JPH10504033A - インフルエンザウィルスの調製方法と、それによって得られる抗原と、抗原の利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 濃縮、精製、断片化の各段階を含み、必要に応じて不活化段階をさらに含む、インフルエンザウィルスを含む液体から純粋なインフルエンザ抗原を調製する方法において、Ａ．精製段階で濾過段階を間にはさんで複数回の超遠心分離操作を行うか、Ｂ．生きたウィルスの断片化段階を両親媒性の非イオン性洗剤の存在下で行った後に、濾過してウィルス構成要素の全てを回収するとともに好ましくない物質を除去するか、あるいはこれら２つの段階を任意の順序で行う。

Description

【発明の詳細な説明】 インフルエンザウィルスの調製方法と、 それによって得られる抗原と、抗原の利用 本発明は、不活化インフルエンザワクチンの製造や診断用ウィルス抗原の製造 において簡単に実施することが可能な、生きたインフルエンザウィルスを断片化 してその感染力を失わせる方法に関するものである。 インフルエンザウィルスは、エンベロープを有する螺旋対称の一本鎖ＲＮＡを 有するウィルスで、オルソミクソウィルス科に属する。公知の抗原は主として下 記の構造蛋白質によって表される： ＮＰ：ウィルスＲＮＡに関連するキャプシドの核蛋白質 Ｍ ：エンベロープの「マトリクス」蛋白質 ＰＡ：ウィルスＲＮＡに関連するポリメラーゼ ＨＡ：エンベロープ表面上に存在するヘマグルチニン（赤血球凝集素）蛋白質 ＮＡ：表面のノイラミニダーゼ酵素蛋白質 核蛋白質および蛋白質ＭはＡ型とＢ型のウィルスに特異的な内部抗原であり、 ヘマグルチニンとノイラミニダーゼとがウィルスＡのサブタイプを決定する。 ヘマグルチニンはウィルスの構成要素中最も抗原性の高い糖蛋白質であり、イ ンフルエンザワクチン中のウィルス抗原量を表すためにヘマグルチニンの含有率 が用いられる。しかし、現在では全てのウィルス抗原が免疫応答の刺激に関与す ること、そして細胞を媒介とする応答においては内部抗原が中心的な役 割を果たすことが分かってる。 核蛋白質（ＮＰ）は細胞毒性を有するＴリンパ球（ＣＴＬ）の主たる標的抗原 であるが、人間ではヘマグルチニンに特異的なＣＴＬは検出されていない。 ウィルスを断片化することによってエンベロープを破壊し、ウィルスの抗原部 位ＮＰ、Ｍ、ＲＮＡ、ウィルスポリメラーゼ、ＨＡおよびＮＡの全てを放出させ ることができる。 従って、この方法で得られるワクチンは非常に免疫原性が高く、表面抗原のみ （これはウィルス構成要素の３６％に過ぎない）を含むワクチンを用いた場合よ りも強い血清変換を引き起こす。 また、断片化されたウィルス粒子を含むワクチンはウィルス粒子そのものを含 むワクチン（アレルギーの原因になり易い）よりも許容度が高い。 現在用いられている断片化法は溶剤／洗剤処理、例えばポリソルベート／麻酔 エーテルまたはポリソルベート／クロロホルム等を含む方法（Pasteur Institut e(Adamowicz-Muller)の米国特許第 4,522,809号）である。 この方法を工業的規模で行うには適当な場所と装置が必要になる。例えばエー テルの場合には防火設備を備えた装置が必要であり、クロロホルムの神経向性毒 性に対してはオペレータを特別に防護する必要がある。 別の方法は、予め不活化したウィルスに洗剤、蛋白分解酵素または胆汁酸塩を 使用するものである。この方法は主として内部抗原を含まないサブユニットワク チンの製造で表面サブユニット（ＨＡおよびＮＡ）を製造するのに用いられる。 例えば特許第DD 155875 号ではデオキシコール酸ナトリウムを使用し、米国特許 第 4,327,182号では界面活性剤を使用し、フランス国 特許第 2,483,779号では非イオン性洗剤を使用している。 本発明は、溶媒を用いずに室温で純粋な生きたインフルエンザウィルスを断片 化することができる容易に実施可能な方法を提供する。