JP2009527242A - 特定の無菌状態の鳥類の卵およびトリの改善された生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特定の無菌状態のトリの改善された飼育方法に関する。具体的には、本発明は、親ドリの腹部から滅菌様式で取り出された卵(無菌状態のものである)の孵化率および生存率を上昇させるための方法に関し、そしてさらに、特定の無菌状態の鳥類の卵の生産にも関する。
特許文献1は、インビトロでの鳥類胚の培養技術を記載し、卵の胚発生をいくらか詳細に記載する。この明細書は、胚がその殻から取り出された後に、密閉された容器内で胚を保温することに関する。実際は、この明細書において、使用される容器は、好ましくは、培養のために同じ種から選択されたか、または、本発明の観点から、同様の雌鶏に由来する卵殻の一部である。この発明は、家禽の遺伝子操作に関するものであるが、また、鳥類の発生の基本的な機構の研究にも関する。同様に、特許文献2は、雌鶏の受精させた卵子のインビトロ培養方法を開示し、この方法においては、まさに受精させたばかりの胚が産卵後約1時間以内に雌鶏の卵管の有頭骨の上側部分から取られ、その後、培養される。しかし、これらの明細書は共に、単に、卵の人工培養を開示するだけであり、本発明の目的については取り扱わない。
本発明は、特定の無菌状態のトリを飼育する改善された方法に関する。具体的には、本発明は、未成熟卵が排出腔に入る前にその殻内にある状態で取り出され、そして、本発明に従って滅菌のままであることを確実にするために使用され得る特定の技術の用途に関する。
(a)トリを親ドリとして飼育する工程;
(b)以下:
(i)未成熟卵が親ドリの排出腔へと移動する前に、親ドリの生殖管内での未成熟卵の位置を決定する工程;ならびに
(ii)殻形成および石灰化の点から未成熟卵の発生段階を決定することによって、必要とされるレベルの卵殻形成および石灰化が起こっている時点を確定する工程
により、親ドリから未成熟卵を取り出すべきタイミングを決定する工程
を包含する。
a)トリを親ドリとして飼育する工程;
b)以下:
i.未成熟卵が親ドリの排出腔へと移動する前に、親ドリの生殖管内での未成熟卵の位置を決定する工程;ならびに
ii.殻形成および石灰化の点から未成熟卵の発生段階を決定することによって、必要とされるレベルの卵殻形成および石灰化が起こっている時点を確定する工程
により、親ドリからその殻内にある状態の未成熟卵を取り出すべきタイミングを決定する工程;
c)必要とされるレベルの卵殻形成および石灰化が起こり、未成熟卵が親ドリの排出腔へと移動する前に、その殻内にある状態の未成熟卵を親ドリから取り出す工程;ならびに
d)その殻内にある状態の未成熟卵を保温し、未成熟卵を孵化させて、卵からトリを孵す工程
を包含する。
排出腔は、トリの体内の主な汚染領域である。排出腔は、トリの消化系および生殖系の両方に連結された房であり、従って、卵と糞便とが排出腔内に同時に存在し得る。主として、卵は、排出腔に入る前は、汚染物質を含まない。しかし、卵殻は短時間多孔性となるので、卵が排出腔に入る際の外部の汚染が大きな問題となる。したがって、本発明は、滅菌性および無菌状態を維持しつつ未成熟卵を親ドリから取り出すためには特定の方法が必要とされることを認識している。
側腹部切開を行い、そして、縫合糸を用いてトリの卵管を両端で結紮する工程;
各縫合糸から遠位に離れた位置で卵管を切断する工程;
卵を卵管中に包まれた状態で取り出す工程;
卵管を滅菌する工程;
卵を取り出す工程;および
卵を滅菌する工程。
トリの皮膚に切開をつくる工程;
子宮を表面へと操作する工程;
子宮に切開をつくり、そして、卵および子宮を取り出すか、または、子宮をクランプ留めし、そして卵を取り出す工程。
本発明の方法に従って提供されるような、同じかまたはより高いレベルの汚染物質を含まない状態を有する卵から孵ったトリを収容する工程;
卵から孵ったトリを用いて卵を産ませる工程;および
別の滅菌環境に卵を移動させる工程
を包含する。
方法
