof, indeholder forskellige tPA-arter med forskellig molekylvægt, herunder tPA-arter, der har 25 molekylvægt på fra ca. 30.000 til ca. 45.000 dalton, tPA-arter med molekylvægt på fra ca. 50.000 til ca. 70.000 dalton og tPA-arter med en molekylvægt på ca. 100.000 eller højere.

Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at tilveje-30 bringe en fremgangsmåde til adskillelse- af tPA med specifikke molekylvægte ud fra en blanding af forskellige tPA-arter med forskellig molekylvægt og proteinholdige urenheder som nævnt oven for.

35 Man har udført omfattende undersøgelser med henblik på at opnå ovennævnte formål. Som resultat har det vist sig, at tPA's adsorptionsgrad til hydroxyapatit bestemmes af pH og/eller saltkoncentrationen og også varierer med molekylvægten af selve tPA'et. Bindingsstyrken af tPA til hydroxyapatit bliver nemlig kraftigere DK 169680 B1 2 når pH eller saltkoncentrationen falder. Ved samme pH og saltkoncentration adsorberes tPA med højere molekylvægt kraftigere.

Ovennævnte opdagelse har ført til fuldendelse af fremgangsmåden 5 ifølge opfindelsen, ved hvilken en lang række tPA-arter med for skellig molekylvægt adsorberes til hydroxyapatit og derpå behandles med elueringsmidler med forskellige pH-værdier og/eller saltkoncentrationer til isolering af en bestemt tPA-art i oprenset form.

10 Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der således en fremgangsmåde til adskillelse af en blanding af vævspi asminogenaktivator (tPA)-arter med forskellige molekylvægte på ikke mindre end 30.000 dalton i en fraktion (1) indeholdende tPA-arter med en molekylvægt på fra ca. 30.000 - ca. 45.000 dalton, en fraktion (2) 15 indeholdende tPA-arter med»en molekylvægt-på fra ca. 45.000 til ca.

70.000 dalton, en fraktion (3) indeholdende tPA-arter med en molekylvægt på ca. 70.000 dalton, og en fraktion (4) indeholdende tPA-arter med en molekylvægt på ikke mindre end ca. 100.000 dalton, hvilken fremgangmåde omfatter følgende trin: 20 (a) at blandingen af tPA-arter bringes i kontakt med hydroxyapatit til adsorption af disse tPA-arter med forskellige molekylvægte på ikke mindre end 30.000 dalton, og 25 (b) at hydroxyapatiten derpå behandles med elueringsmidler for successivt at eluere fraktionerne (1) - (4), hvilke elueringsmidler har forskellige pH-værdier, saltkoncentrationer eller både pH-værdier og saltkoncentrationer, således at fraktionerne (1) - (4) elueres særskilt.

30

Hydroxyapatiten kan f.eks. behandles successivt med følgende elueringsmidler (A) - (D): elueringsmiddel (A) indeholdende 0,02-0,1 M phospbat og med en 35 pH-værdi på fra 6 til 9 til eluering af fraktion (1), elueringsmiddel (B) indeholdende 0,03-0,1 M phosphat og med en pH-værdi på fra 7 til 9 til eluering af fraktion (2), DK 169680 B1 3 elueringsmiddel (C) indeholdende 0,04-0,3 M phosphat og med en pH-værdi på fra 6 til 9 til eluering af fraktion (3) og elueringsmiddel (D) indeholdende 0,04-0,5 M phosphat og med en 5 pH-værdi på fra 6 til 10 til eluering af fraktion (4), hvorved phosphatkoncentrationen i elueringsmidlet øges selektivt i rækkefølgen fra (A) til (D).

