JPH01230533A

JPH01230533A - 抗エイズウイルス抗体陽性静注用免疫グロブリン製剤の製造方法

Info

Publication number: JPH01230533A
Application number: JP33548887A
Authority: JP
Inventors: Masafumi Tochikura; 栃倉　匡文; Hideki Nakajima; 秀樹中島; Nobuyuki Kobayashi; 信行小林; Naoki Yamamoto; 直樹山本; Setsu Goto; 後藤　節; Yatsuhiro Kamimura; 上村　八尋; Tadakazu Suyama; 須山　忠和
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1987-11-20
Filing date: 1987-12-29
Publication date: 1989-09-14
Anticipated expiration: 2012-05-28
Also published as: JP2613409B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は抗エイズウィルス抗体陽性静注用免疫グロブリ
ン製剤の製法に関する。

〔従来の技術〕

特定のウィルスに対する抗体を主成分とする静注用免疫
グロブリン製剤としては、各種ウィルス（Ｂ型肝炎ウィ
ルス、サイトメガロウィルス、水痘帯状ヘルペスウィル
ス、インフルエンザウィルスなど）に対するものが知ら
れており、各々のウィルスによる感染の予防治療のため
に用いられる。

ところで、このようなタイプの製剤の一つとして、エイ
ズウィルス〔総称はＨＩ　Ｖ　（１ｌｕｓａｎＴ＋ｓｍ
ｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ　）であるが
、またＨＴＬＶ　−ｍ　　（Ｈｕｍａｎ　　Ｔ−ｃｅｌ
ｌ　　Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　　Ｖｉｒｕｓ　　ｔ
ｙｐｅ■）またはＬ　Ａ　Ｖ　（Ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏ
ｐａｔｈｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ）ともい
う〕に対する抗体を主成分とする静注用免疫グロブリン
製剤が、最近報告された（特開昭６２−１９２３２６）
。

この報告では滅菌処理の方法としてβ−プロピオラクト
ン／９外線処理が具体的に開示されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

通常の静注用免疫グロブリン製剤において、β−プロピ
オラクトンによる滅菌処理は、化学的な変性をもたらし
ており、グロブリンに様々な影響を与える０例えば、抗
体価の低下、ＩｇＧ、サブクラスの消失、補体結合能の
低下、新たな抗原性の発現などインタクト（ｉｎｔａｃ
ｔ）なグロブリンとは異なる性質を与えうる（Ｖｏｘ　
Ｓａｎｇ、、　２８．４２２〜４３７　（１９７５）、
同３８．．１４７〜１５５　（１９８０）、同４２．。

６２〜７３　（１９８２）　）　、また、β−プロピオ
ラクトン自身の発癌性も問題となりうる。

従って、β−プロピオラクトン処理は必ずしも有用な方
法とは言えない。

本発明の目的は、臨床上通用できる製剤、すなわち、安
全性と有効性の高い抗エイズウィルス抗体陽性静注用免
疫グロブリン製剤の製造方法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段］本発明者らは、この目的に沿って抗エイズウィルス抗体
陽性外注用免疫グロブリン製剤の工業的な製法について
検討した結果、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ
という）分画処理、加熱処理等を組み合わせ、各工程の
処理条件を設定することによって安全性と有効性の高い
抗エイズウィルス抗体陽性静注用免疫グロブリン製剤が
得られることを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完
成した。

（１）出発原料本発明の出発原料としては、抗エイズウィルス抗体陽性
免疫グロブリンを含む百分が使用され、これはヒト血漿
由来であって、抗エイズウィルス抗体陽性免疫グロブリ
ン画分を含むものであれば特に限定されない、具体的に
は、抗エイズウィルス抗体陽性血漿からコーンのエタノ
ール分画により得られる画分■十ｍ、百分■、または抗
エイズウィルス抗体陽性免疫グロブリンを含むこれらと
同等の画分のペースト等が挙げられる。また、この出発
原料は、ヒト血液型抗体、カリクレイン、プレカリクレ
イン、ＩｇＭ、ＩｇＧ重合体などを含んでいてもよい。

（２）製法本発明による製造方法は、好ましくは以下の処理よりな
る。

■低濃度ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処理工程本工程は出発原料を低４度ＰＥＧで処理し、上清を回収
する工程である。

出発原料を適当な水性溶媒に懸濁する。水性溶媒の溶質
として、たとえば塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、
リン酸カリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、クエン酸、ク
エン酸ナトリウム等を含ませてもよい。