本発明方法は洗剤と好ま しくない物質とを除去することによって完全に定義された等張な緩衝イオン性環 境中にウィルス断片化物を含むようにしたものである。 本発明方法では、精製されたインフルエンザウィルス懸濁液の感染力価を大幅 に低下でき、採用する操作条件、例えば濃度および洗剤とインフルエンザウィル スとの接触時間に応じて、完全に不活化された状態と同程度まで低下させること ができる。 本発明の対象は、濃縮、精製、断片化の各段階を含み、必要に応じて不活化段 階をさらに含む、インフルエンザウィルスを含む液体から純粋なインフルエンザ 抗原を調製する方法において、 Ａ．精製段階で濾過段階を間にはさんで複数回の超遠心分離操作を行うか、 Ｂ．生きたウィルスの断片化段階を両親媒性の非イオン性洗剤の存在下で行った 後に、濾過してウィルス構成要素の全てを回収するとともに好ましくない物質を 除去するか、 あるいはこれら２つの段階を任意の順序で行うことを特徴とする方法にある。 本発明方法の好ましい具体例では、使用するインフルエンザウィルスは例えば 哺乳類細胞すなわちサル、ハムスターまたは豚の腎臓細胞またはフェレットある いはマウスの細胞、あるいは胚由来の細胞、人間の肺組織またはひよこの胚の繊 維芽細胞由来の細胞等の感受性宿主細胞上での培養で得られる。 工業的なワクチン製造で最も一般的な系は孵化鶏卵であり、 この系を採用するのが好ましい。 従って、本発明の他の対象は孵化鶏卵で培養してインフルエンザウィルスを得 る上記方法にある。 受精卵の選択は注意深く行わなければならず、専用に確保された健全な農場よ り入手したものでなければならない。それらを37.8℃（100°Ｆ）の培養器に９ 〜12日間入れ、尿嚢にインフルエンザウィルスを接種する前に、卵をろうそくの 光に透かして胚の成長および胚の生存を確認する。 その後、最適条件でウィルスに感染させるために、温度および湿度を制御した 培養インキュベータ中で２〜３日間卵を培養する。これらの条件はインフルエン ザの株と使用したウィルス種に依存する。５±３℃に急冷して培養を停止する。 その後、感染した卵から多量のウィルス粒子を含む尿嚢液を取り出す。 こうして得られたウィルスを含む尿嚢液は迅速に精製して不純物、例えばオバ ルブミンを含む蛋白質、レシチン、バクテリア等を除去しなければならない。そ のためには回収した材料を遠心分離して上澄液を取り、限外濾過で20倍まで濃縮 してからウィルスの精製を行う。 ウィルス精製操作は当業者に周知で、濾過、超遠心分離またはアフィニティー クロマトグラフィー等の分離法を使用することかできる。これらの操作でインフ ルエンザウィルスは濃縮される。 生きたインフルエンザウィルスを精製するのが好ましいということか分かって いる。すなわち精製前に不活化するとウィルスの蛋白質と不純物との間に不可逆 的な化学架橋が多数生じる危険性があり、これは精製効率にとって致命的な欠点 になる。本発明で生きたインフルエンザウィルスの精製物を得る目的は このためである。 本発明方法で用いる精製法は帯域（sonal）超遠心分離である。この超遠心分 離は密度勾配、好ましくはショ糖密度勾配を付けたものが好ましいが、塩化セシ ウムの密度勾配を付けたものでもよい。遠心分離は90,000Ｇ程度の加速度で行う のが好ましく、連続的あるいはバッチで順次行うことができる。従って、ウィル ス粒子は寸法、密度、形状に応じて分離され、ウィルスを含む画分のみを回収す る。 使用するローターの種類に応じて動的回収（遠心分離中）するか、勾配を再配 向（reorientation）させた後に静的回収（停止中）する。 本発明方法は複数の超遠心分離段階を含み、連続した２回の遠心分離の間には 濾過操作を含むのが好ましい。濾過操作は１回の濾過または複数回の濾過操作を 意味し、最後の濾過は孔径か0.3μｍ程度、好ましくは約0.5μｍ、例えば0.45μ ｍにすることができる。 