JPS5889184A - 人尿中のカリクレインの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は人尿からカリクレインを収率よくかつ低経費で
高純度に精製する方法に関するものである。

カリクレインは血漿中のキニノーゲンに作用してキニン
を特異的に遊離させる酵素であり、種々の組織や体液す
な朴ち顎下腺、汗腺、唾液腺、肝瞼、小腸、血清、尿な
どに分布していることが知られている。その薬理作用と
して平滑筋収縮作用、毛細血管透過性亢進作用、血管拡
張作用、血圧降下作用、白血球凝集作用、−疼痛誌発作
用、カテコールア之ン分泌作用等を示す。カリクレイン
製剤は各領域にわたって広く使用されている有用な医薬
品であり、内科領域では脳血管障害、冠動脈性心臓疾患
及び高血圧症等の治療に使用され、外科領域では種々の
原因に依る四肢木棺血行障害の治療に使用され、眼科領
域では網膜末梢血管拡張及び眼底血圧降下等に使用され
、さらに耳鼻科領域ではメニエル症候群や神経性耳鳴等
の治療に使用されている。

カリクレインの回収法は従来からきわめて多数の方法が
提案されてきたが、従来の方法は操作がＷＭであり、収
率や経費において必ずしも十分ではなかった。このため
人尿からのカリクレイン製剤は比較的高価であり、従来
の方法はカリクレイン製剤の工業的−法として満足でき
るものではなかった。

うとするものである。

人尿中には通常カリクレインと共にカリクレイン以外の
蛋白質分解酵素、例えばつ田キナーゼ、トリプシン、プ
ラスミン、キニン分解酵素等が存在する。また、発熱性
物質、血液型物質、血液凝固に影響を及ぼす物質などの
生理活性物質、並びにアルブミン、グミプリン等の血漿
由来蛋白質も存在する。

本発明は人尿とコロイド性含水ケイ酸アルにウムヲｐ　
Ｈ４，０〜６．０にて接触させ、コーイド性　−含水ケ
イ酸アルミニウムにカリクレイン以外の蛋白質分解酵素
を完全に吸着させて上清を分離し、この上清に水不溶性
担体に結合させたアルギニン、アグマチン、リジン又は
ベンズアミジン等ｔｐＨ６，５〜９．５に接触させてカ
リクレインを特異的に吸着させ、濾過および洗浄により
カリクレイン以外の生理活性物質や血漿由来蛋白質を除
去したののである。

本発明は腐敗していない新鮮な人尿を原料とし、人尿は
そのｐＨが５．５〜９であれはそのま一使用してもよい
が、ｐＨを４．　ＯＬ　６．０に調整しておくのが好ま
しい。また尿中の浮遊物およびｐＨの調整時に生ずる沈
殿物は常法例えは廊心分漸、濾過、透析などの処理で除
去しておく。本発明に用いるコロイド性含水ケイ酸アル
ミニウムは人尿がら、カリクレイン以外の蛋白質分解酵
素を選択的にｙｋｍする機能を有し、ｐ　Ｈ４，０〜６
．０において人尿中のカリクレイン以外の蛋白質分解酵
素は約９６〜１００％か吸着される。このコロイド性含
水ケイ酸アルミニウムとは５１０ｇとＡ／２０３を主と
し、ＳｉＯ！　／　Ａ／！０３の比が４．４〜７．７（
平均５．９）からなる化合物である。使用量は原料酸の
１１に対して５０〜ｓ　ｏ　ｏ　ｔ、−ｒｑで十分であ
るが、数置の問題を別にすればこれ以上多く使用しても
よい。

コロイド性含水ケイ酸アルミニウムは前処理として十分
に洗浄したのち必ａｍを人尿中に添加し、を中に含まれ
ているカリクレイン以外の蛋白質分解酵素を吸着させる
。接触時間は約３０分から５時間であり、処理法はカラ
ムク田マド法でもよいがバッチ法で十分であり、バッチ
法の場合は撹拌する。処理温度は室温でよいが、より好
ましくは５〜３０℃である。吸着が十分に行われたのち
、傾斜法又は遠心分離により吸着剤と上清を分離する。