10 Hydroxyapatiten kan f.eks. også behandles successivt med følgende elueringsmidler (E) - (H): elueringsmiddel (E) indeholdende 0,03-0,15 M natriumchlorid og med en pH-værdi på fra 6 til 9 til eluering af fraktion (1), 15 elueringsmiddel (F) indeholdende 0,05-0,15 M natriumchlorid og med en pH-værdi på fra 7 til 9 til eluering af fraktion (2), elueringsmiddel (G) indeholdende 0,07-0,7 M natriumchlorid og med en 20 pH-værdi på fra 6 til 9 til eluering af fraktion (3) og elueringsmiddel (H) indeholdende 0,07-1,0 M natriumchlorid og med en pH-værdi på fra 6 til 10 til eluering af fraktion (4), 25 hvorved natriumchloridkoncentrationen i elueringsmidlerne øges selektivt i rækken af elueringsmidler fra (E) til (H).

Selv om det er kendt at anvende hydroxyapatit til oprensning af proteiner, er isolering af bestemte tPA-arter ud fra et antal 30 forskellige tPA-arter som Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse aldrig blevet beskrevet.

I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan tPA indvindes i op til 90-100% med hensyn til dets aktivitet og kan også 35 adskilles i individuelle tPA-arter med forskellig molekylvægt uden behov for vandig ammoniak som middel til eluering af tPA, der er adsorberet på hydroxyapatit, i modsætning til traditionelle fremgangsmåder.

DK 169680 B1 4 Vævspi asmi nogenaktivator (tPA) produceres i væv hos højere dyr og er et protein, som aktiverer plasminogen, der er en præcursor for pi asmi n, som er et proteolytisk enzym, der er specifikt over for fibrin.

5

Dette tPA frembringes i et dyrkningsmedium ved at dyrke humanmel anomacel ler, normale humanceller eller celler, der bærer human-tPA-genet integreret i overensstemmelse med rekombinant DNA-tekno-logi. tPA, Som opnås i den resulterende dyrkningsbouillon, omfatter 10 en lang række tPA-molekylarter.

Det tPA-råpræparat, på hvilken fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse effektivt kan anvendes, omfatter forskellige molekyl arter, der f.eks. er produceret som beskrevet ovenfor. Det 15 kan foreligge i en form, der er indeholdt i en dyrkningsbouillon, eller kan foreligge i en form, der opnås ved delvis oprensning af et præparat fra en sådan dyrkningsbouillon. Den foreliggende opfindelse er imidlertid ikke begrænset til disse former. Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes på vandige medier, som hver 20 især indeholder forskellige tPA-arter med forskellig molekylvægt, og som er fremstillet ved én blandt forskellige fremgangsmåder.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse bringes et sådant tPA-råpræparat først i forbindelse med hydroxyapatit til 25 adsorption af de forskellige tPA-arter til hydroxyapatiten.

Der stilles ingen bestemte betingelser til det anvendte hydroxyapatit. Det er generelt muligt at anvende hydroxyapatit, som består af calciumphosphat, og som er blevet formet til en blandt forskel-30 lige former ønsket ved én af forskellige fremstillingsprocesser. De former, som fremstilles til anvendelse ved kromatografi, anvendes i mange tilfælde fortrinsvis.

Et vandigt medium, som indeholder forskellige tPA-arter, såsom et 35 tPA-råpræparat, bringes i kontakt med dette hydroxyapatit, således at tPA-arterne med forskellige molekylvægte adsorberes. Der lægges ingen bestemte begrænsninger på de betingelser, hvorunder ovennævnte kontakt frembringes. Kontakten kan følgelig effektueres ved en almindelig søjlefremgangsmåde eller en batchfremgangsmåde. Ved DK 169680 B1 5 søjlefremgangsmåden bringes et vandigt medium indeholdende tPA-arterne til at strømme enten opad eller nedad gennem en søjle, der er pakket med hydroxyapatit, således at tPA-arterne bringes i kontakt med hydroxyapatiten og derefter adsorberes til hydroxy-5 apati ten. På den anden side sammenblandes hydroxyapaptiten og et vandjgt medium, som indeholder forskellige tPA-arter, ved batch-fremgagnsmåden, således at tPA-arterne bringes i kontakt med hydroxyapatiten. Derefter separeres de med forskellig molekylvægt forskellige tPA-arter, som er blevet adsorberet til hydroxyapatiten, 10 fra hinanden.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse ændres pH-værdierne og/eller saltkoncentrationerne i elueringsmidlerne i overensstemmelse med molekylvægten af den tPA-art, som skal elueres.

