JPS59206314A - 血液製剤中の病原体不活化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、血漿性酵素類およびプロ酵素類、活性化さ
れた、または活性化されていない凝固ファクター類、例
えばファクター■、■、■、■、ＩＸ、Ｘ、　　■、ｒ
ＦＥＩＢＡ」　、プロトロンビン複合体製剤、血漿性阻
害物質類、免疫グロブリン類または他の血液産物。例え
ばフィブロネクチンおよびフィブリノ／アン等を含有す
る製剤中の、増殖可能な病原体を不活性化する方法に関
するものであ′る。

公開されたヨーロッパ特許出願箱０．０１８．５６１号
には、凝固因子類の溶液中ｌこアミノ酸および単糖類ま
たは少糖類あるいは糖アルコールを加えることｌこよっ
て凝固ファクター含有製剤類（これらは事実上フイプリ
ノ〆ゲンを含有していない）を熱の影響に対して安定化
する方法が開示されている。上記の処理の後、この製剤
を６０℃で１０時間加熱することができる。この様な処
置【こより、ヒト−アルブミン中の肝炎ウィルスが不活
化されることは知られている。この既知の方法は、凝固
ファクター類の収率が不十分であるという欠点を有する
。さらには、この方法は、ウィルス模型を用いて試験さ
れていないので、この安定化処理法の各種の病原体に対
する不活性化能力は不明である。

公開されたヨーロッパ特許出願箱０．０５２，８２７号
には、さらに、肝炎に対して安全であるとみなされる、
凝固ファクター■および／または■の製剤の製造方法が
開示されている。この方法は、製剤を、アミノ酸、糖類
あるいは糖アルコール類、並びにエチレンジアミン四酢
酸の塩の如きキレート化剤の存在下に加熱することから
なる。

公開されたヨーロッパ特許出願箱０．０５３．３３８号
では、血液凝固ファクターＩＸおよび／またはＸを含有
し、肝炎に対して安全であると考えられる製剤の製造方
法において、この製剤をアミン酸、糖類または糖アルコ
ールおよびＣａイオン類（ここにＣａイオン類は、ファ
クターＩＸおよびＸを熱的不活性化作用に対して安定化
する作用を有するといわれている）の存在下に加熱して
いる。

公開されたヨーロッパ特許出願箱０，０３５，２０４号
にもタンパク成分の調製方法が記載されており、その方
法は、該成分をポリオールと混合し、この混合物を該タ
ンパク成分の殺菌に充分な時間、加熱することからなっ
ている。この方法の改良法が、公開されたヨーロッパ特
許出願箱０．０６５　。

２５６号に記載されており、そこでは、プラスミノーゲ
ン溶液（所望番こより、アミノ酸、糖類または糖アルコ
ールを含有させてもよい）をタンパク分解酵素阻害剤の
存在下に加熱している。この方法の場合もまた、その処
理による不活性化能力が不明であり、しかも収率が不十
分である。

その他の先行技術がアメリカ特許第２，３３７，６２６
号に記載されており、この方法はプラスミノーゲン溶液
の製剤を滅菌するために、リジンの存在下、６０℃で１
０時間加熱している。この文献からも、あるウィルスス
ペクトルに関する活性を知ることはできない。

さらに他の文献例、即ちＦｅｄ、Ｐｒｏｃ、Ｖｏｌ　、
　４１．１９８２、要約２８７７．７６３頁には、濃縮
物を含有するＣ□−不活性化剤（Ｃ□−ＩＮＡ）は、こ
のものを、肝炎の伝染の危険性を軽減するためにクエン
酸カリウムまたはアンモニウムの存在下、６０℃で１０
時間加熱した後であれば、治療に好都合に用いることが
できる、と記載されている。

同様の方法は、抗トロンビン製剤の安定化に関するＪｏ
ｕｎａｌ　　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　。

Ｖｏｌ　、　’２５６．１９８１、Ａ２３．１２１４０
頁にも報告されている。

ドイツ公開公報第３１０２２１７号では、プラスミノー
ゲン製剤を、生理学的に適合性を有する無機塩、リシン
、フェニルメタンスルホニルフルオライド、アプロチニ
ンまたは大豆トリプシン阻害剤と混合する方法が開示さ
れている。しかし、この既知の方法においては、添加さ
れた塩類または阻害剤が除去されずに最終生成物中に残
存し、製剤の活性並びに適合性を減少することになる。

これらの方法の全てに共通する欠点は、その処理の不活
性化能力が不明であり、収率が不充分であるという点で
ある。

本発明は上記の問題点を回避することを目的とするもの
である。本発明は、生物学的および薬学的媒質中の病原
体の不活性化が、製剤中に含まれるタンパク類によって
阻害される、という新発見に基くものである。本発明は
安全な血液製剤の利用を可能にするために、タンパク類
の生物学的な活性並びに分子の完全さを保持しながら、
上記の如き病原体に対するタンパク類の保護作用を破壊
、克服することを目的とするものである。先行技術の方
法は、この様゛な効果を有していない。反対に、それら
のうちのあるものは、さらに病原体を安定化する作用を
有する。

最初に定義した種類の方法に係る本発明は、製剤に硫酸
アンモニウム（ＡＭＳ　）を加えて塩濃度を０．５モル
以上に調節し、熱処理し、製剤中の硫酸アンモニウムを
製剤から除去することから成る。