分離されたコロイド性含水ケイ酸アルミニウムは洗浄し
たのち再使用する。

吸着剤を分離した上清はカリクレインを精製する原料と
して使用される。この上清はそのまま又は遠心分離を行
なったのち、ｐＨを６．５〜９．５好ましくはｐＨ８〜
９．５に調整する。この上清に水不溶性担体に結合させ
たアルギニン、アグマチン、リジン又はベンズアミジン
等を接触させる。ここに水不溶性担体はアガロース特に
メチレン鎖をスペーサとして有するアガｐ−スが好まし
いが、奈知の他の水不溶性担体でもよい。このカリクレ
イン親和性水不溶性担体は洗浄してｐ　Ｈ６，５〜９．
５に調製し、好ましくはこの範囲のｐＨを有する緩働液
で平衡化したのち、パッチ法又はカラムクロマトグラフ
ィー法によってカリクレインを含有する前記上清に接触
させる。接触条件として時間は約３０分から２０時間、
温度は室温でよいが好ましくは５〜３０℃である。使用
量はカリクレインを含む上清１０／に対して約０．５〜
１０ｗｔ１であり、カリクレインを吸着したのち、パッ
チ法の場合は傾斜法又は遠心分離により吸着体を回収し
、カラムクｐ！Ｆ法の場合はカラムを洗浄したのち、溶
離用緩被液で吸着体からカリクレインを溶出させる。

浴出はアルギニン、アグマチン、リジンをリガンドとす
る水不溶性担体を用いる場合は、０．３〜０．６Ｍ塩化
す）　ＩＪウムを含有する中性付近の水溶液で行なうの
が良好であり、ベンズアミジンをリガンドとする水不溶
性担体を用いる場合は、０．３〜０，６Ｍ塩化ナトリウ
ムを含有する酸性水溶液で行なうのが良好である。中性
付近の水溶液としては例えばｐＨ７〜９のリン酸［８Ｗ
ｔ液又はトリス−塩＃Ｉ緩衝液等が用いられ、酸性水溶
液としてはｐＨ３．５〜５のグリシン−塩酸緩衝液又は
酢酸緩衝液等が用いら−れる。このようにして得た溶出
液は純度の高いカリクレインを多量に含有しており、こ
“の溶出液を脱塩して目的とするカリクレインを回収す
る。なお人尿中に混入しているかも知れない肝炎ウィル
スを不活化するための加熱処理を精製工程に加えてもよ
い。

本発明により人尿に含有されるカリクレインを収率よく
かつ高純度に回収することができ、かつ安価なリガンド
を水不溶性担体に結合して繰返し使用するからカリクレ
インの精製に要する鮭費を大巾に節約でき、人尿中のカ
リ−・フレインの工業的製法として満足しうるものであ
る。また回収したカリクレインは他の蛋白質分解酵素や
生理活性物質を全く含有しておらず、医療分野における
価値は極めて高い。

本発明による人尿からのカリクレインの回収率は５０〜
７５％であり、得られたカリクレインの比活性は６００
〜７３０　ＫＵ／Ａ２８Ｇ　（ＫＵ　：　カリクレイン
単位、Ｆｒｅｙ、Ｂ、に、　、Ｋｒａｕｔ、Ｈ，、ａｎ
ｄ　Ｗｅｒｌｅ、ＩＣ，、１９５０、’　ＫａｌｌＩＫ
ｒｅｉｎ　、　Ｐａｄｔｉｎ　’　、　ＥｎＫｅ　Ｖｅ
ｒｌｍｇ。

Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　）で１゛その純度はポリアクリル
アミドゲルのディスク電気泳動（Ｄａｖｉｇ、０．．１
９６４．　　Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、ＳｃＩ　１１
１１２１　、　Ａｒｔ　、２．３０５）により８５〜１
００−％であった。

なおりリフレイン活性の測定はＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌ−Ｌ
ｅｕ　−Ｌ　−Ａｒｇ−Ｐ−ｎｉｔｒｏｍｎｉｌｉｄｅ
（Ｔｅｓｔｚｙｍｅ　　Ｓ−２２６６、Ｋｍｂｉ　ＤＩ
ａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｗｅｄｅｎ）を基質として行なっ
た。この基質は人尿由来のカリクレインに特異性の高い
基質であることが知られている。

しかじ人尿中のカリクレイン以外の蛋白質分解酵素によ
っても分解を受けるため、正確にカリクレインのみを定
量するとはいえない。そこで反応系にＳ　Ｂ　Ｔ　Ｉ　
（５ｏｙｂｅａｎ　　ｔｒｙｐｓｌｎ　　１ｎｈｉｂｉ
ｔｏｒ）及びアプロチニンを添加してこれらをコントロ
ールとした。すなわちカリクレインは５ＢＴＩに阻害さ
れないが、アプロチニンには阻害される。これに対して
人尿中に存在することが知られているウロキナーゼは５
ＢＴＩとアプロチニンの両方に阻害を受けず、又トリプ
シン等の多くの蛋白質分解量は５ＢＴＩにより阻害され
る。このようにカリクレインに特異性の高い基質を用い
るのに加えて、カリタレインを特異的に定量する測定条
件を用しすることにより、カリクレインを正確に定量す
ると共にカリクレイン以外の蛋白質分解酵素につし）て
も正確に定量した。

