CN105473712B - 在细胞培养物中大规模生产病毒 - Google Patents

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Abstract

在细胞培养物中生产病毒的方法，其包括至少下列步骤：a)提供在细胞培养基中的细胞群体，b)通过如下感染细胞群体：i.用病毒接种所述群体，以及ii.孵育接种的群体以便允许病毒复制和繁殖，c）收集生产的病毒由此提供病毒收获物，和d）纯化病毒，其中至少在步骤b）期间将至少15 W/m3、至少30 W/m3、至少60 W/m3、至少100 W/m3、至少120 W/m3的功率密度施加到细胞培养物。

Description

在细胞培养物中大规模生产病毒
本发明用美国政府的支持在Department of Health and Human Services授予的合同# HHSO100200600011C下进行；美国政府在本发明中享有某些权利。
技术领域
本发明涉及用于生产由细胞培养物产生的病毒或病毒抗原的方法，可以通过该方法获得的病毒或病毒抗原以及含有这些病毒或病毒抗原的疫苗。特别是，本发明提供用于改善病毒产率的方法。
背景
作为用于制造病毒疫苗的传统的基于蛋(egg-based)的生产系统的替代方案的基于细胞培养物的技术的开发可能表现为克服与基于蛋的传统系统相关的缺点和限制的最快速和最有希望的解决方案。病毒疫苗的商业生产通常需要大量病毒作为抗原来源。但是基于蛋的方法由于蛋的变化的生物学品质而是有缺点的，并且其由于大量合适的蛋的不可获得性导致的逻辑问题而缺少灵活性。
细胞培养系统表现为疫苗制备的合适的可替代模式，更简单，灵活的，且一致的，允许改进扩大规模疫苗生产能力的可能性，并因此如果需要的话允许获得大量病毒。例如，应对自然大流行威胁或恐怖袭击。
但是有效的疫苗生产需要从宿主系统以高产率产生的大规模量的病毒生长。在其中病毒生长的培养条件在实现可接受的高病毒产率方面是非常重要的。因此，为了最大化所需病毒的产率，系统和培养条件必须专门进行改造以提供适合用于大规模生产的对所需病毒的生产有利的环境。一种方法是改善细胞比生产率，例如通过改良培养基或增加细胞密度。由于在生产后细胞培养物产生的病毒必须从细胞培养物中回收并纯化的事实，改善病毒产率的另一种方法是限制在不同纯化步骤过程中发生的病毒材料丢失。因此，仍然存在需要以提供可替代的和改进的具有增加的病毒产率的生产病毒的方法。根据本发明的方法提供相比本领域已知的方法更好的病毒产率。
发明概述
在本发明的第一方面，提供了在细胞培养物中生产病毒的方法，包括至少下列步骤：
a）提供在细胞培养基中的细胞群体，
b）通过如下感染细胞群体：
i. 用病毒接种所述群体，和
ii. 孵育被接种的群体以便允许病毒复制和繁殖，
c）收集产生的病毒，由此提供病毒收获物，和
d）纯化病毒，
其中至少在步骤b）期间向细胞培养物施加至少15 W/m3、至少30 W/m3、至少60 W/m3、至少100 W/m3、或至少120 W/m3的体积功率输入(volumetric power input)。
在本发明的第二方面，提供了用于制备疫苗的方法，其包括至少混合根据本发明的方法获得的病毒与药学上可接受的载体的步骤。
发明详述
本发明涉及改进的在细胞培养物中生产病毒的方法，其对于大规模生产是特别有用的。特别是，根据本发明的方法通过限制在纯化过程中的病毒丢失而帮助增加病毒产率。本发明人令人惊奇地观察到，在病毒生产方法的上游部分发生的一些变化，诸如增加施加到用于产生病毒的培养细胞的体积功率输入，产生了所述方法的下游部分中的显著改善，诸如在一些纯化步骤后获得的病毒产率增加。特别是，发明人观察到，尽管在上游细胞培养阶段期间增加功率输入对所述细胞比生产率没有影响，但是获得对通过微滤澄清的后续步骤的积极的影响，其中在所述步骤后获得的该病毒的产率相比当在细胞培养阶段实施较低功率输入所得到的产率显著增加。此外，不仅病毒回收率在微滤步骤后增加，而且所获得的回收百分比在实验彼此之间更一致并且变化更少。而且，本发明人观察到，在上游细胞培养阶段期间增加体积功率输入，对在下游病毒纯化阶段期间实施的后续蔗糖梯度超速离心具有类似的有益效果。特别是，本发明人观察到，增加施加到培养的细胞的体积功率输入允许显著增加用于蔗糖梯度超速离心步骤的转子的装载容量大约2倍。作为结果，在一些纯化步骤后所获得的改进的病毒产率导致在病毒生产方法结束时，更好的病毒总体产率。预料不到地，本发明人观察到，更高的体积功率输入对细胞不会导致有害或损伤。
根据本发明的方法提供更容易实施的优势，因为除了通常用于在细胞培养物中生产病毒使用的标准的步骤或设备之外，不需要额外的步骤或不需要进一步的设备。
“装载容量”是本发明方法的步骤c）期间收集的病毒收获物升(viral harvestlitres)的量（其被用于蔗糖梯度超速离心步骤的离心机的转子的每升所装载），或者是当所述病毒收获物在经历蔗糖梯度超速离心步骤之前由于先前的纯化步骤已被处理时，病毒收获物升的“等同”量。例如，如下所述，被收集后，病毒收获物在进行蔗糖梯度超速离心步骤之前可进行超滤/渗滤，所述超滤/渗滤通常导致病毒收获物的浓缩，即病毒收获物升的量在这样的步骤后减少。
“体积功率输入”是每单位体积的功率的量，或平均比能量耗散率。在细胞培养物中，其对应于通过搅拌器轴和叶轮转移至细胞培养物的体积的功率的量。其表示为W/m3。在本领域中用于计算功率的输入值的经验式如下：P/V= (Np x n3 x di5)/V，其中Np是用于叶轮的湍流功率数，n是测量为每秒叶轮旋转的搅拌速率，di是以米测量的叶轮直径和V是以立方米的培养物体积。
根据本发明的方法适用于任何类型的细胞，无论是生长在微载体上粘附细胞还是悬浮细胞。因此，在本发明的意义中，术语“细胞悬浮液”应包括生长在微载体上的粘附细胞和能够在悬浮液中生长的细胞，即，不需要任何粘附支持物（诸如微载体）来增长的细胞。
通常，体积功率输入由细胞悬浮液的机械运动施加。这样的机械运动可以通过不同的方式来实现。例如，细胞悬浮液的机械运动可以通过搅拌装置诸如叶轮来实现。
搅拌可以根据所使用的叶轮类型，作为轴流，径向流或两者的组合传递。通常，叶轮可基于它们的几何形状，并且特别是其叶片的几何形状分为下列几组：（i）平叶片涡轮，也通常被称为Rushton叶轮或Rushton型叶轮；（ii）倾斜叶片叶轮；和（iii）船用叶片(marine-blade)叶轮。
平叶片涡轮或Rushton叶轮，由沿搅拌轴垂直设置的平叶片制成，从而产生单向径向流。这些类型的叶轮通常用于被认为不是剪切敏感的细胞系，诸如酵母、细菌和某些真菌的发酵。然而，如其中所公开，本发明人观察到，Rushton叶轮还可以根据本发明的方法适当地与动物细胞使用。
倾斜叶片叶轮是由相对于搅拌轴以一定角度设置的平叶片制成，从而产生同时轴向和径向流。这种倾斜叶片叶轮通常与在悬浮液中生长的剪切敏感的细胞系一起使用或与微载体的辅助下使用。这些叶轮通常在分批或补料分批培养中使用，但它们也可用于连续和灌注方法。
船用叶片叶轮上的叶片的工作面(leading face)可以是平的，或凹面，而其背面是凸的，从而产生单向轴向流。
考虑不同因素来选择合适类型的叶轮，诸如，例如，细胞类型，培养系统的类型（分批，补料分批或灌注培养系统），培养容器的类型，以及所需的体积功率输入的水平。本领域技术人员理解根据上述特定的条件确定并选择适当的叶轮使用。在一个实施方案中，在根据本发明的方法中施加的体积功率输入，特别是范围从30至120W/m3的体积功率输入，用倾斜叶片叶轮来实现。在另一个实施方案中，在根据本发明的方法中施加的体积功率输入，特别是高于120W/m3的体积功率输入，用Rushton叶轮来实现。
