JP2016528905A - 細胞培養中でのウイルスの大規模製造 - Google Patents

Abstract

細胞培養中でのウイルスの製造方法であって、少なくとも以下のステップ：ａ）細胞培養培地中で培養される細胞集団を提供し、ｂ）ｉ．集団にウイルスを接種し、そしてｉｉ．接種された集団をインキュベートしてウイルスの複製及び増殖を可能とすることによって細胞集団を感染させ、ｃ）生成したウイルスを回収し、それによってウイルス回収物（viral harvest）を提供し、そしてｄ）ウイルスを精製する、を含み、少なくともステップｂ）において、少なくとも15W/m3、少なくとも30W/m3、少なくとも60W/m3、少なくとも100W/m3、少なくとも120W/m3の電力密度を細胞培養物に与える、上記方法。【選択図】 なし

Description

本発明は、保健福祉省（Department of Health and Human Services）によって与えられた契約番号第HHSO100200600011C号の下、米国政府の支援によってなされた；米国政府は、本発明において特定の権利を有する。

技術分野
本発明は、細胞培養により製造されるウイルス、又はウイルス抗原を製造する方法、この方法により得られるウイルス又はウイルス抗原、及びこのようなウイルス又はウイルス抗原を含むワクチンに関する。特に、本発明はウイルス収率を改善するための方法を提供する。

従来のウイルスワクチンの製造のための卵ベースの製造系の代替としての、細胞培養ベースの技術の開発は、恐らくは卵ベースの従来の系に伴う欠点及び制約を克服するための最も迅速且つ最も有望な解決策と考えられる。ウイルスワクチンの商業的製造は、典型的には、抗原源として大量のウイルスを必要とする。しかしながら、卵ベースの工程は、卵の生物学的品質が変動するため脆弱であり、好適な卵が大量に入手できないことによる物流上の問題に起因して柔軟性に欠ける。

細胞培養系は、より簡単で、柔軟な、且つ一貫したワクチン調製の好適な代替様式として現れ、ワクチン製造能を大規模化する可能性を高め、このため必要であれば、（例えば、自然な大流行の脅威又はテロリストの攻撃に対応して）大量のウイルスを得ることを可能とする。

しかし、効率的なワクチン製造は、宿主系から高収率で製造される大規模量のウイルスの増殖を必要とする。ウイルスを増殖させる培養条件は、許容される高収率のウイルスを達成することに関連して極めて重要である。このため、所望のウイルスの収率を最大化するために、系及び培養条件の両方を特異的に適合させて、大規模製造に適した所望のウイルスの製造に有利な環境を提供しなければならない。1つの方法は、例えば、培養培地を改善するか、又は細胞密度を増加させることによって細胞特異的生産性を高めることである。製造後、細胞培養によって製造されたウイルスを細胞培養から回収して精製しなければならないという事実のため、ウイルス収率を改善するための別の方法は、様々な精製ステップに伴って生じるウイルス物質の損失を制限することである。このため、増加したウイルス収率でウイルスを製造するための代替的且つ改善された方法を提供する必要性が残されている。本発明による方法は、当技術分野で公知の方法よりも優れたウイルス収率を提供する。

発明の要約
本発明の第1の態様において、細胞培養中でのウイルスの製造方法であって、少なくとも以下のステップ：
ａ）細胞培養培地中に細胞集団を提供し、
ｂ）ｉ．集団にウイルスを接種し、そして
ｉｉ．接種された集団をインキュベートしてウイルスの複製及び増殖を可能とする
ことによって細胞集団を感染させ、
ｃ）生成したウイルスを回収し、それによってウイルス回収物（viral harvest）を提供し、そして
ｄ）ウイルスを精製する
を含み、少なくともステップｂ）において、少なくとも15W/m³、少なくとも30W/m³、少なくとも60W/m³、少なくとも100W/m³、又は少なくとも120W/m³の体積電力入力（volumetric power input）を細胞培養物に与える、上記方法が提供される。

本発明の第2の態様において、本発明の方法により得られたウイルスを、製薬上許容される担体と混合するステップを少なくとも含む、ワクチンの調製方法が提供される。

詳細な説明
本発明は、大規模製造に特に有用な、細胞培養中でのウイルスの製造方法の改善に関する。特に、本発明による方法は、精製工程におけるウイルスの損失を制限することによるウイルス収率の増加に役立つ。本発明者らは、驚くべきことに、ウイルス製造工程の上流部分で起こる幾つかの変化(例えば、ウイルスを製造するために使用される培養細胞に与えられる体積電力入力の増加)が、上記工程の下流部分において、幾つかの精製ステップ後に得られるウイルス収率の増加などの顕著な改善をもたらすことを観察した。特に、本発明者らは、上流の細胞培養段階における電力入力の増加は細胞特異的生産性に何も影響を与えなかったが、その後の精密ろ過による清澄化のステップの後に得られたウイルス収率が、細胞培養段階においてより低い電力入力を行った場合に得られた収率と比較して顕著に増加するという点で、上記ステップにプラスの影響が得られることを観察した。さらに、精密ろ過ステップ後のウイルス回収が増加しただけでなく、得られた回収率も実験間でより一貫性があり且つ変動が少なかった。また、本発明者らは、上流の細胞培養段階における体積電力入力の増加が、その後の下流のウイルス精製段階において行われるスクロース勾配超遠心分離ステップに与える、同様の有益な効果を観察した。特に、本発明者らは、培養細胞に与えられる体積電力入力の増加が、スクロース勾配超遠心分離ステップに使用されるローターのロード容量を、約2倍に顕著に増加させることができることを観察した。その結果、幾つかの精製ステップの後に得られた改善されたウイルス収率は、ウイルス製造工程の終わりに、ウイルスのより良好な包括的収率をもたらした。予想外に、本発明者らは、より高い体積電力入力が細胞に傷害又は損傷を生じさせないことを観察した。

本発明による方法は、細胞培養中でウイルスを製造するために典型的に用いられる標準的なステップ又は標準的な機器以外には、追加のステップ又は更なる機器が必要とされないため、実行が容易であるという利点を提供する。

「ロード容量」は、スクロース勾配超遠心分離ステップに使用される遠心分離のローター1リットル当たりにロードされる、本発明の方法のステップc）において回収されるウイルス回収物の量（リットル）、又は、上記ウイルス回収物が、事前の精製ステップによりスクロース勾配超遠心分離ステップに供される前に処理された場合は、ウイルス回収物の「当」量（リットル）である。例えば、以下に記載されるとおり、ウイルス回収物を、回収した後、スクロース勾配超遠心分離ステップに供する前に限外ろ過／透析ろ過に供してもよく、この限外ろ過／透析ろ過は、典型的にはウイルス回収物の濃縮をもたらし、すなわちウイルス回収物の量（リットル）は、かかるステップの後に低下する。

「体積電力入力」は、単位体積当たりの電力量、又は平均比エネルギー散逸率である。細胞培養物においては、体積電力入力は、アジテーターシャフト及びインペラーを通してある体積の細胞培養物に伝えられる電力量に対応する。体積電力入力はW/m³として表される。電力入力値を計算するために当技術分野において用いられる経験式は以下のとおりである：P/V= （Np x n³ x di⁵）/V（式中、Npは、インペラーについての乱流動力数であり、nは、1秒当たりのインペラー回転として測定される撹拌速度であり、diは、メートル単位で測定されるインペラー直径であり、Vは、立法メートル単位の培養体積である）。

本発明による方法は、マイクロ担体上で増殖する接着細胞であるか懸濁細胞であるかに関わらず、任意の細胞型に適用することができる。従って、本発明の意味において、用語「細胞懸濁液」は、マイクロ担体上で増殖する接着細胞と、懸濁液中で増殖することができる（すなわち、増殖するためにマイクロ担体などのいかなる接着支持体も必要としない）細胞の両方を包含するものとする。

典型的には、体積電力入力は、細胞懸濁液の機械的な動きによって与えられる。上記の機械的な動きは、様々な手段を通して得ることができる。例えば、細胞懸濁液の機械的な動きは、撹拌デバイス（例えばインペラー）によって得ることができる。

撹拌は、使用されるインペラーの種類に応じて、軸流、半径流、またはその2つの組み合わせとして与えることができる。典型的には、インペラーは、それらの形状、また特に、それらのブレードの形状に基づいて以下のグループに分けることができる：（i）フラットブレードタービン（一般的にはラシュトン（Rushton）インペラー又はラシュトン型インペラーとも呼ばれる）；（ii）ピッチブレードインペラー；及び（iii）マリンブレードインペラー。

フラットブレードタービン、又はラシュトンインペラーは、撹拌シャフトに沿って垂直に設定されたフラットブレードで作製され、一方向半径流を生じる。これらの種類のインペラーは、酵母、細菌、及び一部の真菌などの、せん断感受性であるとは考えられない細胞株の発酵において一般的に使用される。しかし、本明細書中で開示されるとおり、本発明者らは、ラシュトンインペラーを、本発明の方法により動物細胞で好適に使用することもできることを観察した。

ピッチブレードインペラーは、撹拌シャフトに対してある角度に設定されたフラットブレードで作製され、軸流と半径流とを同時に生じさせる。このようなピッチブレードインペラーは、多くの場合、懸濁液中で又はマイクロ担体を利用して増殖するせん断感受性細胞株で使用される。これらのインペラーは、多くの場合、バッチ培養又はフェッドバッチ培養において使用されるが、連続工程及び灌流工程に使用することもできる。

