CN116554281A - 一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法 - Google Patents
一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116554281A CN116554281A CN202210115510.8A CN202210115510A CN116554281A CN 116554281 A CN116554281 A CN 116554281A CN 202210115510 A CN202210115510 A CN 202210115510A CN 116554281 A CN116554281 A CN 116554281A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- foot
- mouth disease
- virus
- capsid protein
- disease virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 title claims abstract description 61
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 title claims abstract description 44
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 56
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 28
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 75
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 26
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 15
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 15
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 15
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 7
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 claims description 6
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 6
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 abstract 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 10
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000005029 sieve analysis Methods 0.000 description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 4
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 4
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 3
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010091324 3C proteases Proteins 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000640813 Homo sapiens Sodium-coupled neutral amino acid transporter 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000716973 Homo sapiens Thialysine N-epsilon-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710107904 NADH-ubiquinone oxidoreductase subunit 9 Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101800001491 Protease 3C Proteins 0.000 description 1
- 101710132845 Protein P1 Proteins 0.000 description 1
- 102100020926 Thialysine N-epsilon-acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
- C12N2770/32123—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
- C12N2770/32151—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法，所述纯化方法包括如下步骤：将含有P1‑2A的融合蛋白用3C和TEV蛋白酶进行酶切，以得到酶切液；再将所述酶切液通过镍柱进行镍柱纯化，得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体；然后可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒VLPs。本发明的纯化方法纯化后纯度能达到90％以上，得率也在95％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染的动物疫病，是偶蹄动物的一种急性烈性传染病，该传染病可快速远距离传播。猪、牛、羊等偶蹄类动物易感。国际动物卫生组织(OIE)将该传染病列在法定上报的动物传染病之首，我国也将其排在一类动物传染病的首位。