施加在动物细胞培养物上的体积功率输入通常大大低于在微生物培养物中的体积功率输入，因为缺少保护性细胞壁的动物细胞的假定的较高脆性，使得它们尤其对剪切应力和泡沫形成比微生物培养物更敏感。然而，如本发明人所观察到的，高的体积功率输入对用于生产病毒的动物细胞培养物的应用，在一定程度上，不损害细胞，同时它有利于所产生病毒的纯化过程中的病毒产率。
本发明的方法可以以大范围的体积功率输入值实施。“最大值”意指，可以在不存在对病毒产率的总体负面影响的情况下施加的最大体积功率输入。已知对病毒产率具有可能的负面影响的一个因素是细胞完整性，诸如，例如细胞生存力降低。本领域技术人员知道如何监测细胞生存力。合适方法的非限制性实例是细胞染色（允许区分活细胞与死细胞），诸如台盼蓝染色，或者任何其它已知的合适的染色。可替代地，也可以通过流式细胞术诸如例如，FACS（荧光激活细胞分选）评估和测量细胞生存力。此外，定义最大值时，可以考虑病毒的细胞比生产率。“细胞比生产率”意指细胞生产病毒的能力，即在进行纯化之前在收集步骤c）取得的病毒的量。施加到的培养细胞的体积功率输入应优选不负面影响病毒的细胞比生产率。
体积功率输入的“最小值”意指相比当没有或低体积功率输入被施加到培养的细胞时在病毒纯化阶段期间获得的病毒产率，在病毒纯化阶段期间提供改进的病毒产率的最小值。任何本领域已知的测量病毒产率或病毒滴度的方法都可合适地用于帮助确定在本发明的方法中应用的体积功率输入的最佳值。例如，可以通过监测病毒接种后发生在宿主细胞中的形态变化（包括细胞变圆、定向障碍、膨大或收缩、死亡、从表面脱离）来测量CPE（细胞病变效应）。另外，在细胞用要生产的目标病毒接种后的任何时间，可以通过蛋白质检测的标准技术，诸如蛋白质印迹分析监测特定的病毒抗原的检测。在流感病毒的特定情况下，HA的含量可以通过SRD测定法（Wood, JM, 等 (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247）在细胞用病毒接种后的任何时间监测，所述测定法是本领域的技术人员熟悉的技术。此外，SRD测定也可以在纯化阶段期间在任何时间使用，以便在任何给定的纯化步骤之前或之后评估病毒产率。根据本发明的方法，施加到用于生产病毒的动物细胞的体积功率输入通常范围为15至900W/m3，合适地为30至500W/m3，更合适地从60至250W/m3，更合适地为120至200W/m3。在一个实施方案中，在根据本发明的方法中使用的体积功率输入是至少15W/m3、至少30 W/m3、至少60 W/m3、至少100 W/m3或至少120 W/m3。在一个具体实施方案中，在根据本发明的方法中使用的体积功率输入是30 W/m3。可替代地，在另一个具体实施方案中，在根据本发明的方法中使用的体积功率输入是120 W/m3。
根据本发明的方法适用于任何类型的、任何尺寸的培养容器，诸如例如，瓶、滚瓶或生物反应器，只要所述容器适合容纳搅拌装置，诸如例如叶轮，或者与单独的搅拌装置的使用兼容。容器包括搅拌装置不是必需的。搅拌装置可以与容器本身分开。例如，在一次性生物反应器的情况下，其通常由塑料袋组成，诸如WaveTM生物反应器，所述一次性生物反应器的搅拌可以通过将生物反应器置于搅拌桌上来实现，无论是轨道摇床或轴向摇床。生物反应器可以由任何类型的材料制成，诸如例如用于非一次性生物反应器的玻璃或不锈钢，或用于一次性生物反应器的塑料。此外，生物反应器可以是任何形状的，诸如例如圆筒形或立方体。生物反应器通常用于中等规模，诸如从1至10 L，和大的生产规模，诸如从20至1000L，和更大。根据本发明的方法可应用于任何类型任何尺寸的生物反应器。特别是，本发明的方法适合用于10L、200L、500L、1000L或10000 L的生物反应器。用于本发明的方法的一种特别合适的生物反应器类型是搅拌槽生物反应器，无论是分批或连续操作。一次性生物反应器代表用于在本发明的方法中使用的生物反应器的一种可替代的合适类型。在一个实施方案中，在根据本发明的方法中使用的细胞在200升的一次性生物反应器中培养。
根据本发明，细胞可以以各种方式生长，诸如例如，使用分批、补料分批或连续系统，诸如灌注系统。当期望高细胞密度时，灌注是特别有利的。高细胞密度可以是特别有利的，以最大化可从给定的细胞类型中产生的病毒的量。其中高体积功率输入施加到根据本发明的细胞培养物中的在细胞培养物中生产病毒的方法适用于任何上述系统，无论细胞使用分批，补料分批或连续系统生长。在本发明的一个实施方案中，根据本发明的方法使用的细胞以分批方式生长。
本发明的方法适合于广泛的病毒，任何能够感染细胞并使用它们用于其复制的病毒，包括但不限于，腺病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、微小核糖核酸病毒、痘病毒、呼肠孤病毒和逆转录病毒。特别是，本发明的方法适合于包膜病毒，诸如粘液病毒。在一个实施方案中，由本发明的方法生产的病毒属于正粘病毒科，尤其是流感病毒。
病毒或病毒抗原可衍生自正粘病毒，诸如流感病毒。正粘病毒抗原可选自一种或多种病毒蛋白质，包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）、基质蛋白（M1）、膜蛋白（M2）、一种或多种转录酶（PB1、PB2和PA）。特别合适的抗原包括HA和NA，这两个表面糖蛋白确定流感亚型的抗原特异性。
流感病毒可以选自人流感病毒、禽流感病毒、马流感病毒、猪流感病毒、猫流感病毒。流感病毒更特别地选自毒株A、B和C，优选选自毒株A和B。
流感抗原可衍生自大流行期间（每年或每季）流感毒株。或者，流感抗原可衍生自具有导致大流行爆发的潜力的毒株（即，相比目前流行毒株中血凝素具有新的血凝素的流感毒株，或在禽主体中具有致病性和有在人群中水平传播的潜力的流感毒株，或对人类有致病性的流感毒株）。根据特定的季节和根据包括在疫苗中抗原的性质，所述流感抗原可衍生自一个或多个以下血凝素亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。优选地，流感病毒或其抗原来自H1、H2、H3、H5、H7或H9亚型。在一个实施方案中，流感病毒来自H2、H5、H6、H7或H9亚型。在一个替代实施方案中，流感病毒来自H1，H3或B亚型。
在根据本发明的方法中使用的细胞原则上可以是可以在细胞培养物中培养并且其可以支持病毒复制的任何所需类型的动物细胞。它们可以是原代细胞或传代细胞系。遗传稳定的细胞系是优选的。哺乳动物细胞是特别合适的，例如，人、仓鼠、牛、猴或犬细胞。可替代地，昆虫细胞也是合适的，诸如，例如，SF9细胞或Hi-5细胞。
许多哺乳动物细胞系在本领域中是已知的，并且包括PER.C6、HEK细胞、人胚肾细胞（293细胞）、HeLa细胞、CHO细胞、Vero细胞和MDCK细胞。
合适的猴细胞是，例如非洲绿猴细胞，诸如以Vero细胞系中的肾细胞。合适的犬细胞是，例如，如以MDCK细胞系中的肾细胞。
用于培养流感病毒的合适的哺乳动物细胞系包括MDCK细胞、Vero细胞或PER.C6细胞。这些细胞系都是可广泛得到的，例如，来自American Type Cell Culture（ATCC）保藏。
根据一个具体的实施方案，本发明的方法使用MDCK细胞。原始的MDCK细胞系可从ATCC作为CCL-34获得，但该细胞系的衍生物也可以使用，诸如适于悬浮生长的MDCK细胞（WO1997/37000）。
