JPH11510151A - 日本脳炎ワクチンの工業的製造方法と、それによって得られるワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 下記段階(a)〜(f)からなる日本脳炎に対するワクチンの工業的製造方法：(a) 細胞株に由来する細胞を培養し、(b) 得られた細胞培養物にウィルス増殖培地の存在下で日本脳炎ウィルスを接種し、(c) 細胞でウィルスを増殖させ、(d) 細胞によって産生されたウィルスの懸濁液を構成するウィルス増殖培地を収穫し、(e) 少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィー段階とゲルパーミエーション段階とによってウィルス懸濁液を精製し、(f) 使用時まで確実に保存するためにウィルス懸濁液を医薬品の状態に処方する。細胞株から得た細胞を用いた培養で得られる日本脳炎ウィルスを含む、細胞ＤＮＡ含有率が100pg/doseである日本脳炎ワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】 日本脳炎ワクチンの工業的製造方法と、それによって得られるワクチン 本発明は、日本脳炎ウィルス(JEV)をベースにした日本脳炎予防ワクチン、特 に人間に対して使用可能なワクチンの製造方法に関するものである。 本発明はさらに、この方法によって得られるワクチンに関するものである。 日本脳炎ウィルスはカを伝達媒体とするウィルスで、極東の多くの国々および 世界の他の地域で日本脳炎として知られる深刻な感染症を引き起こす。 赤ん坊マウスの頭蓋内にJEVを注射し、感染した組織を収穫するという方法で 製造される日本脳炎に対するワクチンは公知である。この方法では得られた組織 乳濁液を一般にはプロタミンを用いた沈殿法で精製する。組織調製物を精製する ための他の方法、例えば限外ろ過、ろ過と遠心分離、ポリエチレングリコールを 用いた沈殿法などが文献に報告されている。これらの方法は互いに組み合わせる ことができ、あるいはゲル濾過またはセルロースサルフェートまたは架橋したポ リサッカライドサルフェートを用いたクロマトグラフィーと組み合わせることが 可能である（特公昭65-000,611号、特開昭53-133,627号、特開昭50-048,118号、 特開平2-223,531号、米国特許第4,725,546号、特開昭49-020,322号および特公昭 56-005,204号、特公昭67-025,408号）。 ウィルス性調製物は、世界保健機構が推奨するように、ホルムアルデヒドなど の化学薬品を用いた標準的な方法すなわち1/2000濃度のホルムアルデヒド中で+4 ℃に50〜60日間保持する長期不活性化によって不活性化される。これはこのよう な環境下ではそれ以上の温度でウィルスが不安定であるという理由による。 こうして得られる市販のワクチンは効果的であるが、調製、精製および不活性 化が難しく、コストがかかるという欠点がある。さらに、赤ん坊マウスの組織に 由来するコンタミナントによって副反応が起こり、用途が制限される。 従って、細胞株でのウィルスを増殖・伝搬させるより工業的な他の方法でワク チンが製造できることが望ましい。しかし、ワクチンを高度に工業化された方法 を用いて大量に製造することは頭蓋内で増殖することよりも困難である。これは 扱う量が多量になるということだけでなく、高い収量を達成するのが困難であり 、制御が難しく、さらに細胞またはウィルス増殖培地に由来する混入物による汚 染の危険と精製上の問題などの理由による。 日本脳炎ウィルスは細胞株、特にベロ細胞を含む種々の細胞培養で増殖可能で あるということは知られている。しかし、公知の培養方法では大規模な工業的培 養条件（安いコストで生産を可能にする唯一の条件）で満足の行く収量を達成す ることはできない。さらに、細胞株での増殖で得られたウィルス調製物を高度に 精製する方法は従公知文献には全く記載されていない。 