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的，该病毒属于RNA单链病毒。目前，根据血清型划分共分为：A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3 7个血清型，虽然各型病毒引起的发病症候相同，但各血清型间无交叉免疫，病后康复或免疫动物仍可感染其它血清型病毒而发病。
FMDV呈二十面体对称结构，直径25nm，内含由约8500核苷酸组成的正极性的单链RNA分子。该RNA分子编码的蛋白如图1所示，其中在成熟过程中，蛋白质P1在2A辅助下被蛋白酶3C剪切成称作VP0、VP1和VP3的三个蛋白质。VP0、VP1和VP3的单拷贝形成5S原体，5个拷贝的5S原体随后形成了12S五聚体，12个12S五聚体组装成二十面体对称的75S空衣壳。5S原体形成以后，在RNA包衣壳过程中，VP0裂解成VP4和VP2。但在RNA分子不出现在病毒衣壳内部时，也可以形成病毒衣壳，该病毒空衣壳也可称为口蹄疫病毒样颗粒(VLP)。
目前，传统疫苗都是病毒灭活疫苗，但这些疫苗在口蹄疫的防治中存在着很多不足，主要表现在：难于进行感染动物和免疫动物的鉴别诊断；在疫苗的生产过程中，大量增殖自然病毒，需要严格的防范病毒扩散的设施，但是仍然存在病毒逃逸和病毒灭活不完全而散毒的可能性。
口蹄疫病毒样颗粒(VLP)具有与完整病毒相同的免疫学特性，但不存在散毒的风险，因而利用各种表达系统生产FMDV的空衣壳一直是国内外研究的热点。
在CN109601007B中公开了先用中空纤维柱超滤浓缩含有口蹄疫VLP，然后用梯度蔗糖溶液超速离心纯化得到口蹄疫VLP，或者超滤浓缩液用两次柱层析，第一次用Sepharose 6 FF柱，第二次用CaptoQ ImpRes离子交换层析柱得到纯化的VLP，梯度蔗糖溶液超速离心纯化不利于规模化生产，并且工艺繁琐，另外用两次层析纯化的方法，同样操作过程繁琐，并且蛋白得率也不高。
在CN110777160A中公开了，含有P1-2A的细胞裂解上清液先用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白初步纯化，然后用亲和色谱层析纯化，得到P1-2A，然后3C蛋白酶酶解，得到酶解液在20mM磷酸缓冲液pH8.0、150mM NaCl中透析组装形成口蹄疫病毒样颗粒，然后进行分子筛色谱纯化，分子筛纯化上样量较少，不利于规模化生产。
在CN104404074B中公开了将获得带SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP3，VP1，VP0)样品在4℃酶切12小时后进行下一步的分子筛色谱纯化，分子筛纯化上样量较少，不利于规模化生产。
在CN110981946A中公开了用大肠杆菌表达，镍柱纯化获得带有sumo标签的三种蛋白smtVP0、smtVP3、和smtVP1，然后加入小泛素样修饰蛋白酶进行酶切，再通过用8～20k膜包循环透析组装病毒样颗粒。该方法使用膜包透析的方法，不能够有效去除酶切后的sumo标签及小泛素样修饰蛋白酶，可能对产品质量产生影响。
在CN101914501B中公开了通过大肠杆菌表达带有sumo标签的三种蛋白，镍柱纯化后通过小泛素样修饰蛋白酶进行酶切，再经镍柱去除小泛素样修饰蛋白酶，并通过透析的方法进行病毒样颗粒的组装，透析的方法不适合规模化生产。
综上所述，在现有技术中，对于口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP0，VP1，VP3)的纯化，操作复杂，不利于规模化生产，并且纯度和得率不高。
发明内容
在现有技术的基础上，本发明为了克服现有技术中存在的诸多缺陷，提供了一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法，所述纯化方法包括如下步骤：1)将含有P1-2A的融合蛋白用3C和TEV蛋白酶进行酶切，以得到酶切液；2)再将步骤1)中所述酶切液通过镍柱进行镍柱纯化，得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体；3)将步骤2)中所述口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体在脱盐柱去除咪唑可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒VLPs。
在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，步骤1)中，加入所述3C蛋白酶的质量为所述含有P1-2A的融合蛋白总质量的5～10％，优选7％；加入TEV蛋白酶的量为所述含有P1-2A的融合蛋白总质量的4-6％，优选为5％。
在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，步骤1)中，所述含有P1-2A的融合蛋白为TF-TEV-P1-2A-6Arg-6His融合蛋白或TF-TEV-P1-2A-6Arg融合蛋白。
在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，步骤2)中，所述镍柱填料为GE FF NiSepharose 6 Fast Flow、Cytiva FF Ni Sepharose 6 Fast Flow、Ni-TED purose 6 FastFlow。
