BR112016004136B1 - Métodos para produzir um vírus em uma cultura celular e para a preparação de uma vacina - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA PRODUZIR UM VÍRUS EM UMA CULTURA CELULAR E PARA A PREPARAÇÃO DE UMA VACINA. Um método para produzir um vírus em uma cultura celular que compreende pelo menos as etapas de a) fornecer uma população de células cultivadas em um meio de cultura celular, b) infectar a população de células por i. inoculação da população com o vírus e ii. incubação da população inoculada a fim de permitir que o vírus replique e propague, c) coletar o vírus produzido, desse modo, fornecendo uma coleta viral e d) purificar o vírus, em que a densidade de energia de pelo menos 15 W/m3, pelo menos 30 W/m3, pelo menos 60 W/m3, pelo menos 100 W/m3, pelo menos 120 W/m3 é aplicado à cultura celular pelo menos durante a etapa b).

Description

[001] Esta invenção foi realizada com o suporte do governo dos Estados Unidos sob o Contrato n° HHSO100200600011C emitido pelo Department of Health and Human Services; o governo dos Estados Unidos tem certos direitos na invenção.

CAMPO TÉCNICO

[002] A presente invenção refere-se a um método para produzir virus ou antígenos virais, produzido por cultura celular, aos vírus ou antígenos virais obteníveis por este método e vacinas que contêm tais vírus ou antígenos virais. Em particular, a invenção fornece um método para melhorar o rendimento viral.

FUNDAMENTOS

[003] O desenvolvimento de tecnologias com base em cultura cellular como uma alternativa aos sistemas de produção com base em ovo tradicionais para a fabricação de vacinas virais parece-se provavelmente como a solução mais rápida e mais promissora para superar as desvantagens e restrições associadas com os sistemas tradicionais com base em ovo. As produções comerciais de vacinas virais requerem tipicamente a quantidades grandes de vírus como uma fonte de antígeno. Entretanto, o processo com base em ovo é vulnerável devido à qualidade biológica variante de ovos e perde sua flexibilidade por causa de problemas logísticos devido a não disponibilidade de quantidades grandes de ovos adequados.

[004] Os sistemas de cultura celular se parecem como um modo alternativo de preparação de vacina, mais simples, flexível e consistente, permitindo melhorar as possibilidades de capacidades de produção melhores e, desta maneira, atinge quantidades grandes de vírus, se necessário. Por exemplo, em resposta a uma ameaça pandêmica natural ou a um ataque terrorista.

[005] Entretanto, a produção de vacina eficiente requer o desenvolvimento de vírus produzido em rendimentos altos de um sistema hospedeiro. As condições de cultivo sob as quais um vírus é desenvolvido são de significância maior em relação a atingir um rendimento alto aceitável do vírus. Desta maneira, a fim de maximizar o rendimento do vírus desejado, tanto o sistema quanto as condições de cultivo devem ser adaptados especificamente para fornecer um ambiente que é vantajoso para a produção do vírus desejado que é adequado para a produção em grande escala. Uma maneira é melhorar a produtividade específica de célula, por exemplo, pela melhora do meio de cultura ou aumentar a densidade celular. Devido ao fato que, após a produção, o vírus produzido por cultura celular deve ser recuperado a partir da cultura celular e purificado, uma outra maneira para melhorar o rendimento de vírus é limitar a perda de material viral que ocorre ao longo de etapas de purificação diferentes. Portanto, permanece uma necessidade para fornecer métodos alternativos e melhorados para a produção de vírus com um rendimento de vírus aumentado. O método de acordo com a presente invenção fornece um rendimento de vírus melhor que os métodos conhecidos na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Em um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para produzir um vírus na cultura celular que compreende pelo menos as etapas de: a) fornecer uma população de células em um meio de cultura celular, b) infectar a população de células por: i. inoculação da população com o vírus e 11. incubação da população inoculada a fim de permitir que o vírus replique e propague, c) coletar o vírus produzido, desse modo, fornecendo uma coleta viral e d) purificar o vírus, em que uma entrada de energia volumétrica de pelo menos 15 W/m3, pelo menos 30 W/m3, pelo menos 60 W/m3, pelo menos 100 W/m3 ou pelo menos 120 W/m3 é aplicado à cultura celular pelo menos durante a etapa b).

[007] Em um segundo aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a preparação de uma vacina que compreende pelo menos a etapa de misturar o vírus obtido de acordo com o método da presente invenção com um carreador farmaceuticamente aceitável.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[008] A presente invenção refere-se a um método melhorado de produzir vírus na cultura celular, que é particularmente útil para a produção em grande escala. Em particular, o método de acordo cm a invenção ajuda a aumentar o rendimento de vírus pela limitação da perda viral durante o processo de purificação. Surpreendentemente, os inventores observaram que algumas mudanças que acontecem na parte a montante do processo de produção viral, tal como aumentando a entrada de energia volumétrica aplicada às células cultivadas usadas para a produção de um vírus, resultaram em uma melhora significante na parte a jusante do dito processo, tal como um aumento do vírus obtido após algumas etapas de purificação. Em particular, os inventores observaram que, enquanto aumenta-se a entrada de energia durante a fase de cultura celular a montante não teve impacto na produtividade específica de célula, um impacto positivo em uma etapa subsequente de clarificação por microfiltração foi obtido em que o rendimento de vírus obtido após a dita etapa foi significantemente aumentado, em comparação com o rendimento obtido quando uma entrada de energia inferior foi implementada durante a fase de cultura celular. Além disso, não foi apenas a recuperação de vírus após a etapa de microfiltração, mas também as porcentagens de recuperação obtidas foram mais consistentes e menos variáveis a partir de um experimento a um outro. Também, os inventores observaram um efeito benéfico similar de aumentar a entrada de energia volumétrica durante a fase de cultura celular a montante em uma etapa de ultracentrifugação de gradiente de sacarose subsequente implementado durante a fase de purificação de vírus a jusante. Em particular, os inventores observaram que o aumento da entrada de energia volumétrica aplicada às células cultivadas permitiu aumentar significantemente, em torno de um fator de 2, a capacidade de carga do rotor usado para a etapa de ultracentrifugação de gradiente de sacarose. Como uma consequência, o rendimento de vírus melhorado obtido após algumas etapas de purificação levou a um rendimento global melhor no final do processo de produção de vírus. Inesperadamente, os inventores observaram que uma entrada de energia volumétrica mais alta não causa prejuízo ou dano às células.

[009] O método de acordo com a presente invenção fornece a vantagem de ser fácil de implementar, como nenhuma etapa extra ou nenhum outro equipamento adicional que não os padrões tipicamente usados para produzir um vírus na cultura celular são requeridos.

[0010] “Capacidade de carga” é a quantidade de litros de coleta viral coletados durante a etapa c) do método da invenção que é carregado por litro de rotor da centrífuga usada para a etapa de ultracentrifugação de gradiente de sacarose ou a quantidade “equivalente” de litros de coleta viral quando a dita coleta viral foi tratada antes de ser submetido à etapa de ultracentrifugação de gradiente de sacarose, devido às etapas de purificação anteriores. Por exemplo, como descrito abaixo, após ser coletada, a coleta viral pode ser submetida a ultrafiltração/diafiltração antes de ser submetido à etapa de ultracentrifugação de gradiente de sacarose, cuja ultrafiltração/diafiltração resultam tipicamente na concentração da coleta viral, isto é, a quantidade de litros de coleta viral é reduzida após uma tal etapa.

[0011] A “entrada de energia volumétrica” é a quantidade de energia por volume de unidade ou a taxa de dissipação de energia específica média. Na cultura celular, isto corresponde à quantidade de energia transferida à quantidade de energia a um volume de cultura celular através do eixo agitador e impulsores. Isto é expressado como W/m3. A fórmula empírica usada na técnica para calcular os valores de entrada de energia calculados é como segue: P/V= (Np x n3 x di5)/V, quando Np é i número de energia turbulenta para o impulsor, n é a taxa de agitação medida como revoluções de impulsor por segundo, di é o diâmetro do impulsor medido em metros e V é o volume de cultura em metros cúbicos.

[0012] O método de acordo com a presente invenção é aplicável a qualquer tipo de células, células aderentes desenvolvidas em microcarreadores ou células de suspensão. Consequentemente, no sentido da presente invenção, o termo “suspensão de célula” deve abranger tanto células aderentes desenvolvidas em microcarreadores quanto células capazes de desenvolver na suspensão, isto é, que não requerem qualquer suporte aderente, tais como microcarreadores, para se desenvolver.

[0013] Tipicamente, a entrada de energia volumétrica é aplicada por um movimento mecânico da suspensão celular. O dito movimento mecânico pode ser atingido através de meios diferentes. Por exemplo, o movimento mecânico da suspensão celular pode ser atingido por meio de um dispositivo de agitação, tais como impulsores.

[0014] A agitação pode ser comunicada como um fluxo axial, um fluxo radial ou uma combinação dos dois, dependendo do tipo impulsor que é usado. Tipicamente, os impulsores podem ser divididos nos grupos seguintes com base em sua geometria e, em particular, a geometria de suas lâminas: (i) as turbinas de lâmina plana, também comumente referidas como impulsores de Rushton ou impulsores do tipo Rushton; (ii) os impulsores com lâmina inclinada e (iii) os impulsores de lâmina naval.

[0015] As turbinas de lâmina plana ou impulsores de Rushton, são feitos de lâminas planas que são fixadas verticalmente ao longo do eixo de agitação, produzindo, desta maneira, um fluxo radial unidirecional. Aqueles tipos de impulsores são comumente usados em fermentações de linhas celulares que não são consideradas sensíveis ao corte, tais como leveduras, bactérias e alguns fungos. Entretanto, como descrito aqui, os inventores observaram que os impulsores de Rushton também podem ser adequadamente usados com células animais de acordo com o método da presente invenção.

[0016] Os impulsores de lâmina inclinada são feitos de lâminas planas que são fixadas em um ângulo em relação ao eixo de agitação, produzindo, desta maneira fluxo axial e radial simultâneo. Tais impulsores de lâmina inclinada são frequentemente usados com linhas celulares sensíveis ao corte que se desenvolve na suspensão ou com o auxílio de microcarreadores. Estes impulsores são frequentemente usados em culturas de batelada ou de alimentado por batelada, mas estes também podem ser usados para os processos contínuos e de perfusão.

[0017] A face principal das lâminas em um impulsor de lâmina naval pode ser plana ou côncava, visto que suas laterais traseiras são convexas, produzindo, desta maneira, um fluxo axial unidirecional.