この懸ＦＡ液を分子量１，０００〜１０．０００　（好
適には約２，０００〜６，０００　）のｒ’ＥＣで処理
する（たとえば、両者を混合する）、処理条件としては
、Ｐ　ＩＦ。

Ｇｆｉ度４〜１０　ｗ　／　ｖ％（特に４〜８　ｗ　／
　ｖ％）、ｐＨ４〜６（特に４．５〜５．５　）　、イ
オン強度０．０００１〜０．１　Ｍ　（特に、０．００
０１〜０．ＯＩＭ）であることが好ましい。

この際、蛋白濃度１〜２Ｑ　ｗ　／　ｖ％（特に、５〜
１５ｗ／ｖ％）であることが好ましい。

当該処理は、０〜４°Ｃ程度で通常３０分〜６時間程度
撹拌することによって行われる。

その後、たとえば遠心骨Ｎ　（６０００〜８０００　ｒ
　ｐ　ｍ、１０〜３０分間）して上清を回収する。

■高濃度ＰＥＧ処理工程本工程は■の工程で得られた上清を高４度ＰＥＧで処理
し、沈澱を回収する工程である。

上記上清を分子！ｌｌ　、　０００〜１０．０００　（
好適には２．０００〜６，０００）のＰＥＧにてさらに
処理する（たとえば、両者を混合する）、処理条件とし
ては、ＰＥＧｉＪ度１０〜１５ｗ／ｖ％（特に、約ｌｌ
〜１３ｗ／ｖ％）、ｐ１１６〜９（特に７．５〜８．５
）、イオン強度０．０００１〜０．１　Ｍ　（特に、０
．０００１−０．０１Ｍ）であることが好ましい。

その後、たとえば遠心骨ｔｌｉｌｆ　（６０００〜８０
００　ｒ　ｐ　ｔｎ　。

１０〜３０分間）して沈澱を回収する。

■陰イオン交換体処理工程本工程は■の工程で得られた沈澱画分を水性溶媒に溶解
後、または後記■の工程の処理後陰イオン交換体で接触
処理して非吸着画分を回収する工程である。

本工程は、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＧ重合体を除くた
めに行われる。

（ｉ）陰イオン交換体のＵ８製陰イオン交換体は陰イオン交換基を不溶性担体に結合し
たものであるが、陰イオン交換基としてはジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）基、四級アミノエチル（ＱＡＥ）
基等を、不溶性担体としてはアガロース、セルロース、
デキストラン、ポリアクリルアミド等を用いることがで
きる。

その結合は公知の方法で行われる。

（ｉｉ）処理方法 ■の工程で得られた沈澱画分を適当な水性溶媒に溶解す
る。水性溶媒はｐＨ５〜８（好ましくはｐＨ５，５〜７
．５　）　、低イオン強度（好ましくは０．０１〜０．
２　Ｍ　）の水溶液であることが好ましい、■の工程と
同様の溶質を含んでいてもよい、蛋白濃度としては１〜
１５　ｗ　／　ｖ％（特に、３〜１０ｗ／ｖ％）が好ま
しい。

さらに、上記水性溶媒で平衡化した陰イオン交換体と接
触処理する。その処理に際してはバッチ法、カラム法の
どちらを用いてもよい。

たとえば、バッチ法では、陰イオン交換体１１に対して
処理対象溶液１０〜！００１程度と混合させ、０〜４℃
で３０分〜２時間程度撹拌した後、遠心骨Ｍ　（６，０
００〜８．００Ｏｒ　ｐ　ｍ、　　１０〜３０分間）し
て上清を回収する。

カラム法でも、陰イオン交換体１＋＊ｌに対して処理対
象溶液１０〜１００ｍ１程度を接触させ、非吸着画分を
回収する。

なお、本■の工程は所望により省略することもできる。

また、液状加熱処理を行う場合には■の固定化ヒト血液
型物質処理後に当該陰イオン交換体処理を実施すること
が好ましい。

■固定化ヒト血液型物質処理工程本工程は■の工程の沈澱画分または■の非吸着画分を固
定化ヒト血液型物質で接触処理して、非吸着画分を回収
する工程である。

本工程はヒト血液型抗体を除くために行われる。

（：）固定化ヒト血液型物質の！ｌｉ製固足固定化ヒト
血液型物質ト血液型物質を不溶性担体に固定化したもの
である。

ヒト血液型物質の調製は、公知の方法を用いればよい、
たとえば、ヒトＡ、Ｂ、ＡＢまたは０型の赤血球を低張
溶液中で溶血、または超音波処理した後、硫安分画法ま
たはＰＥＧ分画法により精製すること等により得られる
。

