EP0776362A1 - Procede de preparation du virus grippal, antigens obtenus et leurs applications - Google Patents
Procede de preparation du virus grippal, antigens obtenus et leurs applicationsInfo
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- EP0776362A1 EP0776362A1 EP95922563A EP95922563A EP0776362A1 EP 0776362 A1 EP0776362 A1 EP 0776362A1 EP 95922563 A EP95922563 A EP 95922563A EP 95922563 A EP95922563 A EP 95922563A EP 0776362 A1 EP0776362 A1 EP 0776362A1
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Definitions
- the invention relates to a method of fragmentation of the live influenza virus, of simple implementation, leading to a destruction of the infectious power, usable in particular in the production of an inactive influenza vaccine, or in obtaining viral antigens for purposes diagnostic
- influenza virus or influenza virus is a single stranded, helical symmetrical RNA virus belonging to the orthomyxovindae family.
- the known antigens are essentially represented by the following structural proteins.
- HA protein hemagglutinin located on the surface of the envelope
- Nucieoprotein and protein M are the internal antigens specific for viral types A and B, hemagglutirune and neuraminidase determining the subtypes of virus A.
- Hemagglutirune is the most immunogenic glycoprotein of the viral constituents The hemagglutirune content is used to express the load of viral antigens in influenza vaccines, however it is now established that all of the viral antigens intervene in the stimulation of immune response and that internal antigens play a major role in the cell-mediated response
- Nucieoprotein is the main target antigen of Cytotoxic T Lymphocytes (CTL), no CTL specific for hemagglutinin having been demonstrated in humans
- the viral fragmentation makes it possible to rupture the envelope and to release all the viral anugeni ⁇ ues sites NP, M, RNA viral Polymerases, HA and NA
- the vaccines obtained by this process are therefore extremely immunogenic and give seroconversions superior to those obtained with vaccines containing only surface antigens (which represent only 36% of the viral constituents) Fragmented virion vaccines are also better tolerated than more reactogenic whole virion vaccines
- the fragmentation processes used combine solvent-detergent treatments such as polysorbate / anesthetic ether or polysorbate / chloroform [Institut Pasteur (Adamowic ⁇ -Muller) US Patent N ° 4522809]
- Our simple implementation process allows fragmentation of the purified live influenza virus without solvent at room temperature. This process involves the removal of detergent and unwanted substances to obtain the viral fragmentation product in a perfectly defined buffered, isoionic ionic environment.
- This process results in a very significant reduction in the infectious area of the purified g ⁇ ppal virus suspension, up to total inactivanon depending on the operating conditions selected such as the concentration and duration of contact between detergent and g ⁇ ppai virus.
- the present invenuon has for its object a process for the preparation of purified influenza antigens, from a liquid containing the influenza virus, comprising the stages of concentration, purification, fragmentation and possibly inactivation, characterized in that
- the pu ⁇ fication step comprises several ultra cent ⁇ fugauon steps separated by a filtration step.
- the fragmentation step is carried out on the living virus in the presence of an amphiphilic nonionic detergent followed by removal of the undesirable substances by filtration retaining all of the viral constituents.
- influenza virus used is obtained by culture on sensitive host cells, such as marnrriifer cells: monkey, hamster, pig kidney cells, ferret, mouse cells or the cells from embryos, human lung tissue, or chicken embryo fibroblasts.
- sensitive host cells such as marnrriifer cells: monkey, hamster, pig kidney cells, ferret, mouse cells or the cells from embryos, human lung tissue, or chicken embryo fibroblasts.
- the most common system for industrial vaccine production is the embryonated chicken egg, this is the preferred system.
- the present invention therefore also relates to the method as described above, characterized in that the influenza virus is obtained by culture on an embryonated egg.
- the fertilized eggs must be carefully selected and come from healthy farms, reserved for this production.
- the eggs are then incubated for 2 to 3 days in culture ovens regulated in temperature and humidity so as to ensure viral infection under optimal conditions. These conditions vary depending on the influenza strains and the viral seeds used. The incubation is completed by rapid refrigeration at 5 ⁇ 3 ° C. The allantoic fluid, very rich in viral particles, is then taken from the infected eggs.
