BE1022132B1 - Nouvelle methode. - Google Patents

Abstract

Cette invention concerne un procédé de production d'un virus en culture cellulaire comprenant au moins les étapes consistant à a) utiliser une population de cellules cultivées dans un milieu de culture cellulaire, b) infecter la population de cellules par i. inoculation de la population avec le virus, et ii. incubation de la population inoculée de façon à permettre au virus de se répliquer et se propager, c) collecter le virus produit, pour obtenir ainsi une récolte virale, et d) purifier le virus. Une puissance volumique d'entrée d'au moins 15 W/m3, d'au moins 30 W/m3, d'au moins 60 W/m3, d'au moins 100 W/m3, d'au moins 120 W/m3 étantappliquée à la culture cellulaire au moins pendant 1'étape b).

Description

NOUVELLE METHODE

DECLARATION CONCERNANT LA RECHERCHE SPONSORISEE PAR LE GOUVERNEMENT .

Cette invention a été mise au point avec l'appui du gouvernement américain, en application du contrat No. HHS0100200600011C accordé au Département de la Santé et des Service sociaux ; le gouvernement américain ayant certains droits sur l'invention.

DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention concerne un procédé de production de virus, ou d'antigènes viraux, en culture cellulaire, les virus ou antigènes viraux pouvant être obtenus par ce procédé et des vaccins contenant lesdits virus ou antigènes viraux. En particulier, l'invention concerne un procédé pour améliorer le rendement viral. CONTEXTE .

La mise au point de techniques en culture cellulaire comme alternative aux systèmes de production classiques basés sur l'utilisation d'œufs pour la fabrication de vaccins viraux est probablement la solution la plus rapide et la plus prometteuse pour pallier aux inconvénients et aux contraintes associés aux systèmes classiques basés sur l'utilisation d'œufs. Les productions commerciales de vaccins viraux exige typiquement d’importantes quantités de virus comme source d'antigène. Toutefois, le procédé basé sur les œufs est vulnérable en raison de la qualité biologique variable des œufs et de son manque de flexibilité en termes de logistique du fait que des quantités importantes d'œufs appropriés ne sont pas disponibles.

Les systèmes en culture cellulaire apparaissent comme un mode alternatif approprié de préparation de vaccins, plus simple, flexible, et régulier, permettant d'améliorer les possibilités d'évolution des capacités de production de vaccins et par conséquent d'obtenir d'importantes quantités de virus,, si nécessaire, par exemple, en réponse à une menace pandémique naturelle ou à une attaque terroriste.

Une production de vaccins efficace exige toutefois la culture de virus à grande échelle à des rendements élevés à partir d'un système hôte. Les conditions de culture dans lesquelles un virus est cultivé ont une importante signification en ce qui concerne l'obtention d'un rendement élevé acceptable du virus. Par conséquent, pour augmenter le rendement du virus recherché, tant le système que les conditions de culture doivent être spécifiquement adaptés pour créer un environnement avantageux approprié à la production à grande échelle du virus recherché. Une façon d'y parvenir consiste à améliorer la productivité spécifique des cellules, par exemple, en améliorant le milieu de culture, ou en augmentant la densité cellulaire. Sachant qu'après production, le virus produit en culture cellulaire doit être récupéré à partir de la culture cellulaire et purifié, une autre façon d'améliorer le rendement viral consiste à limiter la perte de matériel viral se produisant au cours des différentes étapes de la purification. Par conséquent, il subsiste un besoin en termes de procédés alternatifs et améliorés pour produire des virus à un rendement viral accru. Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir un meilleur rendement viral par rapport aux procédés connus dans l'état de l'art.

RESUME DE L'INVENTION

Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé de production d'un virus en culture cellulaire comprenant au moins les étapes consistant à : a) utiliser une population de cellules dans un milieu de culture cellulaire, . b) infecter la population de cellules par : i. inoculation de la population avec le virus, et ii. incubation de la population inoculée de façon à permettre au virus de se répliquer et de se propager, c) collecter le virus produit, pour obtenir ainsi une récolte virale, et d) purifier le virus, dans lequel une puissance volumique d'entrée d'au moins 15 W/m3, d'au moins 30 W/m3, d'au moins 60 W/m3, d'au moins 100 W/m3, ou d'au moins 120 W/m3 est appliquée à la culture cellulaire au moins pendant l'étape b).

Selon un second aspect, l'invention concerne un procédé de préparation d'un vaccin comprenant- au moins l'étape consistant à mélanger le virus obtenu selon le procédé de la présente invention avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. , " DESCRIPTION DETAILLEE '

Cette invention concerne un procédé amélioré de production de virus en culture cellulaire, qui est particulièrement utile pour la production à grande échelle. En particulier, le procédé selon l'invention contribue à augmenter le rendement viral en limitant la perte virale lors du processus de purification. De manière surprenante, les inventeurs ont observé que certains changements intervenant dans la partie amont du procédé de production de virus, tels que l'accroissement de la puissance volumique d'entrée appliquée aux cellules cultivées pour produire un virus, résultaient en une amélioration significative dans la partie aval dudit procédé, telle qu'une augmentation du rendement viral obtenu après plusieurs étapes de purification. En particulier, les inventeurs . ont observé que, alors que l'accroissement de la puissance d'entrée lors de la phase de culture cellulaire amont n'avait pas d'impact sur la productivité spécifique des cellules, un effet positif était obtenu dans l'étape ultérieure de clarification par microfiltration dans la mesure où le rendement viral obtenu après ladite étape était significativement accru, comparé au rendement obtenu quand une puissance d'entrée plus basse était appliquée lors de la phase de culture cellulaire. De plus, non seulement la récupération du virus après l'étape de microfiltration augmentait, mais aussi les pourcentages de récupération obtenus étaient plus réguliers et moins variables d'une expérience à l'autre. Les inventeurs ont également observé un effet bénéfique similaire de l'accroissement de la puissance volumique d'entrée lors de la phase de culture cellulaire amont sur une étape d'ultracentrifugation sur gradient de saccharose ultérieure mise en œuvre lors de la phase avale de purification du virus. En particulier, les inventeurs ont observé que l'accroissement de la puissance volumique d'entrée appliquée aux cellules cultivées permettait d'augmenter significativement, d'un facteur de 2 environ, la capacité de charge du rotor utilisé pour l'étape d'ultracentrifugation sur gradient de saccharose. Par conséquent, le rendement de virus obtenu après plusieurs étapes de purification conduisait à un meilleur rendement global du virus à la fin du processus de production d'un virus. Contre toute attente, les inventeurs ont observé qu'une puissance volumique d'entrée plus élevée n'occasionnait ni préjudices, ni dommages aux cellules.

Le procédé selon la présente invention offre l'avantage d'être facile à mettre en œuvre, ne nécessitant ni étape supplémentaire, ni équipement autre que celui typiquement utilisé en standard pour produire un virus en culture . cellulaire.

La « Capacité de charge » est la quantité en litres de récolte virale collectée pendant l'étape c) du procédé selon l'invention qui est chargée par litre de rotor de la centrifugeuse utilisée pour l'étape d'ultracentrifugation sur gradient de saccharose, ou la quantité « équivalente » en litres de récolte virale quand ladite récolte virale a été traitée avant d'être soumise à l'étape d'ultracentrifugation sur gradient de saccharose, dans le cadre d'étapes de purification antérieures. Par exemple, comme décrit ci-dessous, après avoir été collectée, la récole virale peut être soumise à ultrafiltration/diafiltration avant d'être soumise à une étape d'ultracentrifugation sur gradient de saccharose, ladite ultrafiltration/diafiltration résultant typiquement en une concentration de la récolte virale, i.e., la quantité en litres de récolte virale, après cette étape.

La « puissance volumique d'entrée » est la quantité de puissance par unité de volume, ou la vitesse moyenne de dissipation d'énergie spécifique. En culture cellulaire, cela correspond à la quantité de puissance communiquée à un volume . de culture cellulaire par l'intermédiaire de l'arbre et des turbines de l'agitateur. Elle s'exprime en W/m3. La formule empirique utilisée dans l'état de l'art pour calculer les valeurs de puissance d'entrée est la suivante : P/V= (Np x n3 X di5) /V, où Np est le nombre de puissance en régime turbulent de la turbine, n est la vitesse d'agitation mesurée en tours par seconde de la turbine, di est le diamètre de la turbine mesuré en mètre et V est le volume de culture en mètres cube.

Le procédé selon l'invention est applicable à tout type de cellules, qu'il s'agisse de cellules adhérentes cultivées sur micro-supports ou de cellules en suspension. Par conséquent, dans le cadre de la présente invention, le terme « suspension cellulaire » peut désigner à la fois les cellules adhérentes cultivées sur micro-supports et les cellules capables de se développer en suspension, i.e. qui n'exigent pas de support adhérent, tel que des micro-supports, pour se développer.

Typiquement, la puissance volumique d'entrée est appliquée par un mouvement mécanique de la suspension cellulaire. Ledit mouvement mécanique peut être obtenu par différents moyens. Par exemple, le mouvement mécanique de la suspension cellulaire peut être obtenu au moyen d'un dispositif d'agitation, tel que des turbines. L'agitation peut être conférée sous la forme d'un flux axial, d'un flux radial, ou d'une combinaison des deux, suivant le type de turbine utilisé. Typiquement, les turbines peuvent être divisées en plusieurs groupes en fonction de leur géométrie, et en particulier, de la géométrie de leurs pales : (i) les turbines à pales plates, également appelées turbines de Rushton ou turbines de type Rushton ; (ii) les turbines à pales inclinées ; et (iii) les turbines à pales sous-marines.

Les turbines à pales plates, ou turbines de Rushton, sont constituées de pales plates qui sont montées verticalement le long de l'arbre d'agitation, produisant ainsi un flux radial unidirectionnel. Ces types de turbines sont couramment utilisés dans les fermentations de lignées cellulaires qui ne sont pas considérées comme sensibles au cisaillement, telles que les levures, les bactéries, et certains champignons. Toutefois, comme décrit dans la présente, les inventeurs ont observé que les turbines de Rushton peuvent également être utilisées de manière appropriée avec des cellules animales selon le procédé de la présente invention.

Les turbines à pales inclinées sont constituées de pales plates qui sont montées selon un angle par rapport à l'arbre d'agitation, produisant ainsi un flux simultané axial et radial. Ces turbines à pales inclinées sont souvent utilisées avec les lignées cellulaires sensibles au cisaillement qui se développent en suspension ou à l'aide de micro-supports. Ces turbines sont souvent utilisées en cultures discontinues ou semi-discontinues, mais elles peuvent également être utilisées en mode continu et perfusion.

La face avant des pales sur une turbine à pales sousmarine peut être plate, ou concave, tandis que leur face arrière est convexe, produisant ainsi un flux axial unidirectionnel.

Différents facteurs doivent être considérés pour choisir les types appropriés de turbines tels que, par exemple, le type de cellules, le type de systèmes de culture (discontinue, semi-discontinue ou perfusion), le type de réacteurs de culture, ainsi que le niveau de puissance volumique d'entrée souhaité. Il est de la compétence de l'homme du métier de déterminer et de choisir la turbine appropriée à utiliser et ceci en fonction des conditions spécifiques ci-dessus. Dans un mode de réalisation, une puissance volumique d'entrée, en particulier une puissance volumiqueétrique d'entrée allant de 30 à 120 W/m3, appliquée dans le procédé selon l'invention est obtenue à l'aide d'une turbine à pales inclinées. Dans un autre mode de réalisation, une puissance volumique d'entrée, en particulier une puissance volumique d'entrée supérieure à 120 W/m3, appliquée dans le procédé selon l'invention est obtenue à l'aide d'une turbine de Rushton.