さらにこのヒト血液型物質は生理的食塩液に溶解後、夾
雑するウィルスの不活化に有効とされている、たとえば
、約５０〜７０°Ｃ１好ましくは約６０″Ｃで、７〜１
３時間、好ましくは約１０時間、又は約８０〜１３０℃
、好ましくは９５℃〜１２１℃で約１〜４０分、好まし
くは約２〜３０分間加熱処理する。その後、遠心分離し
て不溶物を除去し、蒸留水に対して透析して、各ヒト血
液型物質を得る。

一方、不溶性担体としてはアガロース、セルロース、デ
キストラン、シリカゲル、ガラス等が用いられる。

固定化は公知の方法に準じればよい０例えば、アガロー
ス、セルロース等はＣＮＢｒ活性化法により、シリカゲ
ル、ガラス等はオキシラン法によりヒト血液型物質を固
定化できる。

（ｉｉ）処理方法処理対象物、たとえば■の工程の沈澱画分を水性溶媒に
溶解したもの、あるいは■の工程の非吸着画分をｐＨ５
〜８（特にｐＨ６〜７）、イオン濃度０．０１〜０．２
Ｍ（特に０．０５〜０．１５Ｍ）の条件下で、上記水性
溶媒で平衡化した固定化ヒト血液型物質と接触処理する
。その際、蛋白濃度１〜１５ｗ　／　ｖ％（特に、３〜
１０　ｗ　／　ｖ％）であることが好ましく、またバッ
チ法、カラム法のどちらを用いてもよい。

たとえばパンチ法では、固定化ヒト血液型物質１１に対
して処理対象溶液１０＝１０Ｏ＋１程度と混合させ、０
〜１０℃、好ましくは０〜４°Ｃで、３０分〜４時間、
好ましくは３０分〜２時間程度撹拌した後、遠心分離（
６，０００〜８，０００　ｒ　ｐ　ｍ、１０〜３０分間
）して上清を回収する。

カラム法でも、固定化ヒト血液型物［１＋ｓｌに対して
処理対象溶液１０〜１００ｍ１程度を接触させ、非吸着
画分を回収する。

この■の工程は所望により省略することもできる。

■加熱処理工程本工程は、所望の段階で安定化剤の存在下に当該免疫グ
ロブリンのエイズウィルスに対する抗体活性の減少は最
小限にとどめるが、夾雑するウィルス、例えばＨＢウィ
ルス、エイズウィルス等は完全に不活化する条件下で加
熱処理する工程である。加熱処理は、含湿度３％以下の
乾燥状態（即ち、乾熱処理）、または溶液状態、即ち免
疫グロブリンの水溶液状態（即ち、液状加熱処理）で行
う、より好ましくは液状加熱処理が推奨される。

安定化剤としては、いずれの処理の場合も、二１！頻（
Ｌサッカロース、マルトース）、Ｆ’フルコール（例、
ソルビトール、マンニトール）が好適に例示される。よ
り好ましくはソルビトールである。

安定化剤の添加量は、乾熱処理法では、二［１、糖アル
コール等を０．５〜５　ｗ　／　ｖ％（好ましくは、１
〜３　ｗ　／　ｖ％）液状加熱処理法では二［１、糖ア
ルコール等を１０　ｗ　／　ｖ％以上（好ましくは２０
〜４５ｗ／ｖ％またはｔｏ〜３５ｗ／ｗ％）を用いるこ
とが好適に例示される。

加熱の対象となる免疫グロブリンの量は、乾熱処理では
、蛋白量として１〜ＩＯＷ／Ｖ％（好ましくは３〜７　
ｗ　／　ｖ％）となるように調整することが好適である
。液状加熱処理では、蛋白量として０．１〜３０ｗ／ｖ
％（好ましくは５〜２０ｗ／Ｖ％）に調整することが好
ましい。