- the pu ⁇ fication technique proposed in the present process is based on the zonal uitracent ⁇ fugauon
- This uitracentnfugation is preferably carried out in gradient of ⁇ ensite, preferably in gradient of sucrose but one can also operate on gradient of cesium chloride.
- the cent ⁇ fugation is carried out at an acceleration which is preferably around 90,000 G, said centrifugation can be carried out continuously or by successive loads.
- the viral pa ⁇ icuies are separated according to their size, density and shape. Only gradient fractions containing the virus are taken
- the process object of the present application comprises a sequence of several ultracentrifugation stages, preferably two successive stages separated by a filtration stage.
- filtration step is meant either a single filter or a sequence of several filtrations, the last of which can be of the order of 0.3 ⁇ m and preferably of approximately 0.5 ⁇ m, for example of 0.45 ⁇ m.
- This sequence applied to the live influenza virus, ensures reproducible in ⁇ ust ⁇ elle pu ⁇ fication of strains of influenza virus cultivated on embryonic eggs.
- the suspension of concentrated punished virus is optionally standardized by dilution to constant values of opaque densities (OD) of the viral protein content of the sample to be treated.
- the final concentration can, for example preferably be between 200 and 1000 ⁇ g of protein per ml.
- the dilution is preferably carried out using a ste ⁇ le buffer, for example PB S (Phosphate Buffered Saline)
- PB S Phosphate Buffered Saline
- the viral fragmentation is carried out at room temperature (20-25 ° C) by addition to the suspension of purified live virus and possibly standardized with an amphiph ⁇ e nonionic detergent.
- This detergent is preferably a product having the general formula
- R represents an octyie or nonyie radical and n represents an integer equal to or greater than 3.
- Triton X-100 ® Triton X-165 ®
- Triton X-205 ® Triton X-305 ®
- Triton X-405 ® Triton X-405 ®
- nonionic amphiphilic detergent which is preferably used is Triton X-100 or octoxynol-9.
- the fragmentation reaction is carried out with stirring, for example for at least one hour of contact, but it can be carried out for a much longer time, for example up to 24 hours. Fragmentation is normally carried out in an atmosphere zone controlled at room temperature.
- the viral structure is dissociated.
- the viral envelope is ruptured, releasing, in the medium, the internal constituents, in particular the NP and M antigens, the only known antigens involved in the cell-mediated immune response. Part of the surface antigens (HA, NA) is also released.
- HA, NA surface antigens
- Fragmentation is stopped by removing the detergent.
- the technique for removing unwanted substances uses a filtration membrane whose porosity allows the passage of detergent molecules and other non-viral solutes and retains the viral fragmentation product.
- the operation is carried out by tangential filtration on a membrane with a porosity less than or equal to 100 Kilos Daltons, preferably around 50 Kilos Daltons, the sample is diafiltered during this ultrafiltration by 10 to 30 volumes of sterile isotonic buffer, preferably PB S.
- the subject of the invention is therefore a process as described above, characterized in that the step of eliminating undesirable substances is carried out according to a diafiltration method allowing the suspension of the fragmented virus suspension with a buffer solution using a filtration membrane retaining the major part of the viral constituents.
- the suspension of fragmented virus is concentrated in a desired volume which can be adapted to a standard viral concentration by measurement of OD.
- the viral inactivation tests carried out at the end of this treatment show that the fragmentation process causes a very significant drop in the infectious titre of the suspension of purified virus, which can go as far as total inactivation of the influenza virus whatever the viral type (A or B).
- the invention therefore also relates to a method as described above, characterized in that the fragmentation step is carried out under conditions allowing total inactivation of the purified influenza virus.
- Viral inactivation can optionally be supplemented by the addition, if necessary, of an inactivating agent (formalin, ⁇ propiolactone) according to techniques known to those skilled in the art.