[0018] Os fatores diferentes devem ser levados em conta para selecionar os tipos apropriados de impulsores, tais como, por exemplo, o tipo de células, o tipo de sistemas de cultura (sistema de cultura de batelada, alimentado por batelada ou perfusão), o tipo de recipientes de cultura, bem como o nível de entrada de energia volumétrica que é desejado. Está dentro do âmbito da pessoa versada determinar e selecionar o impulsor apropriado para o uso dependendo das condições específicas acima. Em uma modalidade, a entrada de energia volumétrica, em entrada de energia volumétrica particular que varia de 30 a 120 W/m3, aplicada no método de acordo com a invenção é atingida com um impulsor de lâmina inclinada. Em uma outra modalidade, a entrada de energia volumétrica, na entrada de energia volumétrica particular maior do que 120 W/m3, aplicada no método de acordo com a invenção é atingida com um impulsor de Rushton.

[0019] A entrada de energia volumétrica aplicada nas culturas de célula animal é, tipicamente, muito menor do que aquela nas culturas microbianas por causa da fragilidade mais alta assumida de células animais que são desprovidas de uma parede celular protetora, tornando-as, em particular, mais sensíveis à tensão de corte e formação de espuma do que as culturas microbianas. Entretanto, como observado pelos presentes inventores, a aplicação de uma entrada de energia volumétrica alta, até certo ponto, às culturas de célula animal usadas para produzir um vírus não prejudica as células, enquanto isto favorece vantajosamente a produção de vírus durante a purificação do vírus produzido.

[0020] O método de acordo com a invenção pode ser implementado em uma faixa ampla de entrada de energia volumétrica. Por “valor máximo” é pretendida a entrada de energia volumétrica máxima que pode ser aplicada na ausência de um impacto negativo total no rendimento viral. Um fator conhecido para ter um impacto negativo possível em rendimento viral é a integridade celular, tal como, por exemplo, viabilidade celular diminuída. A pessoa versada conhece como monitorar a viabilidade celular. Um exemplo não limitante de métodos adequados é o tingimento de célula (permitindo discriminar as células vivente das células mortas), tai como tingimento azul de tripano ou qualquer outro tingimento adequado conhecido. Alternativamente, a viabilidade celular também pode ser avaliada e medida pela citometria de fluxo, tal como, por exemplo, FACS (Classificação de Célula Ativada por Fluorescência). Também, quando se define o valor máximo, a produtividade específica de célula do vírus pode ser levada em conta. Por “produtividade específica de célula”, é entendida a capacidade de células para produzir vírus, isto é, a quantidade de vírus atingida na etapa de coleta c), antes de ser submetido à purificação. A entrada de energia volumétrica aplicada às células cultivadas, preferivelmente, não deve afetar negativamente a produtividade específica de célula do vírus.

[0021] Por “valor mínimo” de entrada de energia volumétrica é entendido o valor mínimo que fornece uma melhora do rendimento do vírus durante a fase de purificação do vírus em comparação com o rendimento do vírus durante a fase de purificação enquanto nenhuma ou uma baixa entrada de energia volumétrica é aplicada às células cultivadas. Qualquer método conhecido na técnica para medir o rendimento do vírus ou titulador do vírus pode ser adequadamente usado para ajudar a determinar os valores ideais de entrada de energia ideal a ser aplicada no método da invenção. Por exemplo, o CPE (Efeito Citopático) pode ser medido pelo monitoramento das mudanças morfológicas que ocorrem em células hospedeiras após a inoculação viral, incluindo o arredondamento, desorientação, dilatação ou encolhimento, morte ou destacamento celular da superfície. Também, a detecção de um antígeno viral específico pode ser monitorada por técnicas padrão de detecção de proteína, tais como uma análise de Western-blot, em qualquer período pós- inoculação das células com o vírus de interesse a ser produzido. No caso particular de vírus influenza, o teor de HA pode ser monitorado em qualquer período pós-inoculação das células com o vírus, pelo método SRD (Wood, JM, et al. (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247), que é uma técnica familiar a uma pessoa versada na técnica. Adicionalmente, o ensaio de SRD também pode ser usado em qualquer tempo durante a fase de purificação a fim de avaliar o rendimento viral antes e após qualquer etapa de purificação dada. De acordo com o método da presente invenção, a entrada de energia volumétrica aplicada às células animais usadas para produzir vírus tipicamente varia de 15 a 900 W/m3, adequadamente de 30 a 500 W/m3, mais adequadamente de 60 a 250 W/m3, mais adequadamente de 120 a 200 W/m3. Em uma modalidade, o valor de entrada de energia volumétrica usado no método de acordo com a invenção é de pelo menos 15 W/m3, pelo menos 30 W/m3, pelo menos 60 W/m3, pelo menos 100 W/m3 ou pelo menos 120 W/m3. Em uma modalidade específica, o valor de entrada de energia volumétrica usado no método de acordo com a invenção é de 30 W/m3. Alternativamente, em uma outra modalidade específica, o valor de entrada de energia volumétrica usado no método de acordo com a invenção é de 120 W/m3.

[0022] O método de acordo com a invenção é aplicável a qualquer tipo de recipientes de cultivo, de qualquer tamanho, tal como, por exemplo, frascos, garrafas rotativas ou biorreatores, contanto que os ditos recipientes são adequados para acomodar os dispositivos de agitação, tais como, por exemplo, impulsores ou são compatíveis com o uso de um dispositivo de agitação separado. Não é necessário que o recipiente compreende um dispositivo de agitação. O dispositivo de agitação pode ser separado do recipiente por si só. Por exemplo, no caso de biorreatores descartáveis consistem tipicamente de sacos plásticos, tais como biorreatores WaveTM, a agitação dos ditos biorreatores descartáveis pode ser atingida pela colocação dos biorreatores em uma mesa de agitação, um agitador orbital ou um agitador axial. Os biorreatores podem ser feitos de qualquer tipo de material, tais como, por exemplo, vidro ou aço inoxidável, para biorreatores não descartáveis ou plástico para biorreatores descartáveis. Também, os biorreatores podem ser de qualquer forma, tais como, por exemplo, na forma de cilindro ou cúbico. Os biorreatores são tipicamente usados para a escala intermediária, tal como de 1 a 10 L e escala de produção grande, tal como de 20 a 1000 L e além. O método de acordo com a invenção é aplicável a qualquer tipo de biorreator de qualquer tamanho. Em particular, o método da invenção é adequado para biorreatores de 10 L, 200 L, 500 L, 1000 L ou 10000 L. Um tipo particularmente adequado para o uso no método da invenção são biorreatores de tanque agitado, operado em batelada ou de maneira contínua. Os biorreatores descartáveis representam um tipo alternativamente adequado de biorreatores para o uso no método da invenção. Em uma modalidade, as células usadas no método de acordo com a presente invenção são cultivadas em um reator descartável de 200 L.

[0023] De acordo com a invenção, as células podem ser desenvolvidas de várias maneiras, tais como, por exemplo, usando-se sistemas de batelada, alimentados por batelada ou contínuos, tais como sistemas de perfusão. A perfusão é particularmente vantajosa quando a densidade celular alta é desejada. A densidade celular alta pode ser particularmente vantajosa a fim de maximizar a quantidade de vírus que pode ser produzida a partir de um dado tipo celular. O método para produzir um vírus na cultura celular em que a entrada de energia volumétrica alta é aplicada à cultura celular de acordo com a presente invenção é aplicável a qualquer um dos sistemas acima, se as células forem desenvolvidas usando-se sistemas de batelada, alimentados por batelada ou contínuos. Em uma modalidade de uma invenção, as células usadas de acordo com o método da presente invenção são desenvolvidas em um modo de batelada.

[0024] O método da invenção é responsável por uma faixa ampla de vírus, qualquer vírus que é capaz de infectar células e usando os para a sua replicação, incluindo, mas não limitado a, adenovírus, hepadnavírus, vírus do herpes, ortomixovírus, papovavírus, paramixovírus, picornavírus, poxvírus, reovírus e retrovírus. Em particular, o método da invenção é adequado para o vírus envelopado, tais como mixovírus. Em uma modalidade, os vírus produzidos pelo método da invenção pertencem à família de ortomixovírus, em particular, vírus influenza.

[0025] Vírus ou antígenos virais podem ser derivados de um Ortomixovírus, tais como o vírus influenza. Os antígenos de Ortomixovírus podem ser selecionados de uma ou mais das proteínas virais, incluindo hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), nucleoproteína (NP), proteína de matriz (M1), proteína de membrana (M2), uma ou mais da transcriptase (PB1, PB2 e PA). Os antígenos particularmente adequados incluem HA e NA, as duas glicoproteínas de superfície determinando a especificidade antigênica dos subtipos Influenza.

[0026] O vírus influenza podem ser selecionados do grupo de vírus influenza humano, vírus influenza aviário, vírus influenza equino, vírus influenza suíno, vírus influenza felino. O vírus Influenza é mais particularmente selecionado em cepas A, B e C, preferivelmente das cepas A e B.

[0027] Os antígenos de Influenza podem ser derivados de cepas de influenza interpandêmicas (anuais ou sazonais). Alternativamente, os antígenos de influenza podem ser derivados de cepas com o potencial para causar um surto pandêmico (isto é, as cepas de influenza com nova hemaglutinina em comparação com a hemaglutinina em cepas correntemente circulantes ou cepas de influenza que são patogênicas em pacientes aviários e têm o potencial para ser transmitido horizontalmente na população humana ou cepas de influenza que são patogênicas aos seres humanos). Dependendo da estação particular e da natureza do antígeno incluído na vacina, os antígenos de influenza podem ser derivados de um ou mais dos seguintes tipos de hemaglutinina: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16. Preferivelmente, o vírus influenza ou os seus antígenos são dos subtipos H1, H2, H3, H5, H7 ou H9. Em uma modalidade, os vírus influenza são dos Subtipos H2, H5, H6, H7 ou H9. Em uma modalidade alternativa, o vírus influenza são dos subtipos H1, H3 ou B.

[0028] As células que são usadas nos métodos de acordo com a invenção podem, em princípio, ser de qualquer tipo desejado de células animais que podem ser cultivadas na cultura celular e que suporta a replicação viral. Estas podem ser, linhas celulares primárias ou celulares contínuas. As linhas celulares geneticamente estáveis são preferidas. As células de mamífero são particularmente adequadas, por exemplo, por exemplo, células humanas, de hamster, de bovino, de macaco ou de cão. Alternativamente, as células de inseto também são adequadas, tais como, por exemplo, as células SF9 ou células Hi-5.