タンパク含有量０．００１〜３０％の製剤が使用に適す
る。

製剤の熱処理には、硫酸アンモニウムを２〜４モル濃度
の割合で用いるのが好ましい。

好ましい実施態様では、硫酸アンモニウムを添加してタ
ンパクおよびＡＭＳを含有する沈殿を回収し、次いでこ
の沈殿を熱処理に付す。

さらに、硫酸アンモニウムを含有する沈殿を凍結乾燥し
、この凍結乾燥物質を熱処理（こ付し、次いでこの凍結
乾燥物質に水性溶媒を加えて再び溶液にし、この溶液か
ら塩を除去してもよい。

溶液の熱処理は、４０℃から１２１℃の間の温度で１秒
〜１００時間に渡って行なわれる。この熱処理は、ショ
ック療法として行なうことが好ましい。

処理の間、製剤のｐＨは５〜１１、好ましくは６．５〜
８．５に保持する。

タンパク質安定化物質、例えばグリシンおよび／または
カブリレートの如き抗微生物物質を熱処理の前に加える
ことが好ましい。

本発明方法では、製剤からの硫酸アンモニウムの除去は
半透膜を用いることにより首尾良く行なわれる。

本発明はまた、血漿性酵素類およびプロ酵素類、活性化
された、または活性化されていない凝固因子類、例えば
凝固ファクター■、■、■、■、ＩＸ、Ｘ１■［、［Ｆ
ＥＩＢＡＪ　、プロトロンビン複合製剤類、血漿性阻害
剤、免疫グロブリンまたはフィブロネクチンおよびフイ
ブリノ〆ゲンの如き血液産物、を含有する製剤に関する
ものであって、その製剤を０．５モル濃度以上の硫酸ア
ンモニウムで処理すると共に熱処理し、該製剤から塩を
除去し、安定化（特に、凍結乾燥法により）することに
よって得られる製剤に関するものである。

既に指摘した様に、本発明は、タンパク質の病原体に対
する保護作用が硫酸アンモニウムおよび熱処理によって
中和される、という事実の発見に基づいて達成されたも
のである。この事実を、以下のモデル分析において、種
々のウィルスによって例証する。

分析例Ｉ Ｉ型ポリオウィルスを１方では等張生理食塩水に、他方
では５％血血性性タンパク溶液加えた。

ポリオウィルスを混合したこれらの２つの溶液を４５℃
で１０時間加熱し、ウィルス力価の測定に供した。次の
表中の値は、ｏ、ｉｍｌあたりのＴＣＩＤ５゜の常用対
数である。なお、ＴＣＩＤ５ｏ　は、細胞培養製剤の５
０％が細胞変性作用を示した量を意味する。

同じウィルスを用いるが、加熱前にこれらの２つの溶液
に硫酸アンモニウム（ＡＭ、Ｓ）をほぼ飽和するまで加
え（硫酸アンモニウム０．７！ｊ／ｍ１．）、ｐＨ７，
３となった溶液について分析を行なった。

４５℃で１０時間加熱し、次のウィルス力価を得た。

分析例２ １型ポリオウイルス、ロータウィルス（Ｒｏｔａｖｉｒ
ｕｓ　）　およびコクサラキーウィルス（Ｃｏｘｓａｃ
ｋｉｅ　ｖｉｒｕｓ　）をそれぞれタンパク含有量が５
４ｍＹ／ｍｌである血漿性タンパク溶液中ｌこ加−− えた。ウィルスを混合したこれら血漿性タンパク溶液の
各１０ｍ１に硫酸アンモニウム７ｇを加え、ＰＨ７，０
に調節した。

ウィルスおよび硫酸アンモニウムを含有する溶液を、１
回は４℃で１０時間、もう１回は６０”Ｃで１０時間加
熱し、平行して実験した。続いて、これらの試料から塩
を透析して除き、ウィルス力価を測定した。以下に示す
表中の値は’Ｉ’ＣＩＩ）５゜７０、ｉｍｌの常用対数
である。

次に実施例を挙げて本発明の方法を、血液から得られる
種々の物質を含有する製剤の製造過程を通じて詳細に説
明する。なお、これらの血液製剤中には、本発明に従っ
て適用される方法の不活化作用を証明するためｌこ、ウ
ィルス類を、故意に分画のある段階で加えた。

実施例１ 凍結された新鮮な血１１Ｊ４６１を００〜＋４℃で解凍
した。生成した寒冷型沈殿物を遠心分離し、０１％クエ
ン酸ナトリウム溶液９６０ｍＡに３７℃で溶かした。こ
のファクター■を含有する寒冷型沈殿物の溶解物を、ア
メリカ特許第３．９７３　、００２号記載の方法に従っ
てｐＨ６，０〜６．８に調節して沈殿を析出させ、該沈
殿を遠心分離して除いた。

この溶液を、ファクター■の含有量が２０単位／−にな
る様に調節し、Ｉ型ポリーオウィルスを混合した後、硫
酸アンモニウム（ＡＭＳ）をｏ、７ｙ／−になる様に加
え、ｐＨを７，３に調節した。次いでこの標本を４つに
わけて＋４℃、５０℃、５５℃および６０℃で１０時間
処理し、ウィルス力価を測定した。