- an inactivating agent formalin, ⁇ propiolactone
- a preservative and any other additive may possibly be added to the vaccine obtained. - /
- the invention also relates to a process as dec ⁇ t above caracte ⁇ se in that one operates either according to step A or according to the two steps A and B
- a subject of the invention is also a process for the preparation of punctate genital anugens from a concentrated allantoic liquid containing the living g ⁇ ppai virus, characterized in that
- the viral concentrate is purified by ultracent ⁇ fugation zonaie, preferably on a sucrose gradient, filtering the harvest obtained preferably up to a pore size of 0.3 ⁇ m minimum then repeating the ultracentrifugation operation,
- pu ⁇ fiee viral suspension is standardized by dilution in aqueous buffer
- the standardized product is fragmented by adding ⁇ 'octoxvnol 9 and then proceeds to remove the unwanted substances by diafiltration using ultrafiltration using a buffer solution,
- the present invention also has for its object to be medicaments, the viral fragments as obtained according to the process described in one of the claims 1 to 9 above, as well as the application of the purified local antigens as obtained according to the process described above for the preparation of a general vaccine for humam or veterinary use and finally the application of purified local antigens as obtained according to the process above, for the preparation of products usable for diagnostic purposes
- the allantoic liquid which is formed is then concentrated by ultrafiltration and stabilized in citrate buffer.
- the viral concentrate is purified by zonal ultracent ⁇ fugation in saccnarose gradient (10 to 55%) at 35,000 revolutions per minute The operation is carried out in continuous flow
- the harvest of the viral fractions of the seed represents approximately 800 ml
- the sucrose concentration is close to 40% This harvest is filtered up to 0.45 ⁇ m, the final volume of suspension, after filtering, is equal to 15 liters
- the suspension of purified virus (1010 ml) is standardized by dilution in PB S stenie buffer, so as to obtain a protein concentration como ⁇ se between 200 and 1000 ⁇ g / mi
- the volume of the virus suspension is 2000 ml.
- the infectious titre is greater than 10 10 ID50 / mi.
- the viral fragmentation is carried out by the aseptic addition of 10 ml (0.5% vol / vol) of octoxynoi 9 (T ⁇ ton X 100) under magnetic stirring, at laboratory temperature
- the viral suspension which has a flocculauon
- the diafiltrauon is carried out asequently at constant sample volume by ultrafiltration on memorane 50 Kd, using a volume of Phosphate Buffer (PBS) ) isotonic equalizes to 20 liters.
- PBS Phosphate Buffer
- the sample is freed from detergent and sucrose (reduction of 100 times).
- the infectious titer, after fragmentation, is reduced to 10 1 - 2 ID50 / mi, which represents a reduction greater than a factor of 10 9 , this for one hour of treatment.
- the vaccine obtained was filtered through 0.2 ⁇ m and added with me ⁇ hiolate (0.01% weight / vol.). This test made it possible to produce 13,000 ml of monovalent A / Beijing 32/92 X 117 vaccine titrating 137 ⁇ g of HA / ml.
- the vaccinating properties of the preparations verified by administration to humans and animals (mice), have made it possible to obtain seroconversions inducing immunological protection, according to the criteria for clinical evaluation of influenza vaccines.
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Abstract
Procédé de préparation d'antigèns grippaux purifiés, à partir d'un liquide contenant le virus grippal, comprenant les étapes de concentration, de purification, de fragmentation et éventuellement d'inactivation caractérisé en ce que: A. ou bien l'étape de purification comporte plusieurs étapes d'ultracentrifugation séparées par une étape de filtration, B. ou bien l'étape de fragmentation est effectuée sur le virus vivant en présence d'un détergent non-ionique amphiphile suivie d'une élimination des substances indésirables par filtration retenant l'ensemble des constituants viraux, ou bien on opère selon ces deux étapes dans un ordre quelconque.
Description
Procédé de préparation du virus grippal, antigènes obtenus et leurs applications .