本発明のこの手順を生きたインフルエンザウィルスに適用することによって、 孵化鶏卵で培養したインフルエンザウィルス株を工業的に再現性良く精製するこ とができる。 ウィルスの断片化操作の前に、濃縮された精製ウィルスの懸濁液を必要に応じ て希釈して、処理すべきサンプルの蛋白質濃度を示す吸光度（ＯＤ）が一定とな るように規格化する。最終濃度は例えば１mlあたり200〜1,000μｇの蛋白質にす るのが好ましい。滅菌した緩衝液、例えばＰＢＳ（燐酸緩衝生理食塩水）を用い て希釈するのが好ましい。 本発明のさらに別の対象は、精製操作と断片化操作との間に蛋白濃度を調節す る規格化（stndardisation）段階を行うことを 特徴とする方法にある。 ウィルスの断片化は精製され（必要に応じて規格化され）た生きたウィルスの 懸濁液に両親媒性（amphiphile）の非イオン性洗剤を室温（20℃〜25℃）で添加 することによって行う。この洗剤は下記一般式で表される物質が好ましい： （ここで、Ｒはオクチルまたはノニル基を表し、ｎは３以上の整数を表す） 上記一般式で表される物質としては以下の市販品を挙げることができる： 特に、両親媒性の非イオン性洗剤であるTrlton X-100またはオクトキシノール ９が好ましい。 断片化反応は攪拌しながら例えば少なくとも１時間接触させて行うが、さらに 長時間、例えば24時間継続することもできる。断片化は通常、制御された周囲環 境領域で室温で行う。 この断片化段階でウィルスの構成要素が分離され、ウィルスのエンベロープが 破壊され、内部の構成要素、特に細胞介在免疫応答への関与が知られている唯一 の抗原であるＮＰおよびＭ抗原が媒体中に放出される。また、表面抗原（ＨＡ、 ＮＡ）部分も媒体中に放出される。処理後の粒径分布から分かることはウィルス 懸濁液には断片化されたウィルス以外のものがほとんど含まれず、従って、ヒト 用の断片化インフルエンザウィルスについての欧州薬局方基準を満足している。 断片化を洗剤を除去することによって停止する。 好ましくない物質の除去は、ウィルス断片生成物を保持し、洗剤分子およびそ の他の非ウィルス性溶質は通過させるような多孔度を有するフィルター膜を用い て行う。このフィルター膜の選択は最も小さいフリーの抗原単位の寸法と分子量 とによって行う。 フリーのヘマグルチニンは分子量210キロダルトンのトリマー（モノマー：７ ０キロダルトン）である。その除去操作は、多孔度が100キロダルトン以下、好 ましくは約50キロダルトンの膜を用いて平行濾過（tangential filtration）で 行う。サンプルはこの限外濾過中に10〜30容積の無菌等張緩衝液、好ましくはＰ ＢＳを用いて透析（diafiltration）される。 本発明のさらに他の対象は、ウィルス構成要素の大部分を保持することが可能 なフィルター膜を用いて、緩衝溶液で断片化ウィルスの懸濁液を洗浄する透析濾 過法によって好ましくない物質の除去を行う方法にある。 透析濾過によって好ましくない物質を除去した後、断片化ウィルスの懸濁液を 適当な体積まで濃縮する。この体積はＯＤ測定によって標準的なウィルス濃度に 合わせることができる。 この処理後にウィルス不活化試験を行うと、断片化処理法によって精製された ウィルス懸濁液の感染力価が大きく低下し、インフルエンザウィルスの種類（Ａ またはＢ）に関係なく完全に不活化された状態と同程度にまで低下することが分 かる。 本発明のさらに他の対象は、精製されたインフルエンザウィルスを完全に不活 化するような条件で断片化する方法にある。 ウィルス不活化は当業者には公知の方法で不活化剤（ホルムアルデヒド、β− プロピオラクトン）を必要に応じて添加することによって終わらせることができ る。 得られたワクチンには必要に応じて保存料、その他任意の添加剤（アジュバン ト）を添加することができる。 