[0029] Diversas linhas celulares de mamífero são conhecidas na técnica e incluem PER.C6, células HEK, células renais embriônicas humanas (células 293), células HeLa, células CHO, células Vero e células MDCK.

[0030] As células de macaco adequadas são, por exemplo, células de macaco verde africano, tais como células renais como na linha celular Vero. As células de cão adequadas são, por exemplo, células renais como na linha celular MDCK.

[0031] As linhas celulares de mamífero adequadas para desenvolver o vírus influenza incluem as células MDCK, células Vero ou células PER.C6. Estas linhas celulares estão amplamente disponíveis, por exemplo, a partir da coleção de Cultura Celular Tipo Americano (ATCC).

[0032] De acordo com uma modalidade específica, o método da invenção usa as células MDCK. A linha celular MDCK original está disponível a partir da ATCC como CCL-34, mas os derivados desta linha celular também podem ser usados, tais como as células MDCK adaptadas para desenvolver na suspensão (WO 1997/37000).

[0033] Alternativamente, as linhas celulares para o uso na invenção podem ser derivadas de fontes aviárias, tais como galinha, pato, ganso, codorniz ou faisão. As linhas celulares aviárias podem ser derivadas de uma variedade de estágios de desenvolvimento incluindo embriônico, pintinho e adulto. Em particular, as linhas celulares podem ser derivadas das células embriônicas, ais como os fibroblastos embriônicos, células germinativas ou órgãos individuais, incluindo tecidos neuronal, cerebral, de retina, renal, hepático, cardíaco, muscular ou extraembriônico e membranas que protegem o embrião. Os fibroblastos de embrião de galinha (CEF) podem ser usados. Os exemplos de linhas celulares aviárias incluem células tronco embriônicas aviárias (WO01/85938) e células retinais de pato (WO05/042728). Em particular, a linha celular EB66® derivada de células tronco embriônica de pato é considerada na presente invenção (WO08/129058). Outras células tronco embriônicas aviárias incluem as linhas celulares EBx® derivadas de células tronco embriônica de frango, EB45, EB14 e EB14-074 (WO2006/108846). Esta linha celular EBx® apresenta a vantagem de ser uma linha celular estável cujo estabelecimento foi produzido naturalmente e não requer qualquer modificação genética, química ou viral. Estas células aviárias são particularmente adequadas para desenvolver vírus influenza.

[0034] De acordo com a modalidade particular, o método da invenção usa células EB66®.

[0035] As condições de cultura celular (temperatura, densidade celular, valor de pH, etc...) são variáveis em uma faixa muito ampla devido à adequabilidade das células utilizadas e podem ser adaptadas aos requerimentos de detalhes de condição de desenvolvimento de vírus particular. Está dentro das capacidades da pessoa versada na técnica determinar as condições cultivadas apropriadas, como a cultura celular é extensivamente documentada na técnica (ver, por exemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editores (1973), and R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, quarta edição (Wiley- Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9).

[0036] Em uma modalidade específica, as células usadas no método descrito na presente invenção são cultivadas nos meios isentos de soro e/ou isentos de proteína. Um “meio isento de soro” (SFM) significa um meio de cultura celular pronto para o uso que não requer a adição de soro permitindo a sobrevivência da célula e o desenvolvimento de célula. Necessariamente, este meio não é quimicamente definido e pode conter hidrolisados de várias origens, a partir da planta, por exemplo. Tal meio isento de soro apresenta a vantagem que a contaminação com vírus adventícios, micoplasma ou agentes infecciosos desconhecidos podem ser descartados. “Isento de proteína” é entendido significar culturas em que a multiplicação das células ocorre com a exclusão de proteínas, fatores de desenvolvimento, outros aditivos de proteína e proteínas que não de soro. Opcionalmente tripsina ou outras proteases que podem ser necessárias para o desenvolvimento podem ser adicionadas durante a infecção viral. As células que se desenvolvem em tal cultura contêm naturalmente a proteína por si só.

[0037] Os meios isentos de soro são comercialmente disponíveis a partir de fontes numerosas, por exemplo, VP SFM (Invitrogen Ref 11681020), Opti-Pro (Invitrogen, Ref 12309-019) ou EX-CELL (JHR Bioscience).

[0038] Antes da infecção com os vírus, as células são cultivadas em torno de 37°C, mais adequadamente em 36,5°C, em um pH que varia de 6,7 a 7,8, adequadamente em torno de 6,8 a 7,5 e mais adequadamente em torno de 7,2. Quando as células são células de inseto, a temperatura antes da infecção com o vírus tipicamente varia de 25°C a 29°C, adequadamente é de 27°C.

[0039] De acordo com o método para produzir um vírus da presente invenção, a produção de vírus com base de cultura celular, em geral, incluem as etapas de a) fornecer uma população de células cultivadas em um meio de cultura; b) inocular as ditas células com os vírus de interesse a serem produzidos, a fim de iniciar o processo de infecção das células com o vírus e incubar ou cultivar as células inoculadas por um período de tempo desejado a fim de permitir a replicação e a propagação viral e c) coletar o vírus produzido. A entrada de energia volumétrica alta de acordo com a presente invenção é adequadamente aplicada pelo menos durante a etapa b) e mais adequadamente durante as etapas a) e b). Consequentemente, em uma modalidade, no método para produzir um vírus de acordo com a presente invenção, uma entrada de energia volumétrica de pelo menos 15 W/m3, pelo menos 30 W/m3, pelo menos 60 W/m3, pelo menos 100 W/m3 ou pelo menos 120 W/m3 é aplicado às células cultivadas durante as etapas a) e b).

[0040] Os termos “inocular/inoculação” e “células inoculadas” devem ser entendidos no sentido da presente invenção como o tempo da adição do vírus de interesse para as células e às células que foram adicionadas com o vírus de interesse, respectivamente. Os termos “pós-inoculação” devem ser entendidos como a duração do tempo após o qual o vírus foi adicionado às células. No resto da especificação, o tempo “pós-inoculação” é indicado em minutos, horas ou dias, tal como, por exemplo, “2h pós-inoculação”, ou “dia 1 (D1) pós-inoculação”. O dia durante o qual as células são inoculadas com o vírus deve ser considerado como o dia 0 (D0). As três etapas sucessivas de inoculação viral, replicação viral e propagação viral devem ser entendidas como sendo parte do processo mais amplo da infecção viral. A entrada de energia volumétrica alta como definido na presente invenção pode ser aplicada à cultura celular durante qualquer uma das etapas acima. A entrada de energia volumétrica alta no sentido da presente invenção pode ser adequadamente aplicada às células enquanto estas são desenvolvidas e cultivadas antes de serem infectadas com o vírus de interesse. A entrada de energia volumétrica alta no sentido da presente invenção também pode ser adequadamente aplicada às células após o que estas foram inoculadas com o vírus e/ou enquanto estas são deixadas incubadas a fim de permitir que o vírus replique e propague. A energia volumétrica alta também pode ser adequadamente aplicada às células enquanto estas são desenvolvidas e cultivadas antes destas serem infectadas, após o que estas foram inoculadas com o vírus e enquanto estas são deixadas incubadas a fim de permitir que o vírus replique e propague. Em uma modalidade, a entrada de energia volumétrica alta é aplicada às células usadas no método de acordo com a presente invenção após estas serem inoculadas com o vírus de interesse e até o vírus produzido ser coletado. Em uma modalidade adicional, a entrada de energia volumétrica alta é aplicada às células, enquanto são desenvolvidas e cultivadas sendo infectadas com o vírus de interesse, bem como após estas serem inoculadas com o dito vírus e até o vírus produzido ser coletado.

[0041] A fim de produzir grandes quantidades de vírus, pode ser vantajoso inocular as células com o vírus de interesse uma vez que as células atingirem uma densidade alta. Usualmente, a inoculação é realizada quando a densidade celular está pelo menos em torno de 5 x 106 células/ml, adequadamente 6 x 106 células/ml, mais adequadamente 7 x 106 células/ml, mais adequadamente 8 x 106 células/ml, mais adequadamente 9 x 106 células/ml ou ainda mais alto, tal como 10 x 106 células/ml, 11 x 106 células/ml, 12 x 106 células/ml ou 13 x 106 células/ml ou ainda mais alto, tal como 20 x 106 células/ml, 25 x 106 células/ml, ou 30 x 106 células/ml. Em uma modalidade do método de acordo com a invenção, a densidade celular atingida antes da infecção viral acontecer é de pelo menos 8 x 106 células/ml, 9 x 106 células/ml, 10 x 106 células/ml, 11 x 106 células/ml, 12 x 106 células/ml ou 13 x 106 células/ml. Em uma outra modalidade, a densidade celular atingida antes da infecção viral acontecer é de pelo menos 20 x 106 células/ml, 25 x 106 células/ml ou 30 x 106 células/ml. Tais níveis de densidade alta podem ser vantajosamente atingidos usando-se um sistema de perfusão para a cultura celular. A densidade celular ideal para obter a produção viral mais alta pode variar de acordo com o tipo celular usado para a propagação viral. A técnica padrão de detecção de proteína, tal como uma análise Western-blot ou ensaio de SRD para vírus influenza ou CPE como descrito acima, também pode ser usado para determinar a faixa de densidade celular ideal requerida para obter um rendimento viral otimizado.

[0042] A fim de produzir grandes quantidades de vírus, também pode ser vantajoso implementar uma fase de adsorção viral. Por “fase de adsorção”, é entendido que as células são inoculadas com o vírus em densidade alta, a fim de favorecer a absorção do vírus para as membranas celulares, por um período curto de tempo, antes da densidade celular ser diminuída pelo resto do período de infecção até o vírus ser coletado. Por exemplo, a inoculação das células com o vírus é realizada quando a densidade celular é de pelo menos 8 x 106 células/ml, adequadamente pelo menos 9 x 106 células/ml, adequadamente pelo menos 10 x 106 células/ml, adequadamente pelo menos 11 x 106 células/ml, adequadamente pelo menos 12 x 106 células/ml, mais adequadamente pelo menos 13 x 106 células/m ou ainda mais alto, tal como 20 x 106 células/ml, 25 x 106 células/ml ou 30 x 106 células/ml. Adequadamente 30 min, mais adequadamente 45 min, mais adequadamente 1h, 1h30 ou 2h pós-inoculação com o vírus, as células inoculadas são diluídas por um fator que varia de 2 a 5, adequadamente 3, para o resto do processo de infecção, isto é, para a incubação adicional antes do vírus produzido ser coletado. Alternativamente, no final da fase de adsorção, as células inoculadas são diluídas a fim de obter uma densidade celular final que varia de 3 a 5 x 106 células/ml, adequadamente 4 x 106 células/ml, para o resto do processo de infecção, isto é, para a incubação adicional antes do vírus produzido ser coletado.