L'invention concerne un procédé de fragmentation du virus gπppal vivant, de mise en oeuvre simple, entraînant une destruction du pouvoir infectieux, utilisable notamment dans la fabncation d'un vaccin grippai inactive, ou dans l'obtention d'antigènes viraux a des fins diagnostiques
Le virus gπppal ou Influenzavirus est un virus a ARN monocatenaire de symetπe hélicoïdale, enveloppe, appartenant a la famille des orthomyxovindae Les antigènes connus sont essentiellement représentes par les protéines structurales suivantes
NP Nucieoproteine de capside lie a TARN viral
M "matnce" proteique de l'enveloppe PA Polymerases liées a TARN viral
HA Hemagglutinine proteique située a la surface de l'enveloppe
NA Neuraminidase protéine enzymatique de surface
La nucieoproteine et la protéine M sont les antigènes internes spécifiques des types viraux A et B, l'hemagglutirune et la neuraminidase déterminant les sous-types de virus A.
L'hemagglutirune est la glycoproteine la plus immunogenique des constituants viraux La teneur en hemagglutirune est utilisée pour exprimer la charge d'antigènes viraux des vaccins grippaux , néanmoins il est aujourd'hui établi que l'ensemble des antigènes viraux intervient dans la stimulation de la réponse immumtaire et que les antigènes internes jouent un rôle majeur dans la réponse a médiation cellulaire
La nucieoproteine (NP) est le principal antigène cible des Lymphocytes T Cytotoxiques (LTC), aucun LTC spécifique de l'hemagglutinine n'ayant ete mis en évidence chez l'homme
La fragmentation virale permet de rompre l'enveloppe et de libérer l'ensemble des sites anugeniαues viraux NP, M, RNA Polymerases virales, HA et NA
Les vaccins obtenus par ce procède sont donc extrêmement îmmunogenes et donnent des seroconversions supeπeures a celles obtenues avec des vaccins ne contenant que les antigènes de surface (qui ne représentent que 36% des constituants viraux)
Les vaccins a virions fragmentes sont également mieux tolères que les vaccins a virions entiers, plus reactogenes
Les procédés de fragmentation utilises associent des traitements solvant-détergent tels que polysorbate/éther anesthesique ou polysorbate/chloroforme [Institut Pasteur (Adamowic∑-Muller) US Patent N° 4522809]
La mise en oeuvre de ces procédés en milieu industriel nécessite des locaux et un mateπel appropnes teis que des équipements antidéflagrants dans le cas de l'éther et des protections spécifiques des operateurs vis à vis de la toxicité neurotrope du chloroforme.
D'autres procédés mettent en jeu des détergents, ou enzymes proteolytiques, ou sels biliaires, appliques aux virus préalablement inactives. Ces procédés sont essentiellement utilises pour l'obtention de sous-unités de suπace (HA et NA) dans la fabπcauon de vaccins sous-unitaires dépourvus des antigènes internes On peut citer par exemple l'utilisation de sodium desoxycholate décπte dans le brevet DD 155875, celle de surfactants décπte dans le brevet USP 4 327.182, enfin celle de détergents non ioniques décπte dans le brevet FR 2.483 779
Notre procédé, de mise en oeuvre simple, permet d'effectuer la fragmentation du virus grippal vivant purifié, sans solvant, a température ambiante. Ce procédé comprend l'élimination du détergent et des substances indésirables permettant d'obtenir le produit de fragmentation virale dans un environnement ionique tamponne, isoionique, parfaitement défini
Ce procédé entraîne une réduction très importante du utre infectieux de la suspension de virus gπppal purifiée, pouvant aller jusqu'à l'inactivanon totale en fonction des conditions opératoires retenues telles que la concentrauon et durée de contact entre détergent et virus gπppai.
La présente invenuon a αonc pour objet un procédé de preparauon d'antigènes gπppaux purifiés, a partir d'un liquide contenant le virus grippal, comprenant les étapes de concentrauon, de purification, de fragmentation et éventuellement d'inactivauon caracteπse en ce que
A. ou bien l'étape de puπfication comporte plusieurs étapes d'ultra centπfugauon séparées par une étape de filtration.
B. ou bien l'étape de fragmentation est effectuée sur le virus vivant en présence d'un détergent non-ionique amphiphile suivie d'une élimination des substances indésirables par filtration retenant l'ensemble des constituants viraux.