可替代地，用于在本发明中使用的细胞系可衍生自禽来源，诸如鸡、鸭、鹅、鹌鹑或野鸡。禽细胞系可衍生自各种发育阶段，包括胚胎，小鸡和成年鸡。特别是，细胞系可衍生自胚胎细胞，诸如胚胎成纤维细胞、生殖细胞或单个器官，包括神经元、脑、视网膜、肾、肝、心脏、肌肉或胚外组织和保护胚胎的膜。可以使用鸡胚胎成纤维细胞（CEF）。禽细胞系的实例包括禽胚胎干细胞（WO01/85938）和鸭视网膜细胞（WO05 /042728）。特别是，源自鸭胚胎干细胞的EB66®细胞系是本发明（WO08/129058）中所考虑的。其它合适的禽胚胎干细胞包括源自鸡胚胎干细胞的EBx®细胞系、EB45、EB14和EB14-074（WO2006/108846）。此EBx®细胞系呈现的优点是，作为其建立已被天然产生并不要求任何遗传、化学或病毒修饰的稳定细胞系。这些禽细胞特别适合用于培养流感病毒。
根据一个具体的实施方案，本发明的方法使用EB66®细胞。
细胞培养条件（温度，细胞密度，pH值等）是在非常宽的范围变化的（这是由于所使用的细胞的适用性），并可适用于特定病毒生长条件细节的要求。确定适当的培养条件是在本领域技术人员的能力内的，因为细胞培养在本领域中已经广泛记载（参见，例如，TissueCulture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)，和R.I. Freshney,Culture of animal cells: A manual of basic technique, 第四版(Wiley-Liss Inc.,2000, ISBN 0-471-34889-9）。
在一个具体的实施方案中，在本发明中所描述的方法中使用的细胞是在无血清和/或无蛋白质的培养基中培养。“无血清培养基”（SFM）指即用型的细胞培养基，其不需要添加允许细胞存活和细胞生长的血清。这种培养基不一定是化学上确定的，并且可以包含各种来源的水解物，例如来自植物。这样的无血清培养基具有这样的优点，其可排除外来病毒、支原体或未知传染原的污染。“无蛋白质”被理解为是指其中发生细胞增殖，并且排除蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂和非血清蛋白质的培养物。任选地可以在病毒感染过程中加入胰蛋白酶或可能对于病毒生长是必要的其它蛋白酶。在这样的培养物中生长的细胞天然含有蛋白质本身。
无血清培养基可商购自许多来源，例如，VP SFM（Invitrogen Ref 11681-020），Opti-Pro（Invitrogen, Ref 12309-019），或EX-CELL（JHR Bioscience）。
在感染病毒前，细胞在约37℃，更合适在36.5℃培养，在pH范围从6.7到7.8，合适地约6.8至7.5，更合适地约7.2。当细胞是昆虫细胞时，用病毒感染前的温度通常范围为25℃至29℃，合适地是27℃。
根据本发明的生产病毒的方法，基于细胞培养的病毒的生产一般包括下列步骤：a）提供在培养基中培养的细胞群体；b）用待生产的目标病毒接种所述细胞，以便启动病毒感染细胞的过程，并孵育或培养接种的细胞持续期望的时间段，以便允许病毒复制和繁殖，和c）收集所产生的病毒。根据本发明的高体积功率输入合适地在至少步骤b）期间施加，并且更合适地在步骤a）和b）期间施加。因此，在一个实施方案中，在根据本发明的生产病毒的方法中，在步骤a）和b）期间向培养的细胞施加至少15 W/m3、至少30 W/m3、至少60 W/m3、至少100 W/m3、或至少120 W/m3的体积功率输入。
术语“接种(inoculating/inoculation)”和“接种的细胞”在本发明意义上分别理解为目标病毒添加到细胞的时候和已加入目标病毒的细胞。术语“接种后”应理解为在将病毒加入到细胞之后的持续时间。在说明书的其余部分，时间“接种后”指示为数分钟，数小时或数天，诸如例如，“接种后2小时”，或“接种后第1天（D1）”。细胞用病毒接种的天应视为第0天（D0）。病毒接种、病毒复制、和病毒繁殖的三个连续的步骤应被理解为是病毒感染的更广泛的过程的一部分。如本发明所定义的高体积功率输入可以在任何上述步骤期间被施加到细胞培养物。在本发明的意义上的高体积功率输入可以在当细胞感染目标病毒之前生长和培养的时候适当地施加到细胞。在本发明的意义上的高体积功率输入也可以在细胞接种病毒之后和/或在它们进行温育以允许病毒复制和繁殖的时候适当地施加于细胞。高体积功率也可以在细胞感染之前生长和培养的时候，细胞接种病毒之后和/或在细胞进行温育以允许病毒复制和繁殖的时候适当地施加于细胞。在一个实施方案中，高体积功率输入在细胞用目标病毒接种后被施加到根据本发明的方法中使用的细胞，并直到产生的病毒被收集。在进一步的实施方案中，高体积功率输入在细胞感染目标病毒之前生长和培养时，以及它们接种所述病毒之后，被施加到细胞，直到所产生的病毒被收集。
为了产生大量的病毒，一旦细胞已达到高密度，用目标病毒接种细胞可以是有利的。通常，当细胞密度至少约5 x 106 细胞/ml、合适地6 x 106 细胞/ml、更合适地7 x 106细胞/ml、更合适地8 x 106 细胞/ml、更合适地9 x 106 细胞/ml或甚至更高，诸如10 x 106细胞/ml、11 x 106 细胞/ml、12 x 106 细胞/ml或13 x 106 细胞/ml、或甚至更高，诸如20x 106 细胞/ml、25 x 106 细胞/ml、或30 x 106 细胞/ml时，进行接种。在根据本发明的方法的一个实施方案中，在病毒感染发生之前达到的细胞密度至少为8 x 106 细胞/ml、9 x106 细胞/ml、10 x 106 细胞/ml、11 x 106 细胞/ml、12 x 106 细胞/ml或13 x 106 细胞/ml。在另一个实施方案中，在病毒感染发生之前达到的细胞密度至少为20 x 106 细胞/ml、25 x 106 细胞/ml或30 x 106 细胞/ml。可使用用于细胞培养的灌注系统有利地达到这种高密度水平。用于获得最高病毒生产的最优细胞密度可根据用于病毒繁殖的细胞类型而变化。也可使用蛋白质检测的标准技术，诸如蛋白质印迹分析，或用于流感病毒的SRD测定法，或如上所述的CPE，用于确定获得优化的病毒产率所需的最佳细胞密度范围。
为了产生大量的病毒，实施病毒吸附阶段也可以是有利的。“吸附阶段”是指细胞以高密度接种病毒，在细胞密度对于剩余的感染期降低之前直至病毒被收集持续短的时间段，以便有利于病毒吸附至细胞膜。例如，当细胞密度是至少8 x 106 细胞/ml、合适地至少9 x 106 细胞/ml、合适地至少10 x 106 细胞/ml、合适地至少11 x 106 细胞/ml、合适地至少12 x 106 细胞/ml、更合适地至少13 x 106 细胞/m或甚至更高，诸如20 x 106 细胞/ml、25 x 106 细胞/ml或30 x 106 细胞/ml时，进行细胞用病毒的接种。接种病毒后合适地30分钟，更合适地45分钟，更合适地1小时，1小时30分钟，或2小时，接种的细胞在剩余的感染过程中被稀释2至5倍的范围，合适地3，即在收集所产生的病毒之前进行进一步的孵育。可替代地，在吸附阶段的结束时，对于剩余的感染过程，稀释接种的细胞以便获得最终细胞密度范围从3至5×106细胞/ml，合适地4×106细胞/ml，即收集所产生的病毒之前进行进一步的孵育。