本発明の目的は、上記の欠点を解決し、安全、迅速且つ経済的な条件で大規模 に実施できる非常に純度の高い効果的なワクチンを極めて高い工業的収量で得る ことが可能な日本脳炎に対するウィルスの製造方法を提供する点にある。 本発明の対象は下記段階(a)〜(f)からなる日本脳炎に対するワクチンの工業的 製造方法にある： (a) 細胞株に由来する細胞を培養し、 (b) 得られた細胞培養物にウィルス増殖培地の存在下で日本脳炎ウィルスを接種 し、 (c) 細胞でウィルスを増殖させ、 (d) 細胞によって産生されたウィルスの懸濁液を構成するウィルス増殖培地を収 穫し、 (e) 少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィー段階とゲルパーミエーショ ン段階とによってウィルス懸濁液を精製し、 (f) 使用時まで確実に保存するためにウィルス懸濁液を医薬品の状態に処方する 。 本発明の一つの特徴は、播種に用いるウィルス量が感染効率0.1以下に相当す る点にある。従って、ウィルスの増殖に関する収率が高い。 本発明の他の特徴は、本発明の方法では精製段階(e)の前または後にウィルス 懸濁液の不活性化段階を含む点にある。従って、ウィルスの増殖に病原性株を用 いても不活性化ワクチンを製造することが可能になる。 本発明方法の一つの特色は不活性化が化学薬品を用いて室温で行われる点にあ る。従って、不活性化を迅速に行うことができる。 本発明方法の一つの実施例では、確実にウィルス増殖を行うためにベロ細胞株 を使用する。ベロ細胞は日本脳炎ウィルスに対して非常に許容であるので、高い 収量を得ることが可能になる。 本発明方法の実施例ではウィルス懸濁液を下記段階(1)〜(3)で精製するので非 常に高純度のワクチンを得ることができる： (1) イオン交換クロマトグラフィー (2) 吸着クロマトグラフィー (3) ゲルパーミエーション 本発明方法の他の実施例では、収穫段階(d)の後に新しいウィルス増殖培地を 再び導入し、ウィルスが増殖するのに十分な時間の後に再びウィルス増殖培地か ら収穫する。従って、同じ細胞培養から多量の収穫物を得ることができる。 本発明の他の対象は、株化細胞に由来する細胞上で培養を行うことによって得 られる日本脳炎ウィルスを含有し、細胞ＤＮＡ含有率が100pg/doseであることを 特徴とする日本脳炎ワクチンにある。 本発明のワクチンは、ウィルス性混入物および蛋白質の両方の観点で、ウィル スと接触する可能性のある全ての人に組織的に投与する上で必要な効力と安全を 有している。 本発明の上記以外の目的および利点は説明の下記説明から理解できよう。 本発明の細胞培養は発酵槽を用いるか、伝統的なフラスコ（ルー(Roux)皿、回 転フラスコ、マルチトレー(Multitray、登録商標)、セルキューブ(Cell Cube、 登録商標)等）を用いて行うことができるが、細胞培地とともにマイクロキャリ アを入れた大容量発酵槽(500〜2000リットル)を用い、その中に日本脳炎ウィル スに対して許容的な細胞株から取った細胞の種菌を入れるのが好ましい。この細 胞株はBHK21(Baby Hamster Kidney)細胞またはベロ細胞にすることができる。 マイクロキャリアは発酵槽内で懸濁液中での培養を可能にする。この用途のマ イクロキャリアは種々知られているが、ベロ細胞を培養するのに特に好適なもの としては濃度1〜3g/lのサイトデックス(Cytodex 1、登録商標)粒子を挙げること ができる。時間、温度、その他の培養条件、特に培養培地の組成はサイトデック ス マイクロキャリア上のベロ細胞の種類に応じて決定される。細胞増殖を良好にし 、培養の静止期より前にウィルスを播種できるようにするには4日間が適当であ る。その後、培地をウィルス増殖培地に変え、感染効率(MOI)の値が低くなるよ うに算出した量の日本脳炎ウィルスの種菌を発酵槽内に導入する。感染効率とは 発酵槽内に存在する細胞の数に対する導入したウイルス粒子量の割合である。 この感染効率は約0.1以下、好ましくは0.01以下にする。 