Ou bien on opère selon ces deux étapes dans un ordre quelconque.
Dans un mode préféré d'exécution du procédé, le virus grippal utilisé est obtenu par culture sur cellules hôtes sensibles, telles que les cellules de marnrriifères : cellules de reins de singe, de hamster, de porc, cellules de furets, de souris ou les cellules issues d'embryons, de tissu pulmonaire humain ou de fibroblastes d'embryon de poulet.
Le système le pius courant pour la production industrielle de vaccin est l'oeuf de poule embryonné, c'est le système préféré.
La présente invention a donc également pour objet le procédé tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que le virus grippai est obtenu par culture sur oeuf embryonné.
Les oeufs fécondés doivent être soigneusement sélectionnés et provenir d'élevages sains, réservés à cette production.
us sont placés en incubateur à 37,8°C (100°F) pendant 9 à 12 jours, le développement embryonnaire et la vitalité des embryons sont contrôlés par mirage avant inoculation du virus grippai par voie intra-ailantoidienne.
Les oeufs sont ensuite incubés pendant 2 à 3 jours en étuves de culture régulées en température et humidité de façon à assurer l'infection virale dans des conditions optimales. Ces conditions sont variables seion les souches grippales et les semences virales utilisées. L'incubation est aπêtée par une réfrigération rapide à 5 ± 3°C. Le liquide allantoique, très riche en particules virales, est alors prélevé sur les oeufs infectés.
On obtient donc le liquide allantoique virulent qui doit être rapidement purifié afin d'éliminer les impuretés présentes : protéines, dont ovaibumine, lécithines, bactéries etc. La récolte est clarifiée par centrifugation et concentrée jusqu'à 20 fois par ultrafiltration préalablement à la purification virale.
Les opérations de puπfication virale connues de l'homme αe métier font appel a des techniques separatives telles que la filtration, ruitracentnfugation ou la cnromatographie d'affinité Ces opérations entraînent une concentration au virus gπppal
Or nous avons constate qu'il est préférable d'effectuer la purification du virus gπppal vivant, l'inactivation préalable a la puππcation pouvant entraîner de nomoreux pontages chimiques irréversibles entre protéines virales et impuretés, préjudiciables a l'efficacité des opérations de punfication. C'est pourquoi notre invention comprenα l'obtention de virus gπppai purifié vivant.
La technique de puπfication oojet au présent procédé s'appuie sur l'uitracentπfugauon zonale Cette uitracentnfugation est réalisée de préférence en gradient de αensite, de préférence en gradient de saccharose mais on peut également opérer sur gradient de chlorure de césium. On opère la centπfugation a une accélération qui est αe préférence de l'ordre de 90 000 G, ladite centrifugation peut être effectuée en contmu ou par charges successives On opère ainsi une séparation des paπicuies virales en fonction de leur taille, leur densité et leur forme Seules les fractions au gradient contenant le virus sont prélevées
Selon le type de rotor utilise on effectuera une récolte dynamique (en cours de centrifugation) ou stauque (à l'arrêt) après reoπentauon au gradient.
Le procède oojet de la présente demande comporte une séquence de plusieurs étapes d'ultracentrifugation de préférence deux étapes successives séparées par une étape de filtration. Par étape de filtration on entend soit une filtrauon unique soit une séquence de plusieurs filtrations dont la dernière peut être de l'orαre αe 0,3 μm et de préférence d'environ 0,5 μm par exemple de 0,45 μm.