[0043] Em uma modalidade alternativa, quando a densidade celular é de pelo menos 8 x 106 células/ml, pelo menos 9 x 106 células/ml, pelo menos 10 x 106 células/ml, pelo menos 11 x 106 células/ml, pelo menos 12 x 106 células/ml, pelo menos 13 x 106 células/ml, pelo menos 20 x 106 células/ml, pelo menos 25 x 106 células/ml ou pelo menos 30 x 106 células/ml, as células são inoculadas com o vírus e imediatamente após a inoculação, as células inoculadas são diluídas, por um fator que varia de 2 a 5, adequadamente 3 ou a fim de obter uma densidade celular final que varia de 3 a 5 x 106 células/ml, adequadamente 4 x 106 células/ml, para o resto do processo de infecção, isto é, para a incubação adicional antes do vírus produzido ser coletado.

[0044] Quando uma fase de adsorção é implementada, a entrada de energia volumétrica pode ser adequadamente mantida em um nível baixo, tal como, por exemplo, em um valor que varia de 2 a 10 W/m3, de 4 a 8 W/m3, adequadamente em 7 W/m3, durante a dita fase, isto é, após as células serem inoculadas com o vírus de interesse e antes das células inoculadas serem diluídas. Consequentemente, em uma modalidade de uma invenção, o método para produzir um vírus na cultura celular compreende pelo menos as etapas de a) fornecer uma população de células cultivada em um meio de cultura, b) infectar a população de células com o vírus por i. inoculação da população com o vírus quando a densidade celular é de pelo menos 8 x 106 células/ml, pelo menos 9 x 106 células/ml, pelo menos 10 x 106 células/ml, pelo menos 11 x 106 células/ml, pelo menos 12 x 106 células/ml ou pelo menos 13 x 106 células/ml por 30 min, 45 min, 1h, 1h30 ou 2h e então diluindo-se as células inoculadas por um fator que varia de 2 a 5 ou um fator 3 ou, alternativamente, de modo que a densidade de célula final obteve faixas de 3 x 106 células/ml a 5 x 106 células/ml, adequadamente 4 x 106 células/ml e ii. Incubar a população inoculada diluída a fim de permitir que o vírus replique e propague, a entrada de energia volumétrica aplicada à cultura celular sendo de pelo menos 15 W/m3, pelo menos 30 W/m3, pelo menos 60 W/m3, pelo menos 100 W/m3 ou pelo menos 120 W/m3, antes das células serem inoculadas com o vírus e então reduzidas a um valor que varia de 2 a 10 W/m3, 4 a 8 W/m3 ou 7 W/m3, após as células serem inoculadas e antes das células inoculadas serem diluídas e aumentadas a pelo menos 15 W/m3, pelo menos 30 W/m3, pelo menos 60 W/m3, pelo menos 100 W/m3 ou pelo menos 120 W/m3 após as células inoculadas serem diluídas e até o vírus produzido ser coletado. Alternativamente, a entrada de energia volumétrica pode ser mantida em um valor constante através da fase de adsorção. Consequentemente, em uma modalidade adicional, a entrada de energia volumétrica aplicada à cultura celular de acordo com a presente invenção é mantida em pelo menos 15 W/m3, pelo menos 30 W/m3, pelo menos 60 W/m3, pelo menos 100 W/m3 ou pelo menos 120 W/m3, através das etapas sucessivas de fornecer uma população de células cultivadas em um meio de cultura celular, inocular a dita população com o vírus de interesse por 30 min, 45 min, 1h, 1h30 ou 2h, diluir as células inoculadas de acordo com as condições acima e incubar a população inoculada diluída.

[0045] A inoculação pode ser realizada em um MOI (Multiplicidade de Infecção) de cerca de 10-1 a 10-7, adequadamente cerca de 10-2 a 10-6 e mais adequadamente, cerca de 10-5.

[0046] As condições de temperatura e pH para a infecção viral pode variar. A temperatura pode variar de 32°C a 39°C dependendo do tipo de vírus. Para a produção de vírus influenza, a infecção da cultura celular pode variar dependendo da cepa que é produzida. A infecção por vírus Influenza é adequadamente realizada em uma temperatura que varia de 32°C a 35°C, adequadamente a 33°C. Em uma modalidade, a infecção viral ocorre a 33°C. Em uma modalidade alternativa, a infecção viral acontece a 35°C. As proteases, tipicamente tripsina, podem ser adicionadas à cultura celular dependendo da cepa viral, para permitir a replicação viral. A protease pode ser adicionada em qualquer estágio adequado durante a cultura. A tripsina é preferivelmente de origem não animal, isto quer dizer que a protease não é purificada a partir de uma fonte animal. Esta é, adequadamente, produzida de maneira recombinante em um micro-organismo, tal como bacteriano, levedura ou planta. Os exemplos adequados de tripsina recombinante são Trypzean, uma tripsina recombinante produzida no milho (Prodigen, 101 Gateway Blvd, Suite 100 College Station, Texas 77845. Código do fabricante: TRY) ou TrpLE (Invitrogen) que é uma enzima semelhante à tripsina expressada no fungo (WO2004/020612). Em uma modalidade, a tripsina é adicionada ao mesmo tempo quando o vírus é inoculado às células, isto é, a tripsina é adicionada no dia 0 (D0). Em uma modalidade adicional, a tripsina ainda é adicionada em pontos de tempo diferentes pós-inoculação, tais como, por exemplo, no dia 1 (D1) e/ou dia 4 (D4) pós-inoculação. Em uma modalidade alternativa, a tripsina ainda é adicionada todo dia pós-inoculação viral até o vírus produzido ser inoculado.

[0047] Uma vez infectadas, as células podem liberar no meio de cultura, partículas virais recentemente formadas, devido à lise espontânea da célula hospedeira, também denominada lise passiva. Portanto, em uma modalidade, a coleta viral produzida por célula pode ser fornecida em qualquer tempo após a inoculação viral pela coleta do meio celular de cultura. Este modo de coleta é particularmente adequado quando é desejado coletar o vírus produzido por célula em pontos de tempo diferentes após a inoculação viral e união de coletas diferentes se necessário.

[0048] Alternativamente, após a infecção viral, o vírus com base em cultura celular pode ser coletado utilizando-se o fator externo para lisar as células hospedeiras, também denominadas lise ativa. Entretanto, contrário ao prévio, um tal modo de coleta requer que a coleta viral derivada de célula seja coletada em um ponto de tempo simples, quando se lisa ativamente as células, terminará imediatamente a cultura celular.

[0049] Os métodos que podem ser usados para a lise celular ativa são conhecidos pela pessoa versada na técnica. Os métodos úteis, sob este aspecto, são, por exemplo, lise por congelamento-descongelamento, corte sólido, hipertônica e/ou hipotônica, corte líquido, extrusão por pressão alta, lise detergente ou qualquer combinação destes.

[0050] De acordo com uma modalidade, a coleta viral com base em cultura celular pode ser fornecida em qualquer período após a inoculação viral pela coleta dos sobrenadantes de cultura, lisando-se as células inoculadas ou ambas.

[0051] Antes da coleta, a infecção celular pode durar de 2 a 10 dias. De acordo com uma modalidade específica, os sobrenadantes de cultura dos dias 3, 4 e 5 pós-inoculação são coletados e unidos pelo processamento a jusante adicional (isolamento de vírus ou purificação de vírus). De acordo com uma modalidade distinta, o sobrenadante de cultura celular é coletado a partir do dia 5 pós-inoculação. O tempo ideal para coletar o vírus produzido por célula é usualmente fundamentado na determinação do pico de infecção. Por exemplo, o CPE (Efeito Citopático) é medido pelo monitoramento das mudanças morfológicas que ocorrem em células hospedeiras após a inoculação viral, incluindo o arredondamento, desorientação, dilatação ou contração, morte, destacamento celular da superfície. A detecção de um antígeno viral específico também pode ser monitorada por técnicas padrão de detecção de proteína, tais como uma análise Western-blot. A coleta pode ser então coletada quando o nível de detecção desejado é atingido. No caso particular de vírus influenza, o teor de HA pode ser monitorado em qualquer período pós-inoculação das células com o vírus, pelo ensaio SRD (Wood, JM, et al. (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247), que é uma técnica familiar para a pessoa versada na técnica. Adicionalmente, o ensaio SRD também pode ser usado para determinar para determinar a faixa de densidade celular ideal requerida para obter um rendimento de vírus otimizado.

[0052] No contexto da presente invenção, a fase de cultura celular será entendida como abrangendo qualquer precedente da etapa de coleta de vírus, enquanto a fase de purificação do vírus será entendida como abrangendo qualquer etapa seguindo a dita etapa de coleta.

[0053] De acordo com a invenção, após produção na cultura celular, o vírus é purificado. Qualquer etapa ou técnica adequada conhecida no campo da purificação de vírus pode ser adequadamente implementada durante o método da invenção após o vírus produzido é coletado. Em uma modalidade, o método da invenção compreende pelo menos uma etapa selecionada da clarificação de coleta viral, ultrafiltração/diafiltração, ultracentrifugação e cromatografia, ou qualquer combinação deste. Dependendo do nível de pureza que é desejado, as etapas acima podem ser combinadas em qualquer maneira.

[0054] Em uma modalidade específica, durante a fase de purificação do vírus, o método da invenção compreende pelo menos uma etapa de clarificação de coleta viral, uma etapa de ultrafiltração/diafiltração, portanto, fornecendo um retido e uma etapa de ultracentrifugação.