既知のSPF状態の50羽の成体の雌および5羽の成体の雄のニワトリの1つの群れを、選択した食餌で維持し、自然繁殖させた。2週間の期間にわたり、各雌について個々に、産卵(egg laying)(産卵(oviposition))の時期を記録した。卵を産む平均日数(時間、L)を各雌について計算した。L−3hの日数を計算し、L−3からLまでの時間を、取り出し間隔とみなした。この間隔は、各トリにおいて最も発生が進行した卵を取り出すために、無菌外科的開腹術を行う時点であった。
生育できるニワトリを、人工的に取り出した卵から首尾よく孵化させた(孵化率>50%、より頻繁に>90%)。サンプリングしたニワトリからは、嫌気性細菌も好気性細菌も単離されなかった。
ニワトリにおける無菌有精卵の人工的な生産のための安全な方法が確立された。卵は生育可能であり、そして、生育可能な無菌のニワトリを生産した。これらのトリは、隔離装置内で首尾よく維持された。欧州特許出願第01650109号に開示される上記方法は、明らかに、無菌のヒナの生産を可能にした。しかし、この方法を繰り返し使用すると、結果が大きく変動し、そしてしばしば、比較的低い孵化率(例えば、<30%)をもたらした(これは、一般に、商業的には容認できない)ことが示された。
2年の期間にわたって行った一連のさらなる研究は、実施例1の方法を改善および洗練するために、実施例1のプロトコールに従って行った。
予想される産卵と、親ドリからの卵の滅菌外科的取り出しとの時間の差の、卵の生存率および滅菌率、ならびに外科手術操作の容易さに対する影響。
孵化率:
対照(自然に産まれた卵)、85〜100%の孵化率、80〜100%の滅菌率;
麻酔または安楽死から30分以内に子宮から取り出した卵、13〜40%の孵化率、80〜100%の滅菌率;
安楽死から60分後に子宮から取り出した卵、14%の孵化率、80〜92%の滅菌率。
対照、適用不可;
上述のとおり30分、良好、組織は容易に持ち上がった;
上述のとおり60分、困難、組織は持ち上がりにくかった(早期の死後硬直)。
時間設定した産卵 対 触診 対 これらの技術の組み合わせの、完全な殻 対 柔らかい殻を有する卵の割合に対する、生存率(通常、孵化の時点で生存するヒナ)に対する、ならびに、外科手術操作の容易さに対する、影響。
時間設定のみ、柔らかい殻でかつ取り出しに適切な卵がない割合8〜71%、生存率13〜50%、滅菌率75〜100%、外科手術操作の容易さ、可変;
触診のみ、柔らかい殻でかつ取り出しに適切な卵がない割合13〜71%、生存率13〜54%、滅菌率89〜100%、外科手術操作の容易さ、良好;
触診と組み合わせた時間設定、柔らかい殻でかつ取り出しに適切な卵がない割合10〜23%、生存率14〜57%、滅菌率92〜100%、外科手術操作の容易さ、良好。
経卵巣細菌およびマイコプラズマ感染の排除、ならびに、胚およびその後のヒナの生存率および滅菌率に対する、抗生物質(例えば、経口投与されたフルオロキノロン)の影響。
抗生物質なし、生存率22〜60%および滅菌率86〜92%;
抗生物質あり、生存率13〜57%および滅菌率89〜100%。
安楽死と卵の取り出しとの間の時間(0〜180分)の、生存率および操作の容易さ、孵化率および滅菌率に対する影響。
滅菌率 100%、
操作は、30分後には次第に困難になった。
孵化率は、安楽死から60分後、40分後および20分後に取り出した卵について、20%、40%および80%であった(各時間ごとにn=10)。
実施例2A〜2Dにおける研究からの結果を再考すると、取り出した卵の最大の孵化率と微生物学的な滅菌率とは、時間設定した産卵と手での触診との組み合わせに基づくと、安楽死させたトリで達成される可能性が高いようであり(麻酔をかけたトリは、操作がより困難であった)、この場合、卵は、安楽死させた後可能な限り迅速に(15〜30分以内)取り出され、そして、卵殻は堅く、かつ十分に形成されている(卵の成熟が十分に進み、柔らかい殻の卵はない)ことが示唆された。取り出した未成熟卵について最適な保温条件を規定するために使用した他のデータに基づいて、保温の最初の18日間は、低い(約25%)相対湿度を選択した。以下に概説するこの方法は、確認研究であり、この研究において、実施例2で同定した全ての変動要因を、これらの変動要因間の相互作用を評価するのに最適の様式でまとめた。