マリンブレードインペラー上のブレードのリーディング面は平面であっても凹面であってもよいが、それらの裏側は凸面であり、このようにして一方向軸流を生じさせる。

適切なインペラーの種類を選択するために、様々な因子、例えば、細胞の種類、培養系の種類（バッチ培養系、フェッドバッチ培養系又は灌流培養系）、培養容器の種類、また望ましい体積電力入力のレベルなどを考慮すべきである。上記の特定の条件に応じて使用するための適切なインペラーを決定して選択することは当業者の能力の範囲内である。一実施形態において、本発明による方法において与えられる体積電力入力、特に30〜120W/m³の範囲の体積電力入力は、ピッチブレードインペラーを用いて得られる。別の実施形態において、本発明による方法において与えられる体積電力入力、特に120W/m³より高い体積電力入力は、ラシュトンインペラーを用いて得られる。

動物細胞培養物に与えられる体積電力入力は、保護細胞壁がなく、特に、微生物培養よりもせん断応力及び泡沫形成に対してより感受性が高くなるために動物細胞の脆弱性がより高いと考えられるため、典型的には、微生物培養物において与えられる体積電力入力よりかなり低い。しかし、本発明者らによって観察されたとおり、ウイルスを製造するために使用される動物細胞培養物への、ある程度までの高い体積電力入力の印加は細胞に害を及ぼさない一方で、生成したウイルスの精製におけるウイルス収率に有利に働く。

本発明による方法は、広範囲の体積電力入力値で行うことができる。「最大値」という用語は、ウイルス収率に全体的に悪影響を及ぼすことなく与えることができる最大体積電力入力を意図する。ウイルス収率に悪影響を与える可能性があることが知られている1つの因子は、例えば、細胞生存能の低下などの細胞統合性である。当業者であれば、細胞生存能をモニターする方法を知っている。好適な方法の非限定的な例は、（生細胞を死細胞と区別することを可能とする）トリパンブルー染色などの細胞染色、又は任意の他の公知の好適な染色である。或いは、細胞生存能はまた、例えば、FACS（蛍光活性化細胞分類（Fluorescence-Activated Cell Sorting））などのフローサイトメトリーによって評価及び測定することもできる。また、最大値を規定する場合、ウイルスの細胞特異的生産性を考慮に入れることができる。「細胞特異的生産性」という用語は、細胞がウイルスを製造する能力、すなわち、精製に供される前に、回収ステップc）において得られるウイルスの量を意味する。培養細胞に与えられる体積電力入力は、好ましくは、ウイルスの細胞特異的生産性に悪影響を与えないものでなければならない。

体積電力入力の「最小値」という用語は、体積電力入力が培養細胞に与えられていないか、又は低い体積電力入力が与えられているウイルス精製段階において得られるウイルス収率と比較して、ウイルス精製段階におけるウイルス収率の改善を与える最小値を意図する。ウイルス収率又はウイルス力価を測定するための当技術分野で公知の任意の方法を、本発明の方法において与えられる体積電力入力の最適値の決定を補助するために好適に用いることができる。例えば、CPE（細胞変性効果（CytoPathic Effect））は、ウイルス接種後に宿主細胞に生じる形態学的変化、例えば細胞の円形化、方向性喪失、膨張又は収縮、死滅、表面からの剥離などをモニターすることによって測定することができる。また、特定のウイルス抗原の検出は、細胞に製造対象の目的ウイルスを接種した後いつでも、ウエスタンブロット分析などのタンパク質検出の標準技術によってモニターすることができる。インフルエンザウイルスの特定の場合においては、細胞にウイルスを接種した後いつでも、当業者によく知られている技術であるSRDアッセイ（Wood, JMら（1977年） J. Biol. Standard. 5, 237-247）によってHA含有量をモニターすることができる。さらに、SRDアッセイは、精製段階においていつでも、任意の所与の精製ステップの前後にウイルス収率を評価するために使用することもできる。本発明の方法によれば、ウイルスを製造するために使用される動物細胞に与えられる体積電力入力は、典型的には、15〜900W/m³の範囲、好適には30〜500W/m³の範囲、さらに好適には60〜250W/m³の範囲、さらに好適には120〜200W/m³の範囲である。一実施形態において、本発明による方法において使用される体積電力入力値は、少なくとも15W/m³、少なくとも30W/m³、少なくとも60W/m³、少なくとも100W/m³、又は少なくとも120W/m³である。特定の実施形態において、本発明による方法において使用される体積電力入力値は30W/m³である。或いは、別の特定の実施形態において、本発明による方法において使用される体積電力入力値は120W/m³である。

本発明による方法は、容器が、撹拌デバイス(例えばインペラーなど)を収容するのに適しているか、又は独立した撹拌デバイスの使用に適合する限り、任意のサイズの、例えばフラスコ、ローラーボトル、又はバイオリアクターなどの任意の種類の培養容器に適用することができる。容器が撹拌デバイスを含むことは必要ではない。撹拌デバイスは、容器自体から分離していてよい。例えば、典型的にはプラスチックバッグから成る使い捨てバイオリアクター（例えばWave（商標）バイオリアクター）の場合、上記使い捨てバイオリアクターの撹拌は、軌道シェーカーであるか又は軸シェーカーであるかに関わらず、バイオリアクターを撹拌テーブル上に配置することによって得ることができる。バイオリアクターは、例えば、非使い捨てバイオリアクター用のガラス若しくはステンレス、又は使い捨てバイオリアクター用のプラスチックなどの任意の種類の材料で作製されていてよい。同様に、バイオリアクターは、例えば、シリンダー形又は立方形などの任意の形状であってよい。バイオリアクターは、典型的には、1〜10Lのような中間規模、また20〜1000L及びそれを超えるような大規模製造用に使用される。本発明による方法は、任意のサイズの任意の種類のバイオリアクターに適用することができる。特に、本発明の方法は、10L、200L、500L、1000L又は10000Lのバイオリアクターに適している。本発明の方法において使用するための1つの特に好適なバイオリアクターの種類は、バッチ操作されるか連続操作されるかに関わらず、撹拌タンクバイオリアクターである。使い捨てバイオリアクターは、本発明の方法において使用するための別の好適な種類のバイオリアクターである。一実施形態において、本発明による方法において使用される細胞は、200Lの使い捨てバイオリアクター中で培養される。

本発明によれば、細胞は、様々な方法で、例えば、バッチ系、フェドバッチ系、又は連続系（例えば灌流系）を使用して増殖させることができる。灌流は、高い細胞密度が望ましい場合に特に有利である。高い細胞密度は、所与の細胞型から製造し得るウイルスの量を最大化するために特に有利であり得る。本発明による高い体積電力入力が細胞培養物に与えられる細胞培養中でのウイルスの製造方法は、細胞が、バッチ系を用いて増殖されるか、フェドバッチ系を用いて増殖されるか、又は連続系を用いて増殖されるかに関わらず、上記の系のいずれかに適用することができる。本発明の一実施形態において、本発明の方法により使用される細胞はバッチ様式で増殖される。

本発明の方法は、広範囲のウイルス（細胞に感染し、複製のためにそれらを利用することができる任意のウイルス）に適しており、例えば、限定するものではないが、アデノウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス及びレトロウイルスが挙げられる。特に、本発明の方法は、ミクソウイルスなどのエンベロープウイルスに適している。一実施形態において、本発明の方法によって製造されるウイルスは、オルトミクソウイルス科に属する（特にインフルエンザウイルス）。

ウイルス又はウイルス抗原は、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザウイルス）に由来し得る。オルトミクソウイルス抗原は、1種以上のウイルスタンパク質、例えば、ヘマグルチニン（HA）、ノイラミニダーゼ（NA）、核タンパク質（NP）、マトリクスタンパク質（M1）、膜タンパク質（M2）、1種以上の転写酵素（PB1、PB2及びPA）から選択することができる。特に好適な抗原として、インフルエンザ亜型の抗原特異性を決定する2種の表面糖タンパク質であるHA及びNAが挙げられる。

インフルエンザウイルスは、ヒトインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、馬インフルエンザウイルス、豚インフルエンザウイルス、猫インフルエンザウイルスの群から選択することができる。インフルエンザウイルスは、さらに特に、A株、B株及びC株から、好ましくはA株及びB株から選択される。

インフルエンザ抗原は、大流行間期の（毎年の又は季節性）インフルエンザ株に由来し得る。或いは、インフルエンザ抗原は、世界的流行の発生を引き起こす可能性がある株（すなわち、現在流行している株におけるヘマグルチニンと比較して新たなヘマグルチニンを含むインフルエンザ株、又は鳥類の対象において病原性であり、ヒト集団に水平伝染する可能性を有するインフルエンザ株、又はヒトに対して病原性を有するインフルエンザ株）に由来し得る。特定の季節及びワクチンに含まれる抗原の性質に応じて、インフルエンザ抗原は、1種以上の以下のヘマグルチニン亜型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15又はH16に由来し得る。好ましくは、インフルエンザウイルス又はその抗原は、H1、H2、H3、H5、H7又はH9亜型に由来する。一実施形態において、インフルエンザウイルスは、H2、H5、H6、H7又はH9亜型に由来する。代替的実施形態において、インフルエンザウイルスは、H1、H3又はB亜型に由来する。

本発明による方法において使用される細胞は、原理上、細胞培養中で培養することが可能であり、ウイルス複製を補助することができる任意の所望の種類の動物細胞であり得る。これらは、初代細胞であってもよいし、連続細胞株であってもよい。遺伝的に安定した細胞株が好ましい。哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、ハムスター細胞、ウシ細胞、サル細胞又はイヌ細胞が特に好適である。或いは、昆虫細胞、例えば、SF9細胞又はHi-5細胞なども好適である。

