JPS62201827A

JPS62201827A - 免疫グロブリンの製造方法

Info

Publication number: JPS62201827A
Application number: JP4494386A
Authority: JP
Inventors: Katsuhiro Uryu; 瓜生　勝寛; Yutaka Hirao; 平尾　豊; Kazuo Takechi; 武智　和男; Yatsuhiro Kamimura; 上村　八尋
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1986-02-28
Filing date: 1986-02-28
Publication date: 1987-09-05
Anticipated expiration: 2009-08-17
Also published as: JPH0662435B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は免疫グロブリンの製造方法に関する。

詳細にはアミノベンズアミジン、アミノフェニルグアニ
ジンおよび塩基性アミノ酸から選ばれる化合物を水不溶
性担体に共有結合した固定化担体で粗製γ−グロブリン
画分を処理することにより、グロブリン画分からプレカ
リクレインまたはカリクレインを除去し、あるいはグロ
ブリン画分中の抗補体価を低下させることによる免疫グ
ロブリンの製造方法に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする問題点〕血漿由来
の粗製γ−グロブリン画分中には、プレカリクレイン、
カリクレインが含まれ、また抗補体価も高いことが問題
とされている。

すなわち、従来からの分画法、例えば、エタノール分画
法、ポリエチレングリコール法あるいは硫安分画法等に
よっても上記の問題点を克服するまでには至っていない
。

そこで、各種の解決手段が考えられている。たとえば、
プレカリクレインを除く方法としてＤＥＡＥ−あるいは
ＱＡＥ−セファデックスによる処理（特開昭５６−１６
４１６号）、カリクレインを除く方法としてポリエチレ
ングリコールによる処理（特開昭５９−１８４１３３号
）そして抗補体価を下げる方法として固定化プラスミン
による処理（特開昭５６−７７２１号）、酸処理（特開
昭５７−３２２２８号）、ＣＭ−セルロースによる処理
（特開昭５９−２２５１２４号）、アルミナ、珪酸等に
よる処理（特開昭６０−６６２２号）などが挙げられる
。

しかし、これらの方法によっても上記問題点を十分に解
決することができず、新たな処理方法が期待されている
。

従って、本発明は粗製Ｔ−グロブリン画分を原料として
、プレカリクレイン、カリクレインの除去、または抗補
体価の低下された免疫グロブリンを製造する方法を提供
することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕本発明者らは、上記目的を達成するために種々研究を重
ねて来たところ、粗製γ−グロブリン画分をアミノベン
ズアミジン、アミノフェニルグアニジンおよび塩基性ア
ミノ酸から選ばれる化合物を水不溶性担体に共有結合さ
せた固定化担体で処理することにより、上記の目的に対
して、従来法以上に良好な効果が得られることを見出し
た。即ち、上記処理によって免疫グロブリンのみが効率
よく非吸着画分中に含まれ、プレカリクレインおよびカ
リクレインは当該担体に吸着され、しかも抗補体価が低
下されることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は粗製γ−グロブリン画分を、アミノベン
ズアミジン、アミノフェニルグアニジンおよび塩基性ア
ミノ酸から選ばれる化合物を水不溶性担体に共有結合し
た固定化担体で処理することにより、プレカリクレイン
またはカリクレインを除去し、あるいは抗補体価を低下
させることを特徴とする免疫グロブリンの製造方法に関
する。

本発明で用いられる粗製γ−グロブリン画分としては、
プレカリクレインまたはカリクレインを夾雑するもの、
あるいは抗補体価が高いもの（特に、抗補体価が２０Ｃ
Ｈｓｏ単位／＋ｍ１以上のもの）であれば特に限定され
ない。

例えば、エタノール分画法〔ジャーナル・オプ・アメリ
カン・ケミ力Ｊし・ソサイアティ　（Ｊ、　Ａｍ。

ＣｈｅＩｌ、　Ｓｏｃ、）　６８．４５９（１９４６）
　）　、ポリエチレングリコール分画法（特開昭４８−
１０１５１６号）、硫安分画法〔ジャーナル・オブ・ア
メリカン・ケミカル・ソサイアテ４　（Ｊ、　Ａｍ、　
Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、）　６２゜３３８６　（１９４０
）　）等、あるいはこれらの任意の２種以上の方法を組
み合わせて、γ−グロブリン含有物（たとえば、血漿）
を処理して得られたもの、筋注用に調製された従来既知
のＴ−グロブリン、静注用に調製されたγ−グロブリン
も粗製γ−グロブリン画分に含まれる。