7つの連続する群に分けた、既知のSPF状態の合計180羽の成体の雌の繁殖用ニワトリ(種々の年齢および遺伝子型)を、選択した食餌で維持し、そして、自然に繁殖させた。時間設定および触診の組み合わせを用いて、トリの腹部からの卵の取り出しに最適な時間を決定した。
人工的に取り出した未成熟卵から、生育能力のあるニワトリを首尾よく孵化させた。サンプルからは、嫌気性細菌も好気性細菌も単離されなかった。(安楽死前9日間に親ドリによって自然に産まれた卵は、86%の生育能力のあるヒナの孵化率を有した。このことは、雌により産まれた卵における自然な繁殖力が正常またはより高いレベルであることを確認するものである)
7つの群の無菌卵の孵化率は、60%(15羽中9羽)〜77%(22羽中17羽)の範囲にわたり、平均は74%であった。
ニワトリにおいて無菌の有精卵を人工的に生産するための安全かつ効率的な方法を確立した。卵は生育可能であり、そして、生育可能な無菌のニワトリをもたらし、これらのニワトリを隔離装置内に首尾よく維持した。この研究は、7つの連続するニワトリの群れにわたって多数の卵を用いて、先に記載した無菌の有精卵を生産するための方法と比較して、取り出した卵の孵化率における変動が少ないことと、100%の一貫した無菌の微生物学的状態とは、十分に成熟した卵を有するトリを選択し(自然に産まれる時点に近い時点;産卵の時間設定と触診との組み合わせに基づいて選択)、雌性の親ドリから卵を迅速に取り出し(安楽死または麻酔の開始から15〜30分)、次いで、約25%のRH(自然に産まれる卵よりかなり低い)で保温することによって達成され得ることを確認した。
Claims (43)
- 親ドリから取り出された場合に無菌状態の卵の孵化率および生存率を高めるための方法であって、該方法は、親ドリから、その殻内にある状態の未成熟卵を取り出す前に滅菌環境において行われ、そして、以下:
(a)トリを親ドリとして飼育する工程;
(b)以下:
(i)該未成熟卵が該親ドリの排出腔へと移動する前に、該親ドリの生殖管内での該未成熟卵の位置を決定する工程;ならびに
(ii)殻形成および石灰化の点から該未成熟卵の発生段階を決定することによって、必要とされるレベルの卵殻形成および石灰化が起こっている時点を確定する工程
により、該親ドリから該未成熟卵を取り出すべきタイミングを決定する工程
を包含する、方法。 - 前記工程(b)が、観察方法および/または物理的方法の組み合わせによって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記物理的方法が、腹部および骨盤の触診、超音波診断法、X線診断法ならびに/またはMRI診断法を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記方法が、前記親ドリから前記未成熟卵を取り出す前に、該親ドリの骨盤から出る前の該未成熟卵の位置を決定することを可能にする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記未成熟卵が前記親ドリの胸骨の尾側面と坐骨隆起との間の実質的に中間にあるかどうかの決定を可能にする、請求項4に記載の方法。
- 前記観察方法が、経時的に前記親ドリの産卵パターンを監視および記録して、該卵が遠位の生殖管および排出腔へと移動する推定時間を導き出す工程を包含する、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 滅菌環境で無菌状態のトリを飼育する方法であって、
a)トリを親ドリとして飼育する工程;
b)以下:
i.未成熟卵が該親ドリの排出腔へと移動する前に、該親ドリの生殖管内での該未成熟卵の位置を決定する工程;ならびに
