JPH02304030A - 抗ｎａｎｂウイルス抗体陽性静注用免疫グロブリン製剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗ＮＡＮＢ　（非Ａ非Ｂ肝炎）ウィルス抗体陽
性静注用免疫グロブリン製剤の製法に関する。

〔従来の技術〕

特定のウィルスに対する抗体を主成分とする静注用免疫
グロブリン製剤としては、各種ウィルス（Ｂ型肝炎ウィ
ルス、サイトメガロウィルス、水痘帯状ヘルペスウィル
ス、インフルエンザウィルスなど）に対するものが知ら
れており、各々のウィルスによる感染の予防治療のため
に用いられる。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、臨床上適用できる製剤、すなわち、安
全性と有効性の高い抗ＮＡＮＢウィルス抗体陽性静注用
免疫グロブリン製剤の製造方法を提供することにある。

〔課題を解決するだめの手段］ 本発明者らは、この目的に沿って抗Ｎ　Ａ　Ｎ　１３ウ
ィルス抗体陽性静注用免疫グロブリン製剤の工業的な製
法について検討した結果、ポリエチレングリコール（以
下、ＰＥＧという）分画処理、加熱処理等を組み合わせ
、各工程の処理条件を設定することによって安全性と有
効性の高い抗ＮＡＮＢウィルス抗体陽性静注用免疫グロ
ブリン製剤が＋ｊられることを見出し、さらに研究を重
ねて本発明を完成した。

（１）出発原料 本発明の出発原料としては、抗エイズウイルス抗体陽性
免疫グロブリンを含む画分が使用され、これはヒト血漿
由来であって、抗ＮへＮＢウィルス抗体陽性免疫グ「ゴ
ブリン画分を含むものであれば特に限定されない。具体
的ムこは、抗ＮＡＮＢウィルス抗体陽性血漿からコーン
のエタノール分画により得られる画分子ｆ　−１−ｆｆ
ｌ、画分■、または抗エイズウイルス抗体陽性免疫グロ
ブリンを含むこれらと同等の画分のペースト等が挙げら
れる。また、この出発原料は、ヒＩ・血液型抗体、カリ
クレイン、プレカリクレイン、ＩｇＭ、ＩｇＧ重合体な
どを含んでいてもよい。陽性の確認は、例えばＧｌｕ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−八ｓｐ−Ｇｌｎ−１
１ｅ−Ｌｙｓ−ＴｈｒＬｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｎ−Ｊｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−へ
ｒｇ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−八ｒｇ−へｒｇ−へｒ
ｇ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−八５ｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−１，ｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ
酸配列からなるペプチドを既知の免疫学的手法（ＲＴ法
、ＲＰ　ＨＡ法、ＥＩＡ法、ラテックス凝集反応法）に
よって試薬化し、この試薬との反応性を検知することに
よって行う。この陽性画分を出発原料とする。なお、後
記参考例にＩＦ、　ＩＡ試薬を例示した。

（２）製法 本発明による製造方法は、好ましくは以下の処理よりな
る。

■低濃度ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処理工程 本工程は出発原料を低濃度ＰＥＧで処理し、−に清を回
収する工程である。

出発原料を適当な水性溶媒に懸濁する。水性溶媒の溶質
として、たとえば塩化す１−リウ１１、リン酸ナトリウ
ム、リン酸カリウム、酢酸、酢酸すｌ・リウム、クエン
酸、クエン酸ナトリウム等を含ませてもよい。

この懸濁液を分子量１，０００〜１０，０００　（好適
には約２．０００〜６，０００　）のＰＥＧで処理する
（たとえば、両者を混合する）。処理条件としては、Ｐ
Ｅ（、？！度４〜Ｌｏｗ／ｖ％（特に４〜８Ｗ／ｖ％）
、ｐＨ４〜６（特に４．５〜５．５　）　、イオン強度
０．０００１〜０．１　Ｍ　（特に、０．０００１〜０
．０１Ｍ）であることが好ましい。