本発明で用いられる固定化担体は、アミノベンズアミジ
ン、アミノフェニルグアニジンあるいは塩基性アミノ酸
（たとえば、リジン、アルギニンなど）から選ばれる化
合物を水不溶性担体に共有結合させたものである。水不
溶性担体としてはセルロース、アガロース、デキストラ
ン、ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体等が挙げら
れる。

固定化は、公知の方法に準じて行えばよい。例えば、特
公昭５７−１３２６６号に開示の方法等が例示される。

また、共有結合を形成させるために、架橋剤および縮合
剤を用いることも可能である。−例を挙げると、シアン
化ブロムで活性化したアガロースをε−アミノカプロン
酸（架橋剤）と結合させた後、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（縮合剤）の
存在下、アミノベンズアミジンと結合させて、固定化担
体を得る。当該担体の市販品として、ベンズアミジン−
セファロース６Ｂ（登録商標、ファルマシア社製）など
がある。

処理方法としては、カラム法、バッチ法のどちらを用い
てもよい、その際の条件としては、好ましくは次のとお
りである。即ち、いずれの方法においても、処理条件は
ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．２Ｍであることが好
ましい。

具体的にはパンチ法の場合、ｐ］１６〜８、塩濃度０．
０１〜０．２Ｍの溶液（たとえば、生理食塩液、０．０
５Ｍリン酸緩衝液など）に溶解した粗製γ−グロブリン
画分（蛋白濃度としては、１〜ｌＯｗ／Ｖ％であること
が好ましい）を同じ溶液で平衡化した固定化担体と接触
させる。その条件としては、固定化担体１ｍｌに対して
粗製Ｔ−グロブリン画分溶液１〜１００ｍ１程度と混合
させ、４±２℃で３０分〜２時間程度であることが好ま
しい、その後、遠心分離して上清のみを回収する。

カラム法の場合、ｐ１）６〜８、塩濃度０．０１〜０．
２Ｍの溶液（たとえば、生理食塩液、０．０５Ｍリン酸
緩衝液など）に溶解した粗製Ｔ−グロブリン画分（蛋白
濃度としては、１〜ＬＯＷ／Ｖ％であることが好ましい
）を同じ溶液で平衡化した固定化担体（カラム）におい
て接触、展開させる。その条件としては、固定化担体１
＋ｉｌに対して粗製Ｔ　−グロブリン画分溶液１〜１０
０ｍ１程度と接触させ、流速１〜１０ｍ１／分程度で展
開することが好ましい。その後、非吸着の透過画分のみ
を回収する。

こうして得られたγ−グロブリン画分は、公知の手段に
より精製、例えば透析、イオン交換クロマトグラフィー
を施した後、免疫タロプリンとして調製される。

〔効果〕

本発明の手段により、プレカリクレインまたはカリクレ
インを含み、あるいは抗補体価の高い粗製γ−グロブリ
ン画分に対し、プレカリクレインまたはカリクレインの
除去、あるいは抗補体価の低下を施すことができる。

こうして得られる免疫グロブリンは不純物を含まないた
め、従来品に比べてさらに安全性が保証されており、静
脈投与用として充分に適用できるものである。

〔実施例・実験例・参考例〕

本発明の詳細な説明するために、実施例、参考例、実験
例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。

なお、以下の実施例および実験例において、γ−グロブ
リン量は２８０ｎ−の吸光度として、カリクレイン量は
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−バラニトロソアニリドを用い
た発色法により４０５ｎｍの吸光度として測定したもの
であり、また抗補体価はカバットとマイヤーの方法〔エ
クスベリメンタル・イムノケミストリー、２２５　　（
１９６１））および西岡・開田の方法〔免疫の生化学、
１０３．昭和４６年（共布出版）〕により測定したもの
である。さらに、凝集度は高速ゲル濾過法（カラムは東
洋曹達社製Ｓ　Ｗ３０００、検出器はウォーターズ社製
モデル４４０を用いた）により測定したものである。

実施例１エタノール分画法により得られた粗製Ｔ−グロブリン画
分を生理食塩液で５ｗ／ｖ％に調整した（カリクレイン
値０．８１６、抗補体価５３）。一方、ベンズアミジン
−セファロース６Ｂ（ファルマシア社製）を生理食塩液
で平衡化した。このカラム５ｍｌにＴ−グロブリン溶液
２０１をチャージし、透過画分を採取した。