在一个可替代的实施方案中，当细胞密度是至少8 x 106 细胞/ml、至少9 x 106细胞/ml、至少10 x 106 细胞/m、至少11 x 106 细胞/ml、至少12 x 106 细胞/ml、至少13 x106 细胞/ml、至少20 x 106 细胞/ml、至少25 x 106 细胞/ml或至少30 x 106 细胞/ml时，用病毒接种细胞并且在接种之后立即稀释接种的细胞2至5倍的范围，合适地3倍，以便获得最终细胞浓度范围从3至5 x 106 细胞/ml、合适地4 x 106 细胞/ml，持续剩余的感染过程，即收集所产生的病毒之前进行进一步的孵育。
当执行吸附阶段时，在所述阶段期间，即细胞用目标病毒接种之后和接种细胞被稀释之前，体积功率输入可以适当地保持在低水平，诸如例如，2-10 W/m3、4-8 W/m3、合适地7 W/m3的值。因此，在本发明的一个实施方案中，在细胞培养物中生产病毒的方法包括至少下列步骤：a) 提供在细胞培养基中的细胞群体，b) 通过如下用病毒感染细胞群体：i. 当细胞密度是至少8 x 106 细胞/ml、至少9 x 106 细胞/ml、至少10 x 106 细胞/ml、至少11 x106 细胞/ml、至少12 x 106 细胞/ml或至少13 x 106 细胞/ml时用病毒接种所述群体，持续30 分钟、45 分钟、1小时、1小时30分钟或2小时，并然后稀释接种的细胞2-5倍范围或3倍，或者可替代地，以便获得的最终细胞密度范围为3 x 106 细胞/ml至5 x 106 细胞/ml、合适地4 x 106 细胞/ml，以及ii.孵育稀释的接种的群体以便允许病毒复制和繁殖，细胞用病毒感染之前施加到细胞培养物的体积功率输入为至少15 W/m3、至少30 W/m3、至少60 W/m3、至少100 W/m3或至少120 W/m3，并然后在细胞接种之后和接种细胞被稀释之前减少到如下范围的值2-10 W/m3、4-8 W/m3或7 W/m3，并在接种细胞被稀释之后且直至收集所产生的病毒时增加到至少15 W/m3、至少30 W/m3、至少60 W/m3、至少100 W/m3或至少120 W/m3 。可替代地，在吸附阶段，体积功率输入可以维持在恒定值。因此，在进一步的实施方案中，在连续步骤（提供在细胞培养基中培养的细胞群体，用目标病毒接种所述群体30 分钟、45 分钟、1小时、1小时30分钟或2小时，根据上述条件稀释经接种的细胞，和孵育稀释的经接种的群体）中，施加到根据本发明的细胞培养物的体积功率输入维持在至少15 W/m3、至少30 W/m3、至少60 W/m3、至少100 W/m3或至少120 W/m3。
接种可以以约10-1至10-7的MOI（感染复数）进行，合适地是约10-2至10-6，并且更合适地，约10-5。
用于病毒感染的温度和pH条件可发生变化。温度可根据病毒类型范围从32℃至39℃。对于流感病毒的生产，细胞培养物的感染可根据所生产的毒株而变化。流感病毒感染合适地在范围从32℃至35℃的温度下，合适地在33℃下进行。在一个实施方案中，病毒感染发生在33℃。在一个可替代的实施方案中，病毒感染发生在35℃。根据病毒毒株可以将蛋白酶，通常是胰蛋白酶添加到细胞培养物，以允许病毒复制。在培养期间可以在任何合适的阶段添加蛋白酶。胰蛋白酶优选是非动物来源，即蛋白酶不是从动物来源纯化的。其合适地在微生物（诸如细菌、酵母或植物）中重组产生。重组胰蛋白酶的合适实例是Trypzean，在玉米中生产的重组胰蛋白酶（Prodigen, 101 Gateway Blvd, Suite 100 College Station,Texas 77845. 制造商代码: TRY），或TrypLE（Invitrogen），其是在真菌中表达的胰蛋白酶样的酶（WO2004/020612）。在一个实施方案中，胰蛋白酶在病毒接种到细胞中的同时加入，即，胰蛋白酶在第0天（D0）添加。在进一步的实施方案中，胰蛋白酶进一步在接种后不同时间点添加，诸如例如，在接种后第1天（D1）和/或第4天（D4）。在一个可替代实施方案中，胰蛋白酶进一步在病毒接种后每天添加，直到所产生的病毒被收集。
一旦感染，细胞可以向培养基中释放新形成的病毒颗粒，这是由于宿主细胞的自发裂解，也被称为被动裂解。因此，在一个实施方案中，可以通过收集细胞培养基在病毒接种后的任何时间提供细胞产生的病毒收获物。当希望在病毒接种后的不同时间点收获细胞产生的病毒，并且如果需要的话合并不同的收获物，这种收获模式是特别合适的。
可替代地，病毒感染后，基于细胞培养的病毒可以通过采用外部因素裂解宿主细胞（也称为主动裂解）来收获。然而，与前一个不同，这样的收获模式要求所述细胞来源的病毒收获物在单一时间点收集，因为主动地裂解细胞将立即终止细胞培养。
可用于主动细胞裂解方法是本领域技术人员已知的。在这方面有用的方法是例如，冻融，固体剪切，高渗和/或低渗裂解，液体剪切，高压挤压，去污剂裂解，或其任何组合。
根据一个实施方案，可通过收集细胞培养上清液，裂解接种的细胞或两者，在病毒接种后的任何时间提供基于细胞培养的病毒收获物。
收获前，细胞感染可持续2至10天。根据一个具体实施方案，收获来自接种后第3、4和5天的培养物上清液并合并用于进一步下游加工（病毒分离或病毒纯化）。根据一个不同的实施方案，细胞培养物上清液收集自接种后第5天。收获细胞产生的病毒的最佳时间通常基于感染峰值的确定。例如，通过监测病毒接种后发生在宿主细胞中的形态变化（包括细胞变圆、定向障碍、膨大或收缩、死亡、从表面脱离）来测量CPE（细胞病变效应）。特定病毒抗原的检测也可以通过蛋白检测的标准技术，诸如蛋白质印迹分析进行监控。当达到所希望的检测水平时，可以然后收集收获物。在流感病毒的特定情况下，HA的含量可以通过SRD测定法（Wood, JM, 等 (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247）在细胞用病毒接种后的任何时间监测，所述测定法是本领域的技术人员熟悉的技术。此外，也可以使用SRD测定法用于确定获得优化的病毒产率所需的最佳细胞密度范围。
在本发明的上下文中，细胞培养阶段将被理解为涵盖了病毒回收步骤之前的任何步骤，而病毒纯化阶段应理解为包括所述收集步骤后的任何步骤。
根据本发明，在细胞培养中生产后，将病毒纯化。在病毒纯化领域中已知的任何合适的步骤或技术都可以在本发明的方法中在产生的病毒被收集后适当地实施。在一个实施方案中，本发明的方法包括选自病毒收获物澄清、超滤/渗滤、超速离心和层析、或其任何组合的至少一个步骤。取决于所期望的纯度水平，上述步骤可以以任何方式进行组合。
在一个具体实施方案中，在病毒纯化阶段，本发明的方法包括至少病毒收获物澄清步骤，由此提供滞留物的超滤/渗滤步骤，和超速离心步骤。
收集感染细胞的含有病毒的细胞培养基后，所提供的病毒收获物通常是澄清的，以便将病毒从细胞材料，诸如完整的细胞或细胞碎片分离。澄清可以通过过滤步骤进行，典型的是微滤步骤，即，使用具有通常0.1 µm至10 µm孔径的滤器。合适的滤器可利用纤维素滤器、再生纤维素滤器、组合无机助滤剂的纤维素纤维、组合无机助滤剂和有机树脂的纤维素滤器，或者它们的任何组合，以及聚合物滤器。虽然不是必需的，可以进行多个过滤过程，如二或三阶段过程，其在于例如以根据杂质大小顺序地和逐步除去杂质，使用具有合适的标称孔径的滤器，特别是，具有递减的标称孔径的滤器，允许开始除去大的沉淀物和细胞碎片。此外，采用相对紧密的滤器或离心的单级操作也可以用于澄清。更一般地，任何澄清的方式，包括但不限于，直流过滤或“死端”过滤、深层过滤、切向流过滤或错流过滤、或离心，其提供适当的清澈度的滤液而不弄脏随后的步骤中的膜和/或树脂，将都可接受用于本发明的澄清步骤。在一个实施方案中，病毒的澄清步骤通过深层过滤进行，特别是使用由例如具有5 µm – 0.5 µm – 0.2 µm的标称孔隙度的三种不同深层滤器构成的三阶段连续过滤（train filtration）。在另一个实施方案中，通过微滤澄清病毒收获物，任选之前是离心步骤作为预澄清。在具体的实施方案中（其中产生病毒诸如流感病毒的根据本发明的方法包括在纯化步骤d）期间的微滤澄清步骤），在所述澄清步骤后获得的病毒产率，诸如流感病毒的HA产率是至少65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％或更多。