La puissance volumique d'entrée appliquée à des cultures de cellules animales est typiquement beaucoup plus basse que pour les cultures microbiennes en raison de la fragilité supposée plus élevée des cellules animales qui sont dépourvues de parois cellulaires protectrices, ce qui les rend en particulier plus sensibles à la contrainte de cisaillement et à la formation de mousse que les cultures microbiennes. Toutefois, comme observé par les présents inventeurs, l'application d'une puissance volumique d'entrée élevée, jusqu'à une certaine mesure, aux, cultures, de cellules animales utilisées pour produire un virus n'est pas préjudiciable aux cellules, tout en favorisant avantageusement le rendement viral lors de la purification du virus produit.

Le procédé selon l'invention peut être implémenté dans une large plage de valeurs de puissance volumique d'entrée.

Par « valeur maximale », on entend la puissance volumique d'entrée maximale qui peut être appliquée en l'absence d'impact négatif global sur le rendement viral. Un facteur connu pour avoir un impact négatif possible sur le rendement viral est l'intégrité cellulaire, comme par exemple une viabilité cellulaire réduite. L'homme du métier sait comment surveiller la viabilité cellulaire. Un exemple non limitatif de procédés appropriés est la coloration cellulaire (qui permet de discriminer les cellules vivantes des cellules mortes), telle que la coloration au bleu de trypan, ou toute autre coloration appropriée connue. En variante, la viabilité cellulaire peut également - être évaluée et mesurée par cytométrie en flux, comme par exemple, par FACS (tri cellulaire activé par fluorescence). En plus, lors de la définition de la valeur maximale, la productivité spécifique des cellules du virus peut être prise en compte. Par « productivité spécifique des cellules », on entend la capacité des cellules à produire le virus, i.e. la quantité de virus obtenue à l'étape de collecte c), avant d'être soumise à une purification. De préférence, la puissance volumique d'entrée appliquée aux cellules cultivées ne pourra pas affecter la productivité spécifique des cellules du virus.

Par « valeur minimale » de la puissance volumique d'entrée, on entend la valeur minimale fournissant une amélioration du rendement viral lors de la phase de purification du virus, comparé au rendement viral obtenu lors de la phase de purification du virus quand aucune, ou une puissance volumique d'entrée basse est appliquée aux cellules cultivées. Tout procédé connu dans l'état de l'art pour mesurer le rendement viral ou le titre viral peut être utilisé de manière appropriée pour contribuer à déterminer les valeurs optimales de puissance volumique d'entrée à appliquer dans le procédé selon l'invention. Par exemple, le CPE (effet cytopathique) peut être mesuré en surveillant les changements morphologiques s'opérant dans les cellules hôtes après l'inoculation du virus, comprenant l'arrondissement, la désorientation, le gonflement ou le rétrécissement, la mort, et le décollement de la surface des cellules. En plus, la détection d'un'antigène viral spécifique peut être surveillée par des techniques standards de détection de protéines, telles que l'analyse par Western-Blot, à tout moment après l'inoculation des cellules avec le virus d'intérêt qui doit être produit. Dans le cas particulier du virus influenza, la teneur en HA peut être surveillée à tout moment après l'inoculation des cellules avec le virus, par un dosage SRD (Wood, JM, et al. (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247), qui est une technique connue de l'homme du métier. En plus, le dosage SRD peut également être utilisé à tout moment lors de la phase de purification afin d'évaluer -le rendement viral .· avant et après toute étape de purification donnée. Selon le procédé de la présente invention, la puissance volumique d'entrée appliquée aux cellules animales pour produire les virus va typiquement de 15 à 900 W/m3, de manière avantageuse de 30 à 500 W/m3, mieux encore de 60 à 250 W/m3, voire de 120 à 200 W/m3. Dans un mode de réalisation, la valeur de puissance volumique d'entrée utilisée dans le procédé selon l'invention est d'au moins 15 W/m3, d'au moins 30 W/m3, d'au moins 60 W/m3, d'au moins 100 W/m3, ou d'au moins 120 W/m3. Dans un mode de réalisation spécifique, la valeur de puissance volumique d'entrée utilisée dans le procédé selon l'invention est de 30 W/m3. En variante, dans un autre mode de réalisation spécifique, la valeur de puissance volumique d'entrée utilisée dans le procédé selon l'invention est de 120 W/m3.

Le procédé selon 1'invention est applicable à tout type de réacteur de culture, de toute taille, comme par exemple, des flasques, des bouteilles pour agitateur rotatif, ou des bioréacteurs, du moment que lesdits réacteurs sont aptes à recevoir des dispositifs d'agitation, tels que par exemple des turbines, ou sont compatibles avec l'utilisation d'un dispositif d'agitation séparé. Il n'est pas nécessaire que le réacteur soit équipé d'un dispositif d'agitation. Le dispositif d'agitation peut être séparé du réacteur lui-même. Par exemple, dans le cas de bioréacteurs à usage unique, constitués typiquementde poches en plastique, tels que les bioréacteurs Wave™, l'agitation desdits bioréacteurs à usage unique peut être obtenue en plaçant les bioréacteurs sur une table d'agitation, que ce soit un agitateur secoueur à mouvement orbital ou un agitateur secoueur à mouvement axial. Les bioréacteurs peuvent être à base de tout type de matériau, comme par exemple le verre ou l'acier inoxydable pour les bioréacteurs à usage non unique, ou le plastique pour les bioréacteurs à usage unique. En plus, les bioréacteurs peuvent être de toute forme, comme par exemple de forme cylindrique ou cubique. Les bioréacteurs sont typiquement utilisés pour une production à l'échelle intermédiaire, comme de 1 à 10 L, et la production à grande échelle, comme de 20 à 1000 L, et au-delà.

Le procédé selon l'invention est applicable à tout type de bioréacteur de toute taille. En particulier, le procédé selon l'invention convient pour des réacteurs de 10 L, 200 L, 500 L, 1000 L ou 10 000 L. Un type particulièrement approprié de bioréacteur pouvant être utilisé dans le procédé selon l'invention est celui des bioréacteurs à cuve agitée, opérant en mode discontinu ou continu. Les bioréacteurs à usage unique représentent un type de bioréacteurs alternatifs appropriés pouvant être utilisés dans le procédé selon l'invention. Dans un mode de réalisation, les cellules utilisées dans le procédé selon l'invention sont cultivées dans un bioréacteur à usage unique de 200 L.

Selon l'invention, les cellules peuvent être cultivées de diverses façons, comme par exemple, à l'aide de systèmes discontinus, semi-discontinus, ou continus, comme des systèmes de perfusion. La perfusion est particulièrement avantageuse lorsqu'une densité cellulaire élevée est souhaitée. Une densité cellulaire élevée peut être particulièrement avantageuse pour maximiser la quantité de virus qui peut être produite à partir d'un type de cellule donné. Le procédé de production d'un virus en culture cellulaire dans lequel une puissance volumique d'entrée élevée est appliquée à la culture cellulaire selon la présente invention est applicable à l'un quelconque des systèmes ci-dessus, que les cellules soient cultivées à l'aide en mode discontinu, semi-discontinu ou continu. Dans un mode de réalisation selon l'invention, les cellules utilisées dans le procédé selon la présente invention sont cultivées en mode discontinu. ' - ·

Le procédé selon l'invention peut être appliqué à une large plage de virus, à savoir tout virus capable d'infecter des cellules et de les utiliser pour sa réplication, comprenant, entre autres, les adénovirus, les hépadnavirus, les herpèsvirus, les orthomyxovirus, les papovavirus, les paramyxovirus, les picornavirus, les poxvirus, les réovirus et les rétrovirus. En particulier, le procédé selon l'invention est applicable aux virus enveloppés, comme les myxovirus. Dans un mode de réalisation, les virus produits par le procédé selon l'invention appartiennent à la famille des orthomyxovirus, en particulier, le virus de la grippe (influenza).

Les virus ou antigènes viraux peuvent être dérivés d'un orthomyxovirus, comme le virus influenza. Les antigènes ' orthomyxoviraux peuvent être choisis parmi une ou plusieurs des protéines virales, comprenant 1'hémagglutinine (HA), la neuraminidase (NA), la nucléoprotéine (NP), la protéine matricielle (Ml), la protéine membranaire (M2), une ou plusieurs des transcriptases (PB1, PB2 et PA). En particulier, les antigènes particulièrement appropriés comprennent HA et NA, les deux glycoprotéines de surface qui déterminent la spécificité antigénique des sous-types de la grippe.

Le virus influenza peut être choisi dans le groupe du virus de la grippe humaine, du virus de la grippe aviaire, du virus de la grippe équine, du virus de la grippe porcine, et du virus de la grippe féline. Le virus influenza est plus particulièrement choisi parmi les souches A, B et C, de préférence parmi les souches A et B.

Les antigènes de la grippe peuvent être dérivés de souches influenza interpandémiques (annuelles ou saisonnières). En variante, les antigènes de la grippe peuvent être dérivés de souches ayant le pouvoir de provoquer une éruption pandémique (i.e., souches influenza ayant une

rO nouvelle hémagglutinine comparée à 1'hémagglutinine dans les souches circulant couramment, ou souches influenza qui sont pathogènes chez les sujets aviaires et ont le pouvoir d'être transmises horizontalement dans la population humaine, ou souches influenza qui sont pathogènes pour l'homme). Suivant la saison considérée et la nature particulière de l'antigène inclus dans le vaccin, les antigènes de la'grippe peuvent être dérivés d'un ou de plusieurs des sous-types d'hémagglutinine suivants : Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 ou H16. De préférence, le virus influenza ou ses antigènes proviennent des sous-types Hl, H2, H'3, H5, H7 ou H9.

Dans un mode de réalisation, les virus influenza proviennent des sous-types H2, H5, H6, H7 ou H9. Dans un autre mode de réalisation, les virus influenza proviennent de Hl, H3 ou B.

Les cellules qui sont utilisées dans le procédé selon l'invention peuvent en principe être tout type souhaité de cellules animales qui sont cultivées en culture cellulaire et capables de supporter la réplication du virus. Ce peut être soit des cellules primaires, soit des lignées cellulaires continues. Génétiquement les lignées cellulaires stables sont préférées. Les cellules de mammifères conviennent tout particulièrement, par exemple, les cellules humaines, de hamster, de bétail, de singe ou de chien. En variante, des cellules d'insectes conviennent également, comme, par exemple, les cellules SF9 ou les cellules Hi-5.

Un certain nombre de lignées cellulaires de mammifères sont connues dans l'état de l'art et comprennent les cellules PER.C6, les cellules HEK, les cellules rénales embryonnaires humaines (cellules 293), les cellules HeLa, les cellules CHO, ' les cellules Vero et les cellules MDCK.

Les cellules simiennes appropriées sont, par exemple, les cellules de singe vert africain, telles que les cellules rénales .. comme dans la lignée cellulaire Ver. Les cellules de chien appropriées sont, par exemple, les cellules de rein · comme la lignée cellulaire MDCK. .