15 Det kan være hensigtsmæssigt at sætte -et tilsætningsmiddel til elueringsmidlerne for at accelere og øge elueringen og isoleringen af forskellige molekyl arter.

Den laveste pH-værdi af et elueringsmiddel, der er anvendelig ved 20 udøvelse af den foreliggende fremgangsmåde, er den laveste pH-værdi, ved hvilken det anvendte hydroxyapatit stadig ikke opløses. På den anden side er den øvre grænse den højeste pH-værdi, ved hvilken tPA-arter med forskellig molekylvægt, og som er reaktive over for anti-human-tPA-antistof, stadig kan isoleres fra hinanden. Der kan 25 således anvendes et elueringsmiddel med et sådant pH-område, men der foretrækkes pH 5-10, og navnlig pH 6-9.

Der anvendes endvidere et salt til adskillelse af tPA fra hydroxyapatit. Det salt, som er brugbart ved udøvelse af fremgangsmåden 30 ifølge den foreliggende opfindelse, er et salt, der ikke besidder chelaterende evne. Det er således f.eks. muligt at anvende et salt, der omfatter en kaotrop ion, såsom et thiocyanat eller perchlorat, eller et chlorid, fluorid, phosphat, carbonat, sulfat, nitrat, borat, acetat eller lignende. Som specifikke eksemplar på foretrukne 35 salte kan nævnes natriumphosphat, kaliumphosphat, natriumchlorid, kaliumchlorid, ammoniumthiocyanat, natriumsulfat, natriumborat, natriumacetat osv.

Som tilsætningsstof kan der anvendes en basisk aminosyre eller DK 169680 Bl 6 derivater heraf, såsom arginin, lysin, ornithin eller ε-aminocapron-syre, i en koncentration på 1 mM - 0,5 M, fortrinsvis 5 mM - 0,3 M i et elueringsmiddel. Anvendelse af et elueringsmiddel, som omfatter et sådant tilsætningsmiddel, letter elueringen yderligere og ti 1 -5 lader også en mere effektiv isolering af tPA-arter med forskellige molekyl vægte.

For at isolere en ønsket tPA-art fra de forskellige tPA-arter, der er adsorberet på hydroxyapatiten, er det nødvendigt at anvende et 10 elueringsmiddel, hvis pH og/eller saltkoncentration justeres således, at de ønskede tPA-arter selektivt elueres, som beskrevet ovenfor. Elueringsmidlet kan være tilsat et tilsætningsmiddel om nødvendigt.

15 En tPA-art med en lavere molekylvægt elueres først, med efterfølgende og successiv eluering af tPA-arter med højere molekylvægt ved forøgelse af elueringsmidiets pH fra et lavere niveau til et højere niveau. Den anvendte saltkoncentration varierer ikke kun med salttype men også med elueringsmidlets pH.

20 Når elueringen udføres med et elueringsmiddel, som indeholder natriumchlorid, foretrækkes det at frembringe adsorptionen af tPA^arterne til hydroxyapatit ved en NaCl-koncentration på 0,03 M eller lavere ved et pH på 6-8.

25

Som det er bekrevet ovenfor, kan tPA-arter med de ønskede molekylvægte isoleres og opnås enten successivt eller selektivt ved anvendelse af et udvalgt salt, saltkoncentration og pH.

30 Den foreliggende opfindels’e vil herefter' blive belyst med nedenstående eksempler.

Eksempel 1 35 Efter dyrkning af Bowes melanomaceller i RPMI 1640-dyrkningsmedium (Gibco) suppleret med 10% varmeinaktiveret (ved 56°C i 30 min) føtalt kalveserum (FCS, Gibco) blev cellerne indvundet og vasket én gang. De vaskede celler blev derpå dyrket i 24 timer i et serumfrit medium, og der blev opnået en resulterende dyrkningssupernatant.

DK 169680 B1 7

Der blev tilsat ammoniumsulfat i et omfang på 300 g/1 til 2 1 af dyrkningssupernatanten. Den resulterende blanding blev derefter justeret til pH 7,0 og fik derpå lov til at henstå natten over ved 4°C.