こうして得られたＴ−グロブリンはカリクレイン値０．
０２、抗補体価１５であり、良好なものであった。

実施例２ポリエチレングリコール分画法により得られた粗製γ−
グロブリン画分を生理食塩液で５　ｗ　／　ｖ％に調整
した（カリクレイン値０．０２７）　、このグロブリン
溶液５０ｍ１を用いる以外は実施例１に準じて行い、同
様にカリクレイン含量の少ないγ−グロブリン（カリク
レイン値０．００７）を得た。

実施例３参考例１　（後述）で調製したｐ−アミノベンズアミジ
ン結合アガロースを用いて、実施例１に準じて操作し、
同様にカリクレイン値（０，０１８）、抗補体価（１４
）が共に低いＴ−グロブリンを得た。

実施例４参考例２（後述）で調製したｐ−アミノベンズアミジン
結合アガロースを用いて、実施例２に準じて操作し、同
様にカリクレイン値（０，００８）が低いγ−グロブリ
ンを得た。

参考例１アガロースを室温下、ｐｌｌｌｌにおいてシアン化ブロ
ムで活性化させた後、ε−アミノカプロン酸を添加し、
ｐＨ９，５で２４時間反応させ、結合させた。十分洗浄
後、ｐＨ５に調整し、ｐ−アミノベンズアミジン及び１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミドを添加して２４時間反応させ、ｐ−アミノベン
ズアミジン結合アガロースを得た。

参考例２ｐ−７ミノベンズアミジンの代わりに、ｐ−アミノベン
ズグアニジンを用いて、参考例１と同様に操作し、ｐ−
アミノベンズグアニジン結合アガロースを得た。

実験例１ｐ−アミノベンズアミジン結合セファロース６Ｂカラム
（５＋ｓｌ）を生理食塩液で平衡化した後、各出発原料
を生理食塩液で５　ｗ　／　ｖ％に調整したものをチャ
ージし、透過画分を５＋ｓｌずつ分取した。

かくして各分についてのＴ−グロブリン量およびカリク
レイン量を前述の方法によって測定し、その結果を第１
表に示した。

出発原料としては、血漿をエタノール分画法に付して得
られた粗製Ｔ−グロブリン画分（筋注製剤用）、これを
さらにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分画法により
処理して得られた粗製Ｔ−グロブリン画分（静注製剤用
）を用いた。（物性を下記第１表に示す）（双下奈白）第１表実験例２本発明処理後の抗補体価、凝集度の変化を調べた。

カラムとしてはｐ−アミノベンズアミジン結合セファロ
ース６Ｂ（１０＋ｍｌ）を、出発原料としては血漿をエ
タノール分画法により処理して得た粗製γ−グロブリン
画分の生理食塩溶液（５ｗ／ｖ％）２０ｍ＋を用いて本
発明方法を実施した。かくして得られた免珠グロブリン
について、その抗補体価、凝集度を前述の方法にて測定
し、原料物質のそれと比較した。その結果は第２表に示
した通りである。

（以下余白）第２表実験例３使用する担体の違いによる効果を比較した。

カラムは１０ｍ１とし、出発原料としては血漿をエタノ
ール分画法に付して得られた粗製Ｔ−グロブリン画分を
、さらにポリエチレングリコール分画法で処理して得ら
れた相！！！Ｔ−グロブリン画分の生理食塩溶液（５ｗ
／ｖ％）２ｏ１を用い、担体としては第３表の処理方法
の欄に記載のものを用いた。

その結果を第３表に示した。

（以下余白）第３表５−」

Claims

【特許請求の範囲】

（１）粗製γ−グロブリン画分を、アミノベンズアミジ
ン、アミノフェニルグアニジンおよび塩基性アミノ酸か
ら選ばれる化合物を水不溶性担体に共有結合した固定化
担体で処理することにより、プレカリクレインまたはカ
リクレインを除去し、あるいは抗補体価を低下させるこ
とを特徴とする免疫グロブリンの製造方法。
（２）処理条件が、ｐＨ６〜８であることを特徴とする
特許請求の範囲第（１）項記載の免疫グロブリンの製造
方法。
（３）処理条件が、塩濃度０．０１〜０．２Ｍであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の免疫グ
ロブリンの製造方法。