結果は次の表に示す通りである。

ウィルス力価は、本発明に係る塩および熱処理によって
、１０３以下に減少されることがわかる。

実施例２ 実施例１の方法に従って調節したファクター■の標本で
あるが、タンパク含有量が７１ｑ／ｒｎｌ（ファクター
■２単位／ｒｎｌ）である標本に、ｌ型ポリオウィルス
を混合し、硫酸アンモニウムをｏ、　ｓ　ｍｙ／ｄにな
る様に加え、得られた溶液を６０℃で２分間、６分間、
２０分間、３時間および１０時間の各時間、熱処理した
。

この実験と平行して、この混合物にタンパク質１ｇ当り
１５　ｍｍｏ　ｌのカプリル酸ナトリウムを硫酸アンモ
ニウムの添加前に加えた試料について同様に実験した。

結果を次の表に示す。

カプリル酸ナトリウムを加えない場合には、ウィルス力
価の顕著な減少効果が３時間後をこあられれるが、カプ
リル酸ナトリウムを加えた場合には、この効果が僅か２
０分後にあられれることがわかる。

以下の実施例では、本発明の更に重要な効果、即ち塩添
加並びに熱による処理後におけるファクター■含有製剤
の生物学的活性の保存性を種々の塩濃度について説明す
る。

実施例３ 前述の方法で各１０ｒｎｌづつの、ウィルスを含有する
ファクター■製剤を調製し、このファクター■を２単位
／−の割合で含有する製剤を、それぞれ硫酸アンモニウ
ム６．４ｇ、８．０ｇおよび９．６ｇと混合した。ｐＨ
を７．０に調節し、この混合物を硫酸アンモニウムが完
全に溶けるか、硫酸アンモニウムが飽和状態に達するま
で攪拌した。この溶液を水浴に入れて６０℃で１０時間
加熱した。ファクター■の含有単位が同じであり、硫酸
アンモニウムの含有量が等しく、かつ熱処理をしない製
剤を対照とした。硫酸アンモニウムを除去スるために、
全ての試料を半透膜を用いて、ＮａＣｌ−クエン酸ナト
リウム６９／ｌ溶液に対して透析した。

次いで、全試料についてファクター■の活性を測定（［
Ａ　Ｌａｂａｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂ
ｌｏｏｄＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎＪ　Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ａｕ
５ｔｅｎ、　　Ｉ、Ｌ・Ｒｈｙｍｅｓ、　Ｂｌａｃｋｗ
ｅｌｌ　　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ（１９７５）に記載の２段階分析（２ｓ、ｔｅｐ
　ａｓｓａｙ）法による）すると共に、ウィルス力価の
測定を行なった。熱処理試料の活性を、熱処理をしない
硫酸アンモニウム添加対照のそれと比較し、ファクター
■の残存活性を百分率（％）で表した。結果を次の表に
示す。

ＡＭＳを混合し、熱処理した試料群からはウィルス活性
を検出することができなかった。

実施例４ 以下の実施例は、種々のタンパク濃度との関係において
本発明のＡＭＳ−熱処理法の効果を示すものであって、
本発明の効果が極めて広範な濃度範囲にわたって達成さ
れることがわかる。

ファクター■を含有する製剤を、前述の如くにして調製
した。このファクター■製剤のタンパク含有量を、０．
１％クエン酸ナトリウム溶液によって１〜／、ｎＩ！お
よび３〜／−に調節した。タンパク含有量が１００η／
ｍｌのファクター■含有製剤を調製するために、上記フ
ァクター■含有製剤に高濃度の血漿タンパク溶液（約２
０％のタンパク溶液）を、該ファクター■製剤のタンパ
ク含有量が１００■／−になるように混合した。次いで
、前述の如くポリオウィルスを加えた。タンパク含有量
が１　”！？／ｒｒＬｌ、３ｍ２／−および１００”Ｉ
Ｐ／−のファクター■含有タンパク溶液の各１０ｄを、
硫酸アンモニウム８ｇと混合した。塩が溶解した後、混
合物をｐＨ７，０に調節し、６０℃で１０時間加熱した
。次に、透析によって硫酸アンモニウムを除き、試料中
のファクター■残存活性を、非処理対照との比較に基い
て決定した。

実施例５ この実施例では、ファクター■製剤に硫酸アンモニウム
を加えた後、種々の温度で熱処理し、その影響を調べた
結果を示す。実施例１の方法に従って調製したウィルス
を含有するファクター■製剤（２単位／ｍｌ）の各１０
−に硫酸アンモニウム７．２ｇを混合した。硫酸アンモ
ニウムが溶解した後、ｐＨを６．５に調節し、混合物を
種々の温度で１０時間加熱した。硫酸アンモニウムの除
去、並びにファクター■の活性測定は実施例４と同様に
行なった。