Les lignées cellulaires de mammifères appropriées pour cultiver le virus influenza comprennent les cellules MDCK, les cellules Vero, ou les cellules PER.C6. Ces lignées cellulaires sont toutes largement disponibles, par exemple, auprès de la collection ATCC (American Type Cell Culture).

Selon un mode de réalisation spécifique, le procédé selon l'invention utilise des cellules MDCK. La lignée cellulaire MDCK originale est disponible auprès de 1'ATCC sous le nom CCL-34, mais des dérivés de cette lignée cellulaire peuvent également être utilisés, comme des cellules MDCK adaptées pour la culture en suspension (WO 1997/37000).

En variante, les lignées cellulaires utilisables dans l'invention peuvent être dérivées de sources aviaires, comme le poulet, le canard, l'oie, la caille ou le faisan. Les lignées cellulaires aviaires peuvent être dérivées de divers stades de développement dont l'embryon, le poussin et l'adulte. En particulier, les lignées cellulaires peuvent être dérivées de cellules embryonnaires, telles que les fibroblastes embryonnaires, de cellules germinales, ou d'organes individuels, comprenant les tissus et les membranes neuronaux, cérébraux, rétiniens, rénaux, hépatiques, cardiaques, musculaires, ou extra-embryonnaires protégeant l'embryon. Des fibroblastes embryonnaires de poulet (CEF) peuvent être utilisés. Les exemples de lignées cellulaires aviaires comprennent les cellules souches embryonnaires aviaires (WOOl/85938) et les cellules rétiniennes de canard (WO05/042728) . En particulier, la lignée cellulaire EB66® dérivée des cellules souches embryonnaires de canard est envisagée dans la présente invention (WO08/129058). D'autres cellules souches embryonnaires aviaires appropriées comprennent la lignée cellulaire EBx® dérivée de cellules souches embryonnaires de poulet, EB45, EB14 et EB14-074 (W02006/108846). Cette lignée cellulaire EBx® présente l'avantage d'être une lignée cellulaire stable, obtenue naturellement sans nécessiter de modification génétique, chimique ou virale. Ces cellules aviaires conviennent tout particulièrement à la culture des virus influenza.

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention utilise des cellules EB66®.

Les conditions de culture cellulaire (température, densité cellulaire, valeur de pH, etc.) varient sur une très large plage en raison de l'adaptabilité des cellules utilisées et peuvent être adaptées aux exigences des conditions détaillées de culture particulières des virus. Il est de la compétence de l'homme du métier de déterminer les conditions de culture appropriées, dans la mesure où la culture cellulaire est très largement documentée dans l'état de l'art (voir, par exemple, Tissue Culture, Academie Press, Kruse and Paterson, Editeurs (1973), et R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, Quatrième Edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9).

Dans un mode de réalisation spécifique, les cellules utilisées dans le procédé décrit dans la présente invention sont cultivés dans des milieux sans sérum et/ou sans protéines. Un « milieu sans sérum » (SFM) désigne un milieu de culture cellulaire prêt à l'emploi ne nécessitant pas l'ajout de sérum pour la survie et la croissance cellulaires. Ce milieu n'est pas nécessairement défini chimiquement et peut contenir des hydrolysats d'origines diverses, végétale par exemple. Le milieu sans sérum présente l'avantage que la contamination par des virus fortuits, des mycoplasmes ou autres agents infectieux inconnus peut être évitée. « Sans protéines » désigne des cultures dans lesquelles la multiplication des cellules s'opère en l'absence de protéines, de facteurs de croissance, d'autres additifs protéiques et de protéines non sériques. Eventuellement une trypsine ou d'autres protéases qui peuvent être nécessaires à la croissance du virus peuvent être ajoutées lors de l'infection virale. Les cellules se développant dans cette culture contiennent naturellement des protéines elles-mêmes.

Les milieux sans sérum sont commercialisés par de nombreuses sources, par exemple, VP SFM (Invitrogen Ref 11681020), Opti-Pro (Invitrogen, Ref 12309-019), ou EX-CELL (JHR Bioscience). . .

Avant l'infeôtion par le virus, les cellules sont cultivées à environ 37 °C, mieux encore à 36,5 °C, à un pH allant de 6,7 à 7,8, de manière avantageuse autour de 6,8 à 7,5, et mieux encore aux environs de 7,2. Quand les cellules sont des cellules d'insectes, la température avant l'infection par le virus va typiquement de 25 à 29 °C, et est appropriés à 27 °C.

Selon le procédé de production d'un virus selon l'invention, la production de virus en culture cellulaire ' comprend généralement les étapes consistant à a) utiliser une population de cellules cultivées dans un milieu de culture, b) inoculer lesdites cellules avec le virus d'intérêt à produire, de façon à amorcer le processus d'infection des cellules par le virus, et incuber ou cultiver les cellules inoculées pendant une période de temps souhaitée pour permettre la réplication et la propagation du virus, et c) collecter le virus produit. La puissance volumique d'entrée élevée selon la présente invention est de manière avantageuse appliquée . pendant au moins l'étape b), et mieux encore, pendant les étapes a) et b). Par conséquent, selon un mode de'réalisation, dans le procédé de production d'un virus selon la présente invention, une puissance volumique d'entrée d'au moins 15 W/m3, d'au moins 30 W/m3, d'au moins 60 W/m3, d'au moins 100 W/m3, ou d'au moins 120 W/m3 est appliquée aux cellules cultivées pendant les étapes a) et b).

Les termes « inoculer/inoculation » et « cellules inoculées » s'entendent dans le cadre de la présente invention . comme le moment où le virus d'intérêt est ajouté aux cellules, et désignent les cellules auxquelles le virus d'intérêt a été ajouté, respectivement. Les termes « après l'inoculation » s'entendent comme le laps de temps après que le virus a été ajouté aux cellules. Dans le reste de la description, le temps « après inoculation » est indiqué en minutes, heures ou jours, comme par exemple, « 2 h après l'inoculation », ou « 1 jour (Jl) après l'inoculation ». Le jour où les cellules sont inoculées avec le virus est considéré comme le jour 0 (JO) .

Les trois étapes successives de l'inoculation du virus, de la réplication du virus et de la propagation du virus s'entendent comme faisant partie du processus plus large de l’infection par le virus. Une puissance volumique d'entrée élevée telle que définie dans la présente invention peut être appliquée à la culture cellulaire pendant l'une quelconque des étapes ci-dessus. La puissance volumique d'entrée élevée au sens de la présente invention peut être appliquée de manière appropriée . aux cellules pendant qu'elles se développent et sont cultivées avant d'être infectées par le virus d'intérêt. La puissance volumique d'entrée élevée au sens de la présente invention peut également être appliquée de manière appropriée aux cellules après qu'elles ont été inoculées avec le virus et/ou pendant leur incubation pour laisser le virus se répliquer et se propager. La puissance' volumique d'entrée élevée peut également être appliquée de manière appropriée aux cellules pendant qu'elles se développent et sont cultivées avant d'être infectées, après qu'elles ont été inoculées avec le virus, et pendant leur incubation pour laisser le virus se répliquer et se propager. Dans un mode de réalisation, la puissance volumique d'entrée est appliquée aux cellules utilisées dans le procédé selon l'invention après qu'elles aient été inoculées avec le virus d'intérêt et jusqu'à ce que le virus produit soit collecté. Dans un autre mode de réalisation, la puissance volumique d'entrée élevée est appliquée aux ' cellules, pendant qu'elles se développent et sont cultivées avant d'être infectées par le virus d'intérêt, ainsi qu'après qu'elles aient été inoculées avec ledit virus et jusqu'à ce que le virus produit soit collecté. ' Afin de produire de grandes quantités de virus, il peut être avantageux d'inoculer les cellules avec le virus d'intérêt une fois que les cellules aient atteint une densité élevée. Généralement, l'inoculation est pratiquée quand la densité cellulaire est au moins d'environ 5 x 106 cellules/ml, de manière avantageuse de 6 x 106 cellules/ml, mieux encore de 7 x 106 cellules/ml, mieux encore de 8 x 106 cellules/ ml, mieux encore de 9 x 106 cellules/ml, voire plus, comme 10 x 106 cellules/ml, 11 x 106 cellules/ml, 12 x 106 cellules/ml ou 13 x 106 cellules/ml, voire plus, comme 20 x 106 cellules/ml, 25 x 106 cellules/ml, ou 30 x 106 cellules/ml. Dans un mode de réalisation selon la présente invention, la densité cellulaire atteinte avant que l'infection par le virus n'ait lieu est d'au moins 8 x 106 cellules/ml, 9 x 106 cellules/ml, 10 x' 106 cellules/ml, 11 x 106 cellules/ml, 12 x 106 cellules/ml ou 13 x 106 cellules/ml. Dans un autre mode de réalisation, la densité cellulaire atteinte avant que l'infection par le virus n'ait lieu est d'au moins 20 x 106 cellules/ml, 25 x 106 cellules/ml, ou 30 x 106 cellules/ml. Ces niveaux de densité élevée peuvent . être avantageusement atteints à l'aide d'un système de 'perfusion pour culture cellulaire. La densité cellulaire optimale pour obtenir la production de virus la plus élevée , peut varier en fonction du type de cellule utilisé pour la propagation du virus. Des techniques standards pour détecter des protéines, telles qu'une analyse par Western-Blot, ou le dosage SRD pour le virus influenza, ou le CPE tels que décrits ci-dessus, peuvent également être utilisées pour déterminer la plage de densités cellulaires optimale requise.pour obtenir un rendement viral optimisé.

Afin de produire de grandes quantités de· virus, il peut également être avantageux de mettre en œuvre une phase d'adsorption du virus. Par « phase d'adsorption », on entend que les cellules sont inoculées avec le virus à une densité élevée, de façon à favoriser 1'adsorption du virus sur les . membranes cellulaires, pendant une courte période de temps, avant que la densité cellulaire ne soit réduite pour le reste de la période d'infection et jusqu'à ce que le virus soit collecté. Par exemple, l'inoculation des cellules avec le virus est pratiquée quand la densité cellulaire est d'au moins 8 X 106 cellules/ml, de manière avantageuse d'au moins 9 x 106 cellules/ml, mieux encore d'au moins 10 x 106 cellules/ml, mieux encore d'au moins 11 x 106 cellules/ml, mieux encore d'au moins 12 x 106 cellules/ml, mieux encore d'au moins 13 x 106 cellules/ml, voire plus, comme 20 x 106 cellules/ml, 25 x 106 cellules/ml, ou 30 x 10® cellules/ml. De manière avantageuse 30 min, mieux encore 45 min, voire lh, lh30, ou 2h après l'inoculation avec le virus, les cellules inoculées sont diluées par un facteur allant de 2 à 5, de manière avantageuse de 3, pour le reste du processus d'infection, i.e. pour 1'incubation ultérieure avant que le virus produit ne soit collecté. En variante, à la fin de la phase d' adsorption, les cellules inoculées sont diluées de façon à obtenir une densité cellulaire finale allant de 3 à 5 x 106 cellules/ml, de manière avantageuse 4 x 106 cellules/ml, pour le reste du processus d'infection, i.e. pour l'incubation ultérieure avant que le virus produit ne soit collecté.