この際、蛋白濃度１〜２０ｗ／ｖ％（特に、５〜１５ｗ
／ｖ％）であることが好ましい。

当該処理は、０〜４℃程度で通常３０分〜６時間程度撹
拌することによって行われる。

その後、たとえば遠心分離（６０００〜８０００　ｒ　
ｐ　ｍ、１０〜３０分間）して上清を回収する。

■高濃度ＰＥＧ処理工程 本工程は■の工程で得られた」１清を高濃度ＰＥＧで処
理し、沈澱を回収する工程である。

上記上清を分子量１　、０００〜１０，０００　（好適
には２．０００〜６，０００）のＰＥＧにてさらに処理
する（たとえば、両者を混合する）。処理条件としては
、ＰＥＧ濃度１０〜１．５ｗ／ｖ％（特に、約１１〜１
３ｗ／ｖ％）、ｐＩＩ６〜９（特に７．５〜８．５　）
、イオン強度０．０００１〜０．１　Ｍ　（特に、０．
０００１〜０．ＯＩＭ）であることが好ましい。

この際、蛋白濃度１〜２０ｗ／ｖ％（特に、５〜１５ｗ
／ｖ％）であることが好ましい。

当該処理は、０〜４　’Ｃ程度で通常３０分〜６時間程
度撹拌することによって行われる。

その後、たとえば遠心分離（６０００〜８０００　ｒ　
ｐ　ｍ、１０〜３０分間）して沈澱を回収する。

■陰イオン交換体処理工程 本工程は■の工程で得られた沈澱画分を水性溶媒に溶解
後、または後記■の工程の処理後陰イオン交換体で接触
処理して非吸着画分を回収する工程である。

本工程は、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＧ重合体を除くた
めに行われる。

（ｉ）陰イオン交換体の調製 陰イオン交換体は陰イオン交換基を不溶性担体に結合し
たものであるが、陰イオン交換基としてはジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）基、四級アミノエチル（ＱＡＥ）
基等を、不溶性担体としてはアガロース、セルロース、
デキストラン、ポリアクリルアミド等を用いることがで
きる。

その結合は公知の方法で行われる。

（ｉｉ）処理方法 ■の工程で得られた沈澱画分を適当な水性溶媒に溶解す
る。水性溶媒はｐＨ５〜８（好ましくはｐＨ５．５〜７
．５　）　、低イオン強度（好ましくは０．０１〜０．
２Ｍ）の水溶液であることが好ましい。■の工程と同様
の溶質を含んでいてもよい。蛋白濃度としでは１〜１５
ｗ／ｖ％（特に、３〜１０　ｗ　／　ｖ％）が好ましい
。

さらに、上記水性溶媒で平衡化した陰イオン交換体と接
触処理する。その処理に際してはバッチ法、カラム法の
どちらを用いてもよい。

たとえば、バッチ法では、陰イオン交換体１　ｍｌｌに
対して処理対象溶液１０〜１００ｍ１程度と混合させ、
０〜４℃で３０分〜２時間程度撹拌した後、遠心分離（
６，０００〜Ｂ＋ＯＯＯｒ　ｐ　ｍ、１０〜３０分間）
して上清を回収する。