[0055] Após coleta do meio de cultura celular contendo o vírus das células infectadas, a coleta viral fornecida é tipicamente clarificada a fim de separar os vírus do material celular, tal como células intactas ou escombros celulares. A clarificação pode ser feita pela etapa de filtração, tipicamente uma etapa de microfiltração, isto é, usando os filtros tendo um tamanho de poro tipicamente entre 0,1 μm e 10 μm. Os filtros adequados podem utilizar os filtros de celulose, filtros de celulose regenerados, fibras de celulose combinadas com auxiliares de filtro inorgânico, filtro de celulose combinado com auxiliares de filtro inorgânico e resinas orgânicas, ou qualquer combinação deste e filtros poliméricos. Embora não requerido, um processo de filtração múltiplo pode ser realizado, semelhante a um processo de dois ou três estágios que consiste, por exemplo, que removem sequencial e progressivamente as impurezas de acordo com o seu tamanho, usando os filtros com tamanho de poro nominal apropriado, em particular, filtros com diminuição do tamanho de poro nominal, permitindo iniciar a remoção os precipitados amplos e escombros celulares. Além disso, as operações de estágio simples utilizam um filtro relativamente firme ou centrifugação também pode ser usado pela clarificação. Mais geralmente, qualquer método de clarificação incluindo, mas não limitado a, filtração de fluxo direto ou filtração sem saída, filtração profunda, filtração de fluxo tangencial ou filtração de fluxo cruzado, ou centrifugação, no qual fornece um filtrado de claridade adequada não suja a membrana e/ou resinas nas etapas subsequentes, será aceitável usar na etapa de clarificação da presente invenção. Em uma modalidade, a etapa de clarificação viral é realizada pela filtração profunda, em particular, usando uma filtração de trem de três estágios composta, por exemplo, dos três filtros profundos diferentes com porosidades nominais de 5 μm - 0,5 μm - 0,2 μm. Em uma modalidade, a coleta viral é clarificada pela microfiltração, opcionalmente precedida por uma etapa de centrifugação como pré-clarificação. Em particular modalidades em que o método para produzir um vírus, tal como vírus influenza, de acordo com a invenção compreende a etapa de clarificação da microfiltração durante a etapa d) de purificação, o rendimento do vírus, tal como rendimento de HA para vírus influenza, obtido após a etapa de clarificação é pelo menos 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90% ou mais.

[0056] De acordo com a presente invenção, durante a fase de purificação do vírus do método da presente invenção, a coleta viral também pode ser submetida a ultrafiltração (algumas vezes referidas como diafiltração quando usadas pela troca de tampão), para concentrar o vírus e/ou troca de tampão. Esta etapa é particularmente vantajosa quando o vírus a ser purificado é diluído, como é o caso, por exemplo, quando se une a coleta viral coletada pela perfusão em uma pós-inoculação de poucos dias. O processo usado para concentrar o vírus e/ou trocar o tampão de acordo com o método da presente invenção pode incluir qualquer processo de filtração onde a concentração de vírus é aumentada forçando-se o diluente a ser passado através do filtro de uma tal maneira que o diluente é removido a partir da suspensão de vírus considerando o vírus é incapaz de passar através do filtro e, portanto, permanecendo na forma concentrada na preparação do vírus.

[0057] Se usar membranas ou filtros que não são neutros, mas positivamente carregados, podem ser úteis para implementar uma etapa adicional de enxaguar a dita membrana ou filtro com um tampão de enxague que compreende os sais para eluir a fração de vírus que podem ser retidos devido as interações iônicas com a membrana ou filtro. Um exemplo do sal adequado que pode ser incluído no tampão de enxague é cloreto de sódio (NaCl), que pode estar presente em uma concentração que varia de 0,1M a 2M, em particular, de 0,5M a 1,5M, adequadamente 1M. Em uma modalidade da invenção, quando clarificação é realizada pela filtração de membrana, se é pré-clarificação ou clarificação, a dita clarificação compreende uma etapa de enxague de membrana com um tampão que compreende NaCl, em particular, NaCl 1M.

[0058] A ultrafiltração pode compreender diafiltração que é uma maneira ideal para remoção e troca de sais, açúcares, solventes não aquosos, remoção do material do peso molecular baixo, da mudança rápida dos ambientes iônicos e/ou pH. Os microssolutos são removidos mais eficientemente pela adição do solvente a solução sendo ultrafiltrado em uma taxa igual a taxa de ultrafiltração. Isto lava as microespécies da solução em um volume constante, isolando o vírus retido. A diafiltração é particularmente vantajosa quando uma etapa a jusante requer que um tampão específico seja usado a fim de criar uma reação muito favorável. Por exemplo, implementação de uma etapa de diafiltração antes da degradação dos ácidos nucleicos da célula hospedeira com uma endonuclease pode permitir a reação de endonuclease em um tampão específico e muito favorável para aquela endonuclease. A concentração e diafiltração também pode ser implementada em qualquer etapa adequada do processo de purificação, quando é desejado remover os compostos indesejados, tal como sacarose, após uma ultracentrifugação de gradiente de sacarose, ou tal como formaldeído, após uma etapa da inativação de vírus com formaldeído. O sistema é composto de três correntes de processo distintas: a solução de alimentação (que compreende o vírus), o permeado e o retido. Dependendo da aplicação, os filtros com tamanhos de poros diferentes podem ser usados. Na presente invenção, o retido contém o vírus e pode ser usado pelas etapas de purificação adicionais, se desejado. A composição de membrana pode ser, mas não é limitada a, celulose regenerada, poliétersulfona, polissulfona, ou derivados destes. As membranas podem ser lâminas planas (também denominadas telas planas) ou fibras ocas.

[0059] Em uma modalidade, a fase de purificação do vírus do método da invenção compreende pelo menos uma etapa de ultrafiltração/diafiltração, adequadamente pelo menos duas etapas de ultrafiltração/diafiltração.

[0060] Dependendo de para qual aplicação o vírus produzido por cultura celular é purificado, também pode ser desejável eliminar da célula hospedeira de coleta viral os contaminantes de ácidos nucleicos da. Em particular, quando o vírus purificado é incluído em uma vacina, ácidos nucleicos da célula hospedeira devem ser degradados e eliminados a partir do vírus purificado. A degradação dos ácidos nucleicos frequentemente ocorre através do uso das nucleases que alvejam RNA e DNA. Um exemplo não limitante de uma nuclease adequada para degradar os ácidos nucleicos da célula hospedeira é BenzonaseTM. BenzonaseTM, ou qualquer outra nuclease adequada, pode ser adicionada em qualquer etapa adequada de um processo de purificação do vírus. Em uma modalidade, o método de acordo com a invenção compreende a etapa de degradação de nuclease, adequadamente um tratamento BenzonaseTM. Por exemplo, a nuclease pode ser adicionada ao retido obtido após ultrafiltração de um meio de cultura celular contendo o vírus clarificado. Alternativamente, a degradação dos ácidos nucleicos da célula hospedeira pode ser atingida através de uma etapa de inativação do vírus com beta-propiolactona.

[0061] Se desejado, o vírus obtido de acordo com a presente invenção ainda pode ser purificado usando as técnicas padrões utilizadas pela purificação de vírus tal como centrifugação de gradiente de densidade, por exemplo, ultracentrifugação de gradiente de sacarose e/ou cromatografia, tal como cromatografia de troca iônica. Em uma modalidade, o método de acordo com a invenção compreende pelo menos uma etapa de centrifugação de gradiente de sacarose. Em uma modalidade adicional, a fase de purificação do método da invenção compreende pelo menos a etapa de clarificação, tal como, por exemplo, a etapa de centrifugação seguida pela etapa de microfiltração, pelo menos uma etapa de ultrafiltração e uma etapa de centrifugação de gradiente de sacarose. Em particular as modalidades em que o método para produzir um vírus, tal como vírus influenza, de acordo com a invenção compreende pelo menos uma etapa de centrifugação de gradiente de sacarose durante a etapa d) de purificação, a capacidade de carga no rotor da centrífuga é pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, ou mais, litros da coleta viral, ou a quantidade “equivalente”, por litro do rotor e o rendimento do vírus, tal como rendimento de HA para vírus influenza, obtido após a dita etapa de centrifugação de gradiente de sacarose é pelo menos 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90% ou mais.

[0062] De acordo com o método da invenção, é possível combinar uma etapa de purificação, tal como ultracentrifugação de gradiente de sacarose, com uma etapa de divisão de vírus. Em particular, um agente de divisão pode ser adicionado ao gradiente de sacarose. Esta modalidade é particularmente adequada, quando esta é desejada para minimizar o número total das etapas do método da invenção, uma vez que permite, dentro de uma operação simples, tanto para purificar quanto dividir o vírus. Visto que, em certas modalidades, quando pelo menos uma ultracentrifugação de gradiente de sacarose é implementada, o gradiente de sacarose adicionalmente compreende um agente de divisão.

[0063] Alternativamente, a etapa de divisão do vírus do método da presente invenção, quando implementada, é realizada em batelada.

[0064] No final da fase de purificação do vírus, a preparação do vírus obtida de acordo com o método da presente invenção pode ser adequadamente submetida a filtração estéril, como é comum nos processos para os materiais de grau farmacêuticos, tal como composições imunogênicas ou vacinas e conhecidas aquela pessoa versada na técnica. Tal filtração estéril pode por exemplo ser adequadamente realizada pela filtração da preparação através de um filtro 0,22 μm. Após preparação estéril, o vírus ou antígenos virais são prontos para o uso clínicos, se desejado.

[0065] As composições imunogênicas, em particular vacinas, podem ser geralmente formuladas em uma forma de subvírion, por exemplo, na forma de um vírus de divisão, onde um envelope de lipídeo foi dissolvido ou rompido, ou na forma de uma ou mais proteínas virais purificadas (vacina de subunidade). Como uma alternativa, as composições imunogênicas podem incluir um vírus total, por exemplo um vírus total atenuado vivo, ou um vírus total inativado.

[0066] Os métodos de divisão de vírus, tal como vírus influenza, são bem conhecidos na técnica (WO02/28422). A divisão de vírus é realizada pelo rompimento ou fragmentação do vírus total infeccioso (tipo selvagem ou atenuado) ou não infeccioso (inativado) com uma concentração de rompimento de um agente de divisão. Os agentes de divisão geralmente incluem agentes capazes de quebrar e dissolver as membranas de lipídeo. Tradicionalmente, a divisão do vírus influenza foi produzida usando-se um tratamento de solvente/detergente, tal como fosfato de tri-n-butila, ou éter dietílico em combinação com TweenTM (conhecido como divisão “Tween- éter”) e este processo ainda é usado em algumas instalações da produção. Outros agentes de divisão agora utilizados incluem detergentes ou enzimas proteolíticas ou sais de bile, por exemplo desoxicolato de sódio. Os detergentes que podem ser usados como agentes de divisão incluem detergentes catiônicos por exemplo brometo de cetil trimetil amônio (CTAB), outros detergentes iônicos, por exemplo sulfato de lauril sódico (SLS), taurodesoxicolato, ou detergentes não iônicos tal como Tween ou Triton X-100, ou combinação de qualquer um de dois ou mais detergentes.

[0067] Em uma modalidade, o agente de divisão é desoxicolato. Em uma modalidade, o agente de divisão é Triton X-100. Em uma modalidade adicional, o método de acordo com a invenção usa uma combinação de Triton X-100 e sulfato de lauril sódico como agentes de divisão.