Dans un autre mode de réalisation, quand la densité cellulaire est d'au moins 8 x 106 cellules/ml, d'au moins 9 x 106 cellules/ml, d'au moins 10 x 106 cellules/m, d'au moins 11 X 106 cellules/ml, d'au moins 12 x 106 cellules/ml, d'au moins 13 x 106 cellules/ml, d'au moins 20 x 106 cellules/ml, d'au moins 25 x 106 cellules/ml, ou d'au moins 30 x 106 cellules/ml, les cellules sont inoculées avec le virus, et immédiatement après l'inoculation, les cellules inoculées sont diluées, soit par un facteur allant de 2 à 5, de manière appropriée 3, soit de façon à obtenir une densité cellulaire finale allant de 3 à 5 x 106 cellules/ml, de manière appropriée de 4 x 106 cellules/ml, pour le reste du processus d'infection, i.e. pour une incubation ultérieure avant que le virus produit ne soit collecté. .

Quand une phase d'adsorption est mise en œuvre, la puissance volumique d'entrée peut être de manière appropriée maintenue à un niveau bas, comme par exemple, à une valeur allant de 2 à 10 W/m3, de 4 à 8 W/m3, de manière avantageuse de 7 W/m3, pendant ladite phase, i.e. après que les cellules aient été inoculées avec le virus d'intérêt et avant que les cellules inoculées soient diluées. Par conséquent, dans un mode de réalisation selon l'invention, le procédé de production d'un virus en culture cellulaire comprend au moins les étapes consistant à a) utiliser une population de cellules cultivées dans un milieu de culture, b) infecter la population de cellules avec le virus par i. inoculation de la population avec le virus quand la densité cellulaire est d'au moins 8 x 10e cellules/ml, d'au moins 9 x 106 cellules/ml, d'au moins 10 x 106 cellules/ml, d'au moins 11 x 106 cellules/ml, d'au moins 12 x 106 cellules/ml, ou d'au moins 13 x 106 cellules/ml pendant 30 min, 45 min, lh, lh30, ou 2h, puis dilution des cellules inoculées par un facteur allant de 2 à 5, ou un facteur de 3, ou en variante, de façon que la densité cellulaire finale obtenue soit de 3 à 5 x 106 cellules/ml, de manière appropriée de 4 x 10e cellules/ml et ii. incubation de la population inoculée diluée de façon à permettre au virus de se répliquer et de se propager, la puissance volumique d'entrée appliquée à la culture cellulaire étant d'au moins 15 W/m3, d'au moins 30 W/m3, d'au moins 60 W/m3, d'au moins 100 W/m3, ou d'au moins 120 W/m3, avant que les cellules ne soient inoculées avec le virus, puis réduite à une valeur allant de 2 à 10 W/m3, de 4 à 8 W/m3, ou 7 W/m3, après que les cellules aient été inoculées et avant que les cellules inoculées ne soient diluées, et portée à au moins 15 W/m3, au moins 30 W/m3, au moins 60 W/m3, ' au moins 100 W/m3, ou au moins 120 W/m3 après que les cellules inoculées aient été diluées et jusqu'à ce que le virus produit soit collecté. En variante, la puissance volumique d'entrée peut être maintenue à une valeur constante pendant toute la phase d'adsorption. Par conséquent, dans un autre mode de réalisation, la puissance volumique d'entrée appliquée à la culture cellulaire selon la présente invention est maintenue à au moins 15 W/m3, au moins 30 W/m3, au moins 60 W/m3, au moins 100 W/m3, ou au moins 120 W/m3, au cours des étapes successives d'utilisation d'une population de cellules cultivées dans un milieu de culture cellulaire, d'inoculation de ladite population avec le virus d'intérêt pendant 30 min, 45 min, lh, lh30, ou 2h, de dilution des cellules inoculées en fonction des conditions ci-dessus, et d'incubation de la population inoculée diluée. L'inoculation peut être pratiquée à une MOI (Multiplicité d'infection) d'environ ICh1 à 10~7, de manière avantageuse d'environ ' ' 10~2 à 10~6, et mieux encore, d'environ 10~5.

Les conditions de température et de pH pour l'infection par le virus peuvent varier. La température peut aller de 32 à 39 °C suivant le type de virus. Pour la production du virus influenza, l'infection de la culture cellulaire peut varier en fonction de la souche qui est produite. L'infection par le virus influenza est de manière avantageuse mise en œuvre à une température allant de 32 à 35 °C, mieux encore à 33 °C. Dans un mode de réalisation, l'infection par le virus se produit à 33 °C. Dans un autre mode de réalisation, l'infection par le virus se produit à 35 °C. Des protéases, typiquement une trypsine, peuvent être ajoutées à la culture cellulaire suivant la souche du virus, pour permettre la réplication du virus. La protéase peut être ajoutée à toute étape appropriée pendant la culture. La trypsine est de préférence d'origine non animale, c'est-à-dire que la protéase n'est pas purifiée à partir d'une source animale. Elle est de manière appropriée produite par recombinaison dans un micro-organisme, tel qu'une bactérie, une levure ou une plante. A titre d'exemples appropriées de trypsine recombinée, il y a le Trypzean, une trypsine recombinée produite dans le blé (Prodigen, 101 Gateway Blvd, Suite 100 College Station, Texas 77845. Code fabriquant : TRY), ou TrpLE (Invitrogen) qui est une enzyme de type trypsine exprimée dans un champignon (W02004/020612). Dans un mode de réalisation, la trypsine est ajoutée en même temps que le virus est inoculé aux cellules, i.e. la trypsine est ajoutée au jour 0 (J0). Dans un autre mode de réalisation, la trypsine est en outre ajoutée à différents points temporels après l'inoculation, comme par exemple, au jour 1 (Jl) et/ou au jour 4 (J4) après l'inoculation. Dans un autre mode de réalisation, la trypsine est en outre ajoutée chaque jour après l'inoculation du virus jusqu'à ce que le virus produit soit collecté. . '

Une fois infectées, les cellules peuvent libérer dans le milieu de culture des particules virales nouvellement formées, par lyse spontanée des cellules hôtes, également appelée lyse passive. Par conséquent, dans un mode de réalisation, la récolte virale produite par les cellules peut être obtenue à tout moment après l'inoculation du virus, par collecte du milieu de culture cellulaire. Ce mode de récolte est particulièrement approprié quand on souhaite récolter le virus produits par les cellules à différents points temporels après l'inoculation du virus, et regrouper les différentes récoltes, si nécessaire.

En variante, après l'infection par le virus, le virus basé sur une culture cellulaire peut être récolté en utilisant un facteur externe pour, la lyse des cellules hôtes, également appelée lyse active. Toutefois, contrairement au·précédent, ce mode de récolte nécessite que la récolte virale dérivée des cellules soit collectée à un seul point temporel, dans la mesure où la lyse active met immédiatement fin à la culture cellulaire.

Les procédés qui peuvent être utilisés pour la lyse active des cellules sont connus de l'homme du métier. Les procédés utiles à cet égard sont par exemple, la congélation-décongélation, le cisaillement en phase solide, la lyse hypertonique et/ou hypotonique, le cisaillement en phase liquide, l'extrusion à haute pression, la lyse au détergent, ou toute combinaison de ceux-ci.

Selon un mode de réalisation, la récolte virale basée sur la culture cellulaire peut être obtenue à tout moment après inoculation du virus par collecte des surnageants des cultures cellulaires, lyse des cellules inoculées ou les deux.

Avant récolte, l'infection des cellules peut durer de 2 à 10 jours. Selon un mode de réalisation spécifique, les surnageants de culture des jours 3, 4 et 5 après l'inoculation sont récoltés et regroupés à des fins de traitement aval ultérieur (isolation du virus ou purification du virus). Selon un autre mode de réalisation, le surnageant de la culture cellulaire est collecté à partir du jour 5 après l'inoculation. Le moment optimal pour récolter le virus produit par les cellules se base généralement sur la détermination du pic d'infection. Par exemple, le CPE (effet cytopathique) est mesuré en surveillant les changements morphologiques s'opérant dans les cellules hôtes après l'inoculation du virus, comprenant l'arrondissement, la désorientation, le gonflement ou le rétrécissement, la mort, et le décollement de la surface des cellules. La détection d'un antigène viral spécifique peut également être surveillée par des techniques standards de détection de protéines, telles que l'analyse par Western-Blot. La récolte peut ensuite être effectuée quand le niveau de détection recherché est atteint. Dans le cas particulier du virus influenza, la teneur en HA peut être surveillée à tout moment après l'inoculation des cellules avec le virus, par le dosage SRD (Wood, JM, et al. (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247), qui est une technique connue de l'homme du métier. En plus, le dosage SRD peut également être utilisé pour déterminer la plage de densités cellulaires optimale requise pour obtenir un rendement viral optimisé.

Dans le cadre de la présente invention, on comprendra que la phase de culture cellulaire comprend toute étape précédant l'étape de collecte du virus, tandis que la phase de purification du virus comprend toute étape suivant ladite étape de collecte.

Selon l'invention, après la production en culture cellulaire, le virus est purifié. Toute étape ou technique appropriée connue dans le domaine de la purification des virus peut être mise en œuvre de manière appropriée dans le procédé selon l'invention après que le virus produit soit collecté. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend au moins une étape choisie parmi la clarification, 1'ultrafiltration/diafiltration, l'ultracentrifugation et la chromatographie de la récolte virale, ou toute combinaison de celles-ci.

Dans un mode de réalisation spécifique, pendant la phase de purification du virus, le procédé selon l'invention comprend au moins une étape de clarification de la récolte virale, une étape d'ultrafiltration/diafiltration pour obtenir ainsi un rétentat et une étape d'ultracentrifugation.

Après collecte du milieu de culture cellulaire contenant le virus des cellules infectées, la récolte virale obtenue est typiquement clarifiée afin de séparer le virus du matériel cellulaire, tel que les cellules intactes ou les débris cellulaires. La clarification peut être effectuée par une étape de filtration, typiquement une étape de microfiltration, i.e. à l'aide de filtres ayant une taille de pores typiquement entre 0,1 et 10 pm. Les filtres appropriés peuvent utiliser les filtres en cellulose, les filtres en cellulose régénérée, les fibres cellulosiques combinées à des auxiliaires de filtration inorganiques, un filtre en cellulose combiné à des auxiliaires de filtration inorganiques et des résines organiques, ou toute combinaison de ceux-ci, et des filtres polymères. Bien que ce ne soit pas requis, un procédé de filtration multiple peut être mis en œuvre, comme un procédé en deux ou trois étapes consistant, par exemple, à éliminer séquentiellement et progressivement les impuretés en fonction de leur taille, à l'aide de filtres ayant une taille de pore nominale appropriée,, en particulier, des filtres ayant une taille de pore nominale décroissante, permettant de commencer par éliminer les gros précipiités et les débris cellulaires. De plus, des opérations en une seule étape utilisant un filtre relativement serré et une centrifugation peuvent également être utilisées pour la clarification. Plus généralement, toute approche de clarification comprenant, entre autres, la filtration à flux direct ou filtration « frontale », la filtration en profondeur, la filtration à flux tangentiel ou . la filtration à flux croisés, ou la centrifugation, qui donnent un filtrat ayant une limpidité appropriée pour ne pas encrasser la mèmbrane et/ou les résines dans des étapes ultérieures, seront acceptables pour une utilisation dans l'étape de clarification selon la présente invention. Dans un mode de réalisation, la clarification virale est effectuée par filtration en profondeur, en particulier, à l'aide d'une filtration en trois étapes composée, par exemple, de trois filtres en profondeur différents ayant des porosités nominales de 5 pm - 0,5 pm - 0,2 pm. Dans un autre mode de réalisation, la récolte virale est clarifiée par microfiltration, éventuellement précédée par une étape de centrifugation à titre de pré-clarification. Dans des modes de réalisation particuliers dans lesquels le procédé de production d'un virus, tel que le virus influenza, selon l'invention comprend une étape de clarification de type microfiltration pendant l'étape d) de purification, le rendement viral, tel que le rendement HA pour le virus influenza, obtenu après ladite étape de clarification est d'au moins 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 85 %, 90 % ou plus.