熱処理した硫酸アンモニウム試料の活性を、非処理試料
の活性と比較し、残存活性を百分率（％）で表わした。

結果を以下の表に示す。

６０℃以上の温度においても残存活性は大いｌこ保持さ
れており、しかもウィルスは不活化されていることがわ
かる。

実施例６ ウィルスおよびファクター■を含有する製剤（ファクタ
ー■２単位／ｍｌ）を硫酸アンモニウム８ｆと混合した
。硫酸アンモニウムが溶けた後、混合物のｐＨを７．０
に調節し、９０℃で３分間加熱した。次いで透析して硫
酸アンモニウムを除き、熱処理した製剤のファクター■
を測定した。その活性を非処理のファクター■含有製剤
の活性と比較し、残存活性を百分率（％）で表した。

その結果、かなり高温の９０℃においてさえも残存活性
は３５％に保持され、ウィルスは活性を失なっているこ
とがわかった。ウィルスの力価はく３であった。

実施例７ この実施例は、本発明方法の範囲内におけるｐＨ依存性
を示すものである。

ウィルスおよびファクター■を含有する製剤（タンパク
含有量７■／ｌ、ファクター■２単位／ｍ１）１０−を
硫酸アンモニウム７．２ｇと混合した。

この塩が溶けた後、個々の混合物のｐＨを、６．５．７
．０．７．５．８．０．８．５．９．０および１０．０
に調節した。この様にｐＨを調節した試料を６０℃で１
０時間加熱した。次いで、透析により硫酸アンモニウム
を除去し、ファクター■を測定し、非処理のファクター
■含有試料に対する残存活性（％）で表わした。さらに
ウイルスカ価も測定した。

以下の実施例は、ファクター■含有分画に対するグリシ
ン添加の影響を示すものである。

実施例８ 新鮮な凍結面９３７／を０℃〜＋４℃で解凍した。生成
したファクター■を含有する寒冷型沈殿物を遠心分離し
て分け、０．１％クエン酸すｌ−ＩＪウム溶液４００−
に３７℃で溶かした。この溶液はタンパク質を６６ｍｙ
、ファクター■を２２単位／−の割合で含有していた。

この溶液に■型ポリオウィルスを加えた。

このファクター■およびウィルスを含有するこのタンパ
ク溶液の各１０ｍ１を、 （ａ）硫酸アンモニウム８ｇと混合し、ｐＨを７に調節
し、この溶液を６０℃で１０時間加熱した；（ｂ）グリ
シン０．０５５ｉ１および硫酸アンモニウム８ｇと混合
し、ｐＨを７に調節し、この溶液を６０℃で１０時間加
熱した； ｌｃ）グリシン０．１ｇおよび硫酸アンモニウム８ｇと
混合し、ｐＨを７に調節し、この溶液を６０℃で１０時
間加熱した； ｌｄ）グリシン０．５ｇおよび硫酸アンモニウム８ｇと
混合し、ｐＨ７に調節し、この溶液を６０℃で１０時間
加熱した。

続いて、硫酸アンモニウムを透析して除き、熱処理試料
中のファクター■の残存活性（％）を非処理試料との比
較において求めると共に、ウィルス力価を測定した。結
果を次の表に示す。

実施例９ 既述の方法で調製したファクター■製剤（タンパク質３
８■、ファクター■２９．５単位／−）２−を硫酸アン
モニウム１．６ｇと混合し、ｐＨを７゜０に調節し、こ
の沈殿と溶液の混合物を凍結乾燥した。凍結乾燥試料を
６０℃で１０時間加熱し、水で復元して透析にかけ、最
後にファクター■の活性を測定した。熱的に非処理の対
照との比較において、ファクター■の残存活性は３４％
であった。

実施例１０ 新鮮な、凍結したクエン酸添加ヒト血漿を解凍し、生成
した寒冷型沈殿物を分離した。この寒冷型沈殿物にＤＥ
ＡＥ−セファデックスを加え、ドイツ公開公報第３１２
７３１８号に従って、１２時間の接触時間の間、ＦＥ　
Ｉ　Ｂ　（Ｆａｃｔｏｒ−Ｅｉｇｈｔ−Ｉｎｂｉｂｉｔ
ｏｒ　−Ｂｙｐａｓｓ　）−Ａｃｔｉｖｉｔｙを測定し
た。次に、ＦＥＩＢＡを含む凝固ファクター類を、緩衝
液を用いてＤＥＡＥ−セファデックスから溶離した。凍
結乾燥処理によってかさの高い物質を得た。この粉末３
１２ｍ９を水１０ｍ１．に溶かした。

この溶液は１ｒｎｌ中にタンパク質２０■、ＦＥ　Ｉ　
ＢＡ２４単位およびファクター■２８単位を含有する。

本発明方法の不活性化作用を証明するために、ウィルス
、即ち、Ｉ型ポリオウィルスを該生成物に故意に添加し
た。その後、このウィルスを混合した試料の中に硫酸ア
ンモニウム（ＡＭＳ）を０．８ｇ／−となる様に加え、
他方、この塩を加えない試料を対照とした。両試料をｐ
Ｈ７に調節した。

塩を加えた溶液を６０℃で１０時間加熱した後、両試料
のウィルス力価を測定した。結果を次の表に示す。

本発明に係るＡＭＳ−熱の併用処理は、ウィルス類等の
病原体を確実に不活性化するのみならず、同様に重要な
効果として、タンパク類の生物学的活性並ひに分子の完
全性の保持をもたらす。このことを証明するため番こ、
上記のａ固ファクター、ＦＥＩＢＡ　製剤の活性を、Ａ
ＭＳ−熱処理の前、並びに後（ＡＭＳは透析によって除
去されている）に測定した。活性は、ドイツ公開公報第
３１２７３１８号に記載の方法に従って測定した。