Cette séquence, appliquée au virus gπppal vivant, assure une puπfication inαustπelle reproductible des souches de virus gπppaux cultives sur oeufs embryonnes
Avant l'étape de fragmentauoπ virale, la suspension de virus punfié concentre est éventuellement standardisée par dilution a αes valeurs constantes de densités opuques (D O) mdicatπces de la teneur en protéine virale de l'échantillon a traiter La concentration finale peut par exemple de préférence être compπse entre 200 et 1000 μg de protéines par ml. La dilution est effectuée de préférence a l'aide d'un tampon steπle par exemple le PB S (Phosphate Buffered Saline)
L'invention a donc aussi pour objet un procédé tel que décrit ci-dessus caractérise en ce que, entre l'étape de purification et l'étape de fragmentation, on procède à une étape de standardisation par ajustement de la concentration en protéines.
La fragmentation virale est effectuée à température ambiante (20-25°C) par addition à la suspension de virus vivant purifiée et éventuellement standardisée d'un détergent non- ionique amphiphϋe. Ce détergent est de préférence un produit ayant la formule générale
R s / (O - CH2-CH2)n OH
dans laquelle R représente un radical octyie ou nonyie et n représente un entier égal ou supérieur à 3.
Parmi les produits couverts par la formule générale ci-dessus on peut citer les produits commerciaux suivants : les Triton X-100®, Triton X-165®, Triton X-205®, Triton X- 305® ou Triton X-405®.
Plus particulièrement le détergent non-ionique amphiphile que l'on utilise de préférence est le Triton X-100 ou octoxynol-9.
La réaction de fragmentation s'effectue sous agitation par exemple pendant au moms une heure de contact mais on peut opérer pendant un temps beaucoup plus long, par exemple jusqu'à 24 heures. La fragmentation est effectuée normalement en zone d'atmosphère contrôlée à température ambiante.
Au cours de cette opération, la structure virale est dissociée. L'enveloppe virale est rompue, libérant, dans le milieu, les constituants internes en particulier les antigènes NP et M, seuls antigènes connus impliqués dans la réponse immunitaire à médiation cellulaire. Une partie des antigènes de suπace (HA, NA) est également libérée. Les études du profil de taille paπicuiaire après traitement montrent que la suspension virale ne contient que presque exclusivement du virus fragmenté, ce qui répond, par exemple, aux critères de la Pharmacopée Européenne pour les vaccins grippaux fragmentés à usage humain.
La fragmentation est stoppée par élimination du détergent.
La technique d'élimination des substances indésirables utilise une membrane de filtration dont la porosité permet le passage des molécules de détergent et d'autres solutés non viraux et retient le produit de fragmentation viraie.
Le choix de la membrane est orienté par la taille et le poids moléculaire des plus petites unités antigéniques libres.
L'hémagglutinine libre est un trimère de PM=210 Kilos Daltons (monomère : 70 Kilos Daltons). L'opération est réalisée par filtration tangentielle sur membrane de porosité inférieure ou égale à 100 Kilos Daltons, de préférence environ 50 Kilos Daltons, l'échantillon est diafiltré au cours de cette ultrafiitration par 10 à 30 voiumes de tampon isotonique stérile de préférence le PB S.
L'invention a donc pour objet un procédé tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que l'étape d'élimination des substances indésirables est effectuée selon une méthode de diafiltration permettant le lavage de la suspension de virus fragmenté par une solution tampon en utilisant une membrane de filtration retenant la majeure paπie des constituants viraux.
Après diafiltration, qui conduit à l'élimination des substances indésirables, la suspension de virus fragmenté, est concentrée sous un volume souhaité qui peut être adapté à une concentration virale standard par mesure de DO.
Les essais d'inactivation virale effectués à l'issue de ce traitement montrent que le procédé de fragmentation provoque une chute très impoπante du titre infectieux de la suspension de virus purifié, pouvant aller jusqu'à l'inactivation totale du virus grippal quel que soit le type viral (A ou B).
L'invention a donc aussi pour objet un procédé tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que l'étape de fragmentation est réalisée dans des conditions permettant une inactivation totale du virus grippal purifié.
L'inactivation virale peut être éventuellement complétée par addition si nécessaire d'un agent inactivant (formol, β propiolactone) selon les techniques connues de l'homme de métier.
Un conservateur et tout autre additif (adjuvant) peuvent éventuellement être ajoutés au vaccin obtenu.