多くの哺乳動物細胞株が当技術分野において公知であり、例えば、PER.C6、HEK細胞、ヒト胚腎細胞（293細胞）、HeLa細胞、CHO細胞、Vero細胞及びMDCK細胞が挙げられる。

好適なサル細胞は、アフリカミドリザル細胞、例えば、Vero細胞株のような腎細胞である。好適なイヌ細胞は、例えば、MDCK細胞株のような腎細胞である。

インフルエンザウイルスを増殖させるための好適な哺乳動物細胞株として、MDCK細胞、Vero細胞、又はPER.C6細胞が挙げられる。これらの細胞株は全て、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Cell Culture （ATCC） collection）から広く入手可能である。

特定の実施形態によれば、本発明の方法はMDCK細胞を使用する。元のMDCK細胞株は、ATCCからCCL-34として入手可能であるが、この細胞株の誘導体も使用することができる（例えば、懸濁液中での増殖に適合させたMDCK細胞（WO 1997/37000））。

或いは、本発明において使用するための細胞株は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ又はキジなどの鳥類源に由来し得る。鳥類細胞株は、胚、雛及び成鳥などの様々な発達段階に由来し得る。特に、細胞株は、胚細胞（例えば胚線維芽細胞）、生殖細胞、又は個々の器官（例えば、神経、脳、網膜、腎臓、肝臓、心臓、筋肉、若しくは胚外組織及び胚を保護する膜）に由来し得る。ニワトリ胚線維芽細胞（CEF）を使用することができる。鳥類細胞株の例としては、鳥類胚性幹細胞（WO01/85938）及びアヒル網膜細胞（WO05/042728）が挙げられる。特に、本発明ではアヒル胚性幹細胞に由来するEB66（登録商標）細胞株が想定される（WO08/129058）。他の好適な鳥類胚性幹細胞としては、ニワトリ胚性幹細胞EB45、EB14及びEB14-074に由来するEBx（登録商標）細胞株が挙げられる（WO2006/108846）。このEBx（登録商標）細胞株は、自然に樹立され、いかなる遺伝的、化学的又はウイルス改変を必要としなかった安定細胞株であるという利点を呈する。これらの鳥類細胞は、インフルエンザウイルスを増殖させるために特に好適である。

特定の実施形態によれば、本発明の方法はEB66（登録商標）細胞を用いる。

細胞培養条件（温度、細胞密度、pH値、等…）は、用いられる細胞の適合性によって極めて広範囲にわたって変えることができ、特定のウイルス増殖条件の詳細の要件に適合させることができる。細胞培養は、当技術分野において広く報告されているため、適切な培養条件を決定することは当業者の能力の範囲内である（例えば、Tissue Culture, Academic Press, Kruse及びPaterson編（1973年）、及びR.I. Freshney, Culture of animal cells：A manual of basic technique, 第4版（Wiley-Liss Inc., 2000年, ISBN 0-471-34889-9を参照されたい）。

特定の実施形態において、本発明において記載される方法において使用される細胞は、無血清培地及び／又は無タンパク質培地中で培養される。「無血清培地」（SFM）は、細胞生存及び細胞増殖を可能とする血清添加を必要としないすぐに使用可能な細胞培養培地を意味する。この培地は、必ずしも化学的に規定されておらず、様々な起源の（例えば植物由来の）加水分解物を含有し得る。このような無血清培地は、外来性ウイルス、マイコプラズマ又は未知の感染因子による汚染を除外することができるという利点を呈する。「無タンパク質」は、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加剤及び非血清タンパク質を除いて細胞の増殖が起こる培養液を意味すると理解される。場合により、ウイルス感染中に、ウイルス増殖に必要とされる可能性があるトリプシン又は他のタンパク質分解酵素を添加してもよい。このような培養液中で増殖する細胞は、タンパク質自体を天然に含む。

無血清培地は多くの供給源、例えば、VP SFM（Invitrogen社、Ref 11681-020）、Opti-Pro（Invitrogen社、Ref 12309-019）、又はEX-CELL（JHR Bioscience社）から市販されている。

ウイルスに感染させる前に、細胞は、約37℃、さらに好適には36.5℃において、6.7〜7.8の範囲のpH、好適には約6.8〜7.5の範囲のpH、さらに好適には約7.2のpHで培養される。細胞が昆虫細胞である場合、ウイルスに感染させる前の温度は、典型的には25℃〜29℃の範囲であり、好適には27℃である。

本発明のウイルスの製造方法によれば、細胞培養ベースのウイルスの製造は、一般的に、a）培養培地中に培養される細胞集団を提供するステップ；b）上記細胞に製造対象の目的ウイルスを接種して細胞のウイルス感染工程を開始させ、そして接種された細胞を、所望の時間インキュベート又は培養してウイルスの複製及び増殖を可能とするステップ、そしてc）生成したウイルスを回収するステップを含む。本発明による高い体積電力入力は、好適には少なくともステップb）において、またさらに好適にはステップa）及びb）において与えられる。従って、一実施形態では、本発明によるウイルスの製造方法において、少なくとも15W/m³、少なくとも30W/m³、少なくとも60W/m³、少なくとも100W/m³、又は少なくとも120W/m³の体積電力入力が、ステップa）及びb）において培養細胞に与えられる。

用語「接種する/接種」及び「接種された細胞」は、本発明の意味において、細胞、及び目的ウイルスが添加されている細胞それぞれへの、目的ウイルスの添加時として理解されるべきである。用語「接種後」は、ウイルスが細胞に添加された後の時間として理解されるべきである。本明細書の残りの部分において、「接種後」の時間は、例えば「接種後2時間」又は「接種後1日目（D1）」のように、分、時間又は日で示される。細胞にウイルスを接種する日を0日目（D0）と考えるものとする。ウイルス接種、ウイルス複製、及びウイルス増殖の3つの連続ステップは、より広いウイルス感染工程の一部であると理解されるものとする。本発明において定義される高い体積電力入力は、上記のステップのいずれかにおいて細胞培養物に与えることができる。本発明の意味における高い体積電力入力は、細胞が目的ウイルスに感染する前、細胞が増殖及び培養される間に細胞に好適に与えることができる。本発明の意味における高い体積電力入力はまた、細胞にウイルスを接種した後及び／又はウイルスが複製及び増殖することができるように細胞をインキュベートしたままにしている間に、細胞に好適に与えることができる。また高い体積電力は、細胞が感染する前に増殖及び培養される間、細胞にウイルスを接種した後、そしてウイルスが複製及び増殖することができるように細胞をインキュベートしたままにしている間に、細胞に好適に与えることができる。一実施形態において、高い体積電力入力は、細胞に目的ウイルスを接種した後、生成したウイルスを回収するまで、本発明による方法において使用される細胞に与えられる。さらなる実施形態において、高い体積電力入力は、目的ウイルスに感染する前に細胞が増殖及び培養される間、また細胞に上記ウイルスを接種した後、生成したウイルスを回収するまで、細胞に与えられる。

大量のウイルスを製造するため、細胞が高密度に達した時点で、細胞に目的ウイルスを接種することが有利であり得る。通常、接種は、細胞密度が少なくとも約5x10⁶個/ml、好適には6x10⁶個/ml、さらに好適には7x10⁶個/ml、さらに好適には8x10⁶個/ml、さらに好適には9x10⁶個/mlであるか、或いはさらに高いか（例えば10x10⁶個/ml、11x10⁶個/ml、12x10⁶個/ml若しくは13x10⁶個/ml）、又はさらに高い（例えば20x10⁶個/ml、25x10⁶個/ml、若しくは30x10⁶個/ml）場合に実施される。本発明による方法の一実施形態において、ウイルス感染が起こる前に到達する細胞密度は、少なくとも8x10⁶個/ml、9x10⁶個/ml、10x10⁶個/ml、11x10⁶個/ml、12x10⁶個/ml又は13x10⁶個/mlである。別の実施形態において、ウイルス感染が起こる前に到達する細胞密度は、少なくとも20x10⁶個/ml、25x10⁶個/ml、又は30x10⁶個/mlである。このようなレベルの高密度は、細胞培養のための灌流系を用いて有利に得ることができる。最高のウイルス製造を得るための最適の細胞密度は、ウイルス増殖に使用される細胞型によって異なり得る。ウエスタンブロット分析などのタンパク質検出の標準的技術、又はインフルエンザウイルス用のSRDアッセイ、又は上記のCPEも、最適化されたウイルス収率を得るために必要とされる最適な細胞密度範囲を決定するために使用することができる。

大量のウイルスを製造するため、ウイルス吸着段階（adsorption phase）を行うことも有利であり得る。「吸着段階」という用語は、細胞にウイルスが高密度で接種され、ウイルスが回収されるまでの残りの感染期間に細胞密度が低下する前の短期間、細胞膜へのウイルスの吸着に有利に働くようにすることを意味する。例えば、細胞へのウイルスの接種は、細胞密度が少なくとも8x10⁶個/ml、好適には少なくとも9x10⁶個/ml、好適には少なくとも10x10⁶個/ml、好適には少なくとも11x10⁶個/ml、好適には少なくとも12x10⁶個/ml、さらに好適には少なくとも13x10⁶個/mlであるか、又はさらに高い（例えば20x10⁶個/ml、25x10⁶個/ml、若しくは30x10⁶個/ml）場合に実施される。ウイルスの接種から、好適には30分間、さらに好適には45分間、さらに好適には1時間、1時間30分、又は2時間後、接種された細胞を、残りの感染工程のために（すなわち生成したウイルスを回収する前の更なるインキュベーションのために）、2〜5倍の範囲の倍率、好適には3倍の倍率で希釈する。或いは、吸着段階の終わりに、接種された細胞を、残りの感染工程のために（すなわち、生成したウイルスを回収する前の更なるインキュベーションのために）、3〜5x10⁶個/mlの範囲、好適には4x10⁶個/mlの最終細胞密度が得られるように希釈する。