在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，步骤2)中，在所述酶切液通过镍柱GEFF Ni Sepharose 6 Fast Flow或Cytiva FF Ni Sepharose 6 Fast Flow、后，还包括用低浓度的咪唑洗脱液洗脱镍柱，得到含有口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体的洗脱液；其中，所述低浓度咪唑洗脱缓冲液为含有10mM-50mM咪唑的50mM磷酸缓冲液。
在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，所述磷酸缓冲液为NaH2PO4，pH＝7.4，0.5M NaCl。
在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，所述低浓度咪唑洗脱缓冲液中咪唑的浓度为20～30mM。
在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，将所述含有口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体的洗脱液进一步进行透析浓缩，去除咪唑，得到的口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体；所述5S原体在通过脱盐柱去除咪唑可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒VLPs。
在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，步骤2)中，在所述酶切液通过镍柱Ni-TED purose 6 Fast Flow后，还包括收集含有口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体的流穿液。
在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，所述流穿液可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒VLPs。
在现有技术的基础上，本发明为了克服现有技术中存在的诸多缺陷，意外发现口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP0，VP1，VP3)可和特定的镍柱亲和结合，并且用低浓度的咪唑就可洗脱下来，且纯化后纯度能达到90％以上，得率也在95％以上，还可以清除内毒素；解决了现有技术中，操作复杂不利于规模化生产，且纯度及得率不高的问题。
附图说明
图1表示FMDV的分子结构。
图2表示SDS-PAGE检测TF-TEV-P1-2A-6Arg-6His融合蛋白酶切后的结果。
图3表示SDS-PAGE检测TF-TEV-P1-2A-6Arg-6His融合蛋白酶切纯化后的结果。
图4表示采用GE FF填料后，目的蛋白在各阶段的分布。
图5表示20mM咪唑洗脱液(透析前)取样分子筛分析结果，显示在17.5处出峰，即为口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体。
图6表示20mM咪唑洗脱液(透析后)取样分子筛分析结果，显示在17.5处出峰，即为口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体。
图7表示经组装后取样分子筛分析结果。
图8表示采用TED填料后，目的蛋白在各阶段的分布。
图9表示电镜检测纯化后口蹄疫病毒样颗粒的检测结果。
图10表示含有SUMO助溶蛋白，采用GE FF填料后，目的蛋白在各阶段的分布。
图11表示含有SUMO助溶蛋白，经纯化后组装后取样分子筛分析结果。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
使用试剂均为国产市售产品。
根据CN2021111316714.X专利申请制备得到的TF-TEV-P1-2A-6Arg-6His或者TF-TEV-P1-2A-6Arg融合蛋白。
TEV酶制备：具体制备方法参见文献(Tropea JE1,Cherry S,Waugh DS，Expression and Purification of Soluble His6-Tagged TEV Protease.Methods MolBiol.2009；498:297-307)。
3C蛋白酶制备：具体制备方法参见文献(James R.Birtley,Stephen R.Knox,etal,Crystal Structure of Foot-and-Mouth Disease Virus 3C Protease.THE JOURNALOF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.280,No.12.11520–11527,2005)。
实施例1 TF-TEV-P1-2A-6Arg-6His融合蛋白酶切
收集根据CN2021111316714.X专利申请制备得到的TF-TEV-P1-2A-6Arg-6His融合蛋白，根据融合蛋白总质量，加入7％(w/w)的3C蛋白酶和5％(w/w)的TEV酶，混合后在30±1℃酶切16±2h小时，得到酶切液，进行下一步镍柱纯化。
酶切的鉴定：分别取3C蛋白酶、TEV蛋白酶、酶切前样品和酶切后样品各20μl,分别加入5μl的5×loading buffer混匀，煮沸10min，然后各取5μl点样于12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，80V恒压跑浓缩胶，120V恒压跑分离胶，随后以考马斯亮蓝染色显示电泳条带，电泳结果见图2所示，其中M为Marker，1是3C蛋白酶对照，2是TEV蛋白酶对照，3是酶切前样品，4是酶切后样品。从图2中可知，前体蛋白P1-2A酶切完整，酶切后口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP0，VP1，VP3)稳定。