本発明のさらに他の対象は、段階Ａまたは段階ＡとＢに従って行われることを 特徴とする上記方法にある。 本発明はさらに他の対象は下記ａ)〜ｄ)を特徴とする生きたインフルエンザウ ィルスを含む尿嚢（allantoique）液の濃縮物から精製されたインフルエンザ抗 原を調製する方法にある： ａ)ウィルスを含む濃縮物を帯域超遠心分離、好ましくはショ糖濃度勾配を付け た帯域超遠心分離で精製し、回収された材料を濾過、好ましくは孔径0.3μｍま で濾過し、超遠心分離を繰り返し、 ｂ)精製したウィルス懸濁液を水性緩衝液に希釈して規格化し、 ｃ)規格化された生成物にオクトキシノール９を添加して断片化し、次いで緩衝 溶液を用いた限外濾過によって透析して好ましくない物質を除去し、 ｄ)必要な場合には、ウィルス懸濁液の不活化を好ましくはホルムアルデヒドを 用いて行う。 本発明のさらに他の対象は、上記方法で得られる医薬品としてのウィルス断片 と、上記方法で得られた精製済のインフルエンザ抗原のヒトおよび動物のインフ ルエンザワクチン製造への利用と、上記方法で得られた精製済のインフルエンザ 抗原の診断医薬としての利用とにある。 上記方法で得られたインフレンザ抗原を用いるワクチンの調製および診断試験 は当業者に公知の方法で行うことかできる。 以下、本発明の実施例を説明するが、下記実施例は本発明の保護範囲を限定す るものではない。実施例 １．ウィルス培養 A/H3N2 A/Beijing 32/92 X 117株を11日目の孵化鶏卵に接種し、35℃の孵卵器 に72時間保存する。尿嚢液を回収し、遠心分離および濾過で精製する。透明にな った尿嚢液は限外濾過によって濃縮し、クエン酸緩衝液で安定化させる。 ２．精製 蔗糖濃度勾配（10〜55％）を付けた帯域超遠心分離（35,000rpm）によってウ ィルス濃縮物を精製する。操作は連続流で行う。回収されたウィルス画分は約80 0mlである。蔗糖濃度は約40％である。回収された材料を0.45μｍまで濾過し、 濾液を洗浄して最終懸濁液の量を15リットルにする。同じ作業条件で超遠心分離 操作を再度実施する。 ３．ウィルス断片化 ２度目の精製後、ウィルス懸濁液（1010ml）を滅菌したＰＢＳ緩衝液に希釈し て規格化し、蛋白質濃度を200〜1,000μｇ／mlにする。規格化後のウィルス懸濁 液の量は2000mlである。感染力価は10¹⁰ID₅₀／ml以上である。 ウィルスの断片化は、磁気攪拌棒を用いて攪拌しながら実験室温度で10ml（0. 5％ v/v）のオクトキシノール９（Triton X-100）を無菌状態で添加することに よって行う。 １時間接触させた後、凝集が見られるウィルス懸濁液を遠心分離で分離う、50 kDのメンブレンと20リットルの等張リン酸緩衝液（ＰＢＳ）とを用いて限外濾過 し、容積一定となるまで無菌状態で透析する。 透析濾過終了後のサンプルは洗剤および蔗糖を含まず（100分の１に減少）、 断片化後の感染力価は10^1.2ID₅₀／mlまで低 下しており、これは１時間の処理で10⁹分の１以下に低下することを示す。別の 実施例ではウィルス／洗剤接触時間を延長する（２時間以上）ことによって断片 化されたウィルス懸濁液の完全な不活化を行うことができた。 本実施例では不活化をホルムアルデヒド（0.01％ vol/vol）の添加で終了する 。 得られたワクチンを0.2μｍのフィルタに通し、メチオレート（0.01％ w/v） を添加した。 この試験では力価が137μｇHA／mlであるA/Beijing 32/92 X 117の一価抗体ワ クチン13,000mlが得られる。 ヘマグルチニン（赤血球凝集素）およびノイラミニダーゼ蛋白質の免疫学的完 全性（immunological integrity）の確認によって抗原の品質を評価したが、国 際スペック（欧州薬局方）を満足するものであった。 