Selon la présente invention, pendant la phase de purification du virus du procédé selon la présente invention, la récolte virale peut également être soumise à ultrafiltration (parfois appelée « diafiltration » quand elle est utilisée pour remplacer le tampon), pour concentrer le virus et/ou remplacer le tampon. Cette étape est particulièrement avantageuse quand le virus à purifier est dilué, comme c'est le cas, par exemple, quand les récoltes virales regroupées sont collectées par perfusion sur plusieurs jours après l'inoculation. Le procédé utilisé pour concentrer le virus et/ou remplacer le tampon selon le procédé de la présente invention, peut comprendre tout procédé de filtration dans lequel la concentration du virus est augmentée en forçant le diluant à passer par un filtre de façon que le diluant soit chassé de la suspension virale tandis que le virus, incapable de traverser le filtre, ainsi subsiste sous forme concentrée dans la préparation virale. . Si des membranes ou des filtres qui ne sont pas neutres mais chargés positivement sont utilisés, il peut être utile de mettre en œuvre une étape supplémentaire de rinçage de ladite membrane ou dudit filtre avec un tampon de rinçage comprenant des sels pour éluer la fraction virale qui peut avoir été retenue en raison d'interactions ioniques avec la membrane ou le filtre. Un exemple de sel approprié qui peut être inclus dans le tampon de rinçage est le chlorure de sodium (NaCl) , qui peut être présent à une concentration allant, de 0,1 à 2M, en particulier, de 0,5 à 1,5M, demanière avantageuse de IM. Dans un mode de réalisation selon l'invention, quand la clarification est effectuée par filtration sur membrane, qu'il s'agisse d'une pré-clarification ou d'une clarification, ladite clarification comprend une étape de rinçage de membrane à l'aide d'un tampon comprenant NaCl, en particulier, NaCl IM. L'ultrafiltration peut comprendre la diafiltration qui est une façon idéale d'éliminer et de remplacer les sels, les sucres, les solvants non aqueux, d'éliminer les matériels de bas poids moléculaire, ou de remplacer rapidement les environnements ioniques et/ou de pH. Les microsolutés sont éliminés très efficacement par ajout de solvant à la solution en cours d'ultrafiltration à une vitesse égale à la vitesse d'ultrafiltration. Les micro-espèces sont lavées de la solution à volume constant, isolant le virus retenu. La diafiltration est particulièrement avantageuse quand une étape aval exige l'utilisation d'un tampon spécifique pour obtenir . une réaction optimale. Par exemple, la mise en œuvre d'une étape de diafiltration avant dégradation des acides nucléiques de la cellule hôte avec une endonucléase peut permettre à la réaction de l'endonucléase de se dérouler dans un tampon spécifique et optimal pour l'endonucléase. La concentration et la diafiltration peuvent également être mises en œuvre à toute étape appropriée du processus de purification, quand on souhaite éliminer des composés indésirables, tels que le saccharose, après une ultracentrifugation sur gradient de saccharose, ou tel que le formaldéhyde, après une étape d'inactivation du virus par le formaldéhyde. Le système est composé de trois flux de procédé distincts : la solution chargée (contenant le virus), le perméat et le rétentat. Suivant l'application, des filtres ayant des tailles de pores différentes peuvent être utilisés. Dans la présente invention, le rétentat contient le virus et peut être utilisé pour d'autres étapes de purification, si souhaité. La composition de la membrane peut être, entre autres, une cellulose régénérée, une polyéthersulfone, une polysulfone, ou des dérivés de celles-ci. Les membranes peuvent être des feuilles plates (également appelées « écrans plats ») ou des fibres creuses.

Dans un mode de réalisation, la phase de purification du virus dans le procédé selon l'invention comprend au moins une . étape d'ultrafiltration/diafiltration, de manière avantageuse au moins deux étapes d'ultrafiltration/diafiltration.

Suivant l'application pour laquelle le virus produit en culture cellulaire est purifié,. il peut être souhaitable d'éliminer également de la récolte virale les contaminants de type acides nucléiques des cellules hôtes. En particulier, quand le virus purifié est destiné à être incorporé dans un vaccin, les acides nucléiques des cellules hôtes doivent être dégradés et éliminés du. virus purifié. La dégradation des acides nucléiques, s'effectue fréquemment par utilisation de nucléases ciblant l'ARN et l'ADN. Un exemple non limitatif de nucléase appropriée pour dégrader les acides nucléiques des cellules hôtes est la Benzonase™. La Benzonase™, ou toute autre nucléase appropriée, peut être ajoutée à toute étape appropriée au processus de purification de virus. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend une étape de dégradation par la nucléase, de manière avantageuse un traitement à la Benzonase™. Par exemple, une nucléase peut être ajoutée au rétentat obtenu après l'ultrafiltration d'un milieu de culture cellulaire clarifié contenant le virus. En variante, la dégradation des acides nucléiques des cellules hôtes peut être effectuée par une étape d'inactivation de virus avec une bêta-propiolactone.

Si souhaité, le virus obtenu selon la présente invention peut en outre être purifié à l'aide des techniques standards utilisées pour la purification des virus telles que la centrifugation sur gradient de densité, par exemple ultracentrifugation sur gradient de saccharose et/ou chromatographie, telle que chromatographie échangeuse d'ions.

Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend au moins une étape de centrifugation sur gradient de saccharose. Dans un autre mode de réalisation, la phase de purification du procédé selon l'invention comprend au moins _ une étape de clarification, telle que par exemple, une étape de centrifugation suivie d'une étape de microfiltration, d'au moins une étape d'ultrafiltration, et d'une étape de centrifugation sur gradient de saccharose. Dans des modes de réalisation particuliers dans lesquels le procédé de production d'un virus, tel que le virus influenza, selon 1'invention comprend au moins une étape de centrifugation sur gradient de saccharose pendant l'étape d) de purification, la capacité de charge sur le rotor de la centrifugeuse est d'au moins 40, d'au moins 50, d'au moins 60, ou plus, litres de récolte virale, ou la quantité « équivalente », par litre de rotor, et le rendement viral, tel que le rendement HA pour le virus influenza, obtenu après ladite étape de centrifugation sur gradient de saccharose est d'au moins 65 %, 66 %, 67 %·, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 85 %, 90 % ou plus.

Selon le procédé de l'invention, il est possible de combiner une étape de purification, telle qu'une ultracentrifugation sur gradient de saccharose, avec une étape . de fragmentation de virus. En particulier, un agent de fragmentation peut être ajouté au gradient de saccharose. Ce mode de réalisation est particulièrement approprié, quand on souhaite réduire au minimum le nombre total d'étapes du procédé selon l'invention, car il permet, en une seule opération, à la fois de purifier et de fragmenter le virus. De ce fait, dans certains modes de réalisation, quand au moins une ultracentrifugation sur gradient de saccharose est mise en œuvre, le gradient de saccharose comprend en plus un agent de fragmentation.

En variante, l'étape de fragmentation du virus du procédé selon la présente invention, quand elle est mise en œuvre, est réalisée en mode discontinu. A la fin de la phase de purification du virus, la préparation virale obtenue selon le procédé de la présente invention peut être soumise de manière appropriée à une filtration stérile, une pratique courante dans les procédés utilisant des matériels de nature pharmaceutique, tels que les compositions immunogènes ou les vaccins, et connue de.. · 1 ' homme du métier. Cette filtration stérile peut par exemple être mise en œuvre de manière appropriée par filtration de la préparation sur filtre de 0,22 pm. Une fois la préparation stérile, le virus et les antigènes viraux sont prêts à l'utilisation clinique, si souhaité.

Les compositions immunogènes, en particulier les vaccins, peuvent généralement être formulés sous la forme d'un sub- virion, e.g. sous la forme d'un virus fragmenté, dont l'enveloppe lipidique a été dissoute ou rompue, ou sous la forme d'une ou de plusieurs protéines virales purifiées (sous-unités vaccinales). En variante, les compositions immunogènes peuvent comprendre un virus entier, e.g. un virus entier vivant atténué, ou un virus entier inactivé.

Les procédés de fragmentation de virus, tels que les virus influenza, sont bien connus dans, l'état de l'art (WO02/28422 ) . La fragmentation du virus est mise en œuvre par rupture ou fragmentation du virus entier qu'il soit infectieux (type sauvage ou atténué) ou non infectieux (inactivé) à l'aide d'une concentration de rupture d'un agent de fragmentation. Les agents de fragmentation comprennent généralement des agents capables de rompre et de dissoudre les membranes lipidiques. De manière classique, le virus influenza fragmenté a été produit par un traitement utilisant un solvant/ détergent, tel que le phosphate de tri-n-butyle, ou l'éther diéthylique en combinaison avec du Tween™ (fragmentation connue sous le nom de fragmentation au « Tween-éther ») et ce procédé est toujours utilisé dans certaines unités de production. D'autres agents de fragmentation actuellement utilisés comprennent les détergents ou les enzymes protéolytiques ou les sels biliaires, par exemple, le désoxycholate de sodium. Les détergents qui peuvent être utilisés à titre d'agents de fragmentation comprennent les détergents cationiques, e.g. le bromure de cétyl-triméthyl-ammonium (CTAB), d'autres détergents ioniques, e.g. laurylsulfate de sodium (SLS), taurodésoxycholate, ou des détergents non ioniques tels que le Tween ou le Triton X-100, ou la combinaison de deux détergents quelconques ou plus.

Dans un mode de réalisation, l'agent de fragmentation est le désoxycholate. Dans un autre mode de réalisation, l'agent de fragmentation est le Triton X-100. Dans un autre mode de réalisation encore, le procédé selon l'invention utilise une ' combinaison de Triton X-100 et de laurylsulfate de sodium à titre d'agents de fragmentation.

Le procédé de fragmentation peut être mis en œuvre en mode discontinu, continu ou semi-continu. En mode discontinu, le virus fragmenté peut nécessiter une étape supplémentaire de purification, telle qu'une étape de chromatographie. Il n'est pas nécessaire de mettre en œuvre une étape de fragmentation en œuvre seule, dans la mesure où il est possible de pratiquer la fragmentation simultanément à une étape de purification.

Par exemple, un détergent peut être ajouté au gradient de saccharose destiné à purifier les protéines par ultracentrifugation, comme décrit ci-dessus. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend une étape de fragmentation mise en œuvre en mode discontinu avec un détergent, en particulier, le Triton X-100, en plus d'au moins une étape d'homogénéisation.