使用するウィルス株は弱毒株、例えばSA 14-14-2または病原性免疫源性株、例 えばナカヤマ(Nakayama)またはベイジン(Beijing)株にすることができる。NVSI( National Vaccine and Serum Institute,Beijing)から提供される第88継代の株P 1は本発明の条件に適している。 ウィルス増殖に使用する培地は通常の培地、例えばMEMなどであり、この培地 中では蛋白質の量をできるだけ少なくすることが重要である。蛋白質（通常ヒト アルブミン）濃度が5g/l以下の培地を使用するのが好ましい。蛋白質を全く含ま ない培地を使用するのも同様に好ましい。 ウィルス増殖に必要な期間は感染力価をモニタリングすることによって決定さ れ、LD50/ml力価が約10⁷〜10⁸になった時点でウィルスの収穫が可能と見なされ る。収穫は細胞によって産生されたウィルスを含むウィルス増殖培地を回収する ことで行われる。ウィルス増殖培地を回収後、再び新しい培地を発酵槽に導入し てさらにウィルスを増殖させ、次の収穫を行うことができる。このように、本発 明では同じ発酵槽で同一細胞培養物から連続８回の収穫を行うことが容易にでき る。LD 50m/lの検査値が10⁷〜10⁸に達するのに必要なウィルス増殖期間は一般に ２〜３日である。最初の収穫はウィルス接種から３日後に行い、続いて２〜３日 置きに収穫するのが好ましい。 従って、発酵槽内でのサイクルが完了するまでの23日間を次の様に分けること ができる： D0 発酵槽内でマイクロサポート上で細胞の培養を開始する。 D4 細胞用培地をウィルス増殖用培地に変え、ウィルスを接種する。 D7 １回目の収穫 D9 ２回目の収穫 D11 ３回目の収穫 D14 ４回目の収穫 D16 ５回目の収穫 D18 ６回目の収穫 D21 ７回目の収穫 D23 ８回目の収穫 得られた各収穫物は個別または混合物して処理することができる。この処理は 精製のみまたは精製および不活性化で構成され、不活性化は精製段階の前後のい ずれかに行うことができる。 開始時点で用いたウィルス株が病原性株の場合、不活性化は必須の段階である が、ウィルス増殖に用いた株が減弱株、例えばSA-14-14の場合には不活性化段階 を省略するか、可能最大限安全な条件で行うことができる。 本発明では不活性化は化学薬品を用いて室温で行うことができる。室温とはJV Eの不活性化で通常用いられる温度である+4℃よりもはるかに高い温度を意味す る。この温度は20〜37℃にすることができ、好ましくは約25℃にすることができ る。実際、この温度でウィルスが急速に不活性化されることが分かっており、さ らに、驚くべきことにウィルス増殖培地に含まれるウィルスが高温にもかかわら ず安定であることが確認されている。活性化の時間が非常に短いことは工業的観 点で本発明方法の重要な利点である。 不活性化に使用する化学薬品はホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトン であり、ホルムアルデヒドが好ましい。不活性化は例えばホルムアルデヒドを用 いて25℃または37℃で14日間またはそれ以下の期間行うが、この時間は少なくと も７日間にするのが好ましい。本発明では使用するホルムアルデヒドの濃度はJE Vの不活性化で通常用いられる濃度よりも低くすることができ、例えば約1/2,000 〜1/8,000、特に1/4,000にすることができる。 ２種類の異なる化学薬品を用いて不活性化段階を逐次行うこともできる。 この不活性化段階の前に各収穫物を濾過して細胞片（タンパク質、核酸など） を除去することもでき、さらにそれぞれを濃縮してウィルス力価および液体培地 の蛋白質含有量を高めることもできる。濃縮倍率は少なくとも10、例えば約1000 にする。濃縮は通常の手段、特に限外濾過によって行うことができる。 ウィルス懸濁液は採用方法に応じて不活性化し、精製する。本発明の重要な特 徴は精製段階が少なくとも１つのクロマトグラフィー段階を含む点にある。