加熱処理は、乾熱処理の場合は、安定化剤を添加後、要
すれば除菌濾過し、たとえば凍結乾燥などによって含水
率３％以下、好ましくは１％以下とする。凍結乾燥の条
件としては０．５−８ｇの真空下、２０〜４０°Ｃで２
４〜９６時間程度が例示される０次いで、たとえば５０
〜７０°Ｃ（好ましくは６０℃程度）、１０〜２００時
間（好ましくは５０〜１００時間程度）で処理する。

また、本加熱処理工程は不活性ガス雰囲気下で行うこと
により、加熱時の安定性をより高めることができる。不
活性ガスとしては例えば、窒素ガス、アルゴン、ヘリウ
ムなどが挙げられる。

液状加熱処理の場合は水溶液のｐＨを４．５〜６．５、
好ましくはｐＨ５〜６に調整し、液状加熱処理法ではた
とえば５０〜７０℃（好ましくは６０°Ｃ程度）で１０
分〜２０時間（好ましくは１０時間程度）処理される。

加熱処理の工程は、乾熱処理の場合は最終工程で行うこ
とが好ましい。

液状加熱処理の場合は、出発原料に対して、または■の
工程の後に行うのが好適である。

なお、■の工程のあとに行う場合は、■および■の処理
を再度行うことが夾雑物除去の点でより好ましい。

また、必要に応じて、他の公知の手段（例えば、固定化
ジアミノ加護による処理など）を行ってもよい。

全工程終了後、公知の方法、すなわち透析、除菌濾過、
分注などの操作により液状製剤とすることができる。さ
らに、凍結乾燥などの操作により乾燥製剤とすることも
できる。

液状製剤の場合、グロブリン濃度としては１〜１５ｗ／
ｖ％（好ましくは５〜１０　ｗ　／　ｖ％）程度である
。また、安定化剤を添加しておくことが好ましい、安定
化剤としては、糖、塘アルコールなどが例示される。そ
の具体的な例については■の加熱処理において既に開示
したものと同様である。

安定化剤の添加量としては、ゾロ１９フ１〜１５くは５
ｗ／ｖ％程度が挙げられる。

また、液状製剤のｐＨは５．３〜５．７程度、好ましく
は５．５程度としておくことが例示される。

乾燥製剤の場合も安定化剤を添加しておくことが好まし
い．安定化剤としては、糖、糖アルコール、アルブミン
、無機塩などが例示される．その具体的な例としては、
糖、糖アルコールについては■の加熱処理において既に
開示したものと同様であり、無機塩としては塩化ナトリ
ウムが例示される。

安定化剤の添加量としては、グロブリン１−１５重量部
当たり、糖または糖アルコールで１〜１０重量部（好ま
しくは２重量部）程度、アルブミンで０．５〜５重量部
（好ましくは１重量部）程度、無機塩で０．１−１重置
部（好ましくは０．５重量部）程度が挙げられる。

〔作用・効果〕

本発明により得られた製剤は免疫グロブリンが殆ど不活
化されておらず、しかも、抗ヒト血液型物質抗体等の夾
雑物は含まれず、加熱処理を施しているので夾雑ウィル
スは不活化され、抗補体活性も充分に低い等の性質を有
し、昭和６０年度発行の日本国生物学的製剤基準（以下
、生基準）に適合できる安全な製剤である。

また、乾燥製剤の場合は溶解性もよい。

本発明により得られた製剤は、用時、液状製剤の場合は
そのまま、あるいは適当な溶媒（例えば、注射用蒸留水
、生理食塩液、ブドウ糖液など）で希釈して、また、乾
燥製剤の場合は適当な溶媒（例えば、注射用蒸留水）に
溶解して、静脈内投与、点滴などにより、エイズ（ＡＩ
ＤＳ）の予防または治療に用いられる．また、公知の他
のエイズ予防治療剤との併用も可能である。

すなわち、本発明は抗エイズウィルス抗体陽性静注用免
疫グロブリン製剤の工業的製法として有用である。

〔実施例〕

本発明をより詳細に説明するために実施例および実験例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。

実施例１抗ＨＩＶ抗体陽性血漿を５６℃で３０分間加熱処理した
後、冷エタノール法により得られたコーン画分１１１ｋ
ｇに０．ＯＯＩＭの塩化ナトリウム溶液１（ｌを加え、
ｐＨを５．０に調整した後、ＰＥＧ＃４０００を終濃度
が８％になるように添加し、２℃で遠心分離を行った。

得られた上清をＩＮ−水酸化ナトリウムを用いてＰＨ８
．０とした後、Ｐ　Ｅ　Ｇ　＃４０００を終濃度が１２
％になるように加え、２°Ｃで遠心分離を行い、ＩｇＧ
画分を集めた。