結果は次の表に示すとおりである。

実施例１１ Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、３３　：　　ＰＰ、３７〜５０　（
１９７７）記載の方法に従い、凝固ファクター■、ＩＸ
およびＸを、ヒト血漿から、ＤＥＡＥ−セファデックス
による吸着、この陰イオン交換体の洗浄および部分的な
プロトロンビン複合体の溶離によって得た。

この溶出液を透析および凍結乾燥工程に付した。

得られたかさの高い粉末４６７■を水１０−に溶かした
。この溶液は１＋ｎｌ中にタンパク質３５ｍ７、ファク
ター］Ｉ７０単位、ファクタ−ｌＸ５２単位およびファ
クタ−Ｘ６１単位を含有し、かくして部分的なプロトロ
ンビン複合体の製剤を構成していた。

前述の様に、■型ポリオウィルスをこの製剤に加え、こ
のＡＭＳ含有製剤を６０℃で１０時間熱処理した。次い
でウィルス力価め測定を行ない、透析した後、凝固ファ
クター類の活性を測定した。

結果を次の表に示す。

実施例１２ アメリカ特許第４，３８８，２３２号に記載の方法に従
って、ヒトのクエン酸添加血漿から凝固ファクター■を
含有する製剤を調製した。寒冷型沈殿″′△ の分離、およびＤＥＡＥ−セファデックス処理の後、フ
ァクター■をＡｌ（ＯＨ）３　に吸着させた。

Ａｌ（ＯＨ）３　を、洗浄、および高められたイオン強
度の下でのファクター■の溶離の各工程に付した。ファ
クター■を含有する溶出液を透析し、凍結乾燥した。か
さ高い粉末１９２　ｍ９を水１０ｆｎｌに溶かした。こ
の溶液は１−中にタンパク質１０．３ｍりおよびファク
ター■２１単位を含有していた。

この場合も、前述の如くＩ型ポリオウィルスを故意に加
え、このＡＭＳ含有製剤を６０℃で１０時間熱処理した
。次いでウィルス力価の測定、透析の後、凝固ファクタ
ー類の活性を測定した。結果を次の表１こまとめる。

実施例１３ 「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｐｓｅａｒｃｈ　５、ｐ、
　４３９（１９７４）Ｊに記載された方法に従って、ヒ
ト血漿からヘパリンアガロースによるアフイニテイクロ
マトグラフイーおよび凍結乾燥法によって抗トロンビン
■製剤を調製した。この抗トロンビンを含有するかさ高
い物１５３０ｆｆｌｌＦを水１．０ｍｌに溶解した。こ
の溶液は、ｌｄ中にタンパク質２６ｍｇ、抗トロンビン
Ｉ［２５単位を含有していた。

次いでこの製剤を■型ポリオウィルスと混合した。その
後、この製剤に硫酸アンモニウムを０．８ｇ／−になる
様に加え、ｐＨを７に調節した。次いで試料を６０℃で
１０時間加熱し、塩を透析して除き、製剤中のウィルス
力価および抗トロンビン■活性を、アミド分解法により
測定した。この測定法は、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　　５．　ｐ。

２８７（１９７５）に記載されている。残存活性は、非
処理対照に対する百分率（％）で表した。

下の表では、ウィルス力価はＴＣＩＤ５ｏ１０，１ｄの
常用対数で表されており、残存活性は％で示されている
。

実施例１４ Ｖｏｘ、　Ｓａｎｇ、　２６、Ｐ、１１８（１９７４）
　　記載の方法に従い、ヒト血漿から、陰イオン交換体
（ＤＥＡＥ−セファデックスを用いて吸着、溶離により
、Ｃ□−エステラーゼ阻害物質（Ｃ□−ＩＮＡ）製剤を
調製した。望ましくないタンパク類を分離するために塩
析した後、この精製Ｃ□−阻害物質製剤を凍結乾燥した
。Ｃ□−阻害物質、を含有するかさ高い物質６５０ｒｎ
ｇを水１０ｍ１に溶かした。この溶液はｌｄ中にタンパ
ク質４９”ＱおよびＣ１−ＩＮＡ６０単位を含有してい
た。

この溶液にＩ型ポリオウィルスを接種した後、本発明の
方法に従い、硫酸アンモニウムを０．８　ｍ？／ｒｎｌ
になる様に加え、ｐＨを７に調節し、６０℃で１０時間
加熱した。透析によって硫酸アンモニウムを除去した後
、ウィルス力価を測定し、Ｃ１−阻害物質の残存活性を
ｌ”　Ｍｉｋｒｏｚｉｒｋｕｌａｔｉｏｎｕｎｄ　ｐｒ
ｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓｔｏｆ［ｗｅｃｌｌｓｅｌ　
Ｊ　。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｅｉｌｅ　２５　Ｅｌ
ｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆｔｈｅ　Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
ｎ　Ａｒｂｅｉｔｓｇｅｍｅｉｎｓｃｈａｆｔ　Ｅｕｒ
Ｂｌｕｔｇｅｒｉｎｎｕｎｇｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ　　
ｉｎ　Ｍｕｎｃｈｅｎ　。