カラム法でも、陰イオン交換体１　ｍｆｌに対して処理
対象溶液１０〜１００ｍ１程度を接触させ、非吸着画分
を回収する。

なお、本■の工程は所望により省略することもできる。

また、液状加熱処理を行う場合には■の固定化ヒト血液
型物質処理後に当該陰イオン交換体処理を実施すること
が好ましい。

■固定化ヒト血液型物質処理工程 本工程は■の工程の沈澱画分または■の非吸着画分を固
定化ヒト血液型物質で接触処理して、非吸着画分を回収
する工程である。

本工程はヒト血液型抗体を除くために行われる。

（ｉ）固定化ヒト血液型物質の調製 固定化ヒト血液型物質はヒト血液型物質を不溶性担体に
固定化したものである。

ヒト血液型物質の調製は、公知の方法を用いればよい。

たとえば、ヒトＡ、Ｂ、ＡＢまたは０型の赤血球を低張
溶液中で溶血、または超音波処理した後、硫安分画法ま
たはＰＥＧ分画法により精製すること等により得られる
。

さらにこのヒト血液型物質は生理的食塩液に溶解後、夾
雑するウィルスの不活化に有効とされている、たとえば
、約５０〜７０℃１好ましくは約６０℃で、７〜１３時
間、好ましくは約１０時間、又は約８０〜１３０″Ｃ１
好ましくは９５℃〜１２１℃で約１〜４０分、好ましく
は約２〜３０分間加熱処理する。その後、遠心分離して
不溶物を除去し、蒸留水に対して透析して、各ヒト血液
型物質を得る。

一方、不溶性担体としてはアガロース、セルロース、デ
キストラン、シリカゲル、ガラス等が用いられる。

固定化は公知の方法に準じればよい。例えば、アガロー
ス、セルロース等はＣＮＢｒ活性化法により、シリカゲ
ル、ガラス等はオキシラン法によりヒト血液型物質を固
定化できる。

（ｉｉ）処理方法 処理対象物、たとえば■の工程の沈澱画分を水性溶媒に
溶解したもの、あるいは■の工程の非吸着画分をｐＨ５
〜８（特にｐ）１６〜７）、イオン濃度０．０１〜０．
２Ｍ（特に０．０５〜０．１５Ｍ）の条件下で、上記水
性溶媒で平衡化した固定化ヒト血液型物質と接触処理す
る。その際、蛋白濃度１〜１５ｗ／ｖ％（特に、３〜１
０ｗ／ｖ％）であるこ七が好ましく、またハツチ法、カ
ラム法のどちらを用いてもよい。

たとえばバッチ法では、固定化ヒト血液型物質１　ｍｆ
ｌに対して処理対象溶液１０〜１００ｍρ程度と混合さ
せ、０〜１０℃１好ましくは０〜４℃で、３０分〜４時
間、好ましくは３０分〜２時間程度撹拌した後、遠心分
離（６，０００〜８，０００　ｒ　ｐ　ｍ、１０〜３０
分間）して上清を回収する。

カラム法でも、固定化ヒト血液型物質１ｍｌに対して処
理対象溶液１０〜１００ｍ１程度を接触さゼ、非吸着画
分を回収する。

この■の工程は所望により省略することもできる。

■加熱処理工程 本工程は、所望の段階で安定化剤の存在下に当該免疫グ
ロブリンのＮＡＮＢウィルスに対する抗体活性の減少は
最小限にとどめるが、夾雑するウィルス、例えばＨＢウ
ィルス、ＮＡＮＢウィルス等は完全に不活化する条件下
で加熱処理する］−程である。加熱処理は、含湿度３％
以下の乾燥状態（即ち、乾熱処理）、または溶液状態、
即ち免疫グロブリンの水溶液状態（即ち、液状加熱処理
）で行う。より好ましくは液状加熱処理が推奨される。

安定化剤としては、いずれの処理の場合も、二季唐類（
例、サッカロース、マルトース）、υｈアルコール（例
、ソルビトール、マンニトール）が好適に例示される。

より好ましくはソルビトールである。

安定化剤の添加量は、乾熱処理法では、三糖類、糖アル
コール等を０．５〜５　ｗ　／　ｖ％（好ましくは、１
〜３　ｗ　／　ｖ％）液状加熱処理法では三糖類、糖ア
ルコール等をＬｏｗ／ｖ％以上（好ましくは２０〜４５
ｗ／ｖ％または１０〜３５ｗ／ｗ％）を用いることが好
適に例示される。

加熱の対象となる免疫グロブリンの量は、乾熱処理では
、蛋白量として１〜１０ｗ／ｖ％（好ましくは３〜７　
ｗ　／　ｖ％）となるように調整することが好適である
。液状加熱処理では、蛋白量として０．１〜３０　ｗ　
／　ｖ％（好ましくば５〜２０ｗ／Ｖ％）に調整するこ
とが好ましい。