代替的実施形態において、細胞密度が少なくとも8x10⁶個/ml、少なくとも9x10⁶個/ml、少なくとも10x10⁶個/ml、少なくとも11x10⁶個/ml、少なくとも12x10⁶個/ml、少なくとも13x10⁶個/ml、少なくとも20x10⁶個/ml、少なくとも25x10⁶個/ml、又は少なくとも30x10⁶個/mlである場合、細胞にウイルスを接種し、接種直後に、接種された細胞を、残りの感染工程の間に（すなわち、生成したウイルスを回収する前の更なるインキュベーションの間に）、2〜5倍の範囲の倍率、好適には3倍の倍率で、又は3〜5x10⁶個/mlの範囲、好適には4x10⁶個/mlの最終細胞密度が得られるように希釈する。

吸着段階を実行する場合、体積電力入力は、上記段階の間（すなわち、細胞に目的ウイルスを接種した後で接種された細胞を希釈する前に）、例えば、2〜10W/m³の範囲の値、4〜8W/m³の範囲の値、好適には7W/m³の値などの低レベルで好適に維持することができる。従って、本発明の一実施形態において、細胞培養中でのウイルスの製造方法は、少なくともa）培養培地中に培養される細胞集団を提供するステップ、b）i. 細胞密度が少なくとも8x10⁶個/ml、少なくとも9x10⁶個/ml、少なくとも10x10⁶個/ml、少なくとも11x10⁶個/ml、少なくとも12x10⁶個/ml、又は少なくとも13x10⁶個/mlである場合、30分間、45分間、1時間、1時間30分、又は2時間、細胞集団にウイルスを接種し、その後、接種された細胞を、2〜5倍の範囲の倍率、もしくは3倍の倍率で、又は代替的には、得られる最終細胞密度が3x10⁶個/ml〜5x10⁶個/mlの範囲、好適には4x10⁶個/mlになるように希釈し、そしてii. 希釈した接種された集団をインキュベートしてウイルスの複製及び増殖を可能とすることによって細胞集団にウイルスを感染させるステップを含み、細胞にウイルスを接種する前に、細胞培養物に与える体積電力入力を、少なくとも15W/m³、少なくとも30W/m³、少なくとも60W/m³、少なくとも100W/m³、又は少なくとも120W/m³とし、その後、細胞に接種した後、接種された細胞を希釈する前に、2〜10W/m³の範囲の値、4〜8W/m³の範囲の値、又は7W/m³の値に低下させ、そして接種された細胞を希釈した後、生成したウイルスを回収するまで、少なくとも15W/m³、少なくとも30W/m³、少なくとも60W/m³、少なくとも100W/m³、又は少なくとも120W/m³に増加させる。或いは、体積電力入力は、吸着段階を通して一定の値に維持することができる。従って、更なる実施形態において、本発明による細胞培養物に与えられる体積電力入力を、細胞培養培地中に培養される細胞集団を提供し、上記集団に目的ウイルスを30分間、45分間、1時間、1時間30分、又は2時間接種し、上記の条件に従って接種された細胞を希釈し、そして希釈した接種された集団をインキュベートする連続ステップを通して、少なくとも15W/m³、少なくとも30W/m³、少なくとも60W/m³、少なくとも100W/m³、又は少なくとも120W/m³に維持する。

接種は、約10^-1〜10^-7、好適には約10^-2〜10^-6、そしてさらに好適には約10^-5のMOI（感染多重度(Multiplicity Of Infection)）で行うことができる。

ウイルス感染のための温度及びpH条件は変動し得る。温度は、ウイルス型に応じて32℃〜39℃の範囲であり得る。インフルエンザウイルス製造の場合、細胞培養感染は、製造対象の株に応じて異なり得る。インフルエンザウイルス感染は、好適には、32℃〜35℃の範囲の温度、好適には33℃の温度で実施される。一実施形態において、ウイルス感染は、33℃で起こる。代替的実施形態において、ウイルス感染は35℃で起こる。ウイルス複製を可能とするために、ウイルス株に応じてプロテアーゼ、典型的にはトリプシンを細胞培養に添加することもできる。プロテアーゼは、培養中の任意の好適な段階で添加することができる。トリプシンは好ましくは非動物起源であり、つまり、プロテアーゼは動物源からは精製されない。トリプシンは、好適には、細菌、酵母又は植物などの微生物中で組み換え的に製造される。組み換えトリプシンの好適な例は、トウモロコシ中で製造される組み換えトリプシンであるTrypzean（Prodigen社製、101 Gateway Blvd, Suite 100 College Station, Texas 77845。メーカーコード：TRY）、又は真菌中で発現されるトリプシン様酵素であるTrpLE（Invitrogen社製）である（WO2004/020612）。一実施形態において、トリプシンは、ウイルスが細胞に接種されるのと同時に添加される。すなわち、トリプシンは0日目（D0）に添加される。さらなる実施形態において、トリプシンは、例えば、接種後1日目（D1）及び／又は4日目（D4）などの接種後の異なる時点で更に添加される。代替的実施形態において、トリプシンは、ウイルス接種後毎日、生成したウイルスを回収するまで更に添加される。

一旦感染すると、細胞は、宿主細胞の自然溶解（受動的溶解とも呼ばれる）により、培養培地中に新たに形成されたウイルス粒子を放出し得る。従って、一実施形態において、細胞生成したウイルス回収物は、細胞培養培地を回収することによってウイルス接種後いつでも提供され得る。この回収様式は、細胞生成したウイルスを、ウイルス接種後異なる時点で回収し、必要であればその異なる回収物をプールすることが望ましい場合に特に好適である。

或いは、ウイルス感染後、細胞培養ベースのウイルスは、宿主細胞を溶解する外因子を用いることにより（能動的溶解とも呼ばれる）回収することができる。しかし、前の回収様式とは対照的に、このような回収様式は、細胞の能動的溶解が細胞培養をすぐに終了させるため、細胞由来のウイルス回収物を単一時点で回収することを必要とする。

能動的細胞溶解に使用することができる方法は、当業者に公知である。これに関して、有用な方法は、例えば、凍結融解、固体せん断、高張性溶解及び／又は低張性溶解、液体せん断、高圧押出、界面活性剤溶解、又はこれらの任意の組合せである。

一実施形態によれば、、細胞培養ベースのウイルス回収物は、細胞培養上清を回収することにより、接種された細胞を溶解することにより、又はその両方により、ウイルス接種後いつでも提供することができる。

回収前、細胞感染は、2〜10日間持続し得る。特定の実施形態によれば、接種後3、4及び5日目から得られる培養上清を回収し、更なる下流の工程（ウイルス単離又はウイルス精製）のためにプールする。明確な実施形態によれば、細胞培養上清を、接種後5日目から回収する。細胞生成したウイルスを回収するために最適な時間は、通常、感染ピークの決定に基づく。例えば、CPE（CytoPathic Effect）は、ウイルス接種後に宿主細胞に起こる形態学的変化、例えば、細胞の円形化、方向性喪失、膨張又は収縮、死滅、表面からの剥離などをモニターすることによって測定される。また、特定のウイルス抗原の検出を、ウエスタンブロット分析などのタンパク質検出の標準技術によってモニターすることもできる。その後、所望の検出レベルが得られた場合に、回収物を回収することができる。インフルエンザウイルスの特定の場合、HA含有量は、当業者によく知られている技術であるSRDアッセイ（Wood, JMら（1977年）. J. Biol. Standard. 5, 237-247）により、細胞にウイルスを接種した後いつでもモニターすることができる。さらに、SRDアッセイは、最適化されたウイルス収率を得るために必要とされる最適な細胞密度範囲を決定するために用いることもできる。

本発明の文脈において、細胞培養段階は、ウイルス回収ステップに先行する任意のステップを包含すると理解されるが、ウイルス精製段階は、上記の回収ステップに続く任意のステップを包含すると理解される。

本発明によれば、細胞培養中での製造後、ウイルスを精製する。本発明の方法において、ウイルス精製の分野で公知の任意の好適なステップ又は技術を、生成したウイルスを回収した後に好適に行うことができる。一実施形態において、本発明の方法は、ウイルス回収物の清澄化、限外ろ過／透析ろ過、超遠心分離及びクロマトグラフィー、又はこれらの任意の組合せから選択される少なくとも1つのステップを含む。所望の純度レベルに応じて、上記のステップを任意の方法で組み合わせることができる。

特定の実施形態において、ウイルス精製段階において、本発明の方法は、少なくともウイルス回収物の清澄化ステップ、保持液を提供する限外ろ過／透析ろ過ステップ、及び超遠心分離ステップを含む。