このＩｇＧ画分を０．６％塩化ナトリウム溶液を用いＩ
ｇＧ濃度が７％になるように溶解せしめ、ｐＨを６．５
に調整した。

このＩｇＧ溶液１００請ｌを別途調整したヒト血ｉ１型
物’ｆｆフォルミルセルロファイン力ラム３ｍｌを通過
させヒト血液型抗体を吸着除去した．この工程での吸着
により血液型抗体は（１：３２）から（１：２）に低下
した。

さらに、この溶液にＤＥＡＥ−セファデックスを添加（
５０麟ｌ熔液当たり１１）し、０〜４°Ｃの条件下、約
１時間接触処理し、処理後遠心分＃（７０００　ｒｐｍ
，約２０分間）して上ｖｆｆ（ＩｇＧ溶液）を回収した
。

この未吸着画分にＩｇＧ５ｗ／ｖ％溶液当たりヒトアル
ブミンを１ｗ／ｖ％、サッカロースを２ｗ　／　ｖ％添
加し、除菌濾過後、凍結乾燥した。

凍結乾燥後、６０℃で７２時間加熱処理を行い、静注用
免疫グロブリン製剤を得た。

本製剤は、実質的にＩｇＧ単量体のみを含み、ヒト血液
型抗体量も充分少なく、抗補体価も１０〜１５ＣＨ，。

程度であった。

また、溶解性も高く、静注用免疫グロブリンとしての生
基準にも合格した。

また、この免疫グロブリンはｉｎ　ｖｉｔｒｏの試験で
ＡＩＤＳウィルスの増殖を抑制した。

実施例２抗ＨＩＶ抗体陽性血漿から冷エタノール法により得られ
たコーン画分■＋［１１ｋｇに水１０ｆｆｉを加え、さ
らに１ｏｃｌｌｌｌ当たりソルビトールを５０ｇ添加し
、ＰＨを５．５に調整した後、６０°Ｃで１０時間加熱
処理を行った。

加熱処理後、ｐＨを５．５に調整した後、ＰＥＧ＃４０
００を終濃度が６％になるように添加し、２°Ｃ３時間
抽出を行った後、２　”Ｃで遠心分離を行った。

得られた上清をＩＮ−水酸化ナトリウムを用いｐＨ８，
８とした後、Ｐ　Ｅ　Ｇ　＃４０００を終濃度が１２％
になるように加え、２℃で遠心分離を行い、沈澱画分に
ＩｇＧ画分を得た。この沈澱を蒸溜水に溶解し、このＩ
ｇＧ溶液１００ｍ１を蒸溜水で平衡化したヒト血液型物
質フォルミルセルロファイン力ラム３ｍｌを通過させヒ
ト血液型抗体を吸着除去した。この工程での吸着により
血液型抗体は（ｌ：３２）から（１：　２）に低下した
。この沈澱に０．４％食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ファデックスを添加（５０ｍｌ溶液当り２ｍ１）　Ｌ、
Ｏ〜４　”Ｃの条件下、約１時間接触処理し、処理後濾
過にてＤＥＡＥ−セファデックスを除き濾過液（ＩｇＧ
溶液）を回収した。

１８０画分に２％ソルビトール、０．５％ＮａＣ１およ
び１％アルブミンを添加溶解し、ｐＨ６，８とした後、
除菌濾過し、凍結乾燥して静注用免疫グロブリン製剤を
得た。

本製剤は、実質的にＩｇＧ単量体のみを含み、ヒト血液
型抗体量も充分少なく、抗補体価もｌ。

〜１５ＣＨ，，程度であった。

実施例３実施例２において、ＤＥＡＥ−セファデックスによる処
理後遠心分離（７０００ｒｐｍ、約２０分間）して上清
（＋ｇｃ溶液）を回収した。

このＩｇＧ溶液を蒸留水で５％ＩｇＧ溶液に調整し、酢
酸ナトリウムで溶液のｐｌを約５．５にし、さらにソル
ビトールを終濃度５％まで添加した。

この水溶液（電導度約１５ｓｈｏ）を除菌濾過し静注用
免疫グロブリン液状製剤を得た。

本製剤は、実質的にＩｇＧ単量体のみを含み、ヒト血液
型抗体量も充分少なく、抗補体価も１０〜１５ＣＨｓｅ
程度であり、静注用免疫グロブリンとしての生基準にも
合格した。