次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

実施例１ 成人男子より採集した新鮮尿約ｘｓｏｔｔｐＨ５，０に
調整し、蒸留水で洗浄したコロイド性含水ケイ酸アルミ
ニウム（乾燥重量５０Ｆ）と接触させる。室温で約１時
間撹拌して十分に接触させたのち、遠心分離により上清
を採取する。上清１３０１にトリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン７８７Ｆを加えて溶かし、３Ｎ−ＨＣ／
にてｐＨ８，５に調部する。

次に０．０５Ｍの）　Ｑス塩酸緩衝液でｐ　Ｈ８，５に
平衡化した１３Ｇ−のアルギニン・ヘキサメチレンセフ
ァローズ４Ｂを加え、室温で２０時間撹拌して吸着反応
を行なう。反応液を濾過してゲルをカラムに充填したの
ち、ｐ　ｉｆ　８．５の０．０５Ｍ）リスー塩酸緩徴液
でカラムを洗浄し、ｐＨ８，５の０．５Ｍ塩化す）　１
３ウム添加０．０５　Ｍ　）　ｌｊスス−酸緩衝液によ
りカリクレインを溶出さセる。このようにして純度９２
％の人尿由来のカリクレインを７０％の収率で回収し、
その比活性は約７００　ＫＵ／Ａ２８０であった。

実施例２ 実施例１と同じコロイド性含水ケイ酸アルミニウム処理
を行なったのち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン７８７ｆおよび塩化ナト９ウム３，０４０Ｆを加え
て溶かし、３Ｎ−ＩＣ／にてｐＨ９，０に調整する。次
に、ｏ、４ｙｔ墳化ナトリウム添加０．０５Ｍ）リス−
塩酸緩衝液でｐ　−Ｈ９，０に平衡化した１’００ＷＴ
！のベンズアミジン・ヘキサメチレンセファロ−ズ４Ｂ
をＪＪ［Ｉえ、室温で８時間撹拌して吸着反応を行なう
。反応液をｔＰ戯してゲルをカラムに充填したのち、ｐ
Ｈ９，０の０．４Ｍ塩化すＦリウム添加０．０５Ｍ）リ
スー塩ｔｎ＊＠液でカラムを洗浄し、ｐＨ４，０の０゜
５Ｍ＃Ａ化ナトリウム添加０．１Ｍダリシンー塩酸緩゛
衡液によりカリクレインを溶出させる。この上りにして
純度９５％の人尿由゛来のカリタレインを７５憾の収率
で回収し、その比活性は約７５０ＫＵ／Ａ！８０であっ
た。

実施例３ 実施例１と同じコロイド性含水ケイ酸アルミニウム処理
を行なったのち、カリタレインの有効画分をｐ　Ｈ７，
８に調整し、このものを限外分子量１０．０００の水田
−フアイバーを用いて１００倍に濃縮し、６０℃で１０
時間の加熱処理を行なう。

次にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−７，９
Ｆを加えて溶解し、以下実施例１と同じアルギニン・ヘ
キサメチレンセファロース４Ｂ処ｊｌｔ行なう。得られ
たカリクレインの収率は６５襲、比活性は７００　ＫＵ
／Ａ　２ｇＧであった。

出願人　　株式会社ミドリ十字 １、事件の表示　待顧昭５６−１８８７４４ｖ２、発明
の名称　　人１減中のカリクレインの精製法３、補正す
る者 事件との関係　出　願　人 株式会社ミドリ十字 ４代理人 ５、指令又は通知の日付臼　　発　昭和　　年　　月　
　日６、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ７、補正の内容

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 人尿とコロイド性含水ケイ酸アルミニウムをｐＨ４，０
   〜６．０にて接触させ、カリクレイン以外の蛋白質分解
   酵素を含水性ケイ酸アルミニウムに吸着させて上清を分
   離し、この上清に水不溶性担体に結合させたアルギニン
   、アグマチン、リジン又はベンズアミジン等をｐ　Ｈ６
   ，５〜９．５にて接触させてカリクレインを特異的に吸
   着させ、吸着されたカリクレインを親和性担体から溶出
   させて回収することを特徴とする人尿中のカリクレイン
   の精製法。