感染細胞のウイルス含有細胞培養培地を回収した後、提供されたウイルス回収物を、典型的には、無傷細胞又は細胞残屑などの細胞物質からウイルスを分離するために清澄化する。清澄化は、ろ過ステップ、典型的には精密ろ過ステップにより、すなわち、典型的には0.1μm〜10μmの孔サイズを有するフィルターを使用して行うことができる。好適なフィルターは、セルロースフィルター、再生セルロースフィルター、無機フィルターエイドと組み合わせたセルロース繊維、無機フィルターエイド及び有機樹脂と組み合わせたセルロースフィルター、又はこれらの任意の組合せ、並びにポリマーフィルターを利用し得る。要求はされないが、例えば、適切な名目孔サイズを有するフィルター、特に減少する名目孔サイズを有するフィルターを使用して、大きな沈殿物及び細胞残屑の除去を開始することを可能とし、不純物をそれらのサイズに応じて連続的且つ漸進的に除去する2段階工程又は3段階工程のような多段階ろ過工程を行うことができる。さらに、比較的目の詰まったフィルターを用いる単一段階操作、又は遠心分離も、清澄化に使用することができる。さらに一般的には、任意の清澄化法、例えば、限定するものではないが、好適な清澄度で後続のステップにおいて膜及び／又は樹脂を詰まらせないろ液を提供する直接フローろ過又は「デッドエンド」ろ過、深層ろ過、タンジェンシャルフローろ過若しくはクロスフローろ過、又は遠心分離が、本発明の清澄化ステップにおいて使用するために許容可能であろう。一実施形態において、ウイルスの清澄化ステップを、深層ろ過により、特に、例えば、5μm-0.5μm-0.2μmの名目多孔度（porosities）を有する3つの異なる深層フィルターで構成される3連ろ過を使用して実施する。別の実施形態において、ウイルス回収物を、場合により予備清澄化としての遠心分離ステップが先行する、精密ろ過によって清澄化する。本発明によるウイルス(例えばインフルエンザウイルス)の製造方法が精製ステップd）において精密ろ過の清澄化ステップを含む特定の実施形態において、上記清澄化ステップ後に得られるウイルス収率（例えばインフルエンザウイルスのHA収率)は、少なくとも65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、又はそれ以上である。

本発明によれば、本発明の方法のウイルス精製段階において、ウイルス濃縮及び/又はバッファー交換のために、ウイルス回収物を限外ろ過（バッファー交換に使用される場合、透析ろ過と呼ばれることもある）に供してもよい。このステップは、例えば、接種後数日間にわたる灌流によって回収されるウイルス回収物をプールする場合と同様、精製対象のウイルスを希釈する場合に特に有利である。本発明の方法によりウイルスを濃縮し及び／又はバッファーを交換するために使用される工程は、任意のろ過工程を含んでいてよく、ここで、希釈液はウイルス懸濁液から除去されるがウイルスはフィルターを通過することができず、これによりウイルス調製物の濃縮形態で残るような方法で希釈液をフィルターに通過させることにより、ウイルスの濃度が増加する。

中性ではないが正電荷を有する膜又はフィルターを使用する場合、上記の膜又はフィルターを、塩を含むすすぎバッファーですすぎ、膜又はフィルターとのイオン性相互作用により保持し得たウイルス画分を溶出する、さらなるステップを行うことが有用であり得る。すすぎバッファー中に含まれ得る好適な塩の一例は、0.1M〜2Mの範囲の濃度、特に、0.5M〜1.5Mの範囲の濃度、好適には1Mの濃度で存在し得る塩化ナトリウム（NaCl）である。本発明の一実施形態において、清澄化が膜ろ過によって実施される場合、それが予備清澄化であるか清澄化であるかに関わらず、上記清澄化は、NaCl、特にNaCl 1Mを含むバッファーによる膜すすぎステップを含む。

限外ろ過は、塩、糖、非水性溶媒の除去及び交換、低分子量物質の除去、イオン環境及び／又はpH環境の迅速な変化のための理想的な方法である透析ろ過を含み得る。微小溶質(microsolute)は、溶媒を、限外ろ過されている溶液に、限外ろ過速度（rate）と同じ速度で添加することによって最も効率的に除去される。これは、微小種を溶液から一定の容量で洗い流し、保持されたウイルスを分離する。透析ろ過は、下流のステップが、最適な反応を得るために特定のバッファーを使用することを必要とする場合に特に有利である。例えば、宿主細胞核酸をエンドヌクレアーゼで分解する前に透析ろ過ステップを行うことは、そのエンドヌクレアーゼに特異的且つ最適なバッファー中でエンドヌクレアーゼ反応を実施することを可能とし得る。濃縮及び透析ろ過はまた、望ましくない化合物(例えばスクロース勾配超遠心分離後のスクロース、又はホルムアルデヒドによるウイルス不活化ステップ後のホルムアルデヒドなど)を除去することが求められる場合、精製工程の任意の好適なステップにおいて行うこともできる。この系は、3つの別々の工程流：供給液（ウイルスを含む）、透過液及び保持液から成る。用途に応じて、種々の孔サイズを有するフィルターを使用することができる。本発明において、保持液はウイルスを含み、所望であれば、更なる精製ステップに使用することができる。膜組成物は、限定するものではないが、再生セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、又はその誘導体であってよい。膜は、フラットシート（フラットスクリーンとも呼ばれる）又は中空糸であり得る。

一実施形態において、本発明の方法のウイルス精製段階は、少なくとも1つの限外ろ過／透析ろ過ステップ、好適には少なくとも2つの限外ろ過／透析ろ過ステップを含む。

細胞培養生成したウイルスが何の用途のために精製されるかに応じて、ウイルス回収物から宿主細胞核酸の夾雑物を除去することが望ましい場合もあり得る。特に、精製したウイルスをワクチンに含める場合、宿主細胞核酸を分解し、精製したウイルスから除去すべきである。核酸分解は、多くの場合、RNA及びDNAを標的とするヌクレアーゼの使用を通して生じる。宿主細胞核酸の分解に好適なヌクレアーゼの非限定的な例は、Benzonase(商標)である。Benzonase(商標)、又は任意の他の好適なヌクレアーゼを、ウイルス精製工程の任意の好適なステップにおいて添加してもよい。一実施形態において、本発明による方法は、ヌクレアーゼ分解ステップ、好適にはBenzonase(商標)処理を含む。例えば、ヌクレアーゼを、清澄化したウイルス含有細胞培養培地の限外ろ過後に得られる保持液に添加してもよい。或いは、宿主細胞核酸分解を、β-プロピオラクトンによるウイルス不活化ステップを通して行うことができる。

所望であれば、本発明により得られるウイルスを、密度勾配遠心分離（例えば、スクロース勾配超遠心分離）及び／又はクロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー）などのウイルス精製に用いられる標準技術を使用してさらに精製することができる。一実施形態において、本発明による方法は、少なくとも1つのスクロース勾配遠心分離ステップを含む。さらなる実施形態において、本発明の方法の精製段階は、少なくとも清澄化ステップ(例えば、遠心分離ステップ及びその後の精密ろ過ステップなど)、少なくとも限外ろ過ステップ、及びスクロース勾配遠心分離ステップを含む。本発明によるウイルス（例えばインフルエンザウイルス）の製造方法が、精製ステップd）において少なくとも1つのスクロース勾配遠心分離ステップを含む特定の実施形態において、遠心分離のローターのロード容量は、少なくとも40リットル、少なくとも50リットル、少なくとも60リットル又はそれ以上のウイルス回収物、又はローター1リットル当たりの「当（equivalent）」量であり、そして上記のスクロース勾配遠心分離ステップ後に得られるウイルス収率（例えばインフルエンザウイルスのHA収率）は、少なくとも65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％又はそれ以上である。

本発明の方法によれば、精製ステップ（例えばスクロース勾配超遠心分離）をウイルス分割ステップと組み合わせることが可能であり得る。特に、分割剤をスクロース勾配に添加することができる。この実施形態は、ウイルスの精製及び分割の両方を単一操作内で可能とするため、本発明の方法のステップの総数を最小限に抑えることが望ましい場合に特に好適である。従って、特定の実施形態において、少なくとも1つのスクロース勾配超遠心分離を行う場合、スクロース勾配は、分割剤をさらに含む。

或いは、本発明の方法のウイルス分割ステップを、実行する場合、バッチ式で実施する。

ウイルス精製段階の終了時に、本発明の方法によって得られたウイルス調製物を、医薬品グレード物質(例えば免疫原性組成物又はワクチン)のための工程において一般的でありさらに当業者に知られているように、滅菌ろ過に好適に供することができる。このような滅菌ろ過は、例えば、0.22μmフィルターを通して調製物をろ過することにより、好適に実施することができる。滅菌調製後、ウイルス又はウイルス抗原は、所望であれば、臨床用途用に利用できる。

免疫原性組成物、特にワクチンは、一般的に、サブビリオン形態（例えば脂質エンベロープが溶解されているか若しくは破壊されている分割ウイルスの形態）、又は1種以上の精製ウイルスタンパク質（サブユニットワクチン）の形態に製剤化することができる。別法として、免疫原性組成物は、全ウイルス(例えば、生弱毒化全ウイルス、又は不活化全ウイルス）を含んでいてもよい。

ウイルス（例えばインフルエンザウイルス）を分割する方法は、当技術分野において周知である（WO02/28422）。ウイルスの分割は、そのウイルスが感染性（野生型若しくは弱毒化型）であるか非感染性（不活化型）であるかに関わらず、破壊濃度の分割剤で全ウイルスを破壊するか又は断片化することによって行われる。分割剤は、一般的に、脂質膜を分解して溶解することができる薬剤を含む。伝統的に、分割インフルエンザウイルスは、溶媒/界面活性剤処理（例えば、トリ-n-ブチルホスフェート、又はTween（商標）と組み合わせたジエチルエーテル（「Tween-エーテル」分割として公知））を用いて製造され、この工程は一部の製造施設において依然として用いられている。現在用いられている他の分割剤として、界面活性剤又はタンパク質分解酵素又は胆汁塩（例えばデオキシコール酸ナトリウム）が挙げられる。分割剤として使用することができる界面活性剤として、カチオン性界面活性剤（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB））、他のイオン性界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（SLS）、タウロデオキシコール酸）、若しくは非イオン性界面活性剤（例えばTween又はTriton X-100）、又は任意の2種以上の界面活性剤の組み合わせが挙げられる。