加熱処理は、乾熱処理の場合は、安定化剤を添加後、要
すれば除菌濾過し、たとえば凍結乾燥などによって含水
率３％以下、好ましくは１％以下とする。凍結乾燥の条
件としては０．５　ｍｍＨｇの真空下、２０〜４０℃で
２４〜９６時間程度が例示される。次いで、たとえば５
０〜７０’Ｃ（好ましくは６０℃程度）、１０〜２００
時間（好ましくは５０〜１００時間程度）で処理する。

また、本加熱処理工程は不活性ガス雰囲気Ｆで行うこと
により、加熱時の安定性をより高めることができる。不
活性ガスとしては例えば、窒素ガス、アルゴン、ヘリウ
ムなどが挙げられる。

液状加熱処理の場合は水溶液のｐ＋＋を４．５〜６．５
、好ましくはｐ１１５〜６に調整し、液状加熱処理法で
はたとえば５０〜７０℃（好ましくは６０℃程度）で１
０分〜２０時間（好ましくは１０時間程度）処理される
。

加熱処理の工程は、乾熱処理の場合は最終工程で行うこ
とが好ましい。

液状加熱処理の場合は、出発原料ムこ対して、またば■
の工程の後に行うのが好適である。

なお、■の工程のあとに行う場合は、■および■の処理
を再度行うことが夾雑物除去の点でより好ましい。

また、必要に応じて、他の公知の手段（例えば、固定化
ジアミノ加護による処理など）を行ってもよい。

全工程終了後、公知の方法、すなわち透析、除菌濾過、
分注などの操作により液状製剤とすることができる。さ
らに、凍結乾燥などの操作により乾燥製剤とすることも
できる。

液状製剤の場合、グロブリン濃度としては１〜１５ｗ／
ｖ％（好ましくは５〜Ｉ　Ｏｗ　／　ｖ％）程度である
。また、安定化剤を添加しておくことが好ましい。安定
化剤としては、糖、糖アルコールなどが例示される。そ
の具体的な例については■の加熱処理において既に開示
したものと同様である。

安定化剤の添加量としては、グロブ９フ１ル１５ｗ／ｖ
％当たり２．１〜１０ｗ／ｖ％程度、好ましくは５　ｗ
　／　ｖ％程度が挙げられる。

また、液状製剤のｐＨは５．３〜５．７程度、好ましく
は５．５程度としておくことが例示される。

乾燥製剤の場合も安定化剤を添加しておくことが好まし
い。安定化剤としては、糖、糖アルコール、アルブミン
、無機塩などが例示される。その具体的な例としては、
糖、糖アルコールについては■の加熱処理において既に
開示したものと同様であり、無機塩としては塩化ナトリ
ウムが例示される。

安定化剤の添加量としては、グロブリン１〜１５重量部
当たり、糖または糖アルコールで１〜１０重量部（好ま
しくは２重量部）程度、アルブミンで０．５〜５重量部
（好ましくは１重量部）程度、無機塩で０．１〜１重量
部（好ましくは０．５重量部）程度が挙げられる。

〔作用・効果〕

本発明により得られた製剤は免疫グロブリンが殆ど不活
化されておらず、しかも、抗ヒト血液型物質抗体等の夾
雑物は含まれず、加熱処理を施しているので夾雑ウィル
スは不活化され、抗補体活性も充分に低い等の性質を有
し、日本国生物学的製剤基準（以下、生基準）に適合で
きる安全な製剤である。

また、乾燥製剤の場合は溶解性もよい。

本発明により得られた製剤は、用時、液状製剤の場合は
そのまま、あるいは適当な溶媒（例えば、注射用蒸留水
、生理食塩液、ブドウ糖液など）で希釈して、また、乾
燥製剤の場合は適当な溶媒（例えば、注射用蒸留水）に
溶解して、静脈内投与、点滴などにより、ＮＡＮＢウィ
ルス由来の肝炎の予防または治療に用いられる。また、
公知の他の肝炎予防治療剤、就中ＮＡＮＢ予防治療剤と
の併用も可能である。