またｉｎ　ｖｉｔｒｏの試験で、ＡＩＤＳウィルスの増
殖を抑制した。

実施例４抗ＨＩ　Ｖ抗体陽性血漿を５６℃で３０分間加温後以下
のような冷エタノール法によりコーン画分■を回収した
。

■エタノール濃度８％、ｐＨ７，２、−３℃、１６時間
で処理して上清を採取 ■エタノール濃度２１％、ｐＨ６，８、−５℃、２４時
間で処理して沈澱（コーン画分＋１＋ｌ１１）を採取 ■沈澱を溶解し、エタノール濃度２０％、ＰＨ６，６、
−５℃、１６時間で処理して沈澱を採取■沈澱を溶解し
、エタノール濃度１７％、ｐＨ５，２、−６℃、８時間
で処理して上清を採取 ■エタノール濃度２５％、ｐＨ７，４、−５℃、１６時
間で処理して沈Ｗ１（コーン百分「）を採取このコーン
画分［ペースト１ｋｇを蒸留水１０２にて懸濁し、ｐＨ
を５．５に調整した後、遠心分離を行い、上清を回収し
て、上清１００ｍ１当たりソルビトールを５０ｇ添加し
、６０℃で１０時間加熱処理した。

加熱処理後、ｐＨを５．５に調整した後、ＰＥＧ＃４０
００を終濃度が６％になるように添加し、２℃で遠心分
離を行った。

得られた上清をＩＮ−水酸化ナトリウムを用いＰＨ８，
０とした後、Ｐ　Ｅ　Ｇ　＃４０００を終濃度が１２％
になるように加え、２℃で遠心分離を行い、沈澱画分に
ＩｇＧＷｉ分を得た。

〔実験例〕

実験例１：抗体価の測定〔材料と方法〕（１）細胞株およびウィルス株皇凶珪三種のＣＤ４陽性ヒトＴ細胞株を用いた。

１、ＨＴＬＶ−１陽性Ｔ細胞株：ＭＴ−４（Ｍｉｙｏｓｈｉ、　１．　ｅｔ　ａｌ、：Ｊ
ｐｎ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、２８＋２１９
−２２８．１９８２）２、ＨＩＶ産生Ｔ細胞株：ＭＯＬＴ−４／［ＩＩＶ（にｏｙａｎａｇｉ、　　ｙ、　　ｅｔ　　ａｌ、：Ｊ
ｐｎ、Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、＋７６＋７９９−
８０２．１９８５）３、　ＨＩ　Ｖ非産生Ｔ細胞株：ＭＯＬＴ−４（Ｍｉｎｏｗａｄａ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、：Ｊ、　Ｎ
ａｔ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、＋４９、８９１−８
９５．１９７２）いずれの細胞株も、１０％濃度の非動化したウシ胎児血
清（Ｆｅ２）と抗生物質を含むＲＰＭＩ−１６４０培地
で培養した。細胞の生存率はトリパンブルー染色によっ
て調べた。

ウィルス株ＨＴＬＶ−１１１１株を用いた。

ウィルス液は、ＭＯＬＴ−４／ＨＴＬＶ−１１１゜の培
養−Ｆ清より調製した。即ち、低速遠心で細胞を除いた
後、ウィルスを含む培養上清を０．４５μ。

のミリポアフィルタ−で濾過し、用時まで、−８０°Ｃ
で凍結保存した。このウィルス液の感染価は、ＭＴ−４
を使ったプラーク形成法で測定したところ、２Ｘ１０’
ρｆｕ／剛ｌであった。

（２）ＨＩ　Ｖ抗体陽性血漿と抗体陽性免疫グロブリン
の調製と抗体価測定法週盟広抗体陽性血漿についてはアメリカの無症候のトＩＩＶ抗
体陽性キャリアより、陰性血漿については日本及びアメ
リカの正常人より集めた。これらの血漿から実施例４の
方法により静注用免疫グロブリンを得た。この百分のＩ
ｇＧ含量は免疫拡散法（ＭＢＬ　　Ｃｏ、、名古屋）に
より、抗体価は下記の免疫蛍光法により求めた（第１表
）。