[0068] O processo de divisão pode ser realizado como uma batelada, processo contínuo ou semicontínuo. Quando implementado em batelada, a divisão do vírus pode requerer uma etapa adicional de purificação, tal como uma etapa de cromatografia. Não é necessário implementar uma etapa de divisão como tal, como é possível para realizar a divisão simultaneamente a uma etapa de purificação. Por exemplo, um detergente pode ser adicionado ao gradiente de sacarose auxiliou na purificação das proteínas virais pela ultracentrifugação, como descrito acima. Em uma modalidade, o método de acordo com a invenção compreende uma etapa de divisão realizada em batelada com um detergente, em particular, Triton X-100, além disso a pelo menos uma etapa de homogeneização.

[0069] Para a segurança das vacinas, pode ser necessário reduzir a infectividade da suspensão de vírus junto com as etapas diferentes do processo de purificação. A infectividade de um vírus é determinada por sua capacidade de replicar em uma linha celular. Portanto, o método de acordo com a presente invenção, opcionalmente, inclui pelo menos uma etapa de inativação de vírus. A inativação pode ser realizada usando, por exemplo, beta-propiolactona (BPL), formaldeído, ou UV, ou qualquer combinação deste, em qualquer etapa adequada do método. Em uma modalidade específica, o método de acordo com a invenção compreende adicionalmente pelo menos uma etapa de tratamento BPL. Em uma modalidade específica, o método de acordo com a invenção compreende adicionalmente pelo menos uma etapa de tratamento BPL e pelo menos uma etapa de tratamento de formaldeído. O formaldeído e BPL podem ser usados sequencialmente, em qualquer ordem, por exemplo, formaldeído é usado após o BPL. Em uma modalidade, o tratamento com formaldeído é seguido por pelo menos uma etapa de homogeneização. Quando usando, em particular, UV como um método de inativação, implementando a homogeneização da preparação de vírus antes da irradiação UV, pode ajudar a melhorar a eficiência da inativação de vírus. Os vírus ou parte dos vírus, que devem estar presentes dentro dos agregados, se os agregados de vírus ou agregados de vírus/célula podem escapar a irradiação por causa da inclusão dentro dos ditos agregados e, deste modo, nenhuma acessibilidade de alguns vírus ou parte do vírus a um agente de inativação. Em uma modalidade, a preparação de vírus obtida de acordo com o método da presente invenção é inativada, por exemplo, pela irradiação UV e a homogeneização é realizada imediatamente antes da dita inativação. As condições da inativação viral podem variar e serão determinadas, em particular, pela avaliação da infectividade viral residual pela medição da Dosagem Infecciosa da Cultura de Tecido (TCID50/ml).

[0070] As composições imunogênicas da presente invenção, incluindo vacinas, podem conter opcionalmente os aditivos comuns para vacinas, em particular substâncias no qual aumentam a resposta imune extraída em um paciente que recebe a composição, isto é, denominadas adjuvantes.

[0071] Em uma modalidade, as composições imunogênicas são consideradas, no qual compreendem um vírus ou antígeno viral da presente invenção misturados com um carreador farmacêutico adequado. Em uma modalidade específica, estes compreendem um adjuvante.

[0072] As composições de adjuvante podem compreender uma emulsão óleo em água que compreendem um óleo metabolizável e um agente de emulsificação. Na ordem para qualquer composição óleo em água a ser adequada pela administração humana, a fase oleosa do sistema de emulsão tem de compreender um óleo metabolizável. O significado do termo óleo metabolizável é bem conhecido na técnica. Metabolizável pode ser definido como ‘sendo capaz de ser transformado pelo metabolismo’ (Dorland’s Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25° edição (1974)). O óleo pode ser qualquer óleo vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou óleo sintético, que não é tóxico ao recipiente e é capaz de ser transformado pelo metabolismo. As nozes, sementes e grãos são fontes comuns de óleos vegetais. Os óleos sintéticos também são partes desta invenção e podem incluir os óleos comercialmente disponíveis tal como NEOBEE® e outros.

[0073] Um óleo metabolizável particularmente adequado é esqualeno. O esqualeno (2,6,10,15,19,23-Hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosa-hexeno) é um óleo insaturado que é observado em quantidades maiores no óleo de fígado de tubarão e nas quantidades inferiores no óleo de oliva, óleo de germe de trigo, óleo de farelo de arroz e levedura e é um óleo particularmente preferido para uso nesta invenção. O esqualeno é um óleo metabolizável em virtude do fato que este é um intermediário na biossíntese do colesterol (Índice Merck, 10° edição, entrada N° 8619). Em uma modalidade adicional da invenção, o óleo metabolizável está presente na composição imunogênica em uma quantidade de 0,5% a 10% (v/v) do volume total da composição.

[0074] A emulsão óleo em água compreende adicionalmente um agente de emulsificação. O agente de emulsificação pode ser adequadamente mono-oleato de polioxietileno sorbitano. Ainda, o dito agente de emulsificação está adequadamente presente na vacina ou composição imunogênica 0,125 a 4% (v/v) do volume da composição total.

[0075] A emulsão óleo em água da presente invenção opcionalmente compreende um tocol. Os tocóis são bem conhecidos na técnica e são descritos no EP0382271. Adequadamente, o que pode ser um tocol é o alfa- tocoferol ou um derivado deste tal como succinato alfa-tocoferol (também conhecido como succinato de vitamina E). O dito tocol é adequadamente presente na composição de adjuvante em uma quantidade 0,25% a 10% (v/v) do volume total da composição imunogênica.

[0076] O método de produção das emulsões óleo em água é bem conhecido aquela pessoa versada na técnica. Comumente, o método compreende a mistura da fase oleosa (opcionalmente compreende um tocol) com um tensoativo tal como uma solução PBS/TWEEN80™, seguido pela homogeneização usando um homogeneizador, deve ser claro a uma pessoa versada na técnica que um método compreende a passagem da mistura duas vezes através da agulha da seringa sendo adequada para homogeneizar os volumes menores do líquido. Igualmente, o processo de emulsificação no microfluidizador (máquina M110S Microfluidics, máximo de 50 passagens, por um período de 2 minutos em entrada de pressão máxima de 0,6 mPa [6 bar] (pressão de saída de cerca de 85 mPa [850 bar])) deve ser adaptado pela pessoa versada na técnica para produzir volumes menores ou maiores da emulsão. A adaptação deve ser atingida pelo experimento de rotina que compreende a medição da emulsão resultante até uma preparação ser atingida com gotículas de óleo do diâmetro requerido.

[0077] Em uma emulsão óleo em água, o óleo e o emulsificador estão em um carreador aquoso. O carreador aquoso pode ser, por exemplo, solução salina tamponada por fosfato.

[0078] Em particular, os sistemas de emulsão óleo em água da presente invenção tem um tamanho de gotícula de óleo pequena na faixa submícron. Adequadamente os tamanhos de gotículas estão na faixa 120 a 750 nm, mais particularmente tamanhos de 120 a 600 nm em diâmetro. Ainda mais particularmente, a emulsão óleo em água contém gotículas de óleo no qual pelo menos 70% em intensidade são menores do que 500 nm em diâmetro, mais particular pelo menos 80% em intensidade são menores do que 300 nm em diâmetro, mais particular pelo menos 90% em intensidade estão na faixa de 120 a 200 nm em diâmetro.

[0079] O tamanho de gotícula de óleo, isto é diâmetro, de acordo com a presente invenção é dado em intensidade. Existem diversas maneiras de determinar o diâmetro do tamanho de gotícula de óleo em intensidade. A intensidade é medida pelo uso de um instrumento de dimensionamento, adequadamente pela dispersão de luz dinâmica tal como o Malvern Zetasizer 4000 ou adequadamente o Malvern Zetasizer 3000HS. Um procedimento detalhado é dado no exemplo II.2. Uma primeira possibilidade é para determinar o diâmetro médio z ZAD pela dispersão de luz dinâmica (Espectroscopia de Correlação PCS-Fóton); este método adicionalmente dá o índice de polidispersidade (PDI) e tanto o ZAD quanto PDI são calculados com o algoritmo acumulativo. Estes valores não requerem o conhecimento do índice de refração da partícula. Uma segunda média é para calcular o diâmetro da gotícula do óleo para determinar a distribuição do tamanho de partícula total pelo outro algoritmo, o Contin, ou NNLS, ou o "Malvern" automático (o algoritmo default fornecido pelo instrumento de dimensionamento). A maior parte do tempo, como o índice de refração da partícula da composição complexa é desconhecida, apenas a distribuição da intensidade é levada em consideração e se necessário a média da intensidade origina-se a partir desta distribuição.

[0080] As composições de adjuvante ainda podem compreender um agonista (TLR) 4 receptor semelhante a Toll. Para “agonista TLR4” é significado que um componente é capaz de causar uma resposta de sinalização através de um caminho de sinalização TLR4, como um ligante direto ou indireto através da geração do ligante endógeno ou exógeno (Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). O TLR 4 pode ser um derivado de lipídeo A, particularmente lipídeo de monofosforila A ou mais particularmente 3 lipídeos de monofosforila desacilados A (3 D - MPL).

[0081] 3D-MPL é disponível sob o nome comercial MPL® por GlaxoSmithKline Biologicals North America e principalmente promove as respostas da célula CD4+ T com um fenótipo IFN-g (Th1). Pode ser produzido de acordo com os métodos descrito em GB 2 220 211 A. Quimicamente é uma mistura dos 3-lipídeos de monofosforila desacilados A com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Em particular, nas composições adjuvantes da presente invenção a partícula menor 3 D- MPL é usada. A partícula menor 3 D -MPL tem um tamanho de partícula tal que este pode ser filtrado estéril através de um filtro 0,22 μ m. Tais preparações são descritas no Pedido de Patente Internacional N° WO 94/21292. Os derivados sintéticos do lipídeo A são conhecidos e pensados serem agonistas TLR 4 incluindo, mas não limitado a: OM174 (2-desóxi-6-o-[2-desóxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra- decanoilamino]-4-o-fosfono-β-D-glicopiranosil]-2-[(R)-3- hidroxitetradecanoilamino]-α-D-glicopiranosildi-hidrogenofosfato), (WO 95/14026) OM 294 DP (3S, 9 R) -3--[(R)- dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3- hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol,1,10-bis(di-hidrogenofosfato) (WO99 /64301 e WO 00/0462) OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R) -3-[(R) - dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol,1-di-hidrogenofosfato 10-(6- amino-hexanoato) (WO 01/46127)

[0082] Outros ligantes TLR4 que podem ser usados são fosfatos de alquil Glicosaminida (AGPs) tal como aqueles descritos no WO9850399 ou US6303347 (processos para preparação de AGPs também são descritos), ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGPs como descritos em US6764840. Alguns AGPs são agonistas TLR4 e alguns são antagonistas TLR4. Ambos são pensados serem úteis como adjuvantes. Além disso, ainda os agonistas TLR-4 adequados são descritos em US2003/0153532 e US2205/0164988.