（Ｆｅｂｒｕａｒ）’　１９８１　）　ｐ、　２２１　
、５ｃｈａｔｔａｕｅｒ発行（１９８１）に記載の方法
に従い、色素産生性基質を用いて測定した。

次の表において、ウィルス力価の値はＴＣＩＤ５゜／　
０．１　ｒｎｌの常用対数で、また残存活性は非処理試
料に対する百分率（％）でそれぞれ示されている。

実施例１５ この実施例は、本発明に係る処理方法の影響を血液製剤
を用いて示すものである。血漿をＩ型ポリオウィルスと
混合し、硫酸アンモニウムを０８ｇ／ｍｌとなる様に加
え、ｐＨを７に調節した後、この試料を６０℃、６５℃
および７５℃で１０時間加熱することからなる熱処理に
付した。次いて、硫酸アンモニウムを透析して除き、ウ
ィルス力価を求めると共に、トリプシン阻害を測定した
。

次の表において、ウィルス力価はＴＣＩＤ５ｏ１０．１
祠の常用対数で示され、血漿のトリプシン阻害活性は非
処理対照に対する残存活性（％）で表わされている。

残存活性の測定法は、まずトリプシン（膵臓プロテアー
ゼ、Ｍｅｒｃｋ　Ａｒｔ　、　Ｎｏ　、　８３６７　）
　８６．４ｍ７を１Ｏ−３ｎ　ＨＣＩ　１００ｒｎＩＩ
ｃ溶かす。このトリプシン溶液を測定すべき試料に加え
ると、血漿中に存在するトリプシン阻害物質が、添加さ
れたトリプシンを中和する。中和されなかったトリプシ
ンの量を色素産生性基質、ＢＺ　−１，Ｊｅｕ　−ＧＩ
！ｕ　−Ｇｌｙ　−Ａｒｇ−ｐＮＡ　　によってアミド
分解的に測定する。残存トリプシン量を、ブランク、即
ち試料を加えない場合のトリプシンの量、と関連づける
。この方法はトリプシン阻害物質の間接的な測定方法で
ある。

実施例１６ （：ｏｈｎ　（７）アルコール分画法に従って、ヒト血
漿から免疫グロブリン製剤を調製した（コーン分画■）
。この溶液は、１−中に、ｒ−グロブリンを９７．３％
、α、β−グロブリンを２．７％の比率で含んでいるタ
ンパク質を１６０ｍ１？、グリシンを２２．５ｇ、およ
びＮ　ａ　Ｃｌを３１ｕｉ含有していた。

この溶液をＩ型ポリオウィルスと混合した。次に硫酸ア
ンモニウムを０．８ｆ／−となる様ｌこ試料に加え、ｐ
Ｈを７に調節し、該製剤を６０℃で１０時間加熱した。

続いて透析によって硫酸アンモニウムを除去し、ウィル
ス力価を測定した。

非処理試料と比較した結果を次の表に示す。表中の数値
はＴＣＩＤ５ｏ１０．１　ｍ７！　　の常用対数である
。

本発明方法に従って処理された免疫グロブリン製剤中を
こ起こり得る変化をみるために、硫酸アンモニウムおよ
び熱で処理した試料を、酢酸セルロース膜上、ｐＨ８，
６、イオン強度０．０７５の条件下で電気泳動にかけ、
グロブリン類を分離した。

この様な電気泳動法による研究は、アメリカ特許第Ｃ３
９５，３９６号に記載されている。

電気泳動法的分離の結果を次の表に示す。

上記の如く、非処理試料と比較してなんら変化が起こっ
ていないことがわかる。即ち、タンパク類は、その分子
の完全性および易動度の面で、何ら変化することなく保
持されている。

さらに、ＡＭＳ−熱処理中に、抗体類の活性が保持され
ていることを証明するために、本発明（こ従って硫酸ア
ンモニウムと熱によって処理された製剤を麻疹、風疹お
よび百日咳に対する抗体試験に付した。麻疹、風疹およ
び百日咳のそれぞれに対する抗体を測定するためにＡｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｈｙｇｉｅｎｅ　
７１、Ｐ、　１２０　（１９６０）　：　Ｊｏｕｒｎａ
ｌｐａｔｈ、　ａｎｄ　Ｂａｃｔ、７８　（１９５９）
　；　Ｒ，Ｔｒｉａｎｉｎ　Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ　　
ＩｍｍｕｎｏＪｏｇｉｑｕｅｓ　　１９６５１ｎｓｔ　
、　Ｍｅｒｉｅｕｘに記載されている各方法に従って８
血球凝集阻害試験および凝集力価試験を行な一〕だ。こ
の方法によりウィルス中和性抗体の量を測定した。ある
特殊な条件下では、ウィルス類は赤！　血球の凝集を誘
発する。この様なウィルス抗原類の凝集性の性質は、特
定の抗体類と反応することによって失なわれる。この過
程を定量するために試料を希釈し、各希釈物を同一量の
ウィルス抗原と共にインキュベートした。試料中の抗体
が、存在している全ての抗原と結合し、赤血球の凝集が
起こらなくなれば終末点に達したことになる。この反応
が起こりうる最大の希釈率が終点であり、次表の風疹お
よび百日咳の場合にそれを示した。