ii.殻形成および石灰化の点から該未成熟卵の発生段階を決定することによって、必要とされるレベルの卵殻形成および石灰化が起こっている時点を確定する工程
により、該親ドリからその殻内にある状態の該未成熟卵を取り出すべきタイミングを決定する工程;
c)該必要とされるレベルの卵殻形成および石灰化が起こり、該未成熟卵が該親ドリの排出腔へと移動する前に、その殻内にある状態の該未成熟卵を該親ドリから取り出す工程;ならびに
d)その殻内にある状態の該未成熟卵を保温し、該未成熟卵を孵化させて、卵からトリを孵す工程
を包含する、方法。 - 前記工程(b)が、観察方法および/または物理的方法の組み合わせにより行われる、請求項7に記載の方法。
- 前記物理的方法が、腹部および骨盤の触診、超音波診断法、X線診断法ならびに/またはMRI診断法を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記方法が、前記親ドリから前記未成熟卵を取り出す前に、該親ドリの骨盤から出る前の該未成熟卵の位置を決定することを可能にする、請求項7〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記未成熟卵が前記親ドリの胸骨の尾側面と坐骨隆起との間の実質的に中間にあるときに、該未成熟卵が取り出される、請求項10に記載の方法。
- 前記観察方法が、経時的に前記親ドリの産卵パターンを監視および記録して、該卵が遠位の生殖管および排出腔へと移動する推定時間を導き出す工程を包含する、請求項7〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記未成熟卵の取り出しが、該卵が前記親ドリの前記排出腔へと自然に移動する時間よりも前であるが、該移動時間に可能な限り近い時点において行われる、請求項7〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記生殖管内にある間に前記未成熟卵を感染させる微生物を取り除く工程をさらに包含する、請求項7〜13のいずれかに記載の方法。
- 請求項14に記載の方法であって、以下:
i.前記生殖管内にある間に前記未成熟卵を感染させる標的微生物を識別する工程;
ii.フルオロキノロン、セファロスポリンおよびマクロライド系抗菌剤のような該標的微生物と闘うのに適切な抗菌剤を選択する工程;ならびに
iii.前記親ドリおよび/または卵中の該未成熟卵に該抗菌剤を投与する工程
を包含する、方法。 - 前記生殖管内での前記未成熟卵の感染が、経卵巣経路で起こる、請求項14または15のいずれかに記載の方法。
- 前記抗菌剤の投薬量レベルが、卵内で決定される、請求項14〜16のいずれかに記載の方法。
- 前記親ドリが屠殺、安楽死または麻酔され、前記工程(c)における前記未成熟卵の取り出しが、該親ドリの屠殺、安楽死または麻酔の時点から約30分未満で行われる、請求項7〜17のいずれかに記載の方法。
- 前記親ドリが、全て同一条件下で飼育された同種のトリの群れから選択される、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- 前記親ドリが、既存の同種の汚染物質を含まない状態のトリの群れから、滅菌環境下で自然に孵化される、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜20のいずれかに記載の方法であって、前記親ドリが、制御された条件下での適切な選択および自然な飼育方法により生産された、別の汚染物質を含まない状態のトリの群れのうちの一羽であり、該方法が、異なる汚染物質を含まない状態のトリを生産するために使用される、方法。
- 請求項7〜21のいずれかに記載の方法であって、前記卵から孵ったトリが群れの一部を形成し、該卵から孵ったトリが孵化された後、該卵から孵ったトリのサンプルが取り出され、そして、特定の汚染物質について検査され、該群れの該汚染物質を含まない状態の指標を提供する、方法。