[0083] A invenção é particularmente adequada para preparação das composições imunogênicas de vírus influenza, incluindo vacinas. Várias formas de vírus influenza são correntemente disponíveis. Estes são geralmente baseados nos vírus vivos ou inativados. As vacinas inativadas podem ser baseadas nos vírions totais, vírions de divisão ou antígenos de superfície purificados (incluindo HA). Os antígenos de influenza também podem ser apresentados na forma de virossomos (partículas lipossomais semelhantes virais isentas do ácido nucleico).

[0084] Os métodos de inativação de vírus e métodos de divisão foram descritos acima e são aplicáveis a vírus influenza.

[0085] As cepas de vírus influenza para uso nas vacinas mudam de estação para estação. No período interpandêmico atual, as vacinas tipicamente incluem duas cepas de influenza A e uma cepa de influenza B. As vacinas trivalentes são típicas, mas maior valência, tal como quadrivalência, também é considerada na presente invenção. A invenção também pode usar HA a partir das cepas pandêmicas (isto é, cepas no qual o recipiente de vacina e a população humana geral são imunologicamente puras) e vacinas contra influenza para cepas pandêmicas podem ser monovalentes ou podem ser baseadas em uma vacina trivalente normal suplementada por uma cepa pandêmica.

[0086] As composições da invenção podem incluir os antígenos de um ou mais cepas de vírus influenza, incluindo vírus influenza A e/ou vírus influenza B. Em particular, uma vacina trivalente incluindo antígenos a partir das cepas do vírus influenza A e uma cepa de vírus influenza B é considerada pela presente invenção. Alternativamente uma vacina quadrivalente incluindo os antígenos de duas cepas de vírus influenza A e duas cepas de vírus influenza B também está dentro do escopo da presente invenção.

[0087] As composições da invenção não são restritas as composições monovalentes, isto é, incluindo apenas um tipo de cepa, isto é apenas cepas sazonais ou apenas cepas pandêmicas. A invenção também abrange as composições multivalentes que compreendem uma combinação das cepas sazonais e/ou das cepas pandêmicas. Em particular, uma composição quadrivalente, que pode ser adjuvantada, que compreende três cepas sazonais e uma cepa pandêmica diverge dentro do escopo da invenção. Outras composições divergem dentro do escopo da invenção são uma composição trivalente que compreende duas cepas A e uma cepa B, tal como cepas H1N1, H3N2 e B e uma composição quadrivalente que compreende duas cepas A e duas cepas B de uma linhagem diferente, tal como H1N1, H3N2, B/Victoria e B/Yamagata.

[0088] HA é o imunógeno principal nas vacinas contra influenza inativadas correntes e as dosagens de vacina são padronizadas por referência aos níveis de HA, tipicamente medidos por SRD. As vacinas existentes tipicamente contêm cerca de 15 μg de HA por cepa, embora as dosagens menores podem ser usadas, por exemplo para crianças, ou nas situações pandêmicas, ou quando usando um adjuvante. As dosagens fracionais tal como uma metade (isto é 7,5 μg de HA por cepa) ou um quarto foram usadas, como tem dosagens maiores, em particular, 3x ou 9x dosagens. Deste modo as composições imunogênicas da presente invenção podem incluir entre 0,1 e 150 μg de HA por cepa de influenza, particularmente, entre 0,1 e 50 μg, por exemplo 0,1-20 μg, 0,1-15 μg, 0,1-10 μg, 0,1-7,5 μg, 0,5-5 μg, etc. As dosagens particulares incluem cerca de 15, cerca de 10, cerca de 7,5, cerca de 5 μg por cepa, cerca de 3,8 μg por cepa e cerca de 1,9 μg por cepa.

[0089] Uma vez que um vírus influenza foi purificado por uma cepa particular, pode ser combinado com vírus a partir de outras cepas para fabricar uma vacina trivalente, por exemplo, como descrito acima. É mais adequado para tratar cada cepa separadamente e para misturar os volumes monovalentes para dar uma mistura multivalente final, antes do que para misturar os vírus e degradar e purificar DNA a partir da mistura multivalente.

[0090] A invenção ainda será descrita por referência aos seguintes exemplos não limitantes. Exemplo I: Produção do Vírus influenza usando uma energia volumétrica alta - As células EB66® foram semeadas em um biorreator 200 L disponível (Cultibag STR de Sartorius AG que inclui um impulsor de lâmina inclinada, ou uma turbina Rushton, onde apropriado) em uma densidade de cerca de 0,4 x 106 células/ml em um volume total de 65 L e desenvolvido na suspensão em modo de batelada a 36,5°C em uma velocidade de agitação de 105 rpm correspondente a aplicação de uma entrada de energia volumétrica de pelo menos 30 W/m3 (N° 039, N° 048, N° 052, N° 058, N° 044, N° 046 e N° 043), ou 135 rpm correspondente a aplicação de uma entrada de energia volumétrica de pelo menos 120 W/m3 (N° 053 e No. 057), ou 65 rpm correspondente a aplicação de uma entrada de energia volumétrica de pelo menos 7 W/m3 (N° 025, N° 026, N° 027 e N° 031). A entrada de energia volumétrica de pelo menos 30 W/m3 foi atingida usando o biorreator disponível incluindo um impulsor de lâmina inclinada, enquanto a entrada de energia de pelo menos 120 W/m3 foi atingida usando o biorreator disponível incluindo uma turbina Rushton. - Após 3 dias de desenvolvimento, a densidade celular atingiu pelo menos 9 x 106 células/ml. Neste ponto no tempo, as células foram inoculadas com uma solução que compreende Vírus influenza H5N1 em uma multiplicidade da infecção (MOI) de 1 x 10-5 e tripsina (30 mrPu/ml TrpLE de Invitrogen), que é considerada Dia 0 (D0) e a temperatura foi mudada a 35°C. 1h30 pós-inoculação, a suspensão da célula inoculada foi submetida a uma diluição por um fator 3 pela adição do meio fresco até um volume total de 200 L. Durante um período de tempo de 1h30 acima, a entrada de energia volumétrica foi reduzida a 7 W/m3 (N° 039, N° 048, N° 052, N° 058, N° 044, N° 046, N° 043, N° 053 e N° 057) ou mantida a 7 W/m3 (N° 025, N° 026, N° 027 e N° 031). - Imediatamente após as células inoculadas serem diluídas, a entrada de energia volumétrica foi aumentada novamente a pelo menos 30 W/m3 (N° 039, N° 048, N° 052, N° 058, N° 044, N° 046 e N° 043), ou pelo menos 120 W/m3 (N° 053 e N° 057) e mantida em tais níveis, ou mantida a 7 W/m3 (N° 025, N° 026, N° 027 e N° 031), até o meio de cultura contendo o vírus foi coletado, 5 dias pós-inoculação viral, produzindo deste modo uma coleta viral. A tripsina (10 mrPu/ml TrpLE de Invitrogen) ainda foi adicionada no Dia 1 (D1) e Dia 4 (D4) pós-inoculação viral. - A coleta viral foi então purificada como descrito abaixo. Exemplo II: Efeito de uma energia volumétrica alta na microfiltração - Uma vez coletada, a coleta viral foi pré-clarificada pela centrifugação contínua a 10500 rpm a 90 L/h, produzindo deste modo uma coleta viral pré-clarificada. - A coleta pré-clarificada foi então submetida a uma etapa de microfiltração usando uma membrana de lâmina plana de 0,45 μm (Sartorius AG), em TMP constante (Pressão Trans Membrana) e taxa de fluxo de alimentação (3 psi e 600 L/m2/h, respectivamente), produzindo deste modo a coleta viral clarificada. - O rendimento do vírus influenza foi avaliado na etapa de microfiltração pela medição do teor de HA antes e após a dita etapa de acordo com um ensaio SRD, como descrito abaixo no Exemplo IV. Os resultados são apresentados na tabela 1 na forma das porcentagens a serem comparadas ao valor de controle 100% representando a quantidade de HA total presente no material de partida, isto é presente na coleta viral pré-clarificada antes da microfiltração.Tabela 1 - Rendimento de HA após microfiltração - energia volumétrica baixa versus energia volumétrica alta

Resultados - Conclusões

[0091] Enquanto o aumento de entrada de energia volumétrica durante a fase de cultura celular (30 W/m3 versus 7 W/m3) não teve impacto no rendimento de HA presente na coleta viral coletada (ver Tabela 1, quarta coluna “produção viral em D5 pi”), um impacto positivo foi observado no rendimento de HA atingido na etapa de microfiltração subsequente. Não é apenas o rendimento de HA obtido após a microfiltração mais alta quando a entrada de energia volumétrica é mais alta (ver as linhas médias respectivas), mas os valores obtidos a partir de um experimento a outro também são mais consistentes e menos variáveis (ver as linhas de desvio padrão respectivas - 6 versus 25 quando a entrada de energia volumétrica é 30 ou 7, respectivamente). Estes resultados indicam que uma energia volumétrica mais alta durante os resultados da fase celular de cultura a montante nos rendimentos de HA melhorados e mais consistentes durante a fase a jusante de purificação do vírus. Exemplo III: Efeito da energia volumétrica alta na ultracentrifugação de gradiente de sacarose - As células foram desenvolvidas e infectadas com Vírus influenza H5N1 e o vírus foi coletado como descrito no Exemplo I acima. - A coleta viral foi pré-clarificada e a coleta pré-clarificada foi submetida a microfiltração como descrito no Exemplo II. - A coleta viral clarificada foi então concentrada 10 vezes pela ultrafiltração com uma membrana de fibra oca de 750 kD feita de polissulfona (GE Healthcare) e diafiltrada contra 5 volumes de PBS contendo 125 mM de citrato pH 7,4 em TMP constante (Pressão Trans Membrana) e taxa de fluxo de alimentação (3 psi e 35 L/m2/h, respectivamente). - O retido por ultrafiltração foi então submetido a uma etapa de ultracentrifugação de gradiente de sacarose, em que vírus e contaminantes migram no gradiente até atingir sua densidade respectiva. O vírus influenza tem uma densidade de aproximadamente 1,19 g/cm3 e deste modo sedimentará no gradiente onde a concentração de sacarose iguala a densidade do vírus (aproximadamente 43% de sacarose). Após formação de um gradiente linear contínuo de 0 a 55% de sacarose no rotor da centrífuga, o retido por ultrafiltração foi carregado no dito rotor em uma capacidade de carregamento do equivalente do retido correspondente a coleta de 30 L por L do rotor (N° 039, N° 043, N° 032, N° 033, N° 028 e N° 029), ou coleta de 5060 L por L do rotor (N° 044A, N° 044B, N° 046, N° 048, N° 025, N° 026, N° 027, N° 031), como indicado nas tabelas 2 e 3. Quando a amostra total é carregada, um tempo de ligação de 1 h permite que o vírus atinja sua densidade e o concentrado dentro do gradiente de sacarose antes da centrífuga ser interrompida e o gradiente de sacarose não ser carregado e fracionado. As partículas virais foram concentradas dentro de poucas frações. As frações do produto estão em PBS pH 7,4 contendo 125 mM de citrato e sacarose. O vírion total purificado foi unido a partir da porcentagem de sacarose que varia aproximadamente de 30 a 50%. Esta faixa foi determinada na base dos perfis de SDS-PAGE e da análise Western Blot usando anticorpos anti-HA. - O rendimento do vírus influenza foi avaliado na etapa de ultracentrifugação de gradiente de sacarose pela medição do teor de HA antes e após a dita etapa de acordo com um ensaio SRD, como descrito abaixo no Exemplo IV. Os resultados são apresentados na Tabela 2 e Tabela 3 na forma de porcentagens a serem comparadas ao valor de controle 100% representando a quantidade de HA total presente no material de partida, isto é presente no retido por ultrafiltração antes da ultracentrifugação de gradiente de sacarose. Tabela 2 - Rendimento de HA após ultracentrifugação de gradiente de sacarose em uma capacidade de carga de coleta de 30 L por L do rotor