麻疹抗体の場合は、希釈段階をＷＨＯの国際基準に照ら
し合わせて国際単位で表した。

実施例１７ Ｄ、Ｇ、Ｄｅｕｔｃｈ　＆　Ｅ、ＴｏＭｅｒＬｚ　（５
ｃｉｅｎｃｅ１７０、Ｐ、１０９５　（１９７０））の
示した方法に従ってプラスミノーゲン製剤を調製した。

カラム内で、リジン−セファロース５０ｒｎｌを、ＰＨ
７，４の０．１Ｍホスフェートと平衡させた。血漿３４
０ｄを水で６４０ｍＩ！に希釈し、この溶液をカラムに
入れた。０．３Ｍホスフェ。ト溶液（ＰＨ７，４）で洗
浄して随伴するタンパク質類を除いた後、０゜２Ｍ６−
アミノカプロン酸（ｐＨ７，４）でプラスミノーゲンを
溶離した。透析、またはセファデックスＧ−２５による
ゲルｒ過によって６−アミノカプロン酸を除去した後、
プラスミノーゲンを含有する溶液を凍結乾燥した。

このかさ高い粉末２３０ｍｆＩを水１０ｍ１に溶かした
。この溶液は、１ｍｌ中にプラスミノーゲン２７１カゼ
イン単位、タンパク質１３■を含有していた。

前の実施例と同じく、この製剤にＩ型ポリオウィルスを
混合し、硫酸アンモニウムを０．８ｇ／ｍｌになる様に
加え、ｐＨを７に調節した後、６０℃で１０時間加熱し
た。次いで、透析によって硫酸アンモニウムを除去し、
ウィルス力価並びにプラスミノーゲンの活性を、「Ｃｈ
ｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅＳｕｂｓｔｒａｔ
ｅｓ：　　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　　ａｎｄ　　Ｃ１
ｉｎＣ１１ｎｉｃａｌＵｓａ、Ｆ、５ｃｕｌｌｙ、Ｖ、
Ｖ、　％ａｋｋｅｒ、　ｐ、　１２８（１９７９）　、
（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ刊）に
記載さされている方法に従い、ウロキナーゼおよび色素
産生性基質によって測定した。

次の表は、非処理試料との比較において、ウィルス力価
および残存活性を示すものであって、ウィルス活性を示
す値は、ＴＣＩＤ５ｏ１０．１ｒｒＬ！、の常用対数で
ある。

実施例１８ Ｄ、Ｈ，Ｂｉｎｇ、　Ｊ、Ｍ、　Ａｎｄｒｅｗｓ、　Ｆ
、Ｌ。

５ｕｄｄａｔｈ　ａｎｄ　Ｒ１５ｐｅｎｃｅｒ、　Ｐｒ
ｏｔ、Ｂｉｏｌ。

Ｆｌｕｉｄｓ　　２３　ｐ、　５５１　（１９７５）に
記載の方法ニ従ってＣ□−エステラーゼ製剤を調製した
。

血９１ｇに、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
を最終濃度が５％になるまで加え、沈殿させた。この沈
殿を遠心分離してとり、りん酸緩衝生理食塩水（イオン
強度０．００５）で洗浄し、Ｑ、５Ｍ−ＮａＣ／　１０
０ｍ１に溶かした。これを、１ｍｍ　ｏ　ｌ　／ｌのＣ
ａ　Ｃｌ　２を含有する等張生理食塩水に対して透析し
た後、ａ結物質を除去した。次に４Ｘ１５ｃｍのカラム
にＩｇＧｐ−アゾベンズアミドエチルアミノ・セファロ
ース６Ｂを入れ、１ｍｍ　Ｏ７／７のＣａ　Ｃ／　２を
含有する等張生理食塩水と平衡させた。このカラムに上
で述べた様にして得た血漿画分を入れ、平衡緩衝液で洗
浄液中にタンパク質が存在しなくなるまで洗浄した。ｌ
　ｍ　ｍ　ｏ　ｌ／ｌのＣａ　Ｃｌ　２を含有するホウ
酸緩衝生理食塩水で洗浄し、非特異的に結合したタンパ
ク質類を除去した。

：１ ＣＩ　−ｘ　スフラーゼを、２．５ｍｍｏ／／ｌのＥＤ
ＴＡを含有する緩衝液で溶離した。溶離液をＴｒ　ｉ　
ｓ　−緩衝生理食塩水に対して透析し、凍結乾燥した。

このかさ高い粉末４．５ｇを水１ｏｒｎｌに溶かした。

この溶液１ｍｌは、タンパク質１３．５Ｔｎｇを含有し
ていた。

酵素活性は、色素産性の基質、ピログルタミル−Ｇ４ｙ
−Ａｒｇ−ｐＮＡ、によりアミド分解的に測定して、ｐ
ＮＡ　７８．１　ｎｍｏ／／ｍｌ／分トイウ値ヲ得た。

（この分析方法は、ｊ　Ｍｉｋｒｏｚｉｒｋｕｌａｔｉ
ｏｎｕｎｄ　　　ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓｔｏｆ
ｆｗｅｃｈｓｅｌ　　Ｊｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ
　　ｔｂｅ　　２５ｔｈ　ＣＯｎｇｒｅＳＳ　ｏｆｔｈ
ｅ　Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ　Ａｒｂｅｉｔｓｇｅｍｅｉｎ
ｓｃｈａｆｔ　ｆｕｒＢｌｕｃｇｅｒｉ、ｎｎｕｎｇｓ
ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ　　ｉｎ　　Ｍｕｎｃｈｅｎ（Ｆｅ
ｂｒｕａｒｙ　　１９８１　）　Ｐ−２２１，５ｃｈａ
ｔｔａｕｃｒ発行（１９８１）の方法に従って行なった
）。