〔実施例・参考例・実験例〕

本発明をより詳細に説明するために実施例および実験例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。

実施例１ 参考例で得たＥＴＡ試薬を使ってスクリーニングした抗
ＮＡＮ、Ｂウィルス抗体陽性血漿を冷エタノール法によ
り得られたコーン画分１１＋ｎ１１ｋｇに冷水１０ｆを
加え、ｐＨを５．５に調整した後、ＰＥＧ　＃４０００
を終濃度が８％になるように添加し、２℃で遠心分離を
行った。

得られた上清をＩＮ−水酸化ナトリウムを用いてｐＨ８
，０とした後、Ｐ　Ｅ　Ｇ　＃４０００を終濃度が１２
％になるように加え、２℃で遠心分離を行い、ＩｇＧ画
分を集めた。

このＩｇＧ画分を０．６％塩化ナトリウム溶液を用いＩ
ｇＧ濃度が７％になるように熔解せしめ、ｐｎを６．５
に調整した。

このＩｇＧ溶液１００ｍ１を別途調整したヒト血液型物
質フォルミルセルロファイン力ラム３ｍｌを通過させヒ
ト血液型抗体を吸着除去した。この工程での吸着により
血液型抗体は（１：３２）から（１：　２）に低下した
。

この未吸着画分にＩｇＧ５ｗ／ｖ％溶液当たりヒトアル
ブミンをｌ　ｗ　／　ｖ％、サッカロースを２ｗ　／　
ｖ％添加し、除菌濾過後、凍結乾燥した。

凍結乾燥後、６０゛Ｃで７２時間加熱処理を行い、静注
用免疫グロブリン製剤を得た。

本製剤は、実質的にＩｇＧ単量体のみを含み、ヒト血液
型抗体量も充分少なく、抗補体価も１０〜１５ＣＨ，。

程度であった。

′１６ また、溶解性も高く、静注用免疫グロブリンとしての生
基準にも合格した。

また、この免疫グロブリンはチンパンジーを使った試験
でＮＡＮＢウィルスの増殖を抑制した。

実施例２ 参考例で得たＥＩＡ試薬を使ってスクリーニングした抗
ＮＡＮＢウィルス抗体陽性血漿から冷エタノール法によ
り得られたコーン画分ｎ＋ｍｔｋｇに水１０乏を加え、
さらに１００ｍ１当たりソルビトールを５０ｇ添加し、
ｐＨを５．５に調整した後、６０℃で１０時間加熱処理
を行った。

加熱処理後、ｐＨを５．５に調整した後、ＰＥＧ＃４０
００を終濃度が６％になるように添加し、２℃３時間抽
出を行った後、２℃で遠心分離を行った。

得られた上清を、ＩＮ−水酸化ナトリウムを用いｐｕｓ
、ａとした後、Ｐ　Ｅ　Ｇ　＃４０００を終濃度が１２
％になるように加え、２℃で遠心分離を行い、沈澱画分
にＩｇＧ画分を得た。この沈澱を蒸溜水に溶解し、この
ＩｇＧ溶液１００ｍ１を蒸溜水で平衡化したヒト血液型
物質フォルミルセルロファインカラ１．３ｍｌを通過さ
せヒト血液型抗体を吸着除去した。この工程での吸着に
より血液型抗体は（１：３２）から（１：２）に低下し
た。この沈澱に０．４％食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−
セファデックスを添加（５０ｍｌ溶液当り２ｍ１）　シ
、０〜４℃の条件下、約１時間接触処理し、処理後濾過
にてＤＥＡＥ−セファデックスを除き濾過液（Ｉ　ｇＧ
温溶液を回収した。

＋ｇｃ画分に２％ソルビトール、０，５％Ｎａ　Ｃｆｆ
および１％アルブミンを添加溶解し、ｐ）１６．８とし
た後、除菌濾過し、凍結乾燥して静注用免疫グロブリン
製剤を得た。