好ま しくは下記３段階を連続して行う： (1)イオン交換クロマトグラフィー (2)吸着クロマトグラフィー (3)ゲルパーミエーション イオン交換クロマトグラフィーは強または弱陰イオンのクロマトグラフ交換で あるのが好ましい。使用する担体は、例えば選択的にウィルス粒子を保持し、混 入物である蛋白質を通過させるバイオセプラ社(Bioscpra,USA)のDEAEスフェロデ ックス(DEAE-Spherodex、登録商標)である。 その後、ウィルスを含む溶出液を例えばハイドロキシアパタイトまたはキレー ト化ゲル（カルシウムキレートなど）の担体上に通す。この場合、ウィルスは担 体に結合せず、担体は核酸を保持する。 この段階の後、ゲル濾過または分子ふるい（ゲルパーミエーションともよばれ る）を行う。その好ましい担体は例えばファルマシア社(Pharmacia)のセファロ ース(Scpharose6FF、登録商標)またはメルク社(E.Merch)のフラクトゲル(Fracto gel、登録商標)である。この操作では、溶出によって最初の画分にウィルス粒子 が回収され、その後の溶出ピークはウィルス性蛋白質または残留不純物に相当す る。従って、ワクチン製造のためには溶出液の最初の画分のみを保存すればよい 。 吸着クロマトグラフィーとゲル濾過との間にカットオフ閾値が10,000ダルトン の膜を用いて限外濾過による濃縮操作をするこのが好ましい。 精製(および必要に応じて不活性化)したウィルス懸濁液は次に配合操作で所望 の抗原力価にする。安定化剤またはアジュバントを添加することもできる。さら に、使用時まで良好な条件で保存できる製剤の形にする。実施例 1.材料 ベロ細胞 ： 発酵槽に播種するためのベロ細胞はベロ細胞バンクから入手した第137継代の もので、このバンクはその特徴および品質保証に必要な全てのチェックを受けた ものである。JEV ： 使用したウィルス株はNVSIより供給された第88継代のP₃株である。 入手したウィルスのバイヤルを100mlの培地に懸濁し、0.1μｍのフィルターを 用いて濾過する。この溶液を用いて75cm²フラスコ２本を感染させる。５日後、 回収した上澄みを濾過する（0.2μｍフィルター）。複数の収穫物が得られ、そ の一時接種バッチを構成する混合物のLD50/ml力価は10^8.16であった。10mlの一 次接種バッチを用いて850cm³の回転フラスコ12本を感染させて作業用接種バッチ を調製する。複数の収穫物が得られ、30.2リットルの混合物のLD50/ml力価は10^{8 .31} である。 次に、一次接種バッチと作業用バッチとをチェックし、それらの特性および品 質を確認する。 2.培養プロセス 500リットル容の発酵タンクを、3g/lの濃度でサイトデックス(Cytodexl、登録 商標)のマイクロキャリアを含むベロ細胞用培地で満たす。培地にベロ細胞の種 菌を播種する(200,000cells/ml)。 細胞を付着させ、４日間増殖させる。４日後、培地をウィルス性増殖培地に変 える。 感染効率MOIが1/500になるように計算した量のウィルスの種菌をタンクに導入 する。温度37℃で各種の培養物を調製する。ウィルス接種の３日後にウィルス増 殖培地を回収し、最初の収穫物を得る。ウィルス増殖培地を新しい培地で置き換 え、一日おきに収穫を行って、合計６個の収穫物を得る。 各収穫毎に得られる力価を表１に示す。 収穫物を濾過膜（孔直径：0.2μｍ）を用いて濾過する。 全ての収穫物を混合する。 混合した収穫物を10,000ダルトンの膜を用いた限外濾過で100倍に濃縮する。 濃縮した収穫物の混合物にホルムアルデヒド溶液を添加して最終濃度1/4000に し、得られた混合物を連続的に撹拌しながら14日間、室温（20℃〜25℃）に保つ 。 さらに濾過を行って、WHO手順(Technical Report 771、1988)に準じた２段階 チェックによって不活性化を確認する。