5

Det „resulterende præcipitat blev opsamlet ved centrifugering, opløst i en 0,01 M phosphatpuffer (pH 6,0) og derpå dialyseret mod samme puffer for at afsalte samme. Den dialyserede opløsning blev derpå sat på en søjle af 5 ml hydroxyapatit, som var blevet ækvi1 ibreret 10 med en 0,01 M phosphatpuffer (pH 6,0).

Gennemløbet fra søjlen blev opsamlet, og den pi asmi nogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt.

15 Der blev imidlertid ikke påvist aktivitet.'

Adsorberede proteiner blev elueret under anvendelse af en 0,03 M phosphatpuffer (pH 6,0).

20 Den plasminogenafhængige fibrinolytiske aktivitet af eluatet blev bestemt. Den viste sig at være 2% af den aktivitet, som var sat på søjlen.

Denne eluerede fraktion blev udsat for elektroforese i en SDS-poly-25 acrylamidgel, og blev derpå analyseret ved zymografi. Som en pi asmi nogenaktivator blev der observeret bånd i området på fra ca.

30.000 dalton til ca. 45.000 dalton.

Søjlen blev derpå vasket med en 0,05 M phosphatpuffer (pH 7,5). Den 30 plasminogenafhængige fibrinolytiske aktivitet af eluatet blev bestemt. Den viste sig at være 3% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Denne eluerede fraktion blev udsat for elektroforese i en SDS-polyacrylamidgel og blev derpå analyseret ved zymografi. Som en pi asmi nogenaktivator blev der observet bånd i området på fra ca.

35 45.000 dalton og op til ca. 70.000 dalton.

Efterfølgende blev hydroxyapatitsøjlen behandlet med en 0,02 M phosphatpuffer (pH 7,0).

DK 169680 B1 8

Den plasminogenafhængige fibrinolytiske aktivitet af eluatet blev bestemt. Den viste sig at være 85% af den aktivitet, der var sat på søjlen.

5 Denne eluerede fraktion blev udsat for elektroforese i en SDS-poly-acrylamidgel og blev derpå analyseret ved zymografi. Som en pi asmi nogenaktivator blev der observeret et bånd med en molekylvægt på ca. 70.000.

10 De resterende adsorberede proteiner blev elueret med en 0,4 M phosphatpuffer (pH 7,5).

Den plasminogenafhængige fibrinolytiske aktivitet af eluatet blev bestemt. Den viste sig at være 5% af den aktivitet, som var sat på 15 søjlen.

Denne eluerede fraktion blev udsat for elektroforese i en SDS-polyacrylamidgel og blev derpå analyseret ved zymografi. Som pi asmi nogenaktivatorer blev der observeret bånd ved molekylvægte på 20 ca. 70.000 henholdsvis 100.000 og højere.

Eksempel 2

Efter stabilisering med 0,02% "Tween 80" (Junsei Chemicals) blev 2 1 25 dyrkningssupernatant, der var fremstillet fra en kultur af human-føtale forhudsceller, hvis dyrkningsmedium indeholdte 10% varme-inaktiveret (56°C, 30 min) føtalt kalveserum og 20 KIU/ml aprotinin (Bayer), sat på en søjle af anti-humanurokinase.

30 Søjlegennemløbet blev opsamlet, og "den plasminogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Der blev observeret ca. 60% af den aktivitet, som var sat på søjlen.

Denne gennemløbsfraktion blev analyseret ved zymografi- efter at være 35 udsat for elektroforese i en SDS-polyacrylamidgel. Der blev observeret forskellige bånd som plasminogenaktivatorer i et molekylvægtsområde på fra ca. 30.000 dalton til ca. 150.000. dalton.

Disse bånd viste sig at svare til tPA, idet de ikke blev påvirket, DK 169680 B1 9 når de blev behandlet med en anti-humanurokinase, men forsvandt efter behandling med et anti-human-tPA-antistof.

Til denne gennemløbsfraktion blev der sat ammoniumsulfat i et omfang 5 på 300 g/Ί. Den resulterende opløsning blev justeret til pH 7,0 og fik derpå lov til at stå natten over ved 4°C.