Pour l'innocuité des vaccins, il peut être nécessaire de réduire l'infectiosité de la suspension virale au cours des différentes étapes du procédé de purification. L'infectiosité d'un virus est déterminée par sa capacité à se répliquer dans une lignée cellulaire. Par conséquent, le procédé selon la présente invention comprend, éventuellement, au moins une étape d'inactivation du virus. L'inactivation peut être effectuée à l'aide, par exemple, d'une bêta-propiolactone (BPL), de formaldéhyde, ou d'UV, ou toute combinaison de ceux- ' -ci, à toute étape appropriée du procédé. Dans un mode de réalisation spécifique, le procédé selon l'invention comprend en outre au moins une étape de traitement à la BPL. Dans un mode de réalisation spécifique, le procédé selon l'invention comprend en outre au moins une étape de traitement à la BPL et au moins une étape de traitement au formaldéhyde. Le formaldéhyde et la BPL peuvent être utilisés séquentiellement, dans un ordre quelconque, par exemple, le formaldéhyde est utilisé après la BPL. Dans un mode de réalisation, le traitement au formaldéhyde est suivi au moins d'une étape d'homogénéisation. En particulier, quand des UV sont utilisés à titre de procédé d'inactivation, la mise en œuvre de l'homogénéisation de la préparation virale avant l'exposition aux UV peut contribuer à améliorer l'efficacité de l'inactivation du virus. Les virus, ou parties de virus, qui pourraient être à l'intérieur d'agrégats, que ce soit des agrégats de virus ou des agrégats de virus/cellules peuvent .échapper au rayonnement en raison de leur enfouissement à l'intérieur desdits agrégats, et par conséquent, certains virus ou parties de virus sont inaccessibles à l'agent d'inactivation. Dans un mode de réalisation, la préparation virale obtenue par le procédé selon la présente invention est inactivée, par exemple, par un rayonnement UV, et l'homogénéisation est mise en œuvre immédiatement avant ladite inactivation. Les conditions d'inactivation virale peuvent varier et seront déterminées, en particulier, par évaluation de l'infectiosité virale résiduelle par mesure de la dose infectieuse en culture tissulaire (DICTso/ml).

Les compositions immunogènes selon la présente invention, comprenant les vaccins, peuvent éventuellement contenir les additifs usuels pour les vaccins, en particulier des substances qui augmentent la réponse immunitaire suscitée chez . un patient qui reçoit la composition, i.e. lesdits adjuvants.

Dans un mode de réalisation, les compositions immunogènes qui comprennent un virus ou un antigène viral selon la présente invention mélangé à un véhicule pharmaceutique convenable sont envisagées. Dans un mode de réalisation spécifique, elles comprennent un adjuvant.

Les compositions adjuvantes peuvent comprendre une - émulsion huile dans l'eau qui comprend une huile métabolisable et un agent émulsifiant. Pour qu'une composition huile dans l'eau quelconque puisse convenir à l'administration humaine, la phase huileuse du système d'émulsion doit comprendre une huile métabolisable. La signification du terme « huile métabolisable » est connue dans l'état de l'art. « Métabolisable » peut être défini comme « capable d'être transformé par le métabolisme » (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25ème Edition (1974)). L'huile peut être toute huile végétale, huile de poisson, huile animale ou huile synthétique, qui n'est pas toxique pour le receveur et peut être transformée par le métabolisme. Les noix, les graines, et les grains sont des sources courantes d'huiles végétales. Les huiles synthétiques font également partie de cette invention et peuvent comprendre des huiles commerciales telles que NEOBEE® et autres.

Une huile métabolisable particulièrement appropriée est le squalène. Le squalène (2,6,10,15,19,23-hexaméthyl-2,6,10, 14, 18,22-tétracosahexène) est une huile insaturée que l'on trouve en grandes quantités dans l'huile de foie de requin, et en moindres quantités, dans l'huile d'olive, l'huile de germes de blé, l'huile de son de riz, et la levure, et est une huile particulièrement préférée dans le cadre de cette invention. Le squalène, qui est un intermédiaire dans la' biosynthèse du cholestérol, est de ce fait une huile métabolisable (Merck -index, 10ème Edition, entrée no. 8619) . Dans un autre mode de réalisation selon l'invention,· l'huile métabolisable est présente dans la composition immunogène en une quantité de 0,5 . à 10 % (v/v) du volume total de la composition. . L'émulsion huile dans l'eau comprend en outre un agent émulsifiant. L'agent émulsifiant approprié peut être "le monooléate de polyoxyéthylène sorbitan. De plus, ledit agent émulsifiant est présent de manière appropriée dans le vaccin ou la composition immunogène à raison de 0,125 à 4 % (v/v) du volume total de la composition. L'émulsion huile dans l'eau selon la présente invention comprend éventuellement un tocol. Les tocols sont connus dans l'état de l'art et décrits dans EP0382271. Un tocol approprié peut être un alpha-tocophérol ou un dérivé de celui-ci tel qu'un succinate d'alpha-tocophérol (également connu sous le nom de succinate de vitamine E). Ledit tocol est présent dans la composition adjuvante de manière appropriée en une quantité de 0,25 à 10 % (v/v) du volume total de la composition immunogène.

Le procédé de production des émulsions huile dans l'eau est bien connu de l'homme du métier. Généralement, il comprend le mélange de la phase huileuse (contenant éventuellement un tocol) avec un agent tensioactif tel qu'une solution PBS/TWEEN80™, suivi de son homogénéisation à l'aide d'un homogénéiseur, étant entendu pour l'homme du métier qu'un procédé comprenant le passage du mélange deux fois par une aiguille de seringue conviendrait pour homogénéiser de petits volumes de liquide. De la même façon, le procédé d'émulsification en' microfluidique (appareil M110S Microfluidics, maximum de 50 passages, pendant une période de 2 minutes à une .pression d'entrée maximale de 6 bars (pression de sortie d'environ 850 bars)) pourrait .être adapté par l'homme du métier pour produire des volumes d'émulsion plus ou moins importants. ' L'adaptation pourrait s'effectuer par expérimentation classique comprenant la mesure de l'émulsion obtenue jusqu'à obtention d'une préparation ayant des gouttelettes d'huile du diamètre requis.

Dans une émulsion huile dans l'eau, l'huile et l'émulsifiant sont dans un véhicule aqueux. Le véhicule aqueux peut être, par exemple, une solution salée à tampon phosphate.

En particulier, les systèmes d'émulsion huile dans l'eau selon la présente invention ont une petite taille de gouttelettes d'huile de l'ordre du sous-micron. De manière appropriée, les tailles des gouttelettes seront dans la plage de 120 à 750 nm, plus particulièrement de 120 à 600 nm de diamètre. Plus particulièrement encore, l'émulsion huile dans l'eau contient des gouttelettes d'huile dont au moins 70 % en intensité ont un diamètre inférieur à 500 nm, plus particulièrement au moins 80 % en intensité ont un diamètre inférieur à 300 nm, plus particulièrement au moins 90 % en intensité ont un diamètre dans la plage de 120 à 200 nm.

La taille des gouttelettes d'huile, i.e. leur diamètre, selon la présente invention est indiquée en intensité. Il existe plusieurs façons de déterminer le diamètre des gouttelettes d'huile par intensité. L'intensité se mesure à l'aide d'un instrument de calibrage, de manière appropriée par diffusion dynamique de la lumière tel que le Malvern Zetasizer 4000 ou de manière appropriée le Malvern Zetasizer 3000HS. Une procédure détaillée est indiquée dans l'Exemple II. 2. Une première possibilité consiste à déterminer le diamètre moyen z ZAD par diffusion dynamique de la lumière (spectroscopie PCS par corrélation de photons) ; ce procédé peut en plus donner l'indice de polydispersité (PDI), et le ZAD et le PDI sont tous deux calculés avec l'algorithme des cumulants. Ces valeurs ne nécessitent pas de connaître l'indice de réfraction des particules. Un second moyen consiste à calculer le diamètre de la gouttelette d'huile par détermination de la distribution des tailles de particules entières par un autre algorithme, soit le Contin, soit NNLS, ou le « Malvern » automatique (algorithme par défaut fourni avec l'instrument de calibrage). La plupart du temps, comme l'indice de réfraction des particules d'une composition complexe est inconnu, seule la distribution des intensités est prise en compte, et si nécessaire la moyenne des intensités provenant de cette distribution.

Les compositions adjuvantes peuvent en outre comprendre un agoniste des récepteurs Toll-like (TLR) 4. Par « agoniste TLR4 », on entend un composant qui est capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire de la voie de signalisation TLR4, soit sous la forme d'un ligand direct, soit indirectement par. génération d'un ligand endogène ou exogène (Sabroe et al, JI 2003 pl630-5). Le TLR 4 peut être un dérivé du lipide A, plus particulièrement le lipide A monophosphorylé ou plus particulièrement le lipide A monophosphorylé 3-désacylé (3D-MPL).

Le 3D-MPL est commercialisé sous le nom de marque MPL® par GlaxoSmithKline Biologicals North America et favorise avant tout les réponses des cellules T CD4+ ayant un phénotype IFN-γ (Thl) . Il peut être produit selon les procédés décrits dans GB 2 220 211 A. Chimiquement c'est un mélange de lipide A monophosphorylé 3-désacylé avec 3, 4, 5 ou 6 chaînes acylées.

En particulier, dans les compositions adjuvantes selon la présente invention, le 3D-MPL à petites particules est utilisé. Le 3D-MPL à petites particules a une taille de particules telle qu'il peut être filtré stérilement sur filtre de 0,22 μπι. Ces préparations sont décrites dans la demande de brevet internationale No W094/21292. Des dérivés synthétiques de lipide A sont connus et considérés comme des agonistes de TLR4, ces dérivés comprenant entre autres : OM174 (2-désoxy-6-0-[2-désoxy-2-[(R)-3-dodécanoyl-oxytétra-décanoylamino]-4-O-phosphono-ß-D-glucopyranosyl]-2-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]-a-D-glucopyranosyl-dihydrogénophosphate), (WO 95/14026) OM 294 DP (3S, 9R)-3-[(R)-dodécanoyloxytétradécanoyl- ‘ amino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]- décan-1,10-diol,1,10-bis(dihydrogénophosphate) (W099 /64301 et WO 00/0462) OM 197 MP-Ac DP (3S, 9R) -3-[ (R) -dodécanoyloxy-tétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétradécanoyl-amino]décan-1,10-diol,1-dihydrogénophosphate 10-(6-amino-hexanoate) (WO 01/46127) D'autres ligands TLR4 qui peuvent être utilisés sont les les alkylglucosaminide phosphates (AGP) tels que ceux décrits " dans WO 98/50399 ou le brevet US No. 6,303,347 (des procédés de préparation des AGP sont également décrits), ou des sels pharmaceutiquement acceptables d'AGP tels que décrits dans le brevet US No. 6,764,840. Certains AGP sont des agonistes des TLR4, et d'autres des antagonistes des TLR4. Les deux devraient être utiles à titre d'adjuvants. De plus, d'autres agonsites des TLR-4 appropriés sont décrits dans les brevets US No 2003/0153532 et 2205/0164988. L'invention se prête tout particulièrement à la préparation de compositions immunogènes à base de virus influenza, comprenant des vaccins. Diverses formes de virus influenza sont actuellement disponibles. Ils sont généralement basés soit sur un virus vivant, soit sur un virus inactivé.