木製剤は、実質的にＪｇＧ単量体のみを含み、ヒト血液
型抗体量も充分少なく、抗補体価も１０〜１５ＣＨｓｏ
程度であった。

また、溶解性も高く、静注用免疫グロブリンとしての生
基準にも合格した。

実施例３ 実施例２において、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セファデックスに
よる処理後遠心分１［ｆｌｌ　（７０００ｒｐｍ、約２
０分間）して上清（ＩｇＧ？容液）を回収した。

このＴｇＧ溶液を蒸留水で５％ＩｇＧ溶液に調整し、酢
酸すＩ・リウムで溶液のｐＨを約５．５にし、さらにソ
ルビトールを終濃度５％まで添加した。

この水溶液（電導度約］、ｍｍｈｏ）を除菌濾過し静注
用免疫グロブリン液状製剤を得た。

本製剤は、実質的にＩｇＧ単量体のみを含み、ヒト血液
型抗体量も充分少なく、抗補体価も１０〜１５ＣＨ５゜
程度であり、静注用免疫グロブリンとしての生基準にも
合格した。

またチンパンジーを使った試験で、ＮＡＮＢウィルスの
増殖を抑制した。

実施例４ 参考例で得たＥＩＡ試薬を使ってスクリーニングした抗
ＮＡＮＢウィルス抗体陽性血漿を５６℃で３０分間加温
後以下のような冷エタノール法によりコーン画分■を回
収した。

■エタノール濃度８％、ｐＨ７，２、−３℃１１６時間
で処理して上清を採取 ■エタノール濃度２１％、ｐＨ６，８、−５℃１２４時
間で処理して沈澱（コーン画分子Ｉ　−＋−ｍ　）を採
取 ■沈澱を溶解し、エタノール濃度２０％、ｐＨ６，６、
−５℃１１６時間で処理して沈澱を採取■沈澱を溶解し
、エタノール濃度１７％、ｐＨ５，２、−６℃、８時間
で処理して」＝清を採取■エタノール濃度２５％、ｐＨ
７，４、−５℃１１６時間で処理して沈澱（コーン画分
■）を採取このコーン画分■ベースｌ−１ｋｇを蒸留水
１．　Ｏｆｆにて懸濁し、ｐＨを５．５に調整した後、
遠心分離を行い、」１清を回収して、−］二清１００ｍ
１当たりソルビトールを５０ｇ添加し、６０℃で１０時
間加熱処理しノこ。

加熱処理後、ｐＨを５．５に調整した後、ＰＦ、Ｃ；＃
４０００を終濃度が６％になるように添加し、２　’Ｃ
で遠心分離を行った。

得られた上清をＩＮ−水酸化すトリウムを用いｐＨ８．
０とした後、ｒ３　ＥＣ，＃４０００を終濃度が１２％
になるように加え、２℃で遠心分離を行い、沈ｇ画分に
ＩｇＧ画分を得た。

参考例　ＩＦ、ＩＡ試薬 （１）固定化ペプチドの調製 マイクロプレートを用意し、このマイクロプレー１−の
各ウェル内に合成ペプチド Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−へｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−八５ｐ−Ｇ
ｌｎ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Δｓｐ−Ａｒ
ｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
−Ｌｙｓ−八ｒｇ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−
へｒｇ−へｒｇ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−八５ｎ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈ
ｅの０．０５　Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液を１００　μ
ｌずつ注下し、４℃で１時間放置した。そして、０．０
５Ｍ　Ｔｉ１ｅｅｎ−２０を含有した０、９Ｍ塩化すｌ
・リウム溶液で洗浄し、さらに各ウェル内に０．２５％
ウシ血清アルブミン含有の等帰化リン酸緩衝液（ｐＨ７
．２）を２００μＰずつ注いだ。この後、室温で３時間
放置し溶媒を除・去して固定化ＮＡＮＢ関連ペプチドを
８周製した。