Det således dannede præcipitat blev indvundet ved centrifugering, fulgt at dialyse mod en 0,03 M phosphatpuffer (pH 6,8).

10

Den dialyserede opløsning blev derpå sat på en søjle af 5 ml hydroxyapatit, som var blevet ækvilibreret med en 0,03 M phosphatpuffer (pH 6,8). Gennemløbet for søjlen blev opsamlet, og den pi asmi nogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Den 15 viste sig at være ca. 2% åf den aktivitet, som var sat på søjlen. Denne gennemløbsfraktion blev udsat for elektroforese i en SDS-polyacrylamidgel og blev derpå analyseret ved zymografi. Bånd blev observeret som tPA i området fra ca. 30.000 dalton til ca. 45.000 dalton.

20 Søjlen blev derpå vasket med en 0,05 M phosphatpuffer (pH 7,8). Den plasminogenafhængige fibrinolytiske aktivitet af eluatet blev bestemt. Den viste sig at være 5% af den aktivitet, som var sat på søjlen. tPA-Arter med molekylvægte i området på fra ca. 45.000 25 dalton til ca. 70.000 dalton blev observeret ved zymografi.

Proteiner, der var adsorberet på denne måde, blev dernæst elueret med en 0,25 M phosphatpuffer (pH 6,0). Den plasminogenafhængige fibrinolytiske aktivitet af eluatet viste sig at være ca. 80% af den 30 aktivitet, som var sat på s’øjlen. Dens molekylvægt viste sig at være ca. 70.000 dalton ved zymografi.

De resterende adsorberede proteiner blev elueret med en 0,3 M Na^HPO^-NaOH-puffer (pH 10,0).

35

Den plasminogenafhængige fibrinolytiske aktivitet af eluatet blev bestemt. Den viste sig at være ca. 10% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Som dens molekylvægte blev der observeret bånd svarende til ca. 70.000 dalton og ca. 100.000 dalton og højere ved zymografi.

DK 169680 B1 10

Eksempel 3

Efter stabilisering med 0,02% "Tween 80" blev 2 1 af en dyrknings-supernatant, som var fremstillet fra en kultur af kinesisk hamster-5 ovarieceller (CHO-celler), hvori der var integreret et human-tPA-gen (CHOj. Kl ATCC CCL 61), hvis dyrkningsmedium indeholdt 10% varme-inaktiveret (56°C, 30 min) føtalt kalveserum og 40 KIU/ml aprotinin, justeret til pH 5,0 med phosphorsyre.

10 Den resulterende opløsning blev sat på en søjle af 50 ml carboxy-methyl (CM)-Sepharose (Pharmacia AB), som var blevet ækvilibreret med en 0,05 M natriumdihydrogenphosphatpuffer (pH 5,0) indeholdende 0,15 M natriumchlorid og Tween 80 (0,02%).

15 De harpiksholdige proteiner, der var adsorberet derpå, blev vasket med..en 0,05 M phosphatpuffer (pH 6,4), fulgt af eluering af tPA med en 0,05 M phosphatpuffer (pH 6,4), som indeholdte 0,5 M natrium-chlorid. Eluatets piaminogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Der viste sig at blive indvundet ca. 85% af den aktivitet, 20 som var sat på søjlen.

Denne eluerede fraktion blev analyseret ved zymografi efter at den var udsat for elektroforese i en SDS-polyacrylamidgel. Forskellige bånd blev genkendt som tPA i området med molekylvægte på fra ca.

25 30.000 dalton til ca. 150.000 dalton.

Eluatet blev fortyndet 10 gange med vand og derpå sat på en søjle af 5 ml hydroxyapatit, der var blevet ækvilibreret med 5 mM natrium-phosphatpuffer (pH 6,4) indeholdende 0,05 M natriumchlorid. Gennem-30 løbet fra søjlen blev 'opsamlet, og den pi asminogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Det viste sig at være ca. 3% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Denne gennemløbsfraktion blev udsat for elektroforese i en SDS-acrylamidgel og blev derpå analyseret ved zymografi. Som en pi asminogenaktivator blev der 35 observeret bånd i området på fra ca. 30.000 dalton til ca. 45.000 dalton.