- /
L'invention a également pour objet un procède tel que decπt ci-dessus caracteπse en ce que l'on opère soit selon l'étape A soit selon les deux étapes A et B
L'invention a également pour objet un proceαe de préparation d'anugenes gπppaux punfies a paπir d'un liquide allantoique concentre contenant le virus gπppai vivant caracteπse en ce que
l'on purifie le concentre viral par ultracentπfugation zonaie, αe préférence sur gradient de saccharose, filtre la récolte obtenue de préférence jusqu'à une taille de pore de 0,3 μm minimum puis répète l'opération d'ultracentrifugation ,
l'on standarαise la suspension virale puπfiee par dilution en tampon aqueux ,
- l'on fragmente le produit standardise par addition α'octoxvnol 9 puis procède a une élimination des substances indesiraoles par diafiltration en utilisant une ultrafiltration a l'aide d'une solution tampon ,
et l'on procède, si nécessaire et si désire, a une inactivation de la susDension viraie, de préférence a l'aide de formaldehyde
La présente invention a également pour objet a ϋtre αe médicaments, les fragments viraux tels qu'obtenus selon le procède decπt a l'une des revendicauons 1 a 9 ci-dessus, ainsi que l'application des antigènes gπppaux purifiés tels qu'obtenus selon le procède decπt ci-dessus a la preoaration d'un vaccm gπppal a usage humam ou vétérinaire et enfin l'applicauon des antigènes gπppaux purifies tels qu'obtenus selon le procède decπt α dessus, a la preoaration de produits utilisables a des fins diagnosuques
La preparauon des vaccins ainsi que des tests de diagnostics renfermant les antigènes gπppaux teis qu'obtenus selon le procède decπt α-dessus peut être réalisée selon les méthodes connues de l'homme de mener
Le procède qui constitue cette invention est illustre a l'aiαe αe l'exemple suivant qui ne saurait limiter la protection de ladite invention.
Exemples
1 Culture virale
La soucne A/H3N2 A Beijing 32/92 X 117 est inoculée a des oeufs embryonnes de 11 jours, places en incubation pendant 72 heures a 35°C
La recoite de liquide allantoique est clarifiée par centrifugation et filtrauon
Le liquide allantoique ciaπfie est ensuite concentre par ultrafiltration et stabilise en tampon citrate
2. Punficauon
Le concentre viral est purifie par ultracentπfugation zonale en gradient de saccnarose (10 a 55%) a 35 000 tours par minute L'opération s'effectue en flux contmu
La récolte αes fractions virales du graαient représente environ 800 ml La concentraπon en saccharose est voisine de 40 % Cette récolte est filtrée jusqu'à 0,45 μm , le volume final de suspension, après nnçage des filtres, est égal à 15 litres
L'étape d'ultracentrifugauon est conduite de nouveau selon les mêmes conαitions opératoires
3 Fragmentauon virale
Apres la seconde purification, la suspension de virus purifié (1010 ml) est standardisée par dilution en tampon PB S stenie, de façon a obtenir une concentration proteique comoπse entre 200 et 1 000 μg/mi
Apres standardisation, le volume de la suspension viraie est de 2000 ml Le titre infectieux est supeπeur a 1010 ID50/mi.
La fragmentation viraie est effectuée par l'addition aseptique de 10 ml (0,5% vol /vol ) d'octoxynoi 9 (Tπton X 100) sous agitation magnétique, a température du laboratoire
Apres une heure de contact, la suspension virale, qui présente une floculauon, est clarifiée par cεntπήigauon La diafiltrauon est réalisée asepuquement a volume d'échantillon constant par ultrafiltration sur memorane 50 Kd, a l'aide d'un volume de Tampon Phosphate (PBS) isotonique égaie a 20 litres.
A l'issue de la diafiltration, l'échantillon est débarrassé du détergent et du saccharose (réduction de 100 fois). Le titre infectieux, après fragmentation, est réduit à 101-2 ID50/mi, ce qui représente une diminution supérieure à un facteur de 109, ceci pour une heure de traitement.