Les virus inactivés peuvent être basés sur des virions entiers, des virions fragmentés ou des antigènes de surface purifiés (comprenant HA) . Les antigènes de la grippe peuvent également se présenter sous la forme de virosomes (particules liposomales de type viral dépourvues d'acides nucléiques).

Les procédés d'inactivation du virus et les procédés de fragmentation décrits ci-dessus sont applicables au virus influenza.

Les souches du virus influenza utilisables dans les vaccins changent d'une saison à l'autre. Dans la période inter-pandémique actuelle, les vaccins comprennent typiquement deux souches A d'influenza et une souche B d'influenza. Les vaccins trivalents sont typiques, mais une valence plus élevée, telle qu'une quadrivalence, est également envisagée dans la présente invention. L'invention peut également utiliser la HA provenant de souches pandémiques (i.e. souches ' vis-à-vis desquelles le receveur du vaccin et la population humaine en général sont immunologiquement naïfs), et les vaccins antigrippaux pour souches pandémiques peuvent être monovalents ou basés sur un vaccin trivalent normal additionné d'une souche pandémique.

Les compositions selon l'invention peuvent comprendre un ou des antigènes provenant d'une ou de plusieurs souches de virus influenza, comprenant le virus influenza A et/ou le virus influenza B. En particulier, un vaccin trivalent comprenant des antigènes provenant de deux souches de virus A et d'une souche de virus influenza B est envisagé par la présente invention. En variante, un vaccin quadrivalent comprenant des antigènes provenant de deux souches de virus A et de deux souches de virus influenza B s'inscrit également dans la portée de la présente invention. ,

Les compositions selon l'invention ne sont pas limitées aux compositions monovalentes, i.e. ne comprenant qu'un seul type de souche, i.e. uniquement des souches saisonnières ou uniquement des souches pandémiques. L'invention englobe également les compositions multivalentes comprenant une combinaison de souches saisonnières et/ou pandémiques. En particulier, une composition quadrivalente, qui peut être ajoutée, comprenant trois souches saisonnières et une souche pandémique s'inscrit dans la portée de la présente invention. D'autres - compositions s'inscrivant dans la portée de l'invention comprennent une composition trivalente comprenant deux souches A et une souche B, telles que les souches H1N1, H3N2 et B, et une composition quadrivalente comprenant deux souches A et deux souches B de lignées différentes, telles que H1N1, H3N2, B/Victoria et B/Yamagata. HA est le principal immunogène dans les actuels vaccins· antigrippaux inactivés, et les doses vaccinales sont normalisées en référence aux niveaux de HA, typiquement mesurées par SRD. Les vaccins existants contiennent typiquement environ 15 pg de HA par souche, bien que des doses plus basses puissent être utilisées, e.g. chez les enfants, ou dans les situations pandémiques, ou quand un adjuvant est utilisé. Des doses fractionnées correspondant à la moitié (i.e. 7,5 pg de HA par souche) ou à un quart ont été utilisées, de même que des doses plus élevées, en particulier, des doses x3 ou x9. Par conséquent, les compositions immunogènes selon la présente invention peuvent comprendre entre 0,1 et 150 pg de HA par souche influenza, en particulier, entre 0,1 et 50 pg, e.g. 0,1-20 pg, 0,1-15 pg, 0,1-10 pg, 0,1-7,5 pg, 0,5-5 pg, etc. Les doses particulières comprennent environ 15, environ 10, environ 7,5, environ 5 pg par souche, environ 3,8 pg par souche et environ 1,9 pg par souche.

Une fois que le virus influenza a été purifié pour une souche particulière, il peut être combiné à des virus provenant d'autres souches pour obtenir un vaccin trivalent, par exemple, comme décrit ci-dessus. Il est plus approprié de traiter chaque souche séparément et de mélanger les masses monovalentes pour obtenir un mélange multivalent final, plutôt que de mélanger des virus et de dégrader l'ADN et de le purifier à partir d'un mélange multivalent. L'invention sera en outre décrite en référence aux exemples, non limitatifs qui suivent.

Exemple I : Production du virus influenza à l'aide d'une puissance volumique d'entrée élevée - Des cellules EB66® ont été ensemencées dans un bioréacteur à usage unique de 200 L (Cultibag STR de chez Sartorius AG équipé d'une turbine à pales inclinées, ou d'une turbine de Rushton, lorsque cela est approprié) à une densité d'environ 0,4 x 106 cellules/ml dans un volume total de 65 L, et cultivées en suspension en mode discontinu à 36,5 °C à une vitesse d'agitation de 105 tours/minute correspondant à l'application d'une puissance volumique d'entrée d'au moins 30 W/m3 (No. 039, No. 048, No. 052, No. 058, No. 044, No. 046, et . No. 043), ou de 135 tours/minute correspondant à l'application d'une puissance volumique d'entrée d'au moins 120 W/m3 (No. 053 et No. 057), ou de 65 tours/minute correspondant à l'application d'une puissance volumique d'entrée d'au moins 7 W/m3 (No. 025, No. 026, No. 027 et No. 031) . La puissance volumique d'entrée d'au moins 30 W/m3 a été obtenue à l'aide du bioréacteur à usage unique équipé d'une turbine à pales inclinées, alors que la puissance volumique d'entrée d'au moins 120 W/m3 a été obtenue à l'aide du bioréacteur à usage unique équipé d'une turbine de Rushton. - Après 3 jours de croissance, la densité cellulaire a atteint au moins 9 x 106 cellules/ml. A ce stade dans le temps, qui est considéré comme le Jour 0 (J0), le.s cellules ont été inoculées avec une solution comprenant le virus influenza H5N1 à une multiplicité d'infection (MOI) de 1 x 10-5 et avec de la trypsine (30 mrPu/ml de TrpLE de chez Invitrogen) , et la température a été portée à 35 °C. Ih30 après l'inoculation, la suspension de cellules inoculées a été soumise à une dilution par un facteur 3 par ajout de milieu frais jusqu'à un volume total de 200 L. Pendant les lh30 ci-dessus, la puissance volumique d'entrée a été soit réduite à 7 W/m3 (No. 039, No. 048, No. 052, No. 058, No. 044, No. 046,

No. 043, No. 053 et No. 057), soit maintenue à 7 W/m3 (No. 025, No. 026, No. 027 et No. 031). - Immédiatement après que les cellules inoculées aient été diluées, la puissance volumique d'entrée a été portée de nouveau à au moins 30 W/m3 (No. 039, No. 048, No. 052, No. 058,

No. 044, No. 046, et No. 043), ou à au moins 120 W/m3 (No. 053 et No. 057) et maintenue à ces niveaux, ou maintenue à 7 W/m3 (No. 025, No. 026, No. 027 et No. 031), jusqu'à ce que le milieu de culture contenant le virus soit collecté, 5 jours après l'inoculation du virus, pour obtenir ainsi la récolte virale. De la trypsine (10 mrPu/ml de TrpLE de chez

Invitrogen) a en outre été ajoutée au Jour 1 (Jl) et au Jour 4 (J4) après l'inoculation du virus. - La récolte virale a ensuite été purifiée comme décrit ci-dessus.

Exemple II : Effet d'une puissance volumique d'entrée élevée sur la microfiltration - Une fois récoltée, la récolte virale a été pré clarifiée par centrifugation continue à 10 500 tours/minute à 90 L/h, pour obtenir ainsi la récolte virale pré-clarifiée. - La récolte pré-clarifiée a ensuite été soumise à une étape de microfiltration à l'aide d'une membrane de type feuille plate de 0,45 pm (Sartorius AG),3 à TMP (pression transmembranaire) et débit constants (3 psi et 600 L/m2/h, respectivement), pour obtenir ainsi la récolte virale clarifiée. - Le rendement de virus influenza a été évalué pendant · l'étape de microfiltration par mesure de la teneur en HA avant et après ladite étape selon le dosage SRD, comme décrit ci-dessous dans l'Exemple IV. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1 sous la forme de pourcentages à comparer à la valeur témoin de 100 % représentant la quantité totale de HA présente dans le matériel de départ, i.e. présente dans la récolte virale pré-clarifiée avant microfiltration.

Tableau 1 - Rendement de HA après microfiltration - Basse puissance volumique contre puissance volumique élevée |§ppej| ^:Pufssaÿ^Sj&amp; ' ellulaii^^ : Re^em^£RA^ p'tlinoëulation dévltpf i^led/épi* ' ' ^WapM^Z^ jfelliÉftIfp^1r- 'w^0W^^°nl\ 1 ~ * * V/m3" ' " ' v,> ' "" , * - '*"?% " ~ » ig£,;-"f , . Λ ·--;)>.< Ç,. .'C,~ '· ^«fvR , · -> ^;>v,-r,\>- ">*&amp; J??if03ÂS 30. 12 '67 71 wëèÊzB±:MMÉ!Ï____ 30 12,6 92 82 |||p;:05Éf 77 30 11 82 81

Moyenne vA./,' ^ 80 78 E.-type** 7' -!; AA >,·.;, - ..-1¾¾¾^ 6 Ï2Ö 12^6 88 70 057¾¾¾ 120 11 79 63. .....y, '-s-'·. ,v _________________

Moyenne Γ Γ 84 67 E. -type** ‘ - < - 5 m-o2$m * " 13 75 ~ 41

SiP^i^S 7 11 57 91

SlSoSsif 7 9^3 82 77 m~°9ÎB 7__13 81 44

Moyenne 74 33 E.-type** f\r -'ipc'· 25 * pi : après 11 inoculation du virus ** : E. type : Ecart-type Résultats - Conclusions .

Bien que l'accroissement de la puissance volumique d'entrée pendant la phase de culture cellulaire (30 W/m3 contre 7 W/m3) n'ait eu aucun impact sur le rendement de la HA présente dans la récolte virale collectée (voir Tableau 1, quatrième colonne, « Production virale J5 pi ») , un impact positif a été observé sur 'le rendement de la HA obtenu après l'étape de microfiltration qui suit. Non seulement le rendement de HA obtenu après microfiltration est plus élevé quand la puissance volumique d'entrée est plus élevée (voir les lignes Moyenne respectives), mais aussi les valeurs obtenues d'une expérience à l'autre sont plus régulières et moins variables (voir les lignes E.-type respectives - 6 contre 25 quand la puissance volumique d'entrée est de 30 ou 7, respectivement). Ces résultats indiquent qu'une puissance volumique d'entrée plus élevée lors de la phase de culture cellulaire amont donne des rendements de HA améliorés et plus réguliers lors de la phase de purification du virus aval.