抗潜Ｊ１１【汰 ■免疫蛍光（ＩＦＡ）法細胞に於けるＨ　Ｉ　Ｖ特異抗原の出現と血漿や免疫グ
ロブリンのＨＩＶに対する結合抗体価は、免疫蛍光法に
よって決めた。以下にその手順の概略を述べる。

１、　メタノール固定細胞に、抗原の検出の為には１０
００倍に希釈した抗体陽性血清（ＩＦ法による抗体価１
　：　４０９６）を、抗体価測定の為には連続希釈した
グロブリン溶液を滴下した。

２、３７°Ｃで３０分間静置後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ
）で１５分間洗浄。

３、　抗ヒトＩ　ｇ　Ｇ　−Ｆ　Ｌ　Ｔ　Ｃ（Ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｉｎ　ｌ５ｏ−ｔｈｉｏｙａｎａＬｅ）標識
ウサギ抗体溶液を滴下し、３７°Ｃで３０分間静置後、
ＰＢＳで洗浄。

４、　蛍光顕微鏡で３００個以上の細胞を観察し、蛍光
陽性細胞の割合を求めた。

■中和抗体（ＮＡ）法ＨＩＶに対する中和抗体価測定の為に、プラーク形成阻
止法を用いた。

１、　非動化血漿と免疫グロブリン溶液を除菌濾過し、
ｌ／２０から１　／２５６０まで倍々希釈した。この希
釈溶液１１を等量の５Ｘ　ＩＯ”ｐｆｕ／ｍｌのウィル
ス溶液と混合した。この混合液を４゛Ｃで２時間振盪し
た。

２゜　各混合液０．５１をシャーレ中のＭＴ−４細胞上
（２，４Ｘ１０’細胞／シヤーレ）に滴下後、ウィルス
の細胞への吸着の為、室温で１時間静置した。

３．０．６％アガロース（Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕｅ　Ａｇ
ａｒｏｓｅ。

Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ
、　ＭＥ）を含有する血清培地１．５ｍｌを各シャーレ
に注いだ。

４、　シャーレを３７℃の炭酸ガス培養器で３日間培養
後、中性赤及びアガロース含有血清培地１．５ｍｌを重
層する。

５、　更に３日間培養後、肉眼でプラークを数える。

なお、実、験は３連で行った。血漿あるいはＨＩＶ−１
ｇの中和抗体価は、陰性対照のプラーク数の５０％以下
となる検体の希釈倍数で表した。

第１表実験例２（１）ＭＴ−４系でのＨＩＶｉｇのＩ（Ｉ　Ｖ感染阻害
■ＨＩ　Ｖ感染細胞の１＋　１　Ｖ−１ｇによる処理Ｈ
Ｉ　Ｖ　−１ｇｈ＜ＭＴ　−４ヲＩＩ　［Ｖｇ３染Ｊ’
う守ルことができるかどうかを調べるために、Ｉ　Ｆ法
による抗体価が１：１２８０〜２５６０のＨ［Ｖ　−１
ｇ調製品を終濃度３０％（Ｖ／Ｖ）となるようにＨＩＶ
感染ＭＴ−４培養系の中に入れた。

ＨＩＶのＭＴ−４への感染条件は細胞１個あたりの接種
ウィルス数ＣＭ、０．１．　）　０．００１で行った。

３７°Ｃで１時間、細胞につ・Ｃルスを吸着させた後、
！Ｓ染細胞を培地で１回洗浄した。２ＸＩＯ’ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌになるように血清培地で細胞密度を調整後、２
４穴組織培養用プレートの各人に１ｍｌずつ分注し、３
７°Ｃ１５％炭酸ガス濃度、湿潤状態で培養した。ＨＩ
Ｍ−１ｇの希釈は血清培地で行い、細胞播種時に細胞培
養液中に加えた。陰性対照としては、抗ＨＩ　Ｖ抗体陰
性血漿を用いた。

ＨＩＶ感染Ｍ　１”　−４の生存率はトリパンブルー染
色法（Ｋｒｕｓｅ、　ｐ、　Ｆ、＋　Ｊｒ、　ａｎｄ　
Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、　Ｍ、に、。

Ｊｒ、、　Ｂｄｓ−＋　１９７３：　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄＡｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ、）により、また、陽性率（感染率）はＩＦ
法により測定した。

■結果陰性対照を添加した系では、感染ＭＴ−４の生存率は、
感染１５日日月は２０％以下にまで急速に落ちた。ＨＩ
Ｖ抗原陽性細胞の割合は、感染３臼目には８０％以上に
なった。一方、ｔ（ＩＩ−１ｇを添加した系では、ＨＩ
Ｖ複製阻害とウィルスによる細胞死の阻害効果がはっき
りと見られた。