根据本发明，在本发明的方法中的病毒纯化阶段期间，病毒收获物也可以进行超滤（当用于缓冲液交换时有时称为渗滤），用于浓缩病毒和/或缓冲液交换。当待纯化的病毒被稀释时，这个步骤是特别有利的，例如，当合并通过经接种后几天灌注收集的病毒收获物时，确实如此。根据本发明的方法，用于浓缩病毒和/或交换缓冲液的方法可以包括任何过滤方法，其中病毒的浓度增加是通过迫使稀释剂以这样的方式经过滤器，所述方式使得稀释剂从病毒悬浮液去除，而病毒无法通过滤器，并由此以浓缩形式保留在病毒制剂中。
如果使用不是中性但带正电荷的膜或滤器，则可以用于实施润洗所述膜或滤器的额外步骤，所述步骤用包含盐的润洗缓冲液以洗脱可能由于与膜或滤器的离子相互作用而被保留的病毒级分。可被包括在润洗缓冲液中的合适的盐的一个实例是氯化钠（NaCl），其可以以0.1M至2M的浓度范围，特别是0.5M至1.5M，合适地1M存在。在本发明的一个实施方案中，当通过膜过滤进行澄清时，无论是预澄清或澄清，所述澄清包括用含有NaCl，尤其是NaCl 1M的缓冲液的膜润洗步骤。
超滤可包括渗滤，其是用于去除和交换盐、糖、非水性溶剂，去除低分子量材料，离子和/或pH环境快速改变的理想方式。微溶质通过以等于超滤速率的速率添加溶剂到被超滤的溶液中而最有效地去除。这以恒定体积从溶液洗去微物质（microspecies），分离保留的病毒。当下游步骤需要使用特定缓冲剂以获得最佳的反应时，渗滤是特别有利的。例如，在用核酸内切酶降解宿主细胞核酸之前实施渗滤步骤可以允许在特定和最适合该核酸内切酶的缓冲液中进行核酸内切酶反应。浓缩和渗滤也可在纯化过程的任何合适的步骤实现，当想要去除不需要的化合物诸如蔗糖（在蔗糖梯度超速离心后），或者诸如甲醛（病毒用甲醛灭活的步骤后）时。该系统是由三种不同的加工流：进料溶液（包含病毒），渗透物和滞留物构成。根据应用，可以使用具有不同孔径的滤器。在本发明中，滞留物包含病毒并可用于进一步的纯化步骤，如果需要的话。膜组成可以是但不限于，再生纤维素，聚醚砜，聚砜，或它们的衍生物。该膜可以是平片（也称为平筛）或中空纤维。
在一个实施方案中，本发明方法的病毒纯化阶段包括至少一个超滤/渗滤步骤，合适地至少两个超滤/渗滤步骤。
取决于纯化的细胞培养物生产的病毒用于什么应用，可能希望还从病毒收获物去除宿主细胞的核酸污染物。特别是，当纯化的病毒将包括在疫苗中时，宿主细胞核酸应被降解并从纯化的病毒去除。核酸降解经常通过使用靶向RNA和DNA的核酸酶发生。合适的用于降解宿主细胞核酸的核酸酶的非限制性实例是的BenzonaseTM。BenzonaseTM，或任何其它合适的核酸酶，可在病毒纯化过程的任何合适的步骤中加入。在一个实施方案中，根据本发明的方法包括核酸酶降解步骤，合适地为BenzonaseTM处理。例如，可在澄清的含有病毒的细胞培养基的超滤后将核酸酶添加到获得的滞留物。可替代地，宿主细胞核酸降解可通过用β-丙内酯的病毒灭活步骤来实现。
如果需要的话，根据本发明获得的病毒可进一步使用对于病毒纯化采用的标准技术进行纯化，诸如密度梯度离心，例如蔗糖梯度超速离心和/或层析，诸如离子交换层析。在一个实施方案中，根据本发明的方法包括至少一个蔗糖梯度离心步骤。在进一步的实施方案中，本发明方法的纯化阶段包括至少澄清步骤，诸如例如，离心步骤和随后的微滤步骤，至少超滤步骤，和蔗糖梯度离心步骤。在具体实施方案中，其中根据本发明的生产病毒诸如流感病毒的方法，包括在纯化步骤d）期间的至少一个蔗糖梯度离心步骤，离心机转子的装载容量为至少40、至少50、至少60、或更多升病毒收获物或“等同”量（转子的每升），且在所述蔗糖梯度离心步骤之后获得的病毒产率诸如流感病毒的HA产率为至少65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％或更多。
根据本发明的方法，可以有可能组合纯化步骤，诸如蔗糖梯度超速离心与病毒裂解步骤。特别是，裂解剂可以加入到蔗糖梯度中。当期望最小化本发明方法的步骤总数时，这个实施例是特别适合的，因为它允许在一个单一的操作中纯化和裂解病毒两者。因此，在某些实施方案中，当实施至少一个蔗糖梯度超速离心时，蔗糖梯度还包括裂解剂。
可替代地，当实施时，本发明方法的病毒裂解步骤分批进行。
在病毒纯化阶段结束时，根据本发明的方法获得的病毒制备物可以合适地进行无菌过滤，所述无菌过滤如在药用级材料诸如免疫原性组合物或疫苗的方法中常见的和本领域技术人员已知的。这种无菌过滤可以例如合适地通过经0.22 µm滤器过滤制备物来执行。无菌制备之后，病毒或病毒抗原准备好用于临床，如果需要的话。
免疫原性组合物，特别是疫苗，一般可以以亚病毒粒子形式配制，例如以裂解病毒的形式，其中所述脂质包膜已经溶解或破坏，或者以一种或多种纯化的病毒蛋白（亚单位疫苗）的形式。作为一种替代方案，免疫原性组合物可包括完整病毒，例如活的减毒的完整病毒或灭活的完整病毒。
裂解病毒，诸如流感病毒的方法，是本领域熟知的（WO02 /28422）。通过用破裂浓度的裂解剂破裂或破碎完整病毒（无论是感染性（野生型或减毒的）或非感染性（灭活的））来进行病毒的裂解。裂解剂通常包括能够打破和溶解脂膜的试剂。传统上，使用溶剂/去污剂处理诸如磷酸三正丁酯、或二乙醚组合TweenTM（称为“吐温-醚”裂解）产生裂解的流感病毒，并且此方法在一些生产设施中仍然使用。现在使用的其它裂解剂包括去污剂或蛋白水解酶或胆汁盐，例如脱氧胆酸钠。可以用作裂解剂的去污剂包括阳离子去污剂例如十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），其它离子去污剂，例如月桂基硫酸钠（SLS），牛磺脱氧胆酸盐，或者非离子型去污剂，诸如吐温或Triton X-100，或任何两种或多种去污剂的组合。
在一个实施方案中，所述裂解剂是脱氧胆酸盐。在另一个实施方案中，所述裂解剂是Trition X-100。在进一步的实施方案中，根据本发明的方法使用Triton X-100和十二烷基硫酸钠的组合作为裂解剂。
裂解过程可以作为分批，连续或半连续过程来进行。当分批实施时，裂解病毒可能需要额外的纯化步骤，诸如层析步骤。没有必要执行这样的裂解步骤，当可以同时执行裂解和纯化步骤。例如，如上所述，可以将去污剂添加到蔗糖梯度（其旨在通过超速离心纯化病毒蛋白质）。在一个实施方案中，除了至少一个均化步骤之外，根据本发明的方法包括分批用去污剂进行的裂解步骤，特别是Triton X-100。
为了疫苗的安全性，可能有必要减少沿纯化过程的不同步骤的病毒悬浮液的感染性。病毒的感染性是由其在细胞系上复制的容量决定的。因此，根据本发明的方法，任选地，包括至少一个病毒灭活步骤。灭活可以通过使用，例如，β-丙内酯（BPL）、甲醛、或UV，或其任何组合，在方法的任何合适的步骤来进行。在一个具体的实施方案中，根据本发明的方法还包括至少一个BPL处理步骤。在一个具体的实施方案中，根据本发明的方法还包括至少一个BPL处理步骤和至少一个甲醛处理步骤。甲醛和BPL可以顺序使用，以任何顺序，例如，甲醛在BPL后使用。在一个实施方案中，甲醛处理之后是至少一个均化步骤。当使用特别是UV作为灭活方法时，实施UV照射前的病毒制剂的同质化，可有助于提高病毒灭活的效率。因为埋藏在聚集体内和因此一些病毒或病毒部分不能接近灭活剂，所以病毒，或病毒的部分（其会在聚集体中存在，无论是病毒聚集体还是病毒/细胞聚集体）可能逃避照射。在一个实施方案中，根据本发明的方法获得的病毒制剂被灭活，例如，通过UV照射，并在进行均化后立即进行所述灭活。病毒灭活的条件可以变化，并且将特别是通过测量组织培养感染剂量（TCID50/ml）评估残留的病毒感染性来确定。