Exemple III : Effet d'une puissance volumique d'entrée élevée sur l'ultracentrifugation sur gradient de saccharose - Les cellules ont été cultivées et infectées avec le virus influenza H5N1, et le virus a été récolté comme décrit dans l'Exemple I ci-dessus. - La récolte virale a été pré-clarifiée, et la récolte pré-clarifiée a été soumise à microfiltration comme décrit dans l'Exemple II. . - La récolte virale clarifiée a ensuite été concentrée 10 fois par ultrafiltration à l'aide d'une membrane à base de fibres creuses de 750 Kd en polysulfone (GE Healthcare) et diafiltrée contre 5 volumes de PBS contenant 125 mM de citrate pH 7,4 à TMP (pression transmembranaire) et débit constants (3 psi et 35 L/m2/h, respectivement). - Le rétentat d'ultrafiltration a ensuite été soumis à . une étape d'ultracentrifugation sur gradient de saccharose, dans laquelle le virus et les contaminants migrent dans le gradient jusqu'à atteindre leur densité respective. Le virus influenza a une densité d'environ 1,19 g/cm3 et par conséquent sédimentera dans le gradient à l'endroit où la concentration de saccharose équivaut à la densité du virus (environ 43 % de saccharose).. Après formation d'un gradient linéaire continu de 0 à 55 % de saccharose dans le rotor de la centrifugeuse, le rétentat d'ultrafiltration a été chargé dans ledit rotor à une capacité de charge d'équivalent rétentat correspondant à 30 L de récolte par L de rotor (No. 039, No. 043, No. 032, No. 033,

No. 028 et No. 029), ou 50-60 L de récolte par L de rotor (No. 044A, No. 044B, No. 046, No. 048, No. 025, No. 026, No. 027,

No. 031), comme indiqué dans les Tableaux 2 et 3. Quand tout l'échantillon est chargé, un temps de formation de bandes de 1 h a permis au virus d'atteindre sa densité et de se concentrer dans le gradient de saccharose avant que la centrifugeuse ne soit arrêtée et que le gradient de saccharose ne soit déchargé et fractionné. Les particules virales ont été concentrées en quelques fractions. Les fractions de produit étaient dans du PBS pH 7,4 contenant 125 mM de citrate et de saccharose. Le virion entier purifié a été regroupé à partir du pourcentage de saccharose allant d'environ 30 à 50 %. Cette plage a été déterminée sur la base des profils . obtenus par SDS-PAGE et par l'analyse par Western-Blot en utilisant des anticorps anti-HA. - Le rendement de virus influenza a été évalué lors de l'étape d'ultracentrifugation sur gradient de saccharose en mesurant la teneur en HA avant et après ladite étape selon le · ' dosage SRD, comme décrit ci-dessous dans l'Exemple TV. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 et le Tableau 3 sous la forme de pourcentages à comparer à la valeur témoin de 100 % représentant la quantité totale de HA présente dans le 'matériel- de départ, i.e. présente dans le rétentat" . d'ultrafiltration avant l'ultracentrifugation sur gradient de saccharose.

Tableau 2 - Rendement de HA après ultracentrifugation sur gradient de saccharose à une capacité de charge de 30 L de récolte par L de rotor

* : E. type : Ecart-type

La capacité de charge indiquée (30) correspond à l'équivalent de rétentat d'ultrafiltration en litres de récolte virale collectée lors de l'étape c) du procédé selon l'invention chargé par litre de rotor de la centrifugeuse. Résultats - Conclusions A une capacité de charge de 30 L de récolte par L de rotor, le rendement de HA moyen obtenu après l'ultracentrifugation sur gradient de saccharose est dans la même plage acceptable, i.e. 72-82 %, que la puissance volumique d'entrée soit de 7 ou 30 V/m3.

Tableau 3 - Rendement de HA après ultracentrifugation sur gradient de saccharose à une capacité de charge de 50-60 L de récolte par L de rotor

* : E. type : Ecart-type

La capacité de charge indiquée (50 ou 60) correspond l'équivalent de rétentat d'ultrafiltration en litres de récolte virale collectée lors de l'étape c) du procédé selon l'invention chargé par litre de rotor de la centrifugeuse. Résultats - Conclusions A une capacité de charge plus élevée de 50-60 L de récolte par L de rotor, quand la puissance volumique d'entrée est de 7 V/m3, i.e. à une puissance volumique d'entrée basse, le rendement de HA moyen obtenu après l'ultracentrifugation sur gradient de saccharose a significativement chuté (voir ' Tableau 3, 31 %), par opposition au rendement du- rendement de HA obtenu à une capacité de charge de 30 L de récolte par L de - rotor à une basse puissance volumique d'entrée similaire (voir

Tableau 2, 82 %). Par contre, quand la puissance volumique d'entrée a été portée à 30 V/m3, le rendement de HA moyen obtenu après l'ultracentrifugation sur gradient de saccharose . à la capacité de charge plus élevée de 50-60<L de récolte par L de rotor a été maintenu dans la même plage acceptable (voir Tableau 3, 71 %). Ceci indique que l'accroissement de la puissance volumique d'entrée lors de la phase de culture cellulaire (30 W/m3 contre 7 W/m3) permet de charger deux fois plus de volume de récolte, ou d'équivalent de volume de récolte, sur le rotor utilisé pour l'étape d'ultracentrifugation sur gradient de saccharose tout en conservant la même plage acceptable de rendement de HA. La capacité de charge sur une centrifugeuse impacte directement le nombre de centrifugeuses requises pour fonctionner à grande échelle. Plus la capacité de charge est élevée, plus le nombre de centrifugeuses nécessaire est bas.

Exemple IV : Procédé SRD utilisé pour mesurer la teneur en HA -

Des plaques en verre (12,4 - 10 cm) ont été revêtues d'un gel d'agarose contenant une concentration de HA sérique antiinfluenza qui est recommandée par le NIBSC. Après prise du gel, 72 puits d'échantillon (3 mm de diamètre) ont été formés dans 1'agarose. 10 μΐ de dilutions appropriées de la référence et de l'échantillon ont été chargés dans les puits. Les plaques ont été incubées pendant 24 .heures à température ambiante (20-25 °C) en chambre humide. Les plaques ont ensuite été immergées toute une nuit dans une solution de NaCl et lavées brièvement dans l'eau déminéralisée. Le gel a ensuite été pressé et séché. Une fois complètement sèches, les plaques ont été colorées avec une solution de Bleu brillant de Coomassie pendant 10 minutes et décolorées deux fois dans un mélange de méthanol et d'acide acétique jusqu'à apparition de zones colorées nettement définies. Après séchage des plaques, le diamètre des zones colorées a été mesuré dans deux directions à angles droits. En variante, un équipement pour mesurer la surface peut être utilisé. Les courbes doses-réponses des dilutions d'antigènes én fonction de la surface ont été tracées et les résultats ont été calculés selon des procédés de dosage de rapports de pente standards (Finney, D.J. (1952). Statistical Methods in Biological Assay. London: Griffin, Cité dans: Wood, JM, et al (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247).

Claims (27)

1. REVENDICATIONS AMENDEES

   1. Procédé de production d'un virus en culture cellulaire comprenant au moins les étapes consistant à : a) utiliser une population de cellules dans un milieu de culture cellulaire, b) infecter la population de cellules par : i. inoculation de la population avec le virus, et ii. incubation de la population inoculée de façon à permettre au virus de se répliquer et de se propager, c) collecter le virus produit, pour obtenir ainsi une récolte virale, et d) purifier le virus, dans lequel une puissance volumique d'entrée d'au moins 15 W/m3, d'au moins 30 W/m3, d'au moins 60 W/m3, d'au moins 100 W/m3, ou d'au moins 120 W/m3 est appliquée à la culture cellulaire au moins pendant l'étape b).
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la puissance volumique d'entrée est appliquée à la culture cellulaire pendant l'étape a) et l'étape b).
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la densité cellulaire des cellules atteint au moins 8 x 106 cellules/ml, au moins 9 x 106 cellules/ml, au moins 10 x 106 cellules/ml', au moins 11 x 106 cellules/ml, au moins 12 x 106 cellules/ml ou au moins 13 x 106 cellules/ml avant que la population de cellules ne soit inoculée avec le virus.
4. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel pendant l'étape b) les cellules inoculées de l'étape i. sont diluées par un facteur allant de 2 à 5, immédiatement après que le virus a été inoculé, et laissées telles quelles po?&amp;4/C l'incubation ultérieure.
5. 5. Procédé selon la revendication 3, dans lequel pendant l'étape b) les cellules inoculées de l'étape i. sont diluées de façon à obtenir une densité cellulaire allant de 3 à 5 X 106 cellules/ml immédiatement après que le virus a été inoculé, et laissées telles quelles pour l'incubation ultérieure.
6. 6. Procédé selon la revendication 3, dans lequel pendant l'étape b) le virus est incubé pendant 30 min, 45 min, Ih, lh30, ou 2h après l'inoculation, avant que les cellules inoculées ne soient diluées par un facteur allant de 2 à 5, et laissées telles quelles pour l'incubation ultérieure.
7. 7. Procédé selon la revendication 3, dans lequel pendant l'étape b) le virus est incubé pendant 30 min, 45 min, lh, lh30, ou 2h après l'inoculation, avant que les cellules inoculées ne soient diluées de façon à obtenir une densité cellulaire allant de 3 à 5 x 106 cellules/ml, et laissées telles quelles pour l'incubation ultérieure.
8. 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, dans lequel pendant l'étape b) la puissance volumique d'entrée est réduite à 2-10 W/m3, 4-8 W/m3, ou 7 W/m3 et maintenue à ce niveau après l'inoculation des cellules et jusqu'à ce que les cellules inoculées soient diluées.
9. 9. Procédé selon les revendications 1 à 8, dans lequel une trypsine est ajoutée aux cellules pendant l'étape b).
10. 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel la trypsine est ajoutée en même temps que l'inoculation du virus.
11. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel i.%|4/0 trypsine est en outre ajoutée au jour J1 et/ou au jour J4 après 1'inoculation.
12. 12. Procédé selon la revendication 10, dans lequel la trypsine est en outre ajoutée chaque jour après l'inoculation du virus jusqu'à ce que le virus produit de l'étape c) soit collecté. ,
13. 13. Procédé selon les revendications 1 à 12, dans lequel le virus produit de l'étape c) est collecté entre 2 à 10 jours après 1'inoculation du virus.
14. 14. Procédé selon les revendications 1 à 13, dans lequel l'étape de purification du virus d) comprend au moins une étape choisie parmi la clarification, 1'ultrafiltration/diafiltration, l'ultracentrifugation et la chromatographie de la récolte virale, ou toute combinaison de celles-ci.
15. 15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel l'étape de purification du virus d) comprend au moins une étape de clarification de la récolte virale.
16. 16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel la récolte virale est clarifiée par microfiltration.
17. 17. Procédé selon les revendications 14 à 16, dans lequel l'étape de purification du virus d) comprend au moins une étape d'ultracentrifugation sur gradient de saccharose.
18. 18. Procédé selon les revendications 1 à 17, dans lequel l'étape de purification du virus d) comprend une étape d'inactivation du virus. έλ
19. 19. Procédé selon la revendication 18, dans lequ^ïH/C l'étape d'inactivation du virus est mise en œuvre avec la bêta-propiolactone.
20. 20. Procédé selon les revendications 1 à 19, dans lequel l'étape de purification du virus d) comprend une étape de fragmentation.
21. 21. Procédé selon les revendications 1 à 20, comprenant en outre une étape de formulation du virus purifié dans un vaccin.
22. 22. Procédé selon les revendications 1 à 21, dans lequel le virus est le virus influenza.
23. 23. Procédé selon la revendication 22, dans lequel le virus influenza est du sous-type H2, H5, H6, H7 ou H9.
24. 24. Procédé selon la revendication 22, dans lequel le virus influenza est du sous-type Hl, H3 ou B.
25. 25. Procédé selon les revendications 1 à 24, dans lequel les cellules sont des cellules de mammifères ou aviaires.
26. 26. Procédé selon les revendications 1 à 25, dans lequel les cellules sont cultivées en suspension.
27. 27. Procédé selon les revendications 1 à 26, dans lequel les cellules sont des cellules EB66®.