- 請求項7〜22のいずれかに記載の方法であって、前記特定の汚染物質を含まない状態が、前記卵から孵ったトリにおいて達成されず、該卵から孵ったトリが該方法において親ドリとして使用される、方法。
- 前記卵が前記親ドリの腹部から外科的に取り出される、請求項7〜23のいずれかに記載の方法。
- 請求項24に記載の方法であって、以下:
i.前記トリの皮膚に切開をつくる工程;
ii.該トリの子宮を表面へと操作する工程;
iii.該子宮に切開をつくって前記卵を取り出すか、または、該子宮をクランプして該卵を取り出す工程
を包含する、方法。 - 請求項7〜25のいずれかに記載の方法であって、前記麻酔、安楽死または屠殺した親ドリからの前記未成熟卵の取り出しが、滅菌環境下で行われ、そして、該手順の滅菌性が、該手順全体を通じて確認される、方法。
- 請求項7〜26のいずれかに記載の方法であって、前記卵から孵ったトリが、卵を産ませるために前記滅菌環境から取り出され、次いで、該卵が孵化されて、さらに卵からトリを孵す、方法。
- 請求項7〜27のいずれかに記載の方法であって、前記卵から孵ったトリが、前記滅菌環境から取り出され、そして、正常な腸の微生物叢を含む食餌を与えられる、方法。
- 前記トリがニワトリである、請求項1〜28のいずれかに記載の方法。
- 請求項7〜29のいずれかに記載の方法であって、トリが、前記特定の汚染物質を含まない状態を持つ卵から孵ったトリから孵化され、かつ卵から孵ったトリでない場合、こうして産まれた該トリは、同等かまたはより低いレベルの汚染物質を含まない状態の卵から孵ったトリのその後の受精のために、滅菌環境で飼育される、方法。
- 無菌状態の卵を滅菌環境中に提供する方法であって、以下:
i.請求項7〜30のいずれかに記載の方法に従って提供されるような同等かまたはより良い無菌状態を持つ卵から孵ったトリを飼育する工程;
ii.該卵から孵ったトリを用いて卵を産ませる工程;および
iii.該卵を別の滅菌環境へと取り出す工程
を包含する、方法。 - 前記卵が産卵後直ちに取り出され、そして、該卵の殻が滅菌される、請求項31に記載の方法。
- 請求項31または32に記載の方法に従って生産される、卵。
- 請求項33に記載の卵から孵化された、トリ。
- 請求項7〜30のいずれかに記載の方法に従って孵化された、トリ。
- 請求項7〜30のいずれかに記載の方法に従って飼育された、卵から孵ったトリによって産卵された卵から孵化された、トリ。
- ワクチン、抗体、モノクローナル抗体、線維芽細胞、血清学的試験用のタンパク質および/もしくは抗原、または、他の類似のタンパク質生成物のような、治療用および予防用の生物学的物質の生産における、請求項31〜32のいずれかに従って生産される卵の使用。
- ワクチンの生産における請求項37に記載の使用であって、前記卵に選択したウイルス株が注入され、次いで、該卵が保温されてウイルスを生成し、そして、そこから生成された該ウイルスがワクチンを形成する、使用。
- 前記卵が外来性タンパク質を生成する、請求項37に記載の使用。
- 治療法および予防法において使用するための、請求項1〜32のいずれかに記載の方法により生産された卵を用いて調製された、生物学的生成物。
- ワクチン、抗体、モノクローナル抗体、線維芽細胞、血清学的試験用のタンパク質および/もしくは抗原、または、他の類似のタンパク質生成物である、請求項40に記載の生物学的生成物。
- 前記生成物がワクチン、好ましくは、インフルエンザウイルスのためのワクチンである、請求項41に記載の生物学的生成物。
- 請求項7〜30のいずれかに記載の方法に従う、トリのストックを補充するための、半滅菌卵の生産のための方法であって、親ドリは、補充されるべきトリの群れから得られ、そこから生産された卵から孵ったトリは、無菌状態の指標を提供するように検査され、そして、いったん該所望の無菌状態が得られると、該卵から孵ったトリおよびその子孫が、適切な無菌状態のトリの群れを形成する、方法。
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