一実施形態において、分割剤は、デオキシコール酸塩である。別の実施形態において、分割剤は、Triton X-100である。さらなる実施形態において、本発明による方法は、分割剤として、Triton X-100とラウリル硫酸ナトリウムとの組み合わせを用いる。

分割工程は、バッチ工程、連続工程又は半連続工程として行うことができる。バッチ式で行う場合、分割ウイルスは、クロマトグラフィーステップなどのさらなる精製ステップを必要とする場合がある。精製ステップと同時に分割を実施することができるため、分割ステップ自体を行うことは必ずしも必要ではない。例えば、上記のとおり、超遠心分離によりウイルスタンパク質を精製することを目的として、界面活性剤をスクロース勾配に添加することができる。一実施形態において、本発明による方法は、少なくとも1つの均質化ステップに加えて、界面活性剤（特にTriton X-100）を用いてバッチ式で実施する分割ステップを含む。

ワクチンの安全性のため、精製工程の様々なステップに沿ってウイルス懸濁液の感染力を低減することが必要とされる場合がある。ウイルスの感染力は、それが細胞株で複製する能力によって決定される。従って、本発明による方法は、場合により、少なくとも1つのウイルス不活化ステップを含む。不活化は、例えば、本方法の任意の好適なステップにおいて、β-プロピオラクトン（BPL）、ホルムアルデヒド、若しくはUV、又はこれらの任意の組合せを使用することによって実施することができる。1つの特定の実施形態において、本発明による方法は、少なくとも1つのBPL処理ステップをさらに含む。特定の実施形態において、本発明による方法は、少なくとも1つのBPL処理ステップと少なくとも1つのホルムアルデヒド処理ステップをさらに含む。ホルムアルデヒドとBPLは、任意の順番で連続的に使用してよく、例えば、ホルムアルデヒドをBPLの後に使用する。一実施形態において、ホルムアルデヒド処理の後、少なくとも1つの均質化ステップが続く。特に、UVを不活化法として用いる場合、UV照射前にウイルス調製物の均質化を行うことは、ウイルス不活化の効率の向上に役立ち得る。ウイルス凝集物であるかウイルス/細胞凝集物であるかに関わらず、凝集物中に存在する可能性があるウイルス又はウイルスの一部は、凝集物に埋没しているために照射から逃れる可能性があり、このため、一部のウイルス又はウイルスの一部は、不活化剤に接近することができない。一実施形態において、本発明の方法により得られるウイルス調製物は、例えばUV照射により不活化され、均質化は上記不活化の直前に実施される。ウイルス不活化の条件は変動することができ、特に、組織培養感染投与量（TCID₅₀/ml）を測定することにより残留ウイルス感染力を評価することによって決定されるだろう。

本発明の免疫原性組成物（ワクチンなど）は、場合によりワクチンに慣用される添加剤、特に、上記組成物を受容する患者において誘発される免疫応答を増加させる物質（すなわち、いわゆるアジュバント）を含み得る。

一実施形態において、本発明のウイルス又はウイルス抗原を好適な医薬担体と混合して含む免疫原性組成物が想定される。特定の実施形態において、免疫原性組成物はアジュバントを含む。

アジュバント組成物は、代謝可能な油と乳化剤を含む水中油型エマルションを含み得る。水中油型組成物がヒト投与に好適であるためには、エマルション系の油相は、代謝可能な油を含んでいなければならない。用語「代謝可能な油」の意味は、当技術分野で周知である。「代謝可能な」は、「代謝によって変換され得る」と定義することができる（Dorland’s Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 第25版（1974））。油は、受容者にとって毒性がなく、代謝によって変換することができる任意の植物油、魚油、動物油または合成油であってよい。木の実、種子、及び穀物は、植物油の一般的な供給源である。合成油も本発明の一部であり、NEOBEE（登録商標）などの市販油を包含し得る。

特に好適な代謝可能油はスクアレンである。スクアレン（2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサエン）は、サメの肝油中に大量に見られ、オリーブ油、小麦胚芽油、ぬか油、及び酵母中には比較的少量見られる不飽和の油であり、本発明において用いるのに特に好ましい油である。スクアレンは、それがコレステロール生合成の中間体であるという事実から、代謝可能な油である（Merck index, 第10版, 登録番号8619）。本発明のさらなる実施形態において、代謝可能油は、免疫原性組成物中に組成物の総体積の0.5％〜10％（v/v）の量で存在する。

水中油型エマルションは、乳化剤をさらに含む。乳化剤は、好適には、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。さらに、上記乳化剤は、好適には、ワクチンまたは免疫原性組成物中に、組成物の総体積の0.125〜4％（v/v）存在する。

本発明の水中油型エマルションは、場合によりトコールを含む。トコールは、当技術分野で周知であり、EP0382271に記載されている。好適には、トコールは、α-トコフェロール又はその誘導体、例えばα-トコフェロールスクシネート（ビタミンEスクシネートとしても知られる）であってよい。上記のトコールは、好適には、アジュバント組成物中に、免疫原性組成物の総体積の0.25％〜10％（v/v）の量で存在する。

水中油型エマルションの製造方法は、当業者に周知である。一般的に、この方法は、油相（場合によりトコールを含む）とPBS/TWEEN80(商標)溶液などの界面活性剤とを混合した後、ホモジナイザーを用いて均質化するステップを含み、当業者には、少量の液体を均質化するには、シリンジ針を通して混合物を2回通過させることを含む方法が好適であることが明らかであろう。同様に、当業者であれば、マイクロフルイダイザー（M110S Microfluidics装置、最大50回通過、6バールの最大圧入力（約850バールの出力圧）で2分間）中の乳化工程を少量または大量のエマルションを製造するために適合させることができるだろう。適合化は、所要の直径の油滴を有するように調製が達成されるまで、結果として得られるエマルションの測定を含む日常的な実験により達成することができるだろう。

水中油型エマルションにおいては、油及び乳化剤は水性担体中に存在する。水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であってよい。

特に、本発明の水中油型エマルション系は、サブミクロン範囲の小さな油滴サイズを有する。好適には、液滴サイズは直径で120〜750nmの範囲内、さらに特に120〜600nmのサイズの範囲内にあるだろう。なおさらに特には、水中油型エマルションは、少なくとも70強度％（％ by intentisy）の油滴が直径500nm未満であり、さらに特に少なくとも80強度％の油滴が直径300nm未満であり、さらに特に少なくとも90強度％の油滴が直径120〜200nmの範囲にある油滴を含有する。

本発明における油滴サイズ(すなわち直径)は強度によって示される。油滴サイズの直径を強度によって決定するためのいくつかの方法がある。強度は、サイジング装置の使用により、好適にはMalvern Zetasizer 4000、又は好適にはMalvern Zetasizer 3000HSなどの動的光散乱によって測定される。詳細な手順は、実施例II.2に示されている。第1の可能性は、動的光散乱（PCS-光子相関分光法）によるz平均直径（ZAD）の決定である；この方法は、多分散性指数（PDI）をさらに与え、ZAD及びPDIはいずれもキュムラントアルゴリズムによって算出される。これらの値は粒子屈折率の知識を必要としない。第2の手段は、別のアルゴリズム（Contin若しくはNNLSのいずれか）、又は自動「Malvern」アルゴリズム（サイジング装置によって提供されるデフォルトアルゴリズム）によって全粒子サイズ分布を決定することにより、油滴の直径を算出することである。大体の場合、複合体組成物の粒子屈折率は未知であるため、強度分布のみを考慮に入れ、必要であれば、この分布に由来する強度平均も考慮に入れる。

アジュバント組成物は、Toll様受容体（TLR）4アゴニストをさらに含み得る。「TLR4アゴニスト」という用語は、直接リガンドとして、又は間接的に内因性リガンド若しくは外因性リガンドの生成を通して、TLR4シグナル伝達経路を介したシグナル応答を引き起こすことができる成分を意味する（Sabroeら, JI 2003 p1630-5）。TLR4は、リピドA誘導体、特にモノホスホリルリピドA、又は特に3脱アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）であり得る。

3D-MPLは、GlaxoSmithKline Biologicals North Americaにより商標MPL（登録商標）の下に入手可能であり、主としてIFN-g（Th1）表現型を有するCD4+T細胞応答を促進する。3D-MPLは、GB 2 220 211 Aに開示される方法によって製造することができる。化学的には、3D-MPLは、3、4、5又は6個のアシル化鎖を有する3脱アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。特に、本発明のアジュバント組成物においては、小粒子3D-MPLが用いられる。小粒子3D-MPLは、0.22μmフィルターを通して滅菌ろ過され得るような粒子サイズを有する。このような調製物は国際特許出願WO 94/21292号に記載されている。リピドAの合成誘導体は公知であり、限定するものではないが、
OM174 （2-デオキシ-6-o-[2-デオキシ-2-[（R）-3-ドデカノイルオキシテトラ-デカノイルアミノ]-4-o-ホスホノ-β-D-グルコピラノシル]-2-[（R）-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-α-D-グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート）、（WO 95/14026）
OM 294 DP （3S,9R）-3--[（R）-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9（R）-[（R）-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1,10-ビス（ジヒドロゲノホスフェート） （WO 99/64301及びWO 00/0462）
OM 197 MP-Ac DP （3S-,9R）-3-[（R）-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[（R）-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1-ジヒドロゲノホスフェート 10-（6-アミノヘキサノエート） （WO 01/46127）
などのTLR4アゴニストであると考えられる。