本发明的包括疫苗的免疫原性组合物可任选地含有常用于疫苗的添加剂，特别是增加在接受组合物的患者中引发的免疫应答的物质，即所谓的佐剂。
在一个实施方案中，考虑免疫原性组合物，其包含与合适的药物载体混合的本发明的病毒或病毒抗原。在一个具体实施方案中，它们包含佐剂。
佐剂组合物可包含水包油乳液，其包含可代谢的油和乳化剂。为了使在水组合物中的任何油适合于人施用，乳液系统的油相必须包含可代谢的油。术语可代谢的油的含义在本领域是熟知的。可代谢的可以被定义为“能够通过代谢被转化”（Dorland’sIllustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition (1974)）。所述油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，其对于接受者是没有毒性的并能够通过新陈代谢被转化。坚果、种子和谷物是植物油的常见来源。合成油也是本发明的一部分，并可包括市售油，例如NEOBEE®等。
一个特别合适的可代谢的油是角鲨烯。角鲨烯（2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-廿四碳六烯）是被大量发现于鲨鱼肝油中，和较低量在橄榄油、小麦胚芽油、米糠油和酵母中的不饱和油，并且是用于本发明的特别优选的油。角鲨烯是可代谢的油，基于其是胆固醇的生物合成的中间体的事实（Merck索引，第10版，记录号8619）。在本发明的进一步的实施方案中，可代谢油以组合物的总体积0.5％-10％（体积/体积）的量存在于免疫原性组合物中。
水包油乳液进一步包含乳化剂。所述乳化剂可合适地是聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯。另外，所述乳化剂合适地以组合物的总体积的0.125至4％（体积/体积）存在于疫苗或免疫原性组合物中。
本发明的水包油乳液任选包含母育酚。母育酚是本领域熟知的，并且在EP0382271中有描述。合适地可以是母育酚的是α-生育酚或其衍生物诸如α-生育酚琥珀酸酯（也称作维生素E琥珀酸酯）。另外，所述母育酚合适地以免疫原性组合物的总体积的0.25%至10%（体积/体积）的量存在于佐剂组合物中。
制备水包油乳液的方法是本领域技术人员熟知的。通常，所述方法包括混合所述油相（任选包含母育酚）与表面活性剂诸如PBS/吐温80™溶液，然后用均化器均化，本领域技术人员将清楚，包括使混合物两次通过注射器针头的方法将适合用于均化小体积液体。同样地，在微流化器（M110S微流体机器，最多50次通过，以6巴的最高压力输入（约850巴的输出压力）持续2分钟时期）中乳化过程可以由本领域技术人员改变以适于产生较小或较大体积的乳液。改变可以通过包括所得乳液的测量的常规实验来实现，直到获得具有所需直径的油滴的制剂。
在水包油乳液，油和乳化剂是在水性载体中。水性载体可以是例如磷酸盐缓冲盐水。
特别是，本发明的水包油乳液体系具有在亚微米范围内的小油滴尺寸。合适地液滴尺寸将在直径120-750nm范围，更具体地尺寸从120到600nm。甚至更具体地，水包油乳液含有油滴，其中以直径计至少70％的强度小于500 nm，更具体以直径计至少80％的强度小于300 nm，更具体以直径计至少90％的强度在120-200nm的范围内。
根据本发明的油滴尺寸，即直径，由强度(intensity)给出。存在由强度确定油滴尺寸的直径的几种方式。强度通过使用尺寸测定仪（sizing instrument）测量，合适地通过动态光散射，诸如Malvern Zetasizer 4000或合适地Malvern Zetasizer3000HS。详细的程序在实施例II.2中给出。第一种可能性是通过动态光散射（PCS光子相关光谱）确定Z平均直径ZAD；此方法另外得到多分散性指数（PDI），并且ZAD和PDI两者都用累积量算法计算得出。这些值不需要颗粒折射率的知识。第二个平均值是通过确定由另一种算法的整个粒度分布来计算油滴的直径，所述另一种算法是Contin，或NNLS或自动“Malvern”算法（由尺寸测定仪提供的默认算法）。大部分时间，因为复合组合物的颗粒折射率是未知的，仅强度分布被考虑，并且如果有必要，考虑源自此分布的强度平均值。
佐剂组合物可进一步包括Toll样受体（TLR）4激动剂。“TLR4激动剂”指这样的组分，其能够导致通过TLR4信号传导途径的信号传导应答，无论是作为直接的配体或间接通过产生内源性或外源性配体（Sabroe等，JI2003 1630-5）。TLR4可以是脂质A衍生物，特别是单磷酰脂质A或更特别地3脱酰单磷酰脂质A（3D-MPL）。
3D-MPL是由GlaxoSmithKline Biologicals North America在商标MPL®下提供，并且主要促进具有IFN-g（Th1）表型的CD4+ T细胞应答。其可以根据GB2220211 A公开的方法产生。化学上其是具有3、4、5或6酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。特别是，在本发明的佐剂组合物中使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有这样的颗粒大小，使得其可以无菌过滤通过0.22μm滤器。这种制剂描述于国际专利申请号WO94/21292。脂质A的合成衍生物是已知的，并认为是TLR4激动剂，包括但不限于：
OM174 (2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰基氧基四-癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基二氢磷酸酯), (WO 95/14026)
OM 294 DP (3S, 9 R) –3--[(R)- 十二烷酰基氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸烷-1,10-二醇,1,10-双(二氢磷酸酯) (WO99 /64301和WO 00/0462 )
OM 197 MP-Ac DP ( 3S-, 9R) -3-[(R) -十二烷酰基氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸烷-1,10-二醇,1 -二氢磷酸酯 10-(6-氨基己酸酯) (WO 01/46127)
可以使用的其它TLR4配体是烷基氨基葡糖苷磷酸酯（AGP）诸如WO9850399或US6303347中公开的那些（还公开了制备AGP的方法），或如在US6764840中讨论的AGP的药学上可接受的盐。一些AGP是TLR4激动剂，而一些是TLR4拮抗剂。两者都被认为作为佐剂是有用的。此外，进一步合适的TLR-4激动剂在US2003/0153532和US2205/0164988中公开。
本发明特别适合用于制备流感病毒免疫原性组合物，包括疫苗。目前可得到流感病毒的各种形式。它们一般基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于整个病毒粒子，裂解的病毒粒子或纯化的表面抗原（包括HA）。流感抗原也可以病毒体的形式（无核酸的病毒样脂质体颗粒）呈现。