[0092] A capacidade de carga indicada (30) corresponde ao equivalente do retido por ultrafiltração dos litros da coleta viral coletados durante a etapa c) do método da invenção carregado por litro do rotor da centrífuga.

Resultados - Conclusões

[0093] Em uma capacidade de carregamento de coleta de 30 L por L do rotor, o rendimento médio de HA atingido após ultracentrifugação de gradiente de sacarose está dentro da mesma faixa aceitável, isto é, 72-82%, se a entrada de energia volumétrica é 7 V/m3 ou 30 V/m3.Tabela 3 - Rendimento de HA após ultracentrifugação de gradiente de sacarose em uma capacidade de carga da coleta 50-60 L por L do rotor

[0094] A capacidade de carga indicada (50 ou 60) corresponde ao equivalente do retido por ultrafiltração dos litros da coleta viral coletados durante a etapa c) do método da invenção carregado por litro do rotor da centrífuga.

Resultados - Conclusões

[0095] Em uma capacidade de carregamento mais alto de coleta de 50-60 L por L do rotor, quando a entrada de energia volumétrica é 7 V/m3, isto é, em uma entrada de energia volumétrica baixa, o rendimento médio de HA atingido após a ultracentrifugação de gradiente de sacarose caiu significantemente (ver Tabela 3, 31%), como oposto ao rendimento de HA atingido em uma capacidade de carregamento de coleta 30 L por L do rotor com uma entrada de energia volumétrica baixa similar (ver Tabela 2, 82%). Do contrário, quando a entrada de energia volumétrica foi aumentada a 30 V/m3, o rendimento médio de HA atingido após ultracentrifugação de gradiente de sacarose na capacidade de carregamento mais alta de coleta de 50-60 L por L do rotor foi mantida na mesma faixa aceitável (ver Tabela 3, 71%). Este indica que o aumento da entrada de energia volumétrica durante a fase de cultura celular (30 W/m3 versus 7 W/m3) permite carregar duas vezes mais o volume de coleta, ou coletar o equivalente do volume, no rotor usado pela etapa de ultracentrifugação de gradiente de sacarose enquanto mantém a mesma faixa aceitável do rendimento de HA. A capacidade de carregamento em uma centrífuga diretamente impacta o número das centrífugas requeridas para operar em ampla escala. Quanto maior a capacidade de carga é, menor o número de centrífugas necessárias.

Exemplo IV: Método SRD usado para medir o teor de HA

[0096] As placas de vidro (12,4 - 10 cm) foram revestidas com um gel de agarose contendo uma concentração do soro anti-influenza HA que é recomendado por NIBSC. Após o gel ser apresentado, 72 reservatórios de amostra (3 mm de diâmetro) foram perfurados em agarose. 10 μl das diluições apropriadas da referência e a amostra foram carregadas nos reservatórios. As placas foram incubadas por 24 horas em temperatura ambiente (20 a 25°C) em uma câmara úmida. Depois disso, as placas foram encharcadas durante a noite com a solução de NaCl e lavadas brevemente em água destilada. O gel foi então comprimido e secado. Quando completamente seco, as placas foram pigmentadas na solução de Coomassie Brillant Blue por 10 minutos e despigmentadas duas vezes em uma mistura de metanol e ácido acético até as zonas tingidas claramente definidas tornarem-se visíveis. Após secagem das placas, o diâmetro das zonas tingidas dos reservatórios de antígeno circundantes foi medido em duas direções nos ângulos retos. Alternativamente o equipamento para medir a superfície pode ser usado. As curvas de dose-resposta das diluições de antígeno contra a superfície foram construídas e os resultados foram calculados de acordo com os métodos de ensaio de razão de inclinação padrão (Finney, D.J. (1952). Statistical Methods in Biological Assay. London: Griffin, Quoted in: Wood, JM, et al (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247).

Claims (29)

1. Método para produzir um vírus em uma cultura celular, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos as etapas de: a) fornecer uma população de células em um meio de cultura celular, b) infectar a população de células por: i. inoculação da população com o vírus e ii. incubação da população inoculada a fim de permitir que o vírus replique e propague, c) coletar o vírus produzido, desse modo, fornecendo uma coleta viral e d) purificar o vírus, em que uma entrada de energia volumétrica de pelo menos 15 W/m3, pelo menos 30 W/m3, pelo menos 60 W/m3, pelo menos 100 W/m3 ou pelo menos 120 W/m3 é aplicado à cultura celular pelo menos durante a etapa b).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a entrada de energia volumétrica é aplicada à cultura celular durante a etapa a) e etapa b).

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a densidade celular das células atinge pelo menos 8 x 106 células/ml, pelo menos 9 x 106 células/ml, pelo menos 10 x 106 células/ml, pelo menos 11 x 106 células/ml, pelo menos 12 x 106 células/ml ou pelo menos 13 x 106 células/ml antes da população de células ser inoculada com o vírus.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que durante a etapa b) as células inoculadas da etapa i. são diluídas por um fator que varia de 2 a 5 imediatamente após o vírus ser inoculado e deixado para a incubação adicional.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que durante a etapa b) as células inoculadas da etapa i. são diluídas a fim de obter uma densidade celular que varia de 3 x 106 células/ml a 5 x 106 células/ml imediatamente após o vírus ser inoculado e deixado para a incubação adicional.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que durante a etapa b) o vírus é deixado incubado por 30 min, 45 min, 1h, 1h30, ou 2h após a inoculação, antes das células inoculadas serem diluídas por um fator que varia de 2 a 5 e deixado para a incubação adicional.

7. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que durante a etapa b) o vírus é deixado incubado por 30 min, 45 min, 1h, 1h30, ou 2h após a inoculação, antes das células inoculadas serem diluídas a fim de obter uma densidade celular que varia de 3 x 106 células/ml a 5 x 106 células/ml e deixado para a incubação adicional.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que durante a etapa b) a entrada de energia volumétrica é reduzida de 2 a 10 W/m3, 4 a 8 W/m3 ou 7 W/m3 e mantido em tal nível após a inoculação das células e até que as células inoculadas sejam diluídas.

9. Método de acordo com a reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a tripsina é adicionada às células durante a etapa b).

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a tripsina é adicionada ao mesmo tempo como a inoculação com o vírus.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a tripsina é ainda adicionada no dia D1 e/ou dia D4 pós- inoculação.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a tripsina é ainda adicionada todo dia pós-inoculação viral até o vírus produzido da etapa c) ser coletado.

13. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o vírus produzido da etapa c) é coletado entre 2 a 10 dias pós-inoculação viral.

14. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a etapa de purificar vírus d) compreende pelo menos uma etapa selecionada de clarificação de coleta viral, ultrafiltração/diafiltração, ultracentrifugação e cromatografia ou qualquer combinação destes.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a etapa de purificar vírus d) compreende pelo menos uma etapa de clarificação de coleta viral.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a coleta viral é clarificada por microfiltração.

17. Método de acordo com as reivindicações de 14 a 16, caracterizado pelo fato de que a etapa de purificar vírus d) compreende pelo menos uma etapa de ultracentrifugação de gradiente de sacarose.

18. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a etapa de purificar vírus d) compreende uma etapa de inativação de vírus.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a etapa de inativação de vírus é realizada com betapropiolactona.

20. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a etapa de purificar vírus d) compreende uma etapa de divisão.

21. Método de acordo com a reivindicações de 1 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de formular o vírus purificado em uma vacina.

22. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o vírus é o vírus influenza.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o vírus influenza é de um subtipo H2, H5, H6, H7 ou H9.

24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o vírus influenza é de um subtipo H1, H3 ou B.

25. Método de acordo com a reivindicações de 1 a 24, caracterizado pelo fato de que as células são células de mamífero ou de ave.

26. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 25, caracterizado pelo fato de que as células são desenvolvidas na suspensão.

27. Método de acordo com a reivindicações de 1 a 26, caracterizado pelo fato de que as células são células tronco embriônicas aviárias.

28. Método para a preparação de uma vacina, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos a etapa de misturar o vírus obtido de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 27 com um carreador farmaceuticamente aceitável.

29. Método para a preparação de uma vacina, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos as seguintes etapas: a) fornecer uma população de células em um meio de cultura celular, b) infectar a população de células por: i. inoculação da população com o vírus e ii. incubação da população inoculada a fim de permitir que o vírus replique e propague, c) coletar o vírus produzido, desse modo, fornecendo uma coleta viral e d) purificar o vírus, em que uma entrada de energia volumétrica de pelo menos 15 W/m3, pelo menos 30 W/m3, pelo menos 60 W/m3, pelo menos 100 W/m3 ou pelo menos 120 W/m3 é aplicado à cultura celular pelo menos durante a etapa b), e e) formular o vírus purificado em uma vacina.