さらに、調製物をヒトおよび動物（マウス）に投与してそのワクチン特性を確 認したところ、インフルエンザワクチンの臨床評価基準による免疫防護を誘導す る血清変換が得られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ジェルディル，カテリーヌ フランス国 69130 エキュリ シュマン ピエール−デュポン 31 (72)発明者 シャルモー，エルヴェ フランス国 69260 シャルボンニエール シュマン ドゥ ラルエット 17 (72)発明者 マクヴェリー，パトリック アメリカ合衆国 18360 ペンシルバニア ストラウズバーグ ノートン ロード 206

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．濃縮、精製、断片化の各段階を含み、必要に応じて不活化段階をさらに含む 、インフルエンザウィルスを含む液体から純粋なインフルエンザ抗原を調製する 方法において、 Ａ．精製段階で濾過段階を間にはさんで複数回の超遠心分離操作を行うか、 Ｂ．生きたウィルスの断片化段階を両親媒性の非イオン性洗剤の存在下で行った 後に、濾過してウィルス構成要素の全てを回収するとともに好ましくない物質を 除去するか、 あるいはこれら２つの段階を任意の順序で行うことを特徴とする方法。 ２．両親媒性の非イオン性洗剤としてオクトキシノール９を使用する請求項１に 記載の方法。 ３．段階Ａか、ＡおよびＢの両方の段階を実施する請求項１または２に記載の方 法。 ４．精製段階と断片化段階との間に、蛋白質濃度を調整する規格化段階を行う請 求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 ５．好ましくない物質の除去段階を、ウィルス構成要素の大部分を保持可能なフ ィルター膜を用い且つ緩衝溶液で断片化ウィルスの懸濁液を洗浄する透析濾過法 で行う請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 ６．断片化段階を精製後のインフルエンザウィルスを完全に不活化できる条件で 行う請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 ７．精製段階が２回の帯域超遠心分離操作と、その間に回収された精製材料を少 なくとも0.3μｍ、好ましくは約0.5μｍの孔径で濾過する濾過操作とを含む請求 項１〜６のいずれか一項に記載の方法。 ８．生きたインフルエンザウィルスを含む尿嚢液濃縮物から精製されたインフル エンザ抗原を調製する方法において、 下記工程を特徴とする方法： ａ) ウィルスを含む濃縮物を帯域超遠心分離、好ましくはショ糖濃度勾配を付け た帯域超遠心分離で精製し、回収された材料を濾過し、好ましくは孔径0.3μｍ まで濾過し、次いで、帯域超遠心分離を繰り返し、 ｂ) 精製したウィルス懸濁液を水性緩衝液に希釈して規格化し、 ｃ) 規格化された生成物にオクトキシノール９を添加して断片化し、次いで緩衝 溶液を用いた限外濾過によって透析濾過して好ましくない物質を除去し、 ｄ) 必要に応じて、ウィルス懸濁液の不活化を、好ましくはホルムアルデヒドを 用いて、行う。 ９．孵化鶏卵の培養でインフルエンザウィルスを得る請求項１〜８のいずれか一 項に記載の方法。 10．請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法で得られる医薬 品としてのウィルス断片。 11．請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法で得られる精製インフルエンザ抗 原のヒトおよび動物用インフルエンザワクチン製造での利用。 12．請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法で得られる精製インフルエンザ抗 原の診断医薬の製造での利用。