病毒灭活方法和裂解方法已经在上面描述并且可应用于流感病毒。
用于疫苗的流感毒株随季节变化。在目前的大流行之间的时期，疫苗一般包括两个甲型流感毒株和一个乙型流感毒株。三价疫苗是典型的，但更高价，诸如四价，也可以考虑在本发明中。本发明还可以使用来自大流行毒株（即，疫苗接受者和普通人群对其是免疫上幼稚的(immunologically naïve)的毒株）的HA，并且用于大流行毒株的流感疫苗可以是单价的或者可以基于补充大流行毒株的正常三价疫苗。
本发明的组合物可以包括来自一种或多种流感毒株包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。特别是，包括来自两个甲型流感病毒毒株和一个乙型流感毒株的抗原的三价疫苗被本发明所考虑。可替代地，包括来自两个甲型流感病毒毒株和两个乙型流感毒株的抗原的四价疫苗也在本发明范围内。
本发明的组合物不局限于单价组合物，即仅包括一个毒株类型，即仅季节性毒株或仅大流行毒株。本发明还涵盖包含季节性毒株和/或大流行毒株的组合的多价组合物。特别是，四价组合物（其可以是佐剂化的，包含三个季节性毒株和一个大流行毒株）落入本发明的范围之内。落入本发明范围内的其它组合物是包含两个A毒株和一个B毒株（诸如H1N1，H3N2和B毒株）的三价组合物，以及包含不同谱系两个A毒株和两个B毒株（诸如H1N1，H3N2，B/Victoria和B/Yamagata）的四价组合物。
HA是目前灭活流感疫苗中的主要免疫原，并且疫苗剂量通过参考HA水平（一般是通过SRD测量）进行标准化。现有疫苗一般含有每毒株约15 µg的HA，尽管可以使用较低的剂量，例如对于儿童，或在大流行的情况下，或者使用佐剂时。已经使用分次剂量诸如一半（即每毒株7.5µg HA）或四分之一，如同具有更高剂量的情况，特别是3x或9x的剂量。因此本发明的免疫原性组合物可包括每流感毒株0.1-150µg的HA，特别是0.1-50µg，例如0.1-20 µg、0.1-15µg、0.1-10µg、0.1-7.5µg、0.5-5µg等。具体剂量包括每毒株约15、约10、约7.5、约5µg，每毒株约3.8µg和每毒株约1.9µg。
一旦流感病毒已被对于具体毒株进行纯化，其可与来自其它毒株的病毒组合以制造例如，如上所述的三价疫苗。分别处理每个毒株并混合单价批次（bulk）以得到最终的多价混合物是更合适的，而不是混合病毒和降解DNA并从多价混合物纯化它。
本发明将通过参考以下的非限制性实施例进一步描述。
实施例I：使用高体积功率的流感病毒的生产
- EB66®细胞以约0.4×106细胞/ml的密度以65L的总体积接种在200L的一次性生物反应器（来自Sartorius AG的Cultibag STR，其包括倾斜叶片叶轮，或Rushton涡轮（合适时）），并且以分批模式在36.5℃悬浮生长，以如下的搅拌速率：对应于应用至少30 W/m3的体积功率输入的105rpm（039号，048号，052号，058号，044号，046号，和043号），或对应于应用至少120 W/m3的体积功率输入的135rpm（053号和057号），或对应于应用至少7 W/m3的体积功率输入的65rpm（025号，026号，027号和031号）。使用包括倾斜叶片叶轮的一次性的生物反应器实现至少30W/m3的体积功率输入，而使用包括Rushton涡轮的一次性的生物反应器实现至少120W/m3的功率输入。
- 生长3天后，细胞密度达到至少9×106个细胞/ml。在这个时间点，细胞用包含1x 10-5的感染复数（MOI）的H5N1流感病毒和胰蛋白酶（来自Invitrogen的30 mrPu/mlTrypLE）的溶液接种，其被认为第0天（D0），并且温度在35℃进行切换。接种1小时30分钟后，接种的细胞悬浮液通过添加多至200 L总体积的新鲜培养基进行3倍稀释。在上述1小时30分钟时间段期间，体积功率输入降低到7 W/m3（039号，048号，052号，058号，044号，046号，043号，053号和057号），或保持在7 W/m3（025号，026号，027号和031号）。
- 接种的细胞稀释后，立即将体积功率输入再次提高到至少30W/m3（039号，048号，052号，058号，044号，046号，和043号），或至少120W/m3（053号和057号），并保持在这样的水平，或维持在7 W/m3（025号，026号，027号和031号），直至收集含有病毒的培养基，病毒接种后5天，由此产生病毒收获物。在病毒接种后第1天（D1）和第4天（D4）进一步添加胰蛋白酶（来自Invitrogen的10 mrPu/ml TrypLE）。
- 然后如下所述纯化的病毒收获物。
实施例II：高体积功率对微滤的作用
- 一旦收获，病毒收获物通过以10500rpm，90L/小时连续离心预澄清，由此产生预澄清的病毒收获物。
- 预澄清的收获物然后使用0.45 µm的平片膜（Sartorius AG），以恒定的TMP（跨膜压力）和进料流速（分别为3psi和600L/m2/h ）进行微滤，从而产生澄清的病毒收获物。
- 在微滤步骤根据SRD测定法通过测量该步骤前后的HA含量评价流感病毒产率，如在下文实施例IV所述。结果显示于表1中，以相比对照值100％的百分比的形式，所述对照值100％表示存在于起始材料（即存在于微滤之前预澄清的病毒收获物）中总的HA量。
表1-微滤后HA产率-低体积功率相比高体积功率
Figure DEST_PATH_IMAGE001
* pi：病毒接种后
* Std Dev：标准偏差。
结果-结论
尽管在细胞培养阶段增加体积功率输入（30W/m3相比7W/m3）对存在于所收集的病毒收获物中的HA产率没有影响（参见表1，第四列“D5 pi的病毒生产”），但是观察到对在随后的微滤步骤获得的HA产率有积极的影响。当体积功率输入较高时（参见相应的平均值的行）不仅微滤后得到的HA产率更高，而且实验之间得到的值也更一致且较少变化（参见相应的标准偏差的行-6相比25，当体积功率输入分别为30或7时）。这些结果表明，在上游细胞培养阶段期间更高的体积功率导致在下游病毒纯化阶段期间改进的和更一致的HA产率。
实施例III：高体积功率对蔗糖梯度超速离心的作用
- 细胞生长和感染H5N1流感病毒，并且如在上述实施例I所述收获病毒。
- 预澄清病毒收获物，并如在实施例II中所述将预澄清的收获物进行微滤。
- 澄清的病毒收获物然后通过用由聚砜制成的750 kD中空纤维膜（GEHealthcare）进行超滤浓缩10倍，并相对5体积的含有125mM柠檬酸盐pH7.4的PBS以恒定的TMP（跨膜压力）和进料流速（分别为3 psi和35 L/m2/h）进行渗滤。
- 然后将超滤滞留物进行蔗糖梯度超速离心步骤，其中病毒和污染物迁移到梯度中直至达到它们各自的密度。流感病毒具有约1.19g/cm3的密度，并且从而将沉淀在蔗糖浓度等于病毒密度的梯度中（约43％蔗糖）。在离心机的转子中形成从0到55％蔗糖的连续线性梯度后，将超滤滞留物装载入所述转子，以对应于转子每升30升收获物（039号，043号，032号，033号，028号和029号）或转子每升50-60升收获物（044A号，044B号，046号，048号，025号，026号，027号，031号）的滞留物当量的装载容量，如表2和3中所示。当装载整个样品时，1小时的成带时间(banding time)允许病毒在离心机停止并且蔗糖梯度被卸载并分级前达到其密度且在蔗糖梯度内浓缩。病毒颗粒浓缩在几个级分内。产物级分在含有125 mM柠檬酸盐和蔗糖的pH 7.4的PBS中。从约从30到50％范围的蔗糖百分比合并纯化的全病毒粒子。已使用抗HA抗体基于SDS-PAGE和蛋白质印迹分析概况确定此范围。