使用し得る他のTLR4リガンドは、アルキルグルコサミニドホスフェート（AGP）（例えばWO 9850399又はUS 6303347に開示されるAGP（AGPの製造方法も開示される））、又はUS 6764840に開示されるようなAGPの製薬上許容される塩である。一部のAGPはTLR4アゴニストであり、また一部のAGPはTLR4アンタゴニストである。いずれもアジュバントとして有用であると考えられている。さらに、更なる好適なTLR4アゴニストは、US2003/0153532及びUS2205/0164988に開示されている。

本発明は、インフルエンザウイルス免疫原性組成物（例えばワクチン）を調製するために特に適している。現在、様々な形態のインフルエンザウイルスが入手可能である。これらは、一般的に、生ウイルス又は不活化ウイルスのいずれかに基づく。不活化ワクチンは、全ビリオン、分割ビリオン又は精製表面抗原（HAを含む）に基づき得る。インフルエンザ抗原はまた、ビロソーム（無核酸ウイルス様リポソーム粒子）の形態で提供されてもよい。

ウイルスの不活化方法及び分割方法は、上記に記載されており、インフルエンザウイルスに適用することができる。

ワクチンにおいて使用するためのインフルエンザウイルス株は、季節により変化する。現在の大流行間期において、ワクチンは、典型的には2種のインフルエンザA株と1種のインフルエンザB株を含む。三価ワクチンが典型的であるが、本発明においては、四価などのより高い価数も想定される。本発明はまた、流行株（すなわち、ワクチン受容者及び一般的なヒト集団が免疫学的に未感作な株）に由来するHAも使用することが可能であり、流行株に対するインフルエンザワクチンは、一価であってもよいし、流行株を追加した通常の三価ワクチンに基づいていてもよい。

本発明の組成物は、インフルエンザAウイルス及び／又はインフルエンザBウイルスなどの1種以上のインフルエンザウイルス株に由来する抗原（1種又は複数種）を含み得る。特に、本発明では、2種のインフルエンザAウイルス株及び1種のインフルエンザBウイルス株に由来する抗原を含む三価ワクチンが想定される。或いは、2種のインフルエンザAウイルス株及び2種のインフルエンザBウイルス株に由来する抗原を含む四価ワクチンもまた、本発明の範囲内である。

本発明の組成物は、一価組成物（すなわち、1種の株型のみ、つまり季節株のみか又は流行株のみを含む組成物）に限定されない。本発明はまた、季節株及び／又は流行株の組み合わせを含む多価組成物も包含する。特に、アジュバント添加しても良い、3種の季節株及び1種の流行株を含む四価組成物は本発明の範囲内に入る。本発明の範囲内に入る他の組成物は、2種のA株及び1種のB株（例えばH1N1株、H3N2株及びB株）を含む三価組成物、並びに異なる系統の2種のA株及び2種のB株（例えば、H1N1、H3N2、B/Victoria及びB/Yamagata）を含む四価組成物である。

HAは、現在の不活化インフルエンザワクチンにおける主な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にはSRDによって測定されるHAレベルを参照することによって標準化される。既存のワクチンは、典型的には、1株当たり約15μgのHAを含むが、例えば子供に対して、又は流行状況において、又はアジュバントを使用する場合、より低い用量を使用することができる。より高い用量、特に3x用量又は9x用量が使用されてきたのと同様に、１／2（すなわち、1株当たりHA 7.5μg）又は１／4などの分割用量が使用されてきた。従って、本発明の免疫原性組成物は、インフルエンザ1株当たり0.1〜150μgのHA、特に、0.1〜50μg、例えば、0.1〜20μg、0.1〜15μg、0.1〜10μg、0.1〜7.5μg、0.5〜5μg等のHAを含み得る。特定の用量は、1株当たり約15、約10、約7.5、約5μg、1株当たり約3.8μg及び1株当たり約1.9μgを含む。

インフルエンザウイルスを特定の株について精製したら、それを他の株に由来するウイルスと組み合わせて、例えば上記の三価ワクチンを作製することができる。ウイルスを混合してDNAを分解し、それを多価混合物から精製するよりもむしろ、各株を別々に処理して一価バルクを混合し、最終多価混合物を得ることがより好適である。

本発明は、以下の非限定的実施例を参照することによってさらに記載される。

実施例I：高い体積電力を用いたインフルエンザウイルス製造
EB66（登録商標）細胞を、200Lの使い捨てバイオリアクター（ピッチブレードインペラー又は適切な場合にはラシュトンタービンを含む、Sartorius AG社製のCultibag STR）に、約0.4x10⁶個/mlの密度にて65Lの総体積で播種し、バッチ様式の懸濁液中で、少なくとも30W/m³の体積電力入力の適用に対応する105rpm（No.039、No.048、No.052、No.058、No.044、No.046及びNo.043）、又は少なくとも120W/m³の体積電力入力の適用に対応する135rpm（No.053及びNo.057）、又は少なくとも7W/m³の体積電力入力の適用に対応する65rpm（No.025、No.026、No.027及びNo.031）の撹拌速度で36.5℃で増殖させた。少なくとも30W/m³の体積電力入力は、ピッチブレードインペラーを含む使い捨てバイオリアクターを使用して得られたが、少なくとも120W/m³の電力入力は、ラシュトンタービンを含む使い捨てバイオリアクターを使用して得られた。

3日間の増殖後、細胞密度は少なくとも9x10⁶個/mlに達した。この時点で、細胞に、1x10^-5の感染多重度（MOI）のH5N1インフルエンザウイルス及びトリプシン（30mrPu/ml TrpLE、Invitrogen社製）を含む溶液を接種し、この日を0日目（D0）と考え、温度を35℃に切り替えた。接種の1時間30分後、接種された細胞懸濁液を、新鮮な培地を200Lの総量まで添加することによって3倍希釈に供した。上記の1時間30分の時間中、体積電力入力を7W/m³に低下させるか（No.039、No.048、No.052、No.058、No.044、No.046、No.043、No.053及びNo.057）、又は7W/m³に維持した（No.025、No.026、No.027及びNo.031）。

接種された細胞を希釈した直後、体積電力入力を少なくとも30W/m³（No.039、No.048、No.052、No.058、No.044、No.046及びNo.043）、又は少なくとも120W/m³（No.053及びNo.057）まで再度増加させ、ウイルス含有培養培地を回収するまでこのレベルで維持するか、又は7W/m³に維持し（No.025、No.026、No.027及びNo.031）、ウイルス接種の5日後、このようにしてウイルス回収物を生成した。トリプシン（10mrPu/ml TrpLE、Invitrogen社製）を、ウイルス接種後1日目（D1）及び4日目（D4）に更に添加した。

その後、ウイルス回収物を以下に記載されるとおりに精製した。

実施例II：高い体積電力が精密ろ過に与える影響
一旦回収したら、ウイルス回収物を、10,500rpmで90L/hの連続遠心分離により予備清澄化し、予備清澄化したウイルス回収物を生成した。

次いで、予備清澄化した回収物を、0.45μmフラットシート膜（Sartorius AG社）を用い、一定のTMP（膜貫通圧力（Trans Membrane Pressure））及び供給速度（それぞれ3psi及び600L/m²/h）での精密ろ過ステップに供し、清澄化したウイルス回収物を生成した。

インフルエンザウイルス収率を、精密ろ過ステップにおいて、以下の実施例IVに記載されるとおり、SRDアッセイにより上記ステップの前後にHA含有量を測定することによって評価した。結果は、出発物質中に存在する（すなわち、精密ろ過前の予備清澄化したウイルス回収物中に存在する）全HA量を表す対照値100%と比較したパーセントの形式で表1に示される。

結果 - 結論
細胞培養段階における体積電力入力の増加（30W/m³対7W/m³）は、回収されたウイルス回収物中に存在するHA収率に何も影響を与えなかったが（表1、第4カラム「D5 piにおけるウイルス製造」を参照）、その後の精密ろ過ステップにおいて得られたHA収率についてプラスの影響が観察された。体積電力入力がより高い場合に精密ろ過後に得られるHA収率がより高いだけでなく（それぞれの「平均」の行を参照）、実験間で得られる値もまた、より一貫性があり且つ変動が少ない（それぞれの「Std Dev」の行を参照-体積電力入力が30又は7の場合、それぞれ6対25）。これらの結果は、上流の細胞培養段階におけるより高い体積電力が、下流のウイルス精製段階における改善され且つより一貫性のあるHA収率をもたらすことを示している。

実施例III：高い体積電力がスクロース勾配超遠心分離に与える影響
上記の実施例Iに記載したように、細胞を増殖させ、H5N1インフルエンザウイルスに感染させ、ウイルスを回収した。

ウイルス回収物を予備清澄化し、実施例IIに記載したように、予備清澄化した回収物を精密ろ過に供した。

次いで、清澄化したウイルス回収物を、ポリスルホン製の750kD中空糸膜（GE Healthcare社）による限外ろ過によって10倍濃縮し、一定のTMP（膜貫通圧力（Trans Membrane Pressure））及び供給速度（それぞれ3psi及び35L/m²/h）で、125mMクエン酸塩（pH7.4）を含有する5体積のPBSに対して透析ろ過した。