实施例2酶切液镍柱(GE FF Ni Sepharose 6 Fast Flow、Cytiva FF NiSepharose 6 Fast Flow)纯化
在大量的实验摸索的前提下，我们发现酶切后不含有6His标签的口蹄疫衣壳蛋白(VP0，VP1，VP3)能够与镍柱(GE FF Ni Sepharose 6 Fast Flow或Cytiva FF NiSepharose 6 Fast Flow，生产厂家：厂家为江苏千纯生物科技有限公司)结合，并且用低浓度的咪唑(一般浓度在10mM～50mM，本优先实施例中使用的是20mM～30mM)就可洗脱下来，所述低浓度的咪唑洗脱液为含有10mM～50mM咪唑的50mM磷酸缓冲液。所述磷酸缓冲液为NaH2PO4，pH＝7.4，0.5M NaCl。并且纯化后纯度能达90％以上，得率也在95％以上，且还可以去除内毒素，如图3所示。酶切后样品纯化具体步骤如下：镍柱平衡后，将酶切后的样品进行上样，然后用50mM磷酸缓冲液冲洗平衡，再用20mM～30mM咪唑洗脱缓冲液(50mM磷酸缓冲液，20mM～30mM咪唑)洗脱目的蛋白，即可得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体。
结果鉴定：取镍柱纯化后的蛋白20μl，加入5μl的5×loading buffer混匀，煮沸10min，然后取5μl点样于12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，80V恒压跑浓缩胶，120V恒压跑分离胶。随后以考马斯亮蓝染色显示电泳条带，电泳结果见图3，其中1是Marker，2是镍柱纯化后的蛋白。
由图3电泳结果可知，酶切产物经镍柱纯化能完全分离TF伴侣蛋白，酶切后口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP0，VP1，VP3)纯度在90％以上，通过计算，酶切纯化后得率在95％以上，基本没有损失(通过比较纯化前后目的蛋白的摩尔比)，并且内毒素含量合格。
从图4可以看出，酶切后口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP0，VP1，VP3)主要由低浓度的咪唑洗脱液洗脱得到。
从图5和图6可以看出，酶切后的目的蛋白自动组装成5S原体。
组装：将洗脱后的样品通过脱盐柱去除咪唑后，可自行进行VLPs组装，得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒(VLPs)，分子筛分析图谱见图6，根据图谱VLPs的出峰位置在8.3左右，VLPs的含量63.4％；并且得到的VLPs稳定，在37.5℃下仍可保持VLPs，不解聚，保持活性。
实施例3：TF-TEV-P1-2A-6Arg融合蛋白酶切
如实施例1的条件对TF-TEV-P1-2A-6Arg融合蛋白进行酶切，得到含有口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP0，VP1，VP3)的酶切液。
实施例4：酶切液镍柱(Ni-TED purose 6 Fast Flow)纯化
酶切后口蹄疫衣壳蛋白(VP0，VP1，VP3)通过镍柱(Ni-TED purose6 Fast Flow，生产厂家：厂家为江苏千纯生物科技有限公司)后，存在于流穿中，但TF伴侣蛋白、TEV蛋白酶、3C蛋白酶及其他杂蛋白能够与镍柱(Ni-TED purose 6 Fast Flow)结合，因此流穿中目的蛋白纯度能达90％以上，得率也在90％以上，如图7所示。酶切后样品纯化具体步骤如下：镍柱平衡后，将酶切后的样品进行上样，并收集流穿液。
结果鉴定：取镍柱纯化后的流穿蛋白20μL，加入5μl的5×loading buffer混匀，煮沸10min，然后取5μl点样于12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，80V恒压跑浓缩胶，120V恒压跑分离胶。随后以考马斯亮蓝染色显示电泳条带，电泳结果见图8。
由图8电泳结果可知，酶切产物经镍柱纯化能完全分离TF伴侣蛋白，酶切后口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP0，VP1，VP3)纯度在90％以上，通过计算，酶切纯化后得率在90％以上。还有少部分挂柱，可以用低浓度咪唑洗脱液洗脱，但经检测内毒素有超标。
组装：流穿液可自行进行VLPs组装，得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒(VLPs)；并且得到的VLPs稳定，在37.5℃下仍可保持VLPs，不解聚，保持活性。
实施例5电镜检测纯化后口蹄疫病毒样颗粒检测
取组装后的口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP0，VP1，VP3)样品10μL加到200目的铜网上，吸附1min后用滤纸吸去多余的样品，超纯水清洗二次，1％醋酸双氧铀清洗一次后负染1min。用透射电镜观察，如图9所示的结果显示：在制得样品中90％以上都形成了VLP，直径约为30nm左右，其中单个颗粒数目较少，多数病毒样颗粒以二聚体，三聚体和多聚体形式存在。
实施例6亚单位疫苗制备及免疫实验
6.1ISA 201VG佐剂(购自法国SEPPIC公司)疫苗制备
水相准备：根据疫苗中目的蛋白含量，使用PBS(或生理盐水)将目的蛋白稀释适当浓度，即为水相。油相准备：根据制备疫苗总量，按照抗原相和佐剂重量比为1:1，体积比为46:54，量取适量ISA 201VG佐剂。乳化：将水相和油相都预热到33℃，将水相缓缓加到油相中，200～500rpm搅拌20～30min，于20℃静置1h置于4℃过夜。分装、贮存：根据需要进行分装，检合格后于4℃保存备用。
6.2免疫实验
参见6.1制备3种浓度的疫苗，分别为疫苗1(30μg/头份)、疫苗2(60μg/头份)、疫苗3(100μg/头份)。