Søjlen blev derpå elueret med en 5 mM phosphatpuffer (pH 7,4) indeholdende 0,08 M natri umchl orid. Der blev målt ca. 7% af den DK 169680 B1 11 aktivitet, som var sat på søjlen. Den eluerede fraktion udviste bånd svarende til molekylvægte på fra ca. 45.000 til ca. 70.000 ved zymografi. Søjlen blev derpå behandlet med en 5 mM phosphatpuffer (pH 7,8), som indeholdte 0,3 M natriumchlorid. Eluatets aktivitet 5 viste sig at udgøre ca. 80% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Dette el uat udvist et bånd svarende til en molekylvægt på ca. 70.000 dalton ved zymografi.

De resterende adsorberede proteiner blev elueret med en 5 mM 10 phosphatpuffer (pH 7,8), som indeholdte 0,5 M natriumchlorid.

Eluatets aktivitet var ca. 10% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Dette el uat udviste bånd svarende til molekylvægte på ca.

70.000 dalton henholdsvis ca. 100.000 dalton og højere ved zymografi .

15

Eksempel 4

To 1 dyrkningssupernatant, der var fremstillet fra en kultur af musefi brobiastceller (C127, ATCC CRL 1616), som var transformeret 20 med human-tPA-genet (DK patentansøgning nr. 5719/86), hvilket dyrkningsmedium indeholdte 2% varmeinaktiveret (56°C, 30 min) føtalt kalveserum og 40 KIU/ml aprotinin, blev stabiliseret med "Tween 80 (0,02%)".

25 Den resulterende opløsning blev sat på en søjle af 50 ml anti-human-tPA-antistof-Sepharose, der var ækvilibreret med en 0,1 M vandig opløsning af ammoniumbicarbonat (pH 8,0), som indeholdte 0,15 M natriumchlorid og "Tween 80 (0,02%)".

30 Efter vask af de således adsorberede proteiner med en 0,1 M vandig opløsning af ammoniumbicarbonat (pH 8,0), som indeholdte 2,0 M natriumchlorid og "Tween 80 (0,02%)", blev proteinerne elueret med en 0,1 M vandig opløsning af ammoniumbicarbonat (pH 8,0), som indeholdte 2,0 M ammoniumthiocyanat og "Tween 80 (0,02%)".

Eluatets piaminogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt.

Den viste sig at være ca. 90% af den aktivitet, som var sat på søjlen.

35 DK 169680 B1 12

Denne eluerede fraktion blev udsat for elektroforese i en SDS-polyacrylamidgel og derpå analyseret ved zymografi. Forskellige bånd blev genkendt som tPA i området med molekylvægte på fra ca. 30.000 dalton til ca. 150.000 dalton.

5

Dette el uat blev fortyndet 20 gange med vand og derpå justeret til pH 7,5. Den resulterende opløsning blev derpå sat på en søjle af 5 ml hydroxyapatit, som var blevet ækvilibreret med en 5 mM vandig opløsning af ammoniumbicarbonat (pH 7,5) indeholdende 0,1 M 10 ammoniumthiocyanat, fulgt af vask af søjlen med samme puffer som den, der blev anvendt til ovennævnte ækvilibrering.

Gennemløbet fra søjlen blev opsamlet. Den pi asmi nogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Den viste sig at være ca. 5% 15 af den aktivitet, som var sat på søjlen. Dette gennemløb udviste ved zymografi bånd i området med molekylvægte på fra ca. 30.000 dalton til ca. 70.000 dalton.

Søjlen blev derpå behandlet med en 0,1 M vandig opløsning af am-20 moniumbicarbonat (pH 8,0), som indeholdte 0,2 M ammoniumthiocyanat. Aktiviteten af eluatet var ca. 90¾ af den aktivitet, som var sat på søjl en. Dette el uat udviste ved zymografi et bånd svarende til en molekylvægt på ca. 70.000 dalton.