その後、限外ろ過の保持液をスクロース勾配超遠心分離ステップに供し、ここでウイルス及び夾雑物は、それらの各密度に達するまで勾配中に移行する。インフルエンザウイルスは約1.19g/cm³の密度を有し、このためスクロース濃度がウイルス密度と等しい勾配（約43%スクロース）中で沈降する。遠心分離のローターにおける0〜55%スクロースの連続線形勾配の形成後、限外ろ過保持液を、表2及び表3に示されるとおり、上記ローターに、ローター1L当たり回収物30L（No.039、No.043、No.032、No.033、No.028及びNo.029）、又はローター1L当たり回収物50〜60L（No.044A、No.044B、No.046、No.048、No.025、No.026、No.027、No.031）に対応する保持液当量のロード容量でロードした。全サンプルをロードすると、1時間のバンディング時間でウイルスをスクロース勾配中のその密度に到達させて濃縮することが可能となり、その後遠心分離を停止し、スクロース勾配をアンロードして分画した。ウイルス粒子を数個の画分に濃縮した。生成物画分は、125mMクエン酸塩とスクロースを含有するPBS（pH7.4）中に存在していた。精製した全ビリオンを、約30〜50%の範囲のスクロースのパーセンテージからプールした。この範囲は、SDS-PAGEから得られたプロファイル及び抗HA抗体を用いたウェスタンブロット分析から得られたプロファイルに基づいて決定された。

インフルエンザウイルス収率を、スクロース勾配超遠心分離ステップにおいて、以下の実施例IVに記載されるとおり、SRDアッセイにより上記ステップの前後にHA含有量を測定することによって評価した。結果は、出発物質中に存在する（すなわちスクロース勾配超遠心分離前の限外ろ過保持液中に存在する）全HA量を表す対照値100%と比較されるパーセントの形式で、表2及び表3に示される。

上記に示されるロード容量（30）は、遠心分離のローター1リットル当たりにロードした、本発明の方法のステップc）において回収した限外ろ過保持液当量のウイルス回収物（リットル）に対応する。

結果 - 結論
ローター1L当たり回収物30Lのロード容量において、スクロース勾配超遠心分離後に得られる平均HA収率は、体積電力入力が7V/m³であるか30V/m³であるかに関わらず、同じ許容範囲内（すなわち72〜82％）にある。

上記に示されるロード容量（50又は60）は、遠心分離のローター1リットル当たりにロードした、本発明の方法のステップc）において回収した限外ろ過保持液当量のウイルス回収物（リットル）に対応する。

結果 - 結論
ローター1L当たり回収物50〜60Lのより高いロード容量においては、体積電力入力が7V/m³である場合（すなわち低い体積電力入力において）、スクロース勾配超遠心分離後に得られた平均HA収率は、同様の低い体積電力入力を用いてローター1L当たり回収物30Lのロード容量で得られたHA収率（表2参照、82%）とは反対に、顕著に低下した（表3参照、31%）。対照的に、体積電力入力を30V/m³まで増加させた場合、ローター1L当たり回収物50〜60Lのより高いロード容量においてスクロース勾配超遠心分離後に得られた平均HA収率は、同じ許容範囲に維持された（表3参照、71%）。これは、細胞培養段階における体積電力入力の増加（30W/m³対7W/m³）によって、同じ許容範囲のHA収率を保ちながら、スクロース勾配超遠心分離ステップに使用されるローターに2倍多い回収物容量、又は回収物容量当量をロードすることを可能となることを示している。遠心分離のロード容量は、大規模に操作するために必要とされる遠心分離の回数に直接影響を与える。ロード容量が高いほど、必要とされる遠心分離の回数は低い。

実施例IV：HA含有量を測定するために使用されるSRD法
ガラスプレート（12.4〜10cm）に、NIBSCにより推奨される濃度の抗インフルエンザHA血清を含有するアガロースゲルをコーティングした。ゲルを固定した後、72個のサンプルウェル（3mm直径）をアガロースにパンチした。10μlの参照及びサンプルの適切な希釈物をウェルにロードした。湿潤チャンバー中で、プレートを室温（20〜25℃）で24時間インキュベートした。その後、プレートをNaCl溶液に一晩浸し、蒸留水で簡単に洗浄した。次いで、ゲルをプレスして乾燥させた。完全に乾燥させると、プレートをクーマシーブリリアントブルー溶液で10分間染色し、明らかにはっきりとした染色帯域が目に見えるようになるまで、メタノールと酢酸の混合液中で2回脱染した。プレートを乾燥させた後、抗原ウェルを取り囲む染色帯域の直径を、直交する2方向で測定した。或いは、表面を測定する機器を使用することができる。表面に対する抗原希釈物の用量応答曲線を構築し、結果を、標準傾斜比アッセイ法（Finney, D.J. （1952）. Statistical Methods in Biological Assay. London：Griffin, Quoted in： Wood, JMら （1977）. J. Biol. Standard. 5, 237-247）に従って算出した。

Claims (28)

1. 細胞培養中でのウイルスの製造方法であって、少なくとも以下のステップ：
   ａ）細胞培養培地中に細胞集団を提供し、
   ｂ）ｉ．集団にウイルスを接種し、そして
   ｉｉ．接種された集団をインキュベートしてウイルスの複製及び増殖を可能とする
   ことによって細胞集団を感染させ、
   ｃ）生成したウイルスを回収し、それによってウイルス回収物（viral harvest）を提供し、そして
   ｄ）ウイルスを精製する
   を含み、少なくともステップｂ）において、少なくとも15W/m³、少なくとも30W/m³、少なくとも60W/m³、少なくとも100W/m³、又は少なくとも120W/m³の体積電力入力（volumetric power input）を細胞培養物に与える、前記方法。
2. 前記体積電力入力をステップａ）及びステップｂ）において細胞培養物に与える、請求項１記載の方法。
3. 細胞集団にウイルスを接種する前に、細胞の細胞密度が少なくとも8x10⁶個／ml、少なくとも9x10⁶個／ml、少なくとも10x10⁶個／ml、少なくとも11x10⁶個／ml、少なくとも12x10⁶個／ml、又は少なくとも13x10⁶個／mlに達する、請求項１又は２記載の方法。
4. ステップｂ）において、ステップｉ．の接種された細胞を、ウイルスを接種した直後に2〜5倍の範囲の倍率で希釈し、更なるインキュベーションに供する、請求項３記載の方法。
5. ステップｂ）において、ステップｉ．の接種された細胞を、ウイルスを接種した直後に3x10⁶個／ml〜5x10⁶個／mlの範囲の細胞密度が得られるように希釈し、更なるインキュベーションに供する、請求項３記載の方法。
6. ステップｂ）において、接種された細胞を2〜5倍の範囲の倍率で希釈し、更なるインキュベーションに供する前に、ウイルスを接種後30分間、45分間、1時間、1時間30分、又は2時間インキュベートする、請求項３記載の方法。
7. ステップｂ）において、接種された細胞を3x10⁶個／ml〜5x10⁶個／mlの範囲の細胞密度が得られるように希釈し、更なるインキュベーションに供する前に、ウイルスを接種後30分間、45分間、1時間、1時間30分、又は2時間インキュベートする、請求項３記載の方法。
8. ステップｂ）において、細胞の接種後、接種された細胞を希釈するまで体積電力入力を2〜10W/m³、4〜8 W/m³、又は7W/m³に低下させ、そのレベルに維持する、請求項６又は７記載の方法。
9. ステップｂ）においてトリプシンを細胞に添加する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. トリプシンをウイルスの接種と同時に添加する、請求項９記載の方法。
11. 接種後１日目（D1）及び／又は4日目（D4）にトリプシンを更に添加する、請求項１０記載の方法。
12. トリプシンを、ウイルス接種後、生成したウイルスをステップｃ）で回収するまで毎日更に添加する、請求項１０記載の方法。
13. ステップｃ）の生成したウイルスをウイルス接種の2日後〜10日後の間に回収する、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
14. ウイルス精製ステップｄ）が、ウイルス回収物の清澄化、限外ろ過／透析ろ過、超遠心分離及びクロマトグラフィー、又はこれらの任意の組合せから選択される少なくとも1つのステップを含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
15. ウイルス精製ステップｄ）が少なくともウイルス回収物の清澄化のステップを含む、請求項１４記載の方法。
16. ウイルス回収物を精密ろ過によって清澄化する、請求項１５記載の方法。
17. ウイルス精製ステップｄ）が、スクロース勾配超遠心分離の少なくとも１つのステップを含む、請求項１４〜１６のいずれか１項記載の方法。
18. ウイルス精製ステップｄ）がウイルス不活化のステップを含む、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
19. ウイルス不活化ステップが、β-プロピオラクトンを用いて実施される、請求項１８記載の方法。
20. ウイルス精製ステップｄ）が分割（splitting）ステップを含む、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法。
21. 精製ウイルスをワクチンに製剤化するステップを更に含む、請求項１〜２０のいずれか１項記載の方法。
22. ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１〜２１のいずれか１項記載の方法。
23. インフルエンザウイルスが、H2、H5、H6、H7又はH9亜型である、請求項２２記載の方法。
24. インフルエンザウイルスが、H1、H3又はB亜型である、請求項２２記載の方法。
25. 細胞が哺乳類又は鳥類の細胞である、請求項１〜２４のいずれか１項記載の方法。
26. 細胞が懸濁液中で増殖する、請求項１〜２５のいずれか１項記載の方法。
27. 細胞がEB66（登録商標）細胞である、請求項１〜２６のいずれか１項記載の方法。
28. 請求項１〜２７のいずれか１項記載の方法に従って得られたウイルスを、製薬上許容される担体と混合するステップを少なくとも含む、ワクチンの調製方法。