得られた製剤（これは指摘されている特性を有していた
）に■型ポリオウィルスを接種し、本発明。に従って硫
酸アンモニウムを０．８９／ｍｌになる様に加え、ｐＨ
を７に調節し、６０℃で１０時間加熱した。既述の如く
処理した後、ウィルス力価およびアミド分解的な活性を
測定した。次の表は、ウィルス力価および非処理試料と
の比較で表した残存活性（％）を示す、なおウィルス力
価の値はＴＣＩＤ５ｏ１０．１ｍｌ　の常用対数である
。

第１頁の続き 優先権主張　＠１９８３年５月２日■オーストリア（Ａ
Ｔ）■Ａ１５９１／８３ ＠１９８３年５月２日■オーストリ ア（ＡＴ）■Ａ１５９２／８３ ＠１９８３年５月２日■オーストリ ア（ＡＴ）■Ａ１５９３／８３ ０発　明　者　ジョアン・アイプル オーストリア国ウィーン１８ゲス タフ・チェルマークガツセ２番 ＠ｌ！　　間者　　オツド・シュヴアルツオーストリア
国ウィーン１９セル テスガツセ５番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血漿性の酵素類およびプロ酵素類、活性化された、
   または活性化されていないファクター■、■、■、■、
   ＩＸ、Ｘ、ＸＩ［、「ＦＥＩＢＡＪ　（７）如き載置フ
   ァクター類、プロトロンビン複合体製剤、血漿性阻害物
   質類、免疫グロブリン類、あるいはフィブロネクチンお
   よびフイブリノゲンの如きその他の血液産物、を含有す
   る製剤中の増殖用能な病原体を不活化する方法であって
   、該製剤に硫酸アンモニウムを、塩濃度が０．５モル濃
   度以上に達する様に加え、該製剤を熱処理し、その後、
   該製剤から硫酸アンモニウムを除去することを特徴とす
   る方法。 ２、該製剤のタンパク質含有量が０．００１％〜３０％
   である第１項に記載の方法。 ３．２〜４モル濃度の硫酸アンモニウムを含有する該製
   剤を熱処理することを特徴とする第１項に記載の方法。 ４、該製剤に硫酸アンモニウムを加えて、該製剤からタ
   ンパク質および硫酸アンモニウムを含有する沈殿を回収
   し、この沈殿を熱処理することを特徴とする第１項に記
   載の方法。 ５、硫酸アンモニウムを加えた後、該製剤を凍結乾燥し
   て凍結乾燥物を得、該凍結乾燥物を熱処理し、次いでこ
   の熱処理された凍結乾燥物に水性溶媒を加えて溶液を復
   元し、この溶液から硫酸アンモニウムを除去することを
   特徴きする第１項に記載の方法。 ６、熱処理が４０℃〜１２１℃の温度で１秒〜１００時
   間の間行なわれることを特徴とする第１項に記載の方法
   。 ７、熱処理がショック療法として行なわれることを特徴
   とする第１項に記載の方法。 ８、該製剤のｐＨを、処理の間、５〜１１の範囲に維持
   することを特徴とする第１項に記載の方法。 ９、該製剤のｐＨを６５〜８．５の範囲に維持すること
   を特徴とする第８項に記載の方法。 １０、熱処理の前に、該製剤にタンパク安定化物質を加
   えることを特徴とする第１項ζこ記載の方法。 １１、タンパク安定化物質がグリシンである第１０項番
   こ記載の方法。 １２、熱処理の前に、該製剤に抗微生物剤を加えること
   を特徴とする第１項に記載の方法。 １３、該抗微生物剤がカプリル酸塩である第１２項に記
   載の方法。 １４、該製剤からの硫酸アンモニウムの除去を、半透膜
   を用いて行なうことを特徴とする第１項に記載の方法、 １５、血漿性の酵素類およびプロ酵素類、活性化された
   または活性化されていないファクター■、■、■、■、
   ＩＸ、Ｘ、ＩＩＩ、　　ｒＦＥＩＢＡＪ　の如き凝固フ
   ァクター類、プロトロンビン複合体製剤、血漿性阻害物
   質、免疫グロブリン類、あるいはフィブロネクチンおよ
   びフイプリノゲンの如きその他の血液産物を含有する製
   剤であって、該製剤が、０．５モル濃度以上の塩濃度の
   硫酸アンモニウムによる処理、熱処理および該製剤から
   の硫酸アンモニウムの除去により調製された安定な形の
   製剤。 １６、凍結乾燥によって安定な形にされた第１５項に記
   載の製剤。