根据2015版《中华人民共和国兽药典》三部第53页的安全检验和效力检验的方法对上述3种疫苗进行检验，由于口蹄疫病毒为国家管制病毒，故效力检验没有做攻毒实验，仅检测了一免28天的中和抗体。
安全检验结果：免疫后的豚鼠和猪只均正常，没有因疫苗免疫而引起的死亡或明显的局部或全身不良反应；因此，这3批疫苗均是安全的。
效力检验结果：中和抗体检测结果如下表所示，以中和抗体≥1:32为保护的判定标准计算疫苗免疫后的PD50，其中疫苗1的PD50为6.4，疫苗2和疫苗3的PD50均为7.6，都能达到目前国家口蹄疫疫苗效检标准(PD50≥6)，因此，这三批疫苗效检都是合格的，且疫苗2和疫苗3的保护率一致，均比疫苗1要好；另外，从效价高低来看，随着免疫剂量的增大，效价有所提高，但幅度不明显，特别是疫苗2和疫苗3；因此综合考虑成本和效果，选择疫苗2作为理想的疫苗进行后续研究和工业化生产。
对比例：SUMO-TEV-VP0/SUMO-TEV-VP1/SUMO-TEV-VP3纯化
根据CN101914501B制备得到SUMO-TEV-VP0/SUMO-TEV-VP1/SUMO-TEV-VP3的融合蛋白，如实施例1的条件进行酶切，得到含有口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP0，VP1，VP3)的酶切液。
如实施例2的条件对酶切后的样品进行镍柱纯化，得到的口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP0，VP1，VP3)纯度在90％以上，见图10。
组装：将洗脱后的样品通过脱盐柱去除咪唑进行VLPs组装，得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒(VLPs)，分子筛分析图谱见图11，根据图谱VLPs的出峰位置在8.6左右，VLPs的含量15.7％，还有大量的5S原体未能组装成VLPs，得到的VLPs在37.5℃下解聚，不能保持VLPs形态。
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。
Claims (10)
1.一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括如下步骤：
1)将含有P1-2A的融合蛋白用3C蛋白酶和TEV蛋白酶进行酶切，以得到酶切液；
2)再将步骤1)中所述酶切液通过镍柱进行镍柱纯化，得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体；
3)将步骤2)中所述口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒VLPs。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1)中，加入所述3C蛋白酶的质量为所述含有P1-2A的融合蛋白总质量的5～10％，优选7％，加入TEV蛋白酶的量为所述含有P1-2A的融合蛋白总质量的4-6％，优选为5％。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述含有P1-2A的融合蛋白为TF-TEV-P1-2A-6Arg-6His融合蛋白或TF-TEV-P1-2A-6Arg融合蛋白。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述镍柱填料为GE FF NiSepharose 6Fast Flow、Cytiva FF Ni Sepharose 6Fast Flow、Ni-TED purose 6FastFlow。
5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤2)中，在所述酶切液通过镍柱GEFF Ni Sepharose 6Fast Flow或Cytiva FF Ni Sepharose 6Fast Flow后，还包括用低浓度的咪唑洗脱液洗脱镍柱，得到含有口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体的洗脱液；其中，所述低浓度咪唑洗脱缓冲液为含有10mM～50mM咪唑的50mM磷酸缓冲液。
6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液为NaH2PO4，pH＝7.4，0.5M NaCl。
7.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述低浓度咪唑洗脱缓冲液中咪唑的浓度为20～30mM。
8.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，将所述洗脱液进一步进行透析换液去除咪唑，得到的口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体，然后可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒VLPs。
9.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤2)中，在所述酶切液通过镍柱Ni-TED purose 6Fast Flow后，还包括收集含有口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体的流穿液。
10.根据权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，所述流穿液可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒VLPs。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210115510.8A CN116554281A (zh) | 2022-01-30 | 2022-01-30 | 一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210115510.8A CN116554281A (zh) | 2022-01-30 | 2022-01-30 | 一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116554281A true CN116554281A (zh) | 2023-08-08 |