即ち、感染２週間後には、陰性対照処理系では殆ど全て
の感染細胞が死滅したのに対し、ＨＩＶ−１ｇ処理培養
系に於いては抗原陽性細胞が１％以下しかなく細胞は生
きていた。

第２表〔以下余白］第３表実験例３次に、Ｈ［Ｖ−１ｇの感染阻止に関する濃度の影響を見
た。ＨＩＶ−１ｇをいろいろな濃度で感染培養系に加え
たところ、阻害の程度は明らかにＩｇＧ濃度依存性であ
った（第４表）。１０日日間実験期間中、ＨＩ　Ｖ感染
拡大の完全な阻止は、ＩｇＧの終濃度が５．３＋１ｇ／
ｍｌの時に見られた。２．７ｍｇ／ｍｌ以下の濃度では
、ＨＩ　Ｖ感染を初期に僅かに阻害したのみであった。

第４表実験例４ｆ２）　１Ｂ胞接触を通じてのＨＩＶ惑染拡大の１１Ｉ
■−Ｉｇによる阻害効果：ＭＯＬＴ−４系次に、ＭＯＬＴ−４とＭＯＬＴ−４／ＨＴＬＶ−■、共
培養系に於いて、ＨＩＶ−１ｇが多核巨細胞の形成を阻
害するかどうかを調べた。

■ＨＩ　Ｖ感染細胞のＨＩＶ−１ｇによる処理ＭＯＬＴ
−４とＭＯＬＴ−４／ＨＴＬＶ−Ｉ［１ｍについては９
対１０割合で混ぜ、３Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整
後、各人にｌｓｌずつ分注した。この細胞混合溶液にＨ
ＩＶ−１ｇ検体を加えて培養した。その培養液は３日毎
に交換し、ＨＩ　’ｌ−１ｇもその凌毎に添加した。

■結果１１１Ｖ−１ｇを添加しない場合には、共培養開始２日
以内に多核巨細胞が出現し、５日後にはシャーレ全体を
占めた。ＨＩＶ−１［を添加した場合には、多核巨細胞
は実験期間中出現しなかった。

また、蛍光（Ｉ（ＩＶ抗涼）陽性細胞の割合は、２４日
間の実験期間中、約１０％のままだった。これは、最初
のＨＩ　Ｖ産生細胞の混合比率とほぼ同じだった。対照
的にｌＩ［Ｖ−１ｇを添加しない場合には、１０日以内
に蛍光陽性細胞の割合が９０％以上になった。ところが
、実験途中で培養液からＨＩ　Ｖ　−１ｇを抜くと、抗
原陽性の多核巨細胞が象、速に出現した。このことは、
ＨＩＶ−１ｇが常に培養液中に含まれていることが、Ｈ
Ｉ　Ｖの複製を阻止するのに必要であることを示唆して
いる。

特許出願人　株式会社　ミドリ十字手続補正書（自発）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）抗エイズウィルス抗体陽性免疫グロブリンを含む
画分を出発原料とする、以下の処理からなる抗エイズウ
ィルス抗体陽性静注用免疫グロブリン製剤の製造方法：（ａ）ｐＨ４〜６、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ
、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０００〜１０，０
００のポリエチレングリコール４〜１０ｗ／ｖ％で処理
して上清を回収する。（ｂ）（ａ）の上清をｐＨ６〜９、イオン強度０．００
０１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０
００〜１０，０００のポリエチレングリコール１０〜１
５ｗ／ｖ％で処理して沈澱を回収する。（ｃ）所望の工程で夾雑するウィルスが不活化するのに
充分な条件下、安定化剤の存在下で加熱処理する。
（２）（ｂ）の工程の後に、ｐＨ５〜８、イオン強度０
．０１〜０．２Ｍの条件下、固定化ヒト血液型物質で処
理して非吸着画分を回収する工程を含むことを特徴とす
る特許請求の範囲第（１）項記載の製造方法。
（３）（ｂ）の沈澱を水性溶媒に溶解し、ｐＨ５〜８、
イオン強度０．０１〜０．２Ｍの条件下、陰イオン交換
体で処理して非吸着画分を回収する工程を含んでなる特
許請求の範囲第（１）項記載の製造方法。