- 在蔗糖梯度超速离心步骤根据SRD测定法通过测量该步骤前后的HA含量评价流感病毒产率，如在下文实施例IV所述。结果显示于表2和表3中，以相比对照值100％的百分比的形式，所述对照值100％表示存在于起始材料（即存在于蔗糖梯度超速离心之前超速离心滞留物）中总的HA量。
表2 - 以转子每升30升收获物的装载容量的蔗糖梯度超速离心后的HA产率
Figure 503552DEST_PATH_IMAGE002
* Std Dev：标准偏差。
指示的装载容量（30）对应于离心机转子每升装载的在本发明方法的步骤c）期间收集病毒收获物升的超滤滞留物当量。
结果-结论
以转子每升的30升收获物的装载容量，蔗糖梯度超速离心后获得的平均HA产率在相同的可接受的范围内，即72-82％，无论体积功率输入是7 V/m3或30 V/m3。
表3 - 以转子每升50-60升收获物的装载容量的蔗糖梯度超速离心后的HA产率
Figure DEST_PATH_IMAGE003
* Std Dev：标准偏差。
指示的装载容量（50或60）对应于离心机转子每升装载的在本发明方法的步骤c）期间收集病毒收获物升的超滤滞留物当量。
结果-结论
在转子每升50-60升收获物的较高装载容量，当体积功率输入为7V/m3，即在低的体积功率输入时，蔗糖梯度超速离心后获得的平均HA产率显著下降（参见表3，31％），与在转子每升30升收获物的装载容量并具有相似的低体积功率输入获得的HA产率相反（参见表2，82％）。相反，当体积功率输入增加至30V/m3时，以转子每升50-60升收获物的更高装置容量在蔗糖梯度超速离心后获得的平均HA产率维持在相同的可接受的范围内（参见表3，71％）。这表明，在细胞培养阶段增加体积功率输入（30W/m3相比7W/m3）允许在用于蔗糖梯度超速离心步骤的转子上装载两倍或更多的收获物体积或收获物体积当量，同时保持相同的可接受范围内的HA产率。离心机上的装置容量直接影响大规模操作所需的离心机的数量。装置容量越高，所需要的离心机的数目越低。
实施例IV：用于测量HA含量的SRD方法
玻璃板（12.4 - 10 cm）涂覆有含有一定浓度的由NIBSC推荐的抗流感HA血清的琼脂糖凝胶。凝胶凝固后，将72个样品孔（直径3 mm）打孔到琼脂糖中。将10µl的参考和样品的适当稀释液装载到孔中。将平板在保湿室中在室温（20至25℃）下孵育24小时。在此之后，将板用NaCl溶液浸泡过夜并在蒸馏水中简单清洗。然后将该凝胶压制和干燥。当完全干燥后，将平板在考马斯亮蓝溶液上染色10分钟，并在甲醇和乙酸的混合物中脱色两次，直到清楚确定的染色区域变得可见。干燥该板后，抗原孔周围染色区域的直径在成直角的两个方向进行测量。可替代地，可以使用测量表面的设备。建立针对表面抗原稀释液的剂量 - 反应曲线，并根据标准斜率比测定方法计算结果（Finney, D.J. (1952). StatisticalMethods in Biological Assay. London: Griffin, Quoted in: Wood, JM, et al(1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247）。

Claims (26)

1.在细胞培养物中生产病毒的方法，其包括至少下列步骤：
a）提供在细胞培养基中的细胞群体，其中向所述细胞施加30 W/m3-120 W/m3的体积功率输入，直到所述细胞的细胞密度达到8 x 106 细胞/ml-20 x 106 细胞/ml，
b）通过如下感染细胞群体：
i. 用病毒接种所述群体1小时30分钟，其中体积功率输入降低到7 W/m3，和
ii. 孵育被接种的群体以便允许病毒复制和繁殖，其中体积功率输入再次增加到30W/m3-120 W/m3，
c）收集生产的病毒，由此提供病毒收获物，和
d）纯化所述病毒，其中所述病毒收获物通过微滤澄清，并且通过蔗糖梯度超速离心进一步纯化，并且其中所述蔗糖梯度超速离心的装载容量是每升转子50-60L病毒收获物，
其中所述细胞是禽类胚胎干细胞，并且所述病毒是流感病毒。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤b)ii的所述体积功率输入是至少60 W/m3。
3.根据权利要求2的方法，其中步骤b)ii的所述体积功率输入是至少100 W/m3。
4.根据权利要求1的方法，其中所述体积功率输入在步骤a）和步骤b）期间施加到所述细胞培养物。
5.根据权利要求1的方法，其中在所述细胞群体用病毒接种之前，所述细胞的细胞密度达到至少9 x 106 细胞/ml。
6.根据权利要求5的方法，其中在所述细胞群体用病毒接种之前，所述细胞的细胞密度达到至少10 x 106 细胞/ml。
7.根据权利要求6的方法，其中在所述细胞群体用病毒接种之前，所述细胞的细胞密度达到至少11x 106 细胞/ml。
8.根据权利要求7的方法，其中在所述细胞群体用病毒接种之前，所述细胞的细胞密度达到至少12x 106 细胞/ml。
9.根据权利要求8的方法，其中在所述细胞群体用病毒接种之前，所述细胞的细胞密度达到至少13 x 106 细胞/ml。
10.根据权利要求1的方法，其中在步骤b）期间，步骤i.的接种的细胞在接种病毒后立即被稀释2-5倍范围，并进行进一步的孵育。
11.根据权利要求1的方法，其中在步骤b）期间，步骤i.的接种的细胞在接种病毒后立即被稀释以获得3 x 106 细胞/ml至5 x 106 细胞/ml范围的细胞密度，并进行进一步的孵育。
12.根据权利要求1的方法，其中在步骤b）期间，在接种后病毒进行孵育30分钟、45分钟、1小时、1小时30分钟或2小时，然后将接种的细胞稀释2-5倍的范围并进行进一步的孵育。
13.根据权利要求1的方法，其中在步骤b）期间，在接种后病毒进行孵育30分钟、45分钟、1小时、1小时30分钟或2小时，然后将接种的细胞稀释以获得3 x 106 细胞/ml至5 x 106细胞/ml范围的细胞密度，并进行进一步的孵育。
14.根据权利要求1-4的任一项的方法，其中胰蛋白酶在步骤b）期间添加到细胞。
15.根据权利要求14的方法，其中胰蛋白酶在接种病毒的同时添加。
16.根据权利要求15的方法，其中胰蛋白酶进一步在接种后第1天和/或第4天添加。
17.根据权利要求15的方法，其中胰蛋白酶进一步在病毒接种后每天添加，直至步骤c）的生产的病毒被收集。
18.根据权利要求1-4的任一项的方法，其中步骤c）的生产的病毒在病毒接种后2-10天收集。
19.根据权利要求1-4的任一项的方法，其中所述病毒纯化步骤d）进一步包括病毒灭活步骤。
20.根据权利要求19的方法，其中所述病毒灭活步骤用β-丙内酯进行。
21.根据权利要求1-4的任一项的方法，其中所述病毒纯化步骤d）包括裂解步骤。
22.根据权利要求1-4的任一项的方法，其中所述流感病毒是H2、H5、H6、H7或H9亚型。
23.根据权利要求22的方法，其中所述流感病毒是H1、H3或B亚型。
24.根据权利要求1-4的任一项的方法，其中所述细胞悬浮生长。
25.根据权利要求1-4的任一项的方法，其中所述细胞是EB66®细胞。
26.用于制备疫苗的方法，其至少包括混合根据权利要求1-25的任一项的方法获得的病毒与药学上可接受的载体的步骤。
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