25 Søjlen blev yderligere vasket med en 0,1 M vandig opløsning af ammoniumbicarbonat (pH 8,0), som indeholdte 0,5 M ammoniumthiocyanat. I det således opnåede el uat blev der bestemt ca. 5% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Dette el uat udviste ved zymografi bånd svarende til molekylvægte på ca. 70.000 dalton henholdsvis 30 100.000 dalton og højere.

Eksempel 5

Ammoniumsulfat blev i et omfang på 300 g/1 sat til—2 1 dyrknings-35 supernatant, der var fremstillet fra en kultur af humanføtale fosterhindeceller (FL, ATCC CCL-62), der bar human-tPA-genet forbundet med humancytomegalovirus (HCMV) som en promotor til human-tPA-ekspression, hvilket dyrkningsmedium indeholdte 2% varmein-aktiveret (56°C, 30 min) føtalt kalveserum og 20 KlU/ml aprotinin.

DK 169680 B1 13

Den resulterende blanding blev justeret til pH 7,0 og fik derpå lov til at stå natten over ved 4°C.

Det således dannede præcipitat blev opsamlet ved centrifugering, 5 fulgt af dialyse mod en 0,04 M phosphatpuffer (pH 8,0) indeholdende 10 mM argi nin for at afsal te præcipitatet.

Den resulterende dialyserede opløsning blev sat på en søjle af 5 ml hydroxyapatit ækvilibreret med en 0,04 M phosphatpuffer (pH 8,0) 10 indeholdende 10 mM arginin. Søjlen blev vasket med den samme puffer, som der blev benyttet ved askvil ibreringen.

Gennemløbet fra søjlen blev opsamlet, og den pi asmi nogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Den viste sig, at være ca. 5% 15 af den aktivitet, som var sat på søjlen. Dette gennemløb udviste ved zymografi bånd i området med molekylvægte på fra ca. 30.000 dalton til ca. 70.000 dalton.

Søjlen blev derpå behandlet med en 0,20 M phosphatpuffer (pH 6,0), 20 som indeholdte 50 mM arginin. Eluatets aktivitet var ca. 90% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Dette el uat udviste ved zymografi et bånd svarende til en molekylvægt på ca. 70.000 dalton.

Søjlen blev derpå vasket med en 0,5 M phosphatpuffer (pH 7,8) 25 indeholdende 50 mM arginin, og der blev bestemt ca. 5% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Denne eluerede fraktion udviste ved zymografi bånd svarende til molekylvægte på ca. 70.000 dalton og ca. 100.000 dalton og højere.

30 Eksempel 6 Værtsceller (Saccharomvces cerevisiaeh der var transformeret med human-tPA-genet, fik lov til at vokse ved en kendt fremgangsmåde, nemlig ved den fremgangsmåde, som er beskrevet i -Principles and 35 Practice of Recombinant DNA Research with Yeast in The Molecular

Biology of Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression", side 603-636, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982). De resulterende celler blev malet med glaskugler. tPA Blev ekstraheret med 0,01 M phosphatpuffer (pH 7,0), som indeholdte 14 DK 169680 B1 50 mM lysin, 1,0 M natriumchlorid og 0,02% "Tween 80". Den resulterende flydende blanding blev filtreret for at indvinde et filtrat.

Filtratet blev fortyndet 10 gange i 0,01 M phosphatpuffer (pH 7,5), 5 og blev derpå sat på en søjle af 5 ml hydroxyapatit, der var ækvilibreret med en 0,01 M phosphatpuffer (pH 7,0), som indeholdte 5 mM lysin og 0,1 M natri umchl orid. Søjlen blev vasket med den samme puffer, som der blev benyttet ved ækvilibreringen.

10 Gennemløbet for søjlen blev opsamlet, og den pi asmi nogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Der blev fundet ca. 15% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Dette gennemløb udviste ved zymografi bånd i området med molekylvægte på fra ca. 30.000 dalton til ca. 70.000 dalton.