（２）酵素標識抗体の調製例 通常のグルタルアルデヒド法により、パーオキシダーゼ
を抗ヒ）ＩｇＧ抗体に結合させて調製した。

（３）測定例 まず、（１）項で調製したマイクロプレートを用意し、
１％ウサギ血清および０．２５％ウシ血清アルブミンを
含有した等帰化リン酸緩衝液を各ウェル内に７５μｌ注
下し、さらに各ウェル内に検体溶液を２５μ！添加し、
室温で１時間放置した。

その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有の０．９％塩
化ナトリウム溶液で洗浄し、（２）項で調製した酵素標
識抗体を、１％ウサギ血清および０．２５％ウシ血清ア
ルブミン含有の等帰化リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希
釈した希釈溶液を各ウェルに１００ｐｌずつ添加し、室
温で１時間放置後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有の
０．９％塩化ナトリウム溶液で洗浄した。そして、１　
ｍｇ　／　ｍＱ濃度のオルトフェニレンジアミンおよび
０．０１５％過酸化水素を含有した０、　０５　Ｍクエ
ン酸−リン酸緩衝液（ｐｆ１５）を各ウェル内に１００
μ！添加し、室温で３０分間放置した。さらに各ウェル
内に、２Ｎ硫酸を１００μｌ添加し、これを吸光度測定
に供した。

吸光度測定は波長４９２ｎｍでの吸光度とし、これらの
吸光度を測定した。対照吸光度は６９０ｎｍでの吸光度
とし、これらの吸光度の相対比（Ａ　４　ｑ　２　／　
Ａ　ｂ　ｑ。）を算出することによって行い、酵素活性
を求めた。陰性血清についても同様に操作し、酵素活性
を求めた（Ｂｌａｎｋ値）。旧ａｎｋ　（ｉの２倍以上
の値を示す検体を陽性と判断した。

また、標準品を用いた反応系により標準検量線を作成し
、上記被検液の反応で得られた酵素活性を検量線と比較
することにより、被検液に含まれる抗ＮＡＮＢウィルス
抗体の量を求めた。

実験例１：抗体価の測定 星製抜 抗体陽性血漿については無症候で、かつ参考例で得たＥ
ＴＡ試薬を使ってスクリーニングされたＮＡＮＢウィル
ス抗体陽性キャリアより、陰性血漿については正常人よ
り集めた。これらの血漿から実施例４の方法により静注
用免疫グロブリンを得た。この画分のＩｇｃ含量は免疫
拡散法（ＭＢＬ　　Ｃｏ、、名古屋）により、抗体価は
上記の参考例の方法により求めた（第１表）。

第１表　　　゛

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗ＮＡＮＢウィルス抗体陽性免疫グロブリンを含
   む画分を出発原料とする、以下の処理からなる抗ＮＡＮ
   Ｂウィルス抗体陽性静注用免疫グロブリン製剤の製造方
   法： （ａ）ｐＨ４〜６、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ
   、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０００〜１０，０
   ００のポリエチレングリコール４〜１０ｗ／ｖ％で処理
   して上清を回収する。 （ｂ）（ａ）の上清をｐＨ６〜９、イオン強度０．００
   ０１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０
   ００〜１０，０００のポリエチレングリコール１０〜１
   ５ｗ／ｖ％で処理して沈澱を回収する。 （ｃ）所望の工程で夾雑するウィルスが不活化するのに
   充分な条件下、安定化剤の存在下で加熱処理する。
2. （２）（ｂ）の工程の後に、ｐＨ５〜８、イオン強度０
   ．０１〜０．２Ｍの条件下、固定化ヒト血液型物質で処
   理して非吸着画分を回収する工程を含むことを特徴とす
   る請求項（１）記載の製造方法。
3. （３）（ｂ）の沈澱を水性溶媒に溶解し、ｐＨ５〜８、
   イオン強度０．０１〜０．２Ｍの条件下、陰イオン交換
   体で処理して非吸着画分を回収する工程を含んでなる請
   求項（１）記載の製造方法。