その結果、ホルムアルデヒドを用いて不 活性化した全ての調製物が満足なものであることが証明された。 不活性化した溶液をｐＨ８で平衡化されたDEAE基を含むイオン交換クロマトグ ラフィーカラム（DEAEスフェロデックス樹脂）にかける。ウィルスはカラム上に 保持される。リン酸緩衝液で洗浄後、リン酸緩衝液（0.2M NaCl）を用いてウィ ルスを溶出させる。この操作でほとんどの蛋白質混入物が除去される。 溶出液をファルマシア社のキレーティングセファロースカラム(Chelating Sep harose、登録商標)に通して、カルシウムの相互作用によるキレート化アフィニ ティによって溶出液を精製する。ウィルスは結合せず、カラムを通過する。 次に、カットオフ閾値が10,000Daの膜を用いた限外濾過によって濃縮して、ウ ィルス懸濁液の量を約20分の１にする。 予備精製したウィルスの濃縮液をセファロース6FFカラムに導入し、0.2MのNaC lを含むリン酸緩衝液を用いて溶出する。ウィルス粒子は追い出された画分中に 溶出する。 上記の精製プロセスの特徴を表２に示す。 (^*)段階的収量 精製および不活性化されたウィルス溶液をD0とD7に注射してマウスを免疫処理 した。毒性ウィルスを用いた試験は10⁵LD 50/mlを含む溶液を用いて30日目に行 った。希釈なしの精製調製物を用いてワクチン接種したマウスと、1/32希釈した 精製調製物を用いてワクチン接種したマウスとの全て保護された。同じ試験でビ ーケン(Biken)ワクチン（1/32希釈）を用いてワクチン接種したマウスではその2 /5だけが保護された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 エマンダンジェ，ピエール フランス国 69008 リヨン リュ バタ イユ 35 ル モンセギュ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 下記段階(a)〜(f)からなる日本脳炎に対するワクチンの工業的製造方法： (a) 細胞株に由来する細胞を培養し、 (b) 得られた細胞培養物にウィルス増殖培地の存在下で日本脳炎ウィルスを接種 し、 (c) 細胞でウィルスを増殖させ、 (d) 細胞によって産生されたウィルスの懸濁液を構成するウィルス増殖培地を収 穫し、 (e) 少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィー段階とゲルパーミエーショ ン段階とによってウィルス懸濁液を精製し、 (f) 使用時まで確実に保存するためにウィルス懸濁液を医薬品の状態に処方する 。 ２． 播種に用いるウィルス量が感染効率0.1以下に相当する請求項１に記載の 方法。 ３． 精製段階(e)の前または後にウィルス懸濁液の不活性化段階を行う請求項 １または２に記載の方法。 ４． 不活性化を化学薬品を用いて室温で行う請求項１〜３のいずれか一項に記 載の方法。 ５． ウィルス増殖に用いる細胞がベロ細胞である請求項１〜４のいずれか一項 に記載の方法。 ６． 下記操作で精製を行う請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法： (a) イオン交換クロマトグラフィー (b) 吸着クロマトグラフィー (c) ゲルパーミエーション。 ７． 収穫段階(d)の後に、新しいウィルス増殖培地を再び導入し、ウィルスが 増殖するのに十分な時間をおいてから再びウィルス増殖培地の収穫を行う請求項 １〜６のいずれか一項に記載の方法。 ８． ウィルス増殖培地を収穫して新しい培地で置き換える操作を１〜７回行う 請求項７に記載の方法。 ９． 段階(d)の後に収穫したウィルス懸濁液を濾過する請求項１〜８のいずれ か一項に記載の方法。 10． ウイルス増殖培地の蛋白質濃度が5g/l以下である請求項１〜９のいずれか 一項に記載の方法。 11． 細胞株に由来する細胞で培養して得られる日本脳炎ウィルスからなる、細 胞ＤＮＡ含有率が100pg/doseであることを特徴とする日本脳炎ワクチン。