15

De således adsorberede proteiner blev elueret med en 0,20 M phosphatpuffer (pH 6,5), som indeholdte 5 mM lysin. Aktiviteten af eluatet var ca. 80% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Dette el uat udviste ved zymografi et bånd svarende til en molekylvægt på 20 ca. 70.000 dalton.

Søjlen blev vasket med en 0,5 M phosphatpuffer (pH 7,8) indeholdende 5 mM lysin. Det således opnåede eluat indeholdte ca. 5% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Dette eluat udviste ved zymografi 25 bånd svarnede til molekylvægte på ca. 70.000 dalton henholdsvis ca.

100.000 dalton og højere.

Som hydroxyapatit blev der anvendt HCA-100S (Mitsui Toatsu Chemicals, Inc.) i eksemplerne 1 og 2, HA-ultrogel (LKB) i eksemp-30 lerne 3 og 4, og Bio gel-HT (Bio Rad) i eksemplerne 5 og 6.

35

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til adskillelse af en blanding af vævsplasmino-genaktivator (tPA)-arter med forskellige molekylvægte på ikke mindre 5 end 30.000 dalton i en fraktion (1) indeholdende tPA-arter med en molekylvægt på fra ca. 30.000 - ca. 45.000 dalton, en fraktion (2) indeholdende tPA-arter med en molekylvægt på fra ca. 45.000 til ca. 70.000 dalton, en fraktion (3) indeholdende tPA-arter med en molekylvægt på ca. 70.000 dalton, og en fraktion (4) indeholdende 10 tPA-arter med en molekylvægt på ikke mindre end ca. 100.000 dalton, hvilken fremgangmåde omfatter følgende trin: (a) at blandingen af tPA-arter bringes i kontakt med hydroxyapatit til adsorption af disse tPA-arter med forskellige molekylvægte ^ · 15 på ikke mindre end 30.000 dalton, og (b) at hydroxyapati ten derpå behandles med elueringsmidler for successivt at eluere fraktionerne (1) - (4), hvilke elueringsmidler har forskellige pH-værdier, saltkoncentrationer eller 20 både pH-værdier og saltkoncentrationer, således at fraktionerne (1) - (4) elueres særskilt.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hydroxyapatiten successivt behandles med følgende elueringsmidler 25 (A) - (D): elueringsmiddel (A) indeholdende 0,02-0,1 M phosphat og med en pH-værdi på fra 6 til 9 til eluering af fraktion (1), 30 elueringsmiddel (B) indeholdende 0,03-0,1 M phosphat og med en pH-værdi på fra 7 til 9 til eluering af fraktion (2), elueringsmiddel (C) indeholdende 0,04-0,3 M phosphat og med en pH-værdi på fra 6 til 9 til eluering af fraktion (3)-og 35 elueringsmiddel (D) indeholdende 0,04-0,5 M phosphat og med en pH-værdi på fra 6 til 10 til eluering af fraktion (4), hvorved phosphatkoncentrationen i elueringsmidlet øges selektivt i 16 DK 169680 B1 rækken af elueringsmidler fra (A) til (D).

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hydroxyapatiten successivt behandles med følgende elueringsmidler 5 (E) - (H): elueringsmiddel (E) indeholdende 0,03-0,15 M natriumchlorid og med en pH-værdi på fra 6 til 9 til eluering af fraktion (1), 10 elueringsmiddel (F) indeholdende 0,05-0,15 M natriumchlorid og med en pH-værdi på fra 7 til 9 til eluering af fraktion (2), elueringsmiddel (G) indeholdende 0,07-0,7 M natriumchlorid og med en pH-værdi på fra 6 til 9 til eluering af fraktion (3) og 15 elueringsmiddel (H) indeholdende 0,07-1,0 M natriumchlorid og med en pH-værdi på fra 6 til 10 til eluering af fraktion (4), hvorved natriumchloridkoncentrationen i elueringsmidlerne øges 20 selektivt i rækken af elueringsmidler fra (E) til (H).

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at ét eller flere af elueringsmidlerne indeholder mindst ét stof, som er udvalgt blandt basiske aminosyrer og deres analoge 25 stoffer.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at ét eller flere af elueringsmidlerne indeholder mindst én blandt lysin og arginin. 30 35