Family
ID=87497139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210115510.8A Pending CN116554281A (zh) | 2022-01-30 | 2022-01-30 | 一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116554281A (zh) |
-
2022
- 2022-01-30 CN CN202210115510.8A patent/CN116554281A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11091519B2 (en) | Purification of virus like particles | |
| CN104404074B (zh) | 口蹄疫病毒衣壳蛋白串联共表达和病毒样颗粒的制备方法 | |
| JP2019068846A (ja) | ウイルス様粒子の精製 | |
| US6149917A (en) | Industrial production process for a vaccine against Japanese encephalitis virus and vaccine produced | |
| CN111471103A (zh) | 一种新冠病毒（2019-nCOV）的异源抗体及其制备方法 | |
| JPH10504033A (ja) | インフルエンザウィルスの調製方法と、それによって得られる抗原と、抗原の利用 | |
| WO2018119746A1 (zh) | 重组ev71病毒样颗粒的纯化及其疫苗制备方法 | |
| KR101617464B1 (ko) | Ｉｐｖ―ｄｐｔ 백신 | |
| CN111249456A (zh) | 一种狂犬病病毒灭活疫苗的纯化方法 | |
| WO1987006939A1 (en) | Process for isolating and purifying p. falciparum cs protein vaccine expressed in recombinant e. coli | |
| CN116554281A (zh) | 一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法 | |
| CN108715607B (zh) | 重组霍乱毒素b亚基蛋白、pedv灭活疫苗及制备与应用 | |
| JP6664014B2 (ja) | 口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法 | |
| CN111575249A (zh) | 新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法 | |
| WO2024183695A1 (zh) | 一种纯化病毒样颗粒的方法和用途 | |
| CN109529031A (zh) | 一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置 | |
| CN114276423B (zh) | 猪传染性胃肠炎病毒的s蛋白突变体及其应用 | |
| CN107893058A (zh) | 一种去除疫苗制品中内毒素的方法 | |
| Schneider | Concentration and purification | |
| JP2024500618A (ja) | ＣＲＩＳＰＲ技術によって複合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン候補を設計するための汎用バクテリオファージＴ４ナノ粒子プラットフォーム | |
| AU2013242822B2 (en) | Virus like particle purification | |
| CN118291400A (zh) | 基于原核表达的嵌合PCV2中和表位的PCV3 VLPs及其制备和应用 | |
| FR2737412A1 (fr) | Procede de production d'un vaccin contre le virus de l'encephalite japonaise et vaccin obtenu par ce procede | |
| JP2005325132A (ja) | 静注用免疫グロブリン製剤の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Country or region after: China Address after: 312366 No. 1, Baichuan Road, Binhai New Area, Shaoxing City, Zhejiang Province Applicant after: Zhejiang Hailong Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 312366 No. 1, Baichuan Road, Binhai New Area, Shaoxing City, Zhejiang Province Applicant before: NOVO BIOTECH Corp. Country or region before: China |
|
| CB02 | Change of applicant information |