Sur d'autres expériences on a pu obtenir, grâce à des temps de contact virus/détergent prolongés (> 2 heures), une activation totale de la suspension virale fragmentée.
Dans l'exemple présenté, l'inactivation a été complétée par addition de formol (0,01% vol./ vol.).
Le vaccin obtenu a été filtré sur 0,2 μm et additionné de meπhiolate (0,01% poids/vol.). Cet essai a permis de produire 13.000 ml de vaccin monovalent A/Beijing 32/92 X 117 titrant 137 μg de HA/ml.
La qualité des antigènes obtenus, évaluée par vérification de l'intégrité immunologique des protéines hémagglutinine et neuraminidase, satisfait aux spécifications internationales (Pharmacopée Européenne).
Par ailleurs, les propriétés vaccinantes des préparations, vérifiées par administration à l'homme et l'animal (souris), ont permis d'obtenir des séroconversions induisant une protection immunologique, selon les critères d'évaluation clinique des vaccins grippaux.
Claims
1. Procédé de préparation d'antigènes grippaux purifiés, à partir d'un liquide contenant le virus grippal, comprenant les étapes de concentration, de purification, de fragmentation et éventuellement d'inactivation caractérisé en ce que :
A. ou bien l'étape de purification comporte plusieurs étapes d'ultra centrifugation séparées par une étape de filtration,
B. ou bien l'étape de fragmentation est effectuée sur le virus vivant en présence d'un détergent non-ionique amphiphile suivie d'une élimination des substances indésirables par filtration retenant l'ensemble des constituants viraux,
ou bien on opère selon ces deux étapes dans un ordre quelconque.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le détergent non- ionique amphiphile que l'on utilise est de préférence l'octoxynol 9.
. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que l'on opère soit selon l'étape A soit selon les deux étapes A et B.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caraαérisé en ce que, ente l'étape de purification et l'étape de fragmentation, on procède à une étape de standardisation par ajustement de la concentration en protéines.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'étape d'élimination des substances indésirables est effectuée seion une méthode de diafiltration permettant le lavage de la suspension de virus fragmenté par une solution tampon en utilisant une membrane de filtration retenant la majeure partie des constituants viraux.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caraαérisé en ce que l'étape de fragmentation est réalisée dans des conditions permettant une inaαivation totale du virus grippal purifié.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que l'étape de purification comporte deux étapes d'ultracentrifugation zonale séparées par une étape de filtration des récoltes purifiées jusqu'à une taille de pores au moins égale à 0,3 μm et de préférence de 0,5 μm environ.
8. Procédé de préparation d'antigènes grippaux purifiés à partir d'un liquide allantoique concentré contenant le virus grippal vivant caractérisé en ce que :
l'on purifie le concentré viral par ultracentrifugation zonale, de préférence sur gradient de saccharose, filtre la récolte obtenue de préférence jusqu'à une taille de pore de 0,3 μm minimum puis répète l'opération d'ultracentrifugation ;
l'on standardise la suspension virale purifiée par dilution en tampon aqueux ;
l'on fragmente le produit standardisé par addition d'oαoxynol 9 puis procède à une élimination des substances indésirables par diafiltration en utilisant une ultrafiltration à l'aide d'une solution tampon ;
et l'on procède, si nécessaire et si désiré, à une inactivation de la suspension virale, de préférence à l'aide de forraaldéhyde.
9. Procédé selon les revendications 1 et 8 caraαérisé en ce que le virus grippal est obtenu par culture sur oeuf embryonné.
10. A titre de médicaments, les fragments viraux tels qu'obtenus selon le procédé décrit à l'une des revendications 1 à 9.
11. Application des antigènes grippaux purifiés tels qu'obtenus selon le procédé décrit à l'une des revendications 1 à 9 à la préparation d'un vaccin grippal à usage humain ou vétérinaire. Application des antigènes gπppaux puπfies tels qu'obtenus selon le procède decnt a l'une des revendicauons 1 a 9 a la préparation de produits utilisables a des fins de diagnostiques
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