JP2007254482A - バキュロウイルスベクター発現系におけるタンパク質の発現 - Google Patents

Abstract

【課題】バキュロベクターウイルス発現系においてタンパク質抗原の発現を増加するためのワクチン製造方法の提供。
【解決手段】下記工程を含む古典的ブタ熱ウイルスＥ２バキュロウイルスタンパク質を含むワクチンの製造方法。当該タンパク質をエンコードする組換えバキュロウイルを選択する工程、少なくとも２リットルの十分な容量を備える培養容器において増殖培地中で昆虫細胞を増殖する工程、１×１０⁵〜１×１０⁶個／ｍｌの密度の当該細胞を０．０１未満のＭＯＩにて当該バキュロウイルスの接種物で感染する工程、前記細胞の約半分以上が細胞変性効果を示すまで前記細胞を培養し、増殖培地中のＥ２たんぱく質の最終濃度が１００〜３００μｇ／ｍｌのときに、細胞性物質を除去する工程、免疫アフィニティ精製することなく、ワクチンを調製する工程。当該製造法はさらに、組換え卵胞刺激ホルモンの製造に適用可能である。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

本発明は、バキュロウイルスベクター発現系においてタンパク質またはポリぺプチドの発現を増加するための方法に関する。組換えＤＮＡ技術が開発されたとき、遺伝子改変された細菌を使用する大規模のタンパク質生成に関して期待が高かった。しかし、大多数の商業的に魅力的なタンパク質は、それらが生物学的に活性なタンパク質になり得る前に翻訳後修飾を必ず受ける。したがって、動物細胞が、組換えタンパク質を生成するために現在より頻繁に使用される。

動物細胞の中で、昆虫細胞は組換えタンパク質の生成のために益々重要である。昆虫細胞を使用する簡便なおよび用途の広いバキュロウイルスベクター系が開発された。昆虫細胞の生理学に対する情報はかなり少ないが、バキュロウイルス組換え技術を介して生成されるワクチンは一般に十分に受容される。１つの例は、臨床試行において可能なＡＩＤＳワクチンとしてのヒト免疫不全ウイルスＩ型の、バキュロウイルスにより発現されるｇｐ１６０エンベロープタンパク質の使用である。

現在まで、昆虫細胞におけるバキュロウイルスにより発現されるタンパク質の大規模の生成は、約１０リットルまでのバイオリアクターに制限される。規模を大きくするために、懸濁培養は最も良好な可能性を提供する。大規模生成において（Tramperら、Rec. Adv. Biotech.、１９９２、２６３〜２８４；PowerおよびNielsen、Cytotechnology ２０：２０９〜２１９、１９９６を参照のこと）、特別な重要視が細胞増殖およびウイルス生成を影響する因子に与えられるべきである。このような因子の変化は、組換えタンパク質の生成の最終的なレベルを大きく影響する。

バキュロウイルスは、閉塞体中に一般に閉塞される桿状ウイルス粒子により特徴付けられる。

バキュロウイルスは、閉塞体中に一般に閉塞される桿状ウイルス粒子により特徴づけられる（多角体としてまた呼ばれる）。バキュロウイルス科は、閉塞ウイルス：核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）および顆粒症ウイルス（ＧＶ）の２つの属を含有する真正バキュロウイルス、ならびに非閉塞ウイルスを含有するヌードバキュロウイルス亜科の２つの亜科に分けられる。Autographa californica（Ac）ＮＰＶの細胞および分子生物学がより詳細に研究された。

多くのタンパク質が、そのタンパク質をコードする組換えバキュロウイルスで感染された昆虫細胞において発現されてきた。コードすることは、このようなウイルスが非相同タンパク質をコードする核酸配列を提供され、そしてしばしば、プロモーターのような調節核酸配列をさらに提供されることを意味する。最も頻繁には、ポリヘドリンプロモーターが外来遺伝子を発現するために使用されるが、p１０プロモーターは等しく十分に適切であり、そして同様に使用される。

いくつかの細胞株が、組換えバキュロウイルスでの感染に利用可能である。細胞株ＳＦ−２１は、アワトウヨウの幼虫（Spodoptera frugiperda）の卵巣組識に由来した。アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＣＲＬ １７１１）から利用可能であるクローン単離物のＳＦ−９は、組換えウイルスのインビトロ生成のためのおおむね標準的な細胞株であり、そして組換えウイルスを生成することにおいて優れていると言われる。他の細胞株は、たとえば、Ｈｉ−Ｆｉｖｅ細胞株ならびにイラクサキンウワバ（Trichoplusia ni）から得られるＴｎ−３６８およびＴｎ−３６８Ａ細胞株である。昆虫細胞が増殖する最も広範に使用される培地としては、ＴＮＭ−ＦＨ、ＢＭＬ−ＴＣ/１０、およびＩＰＬ-４１が挙げられる。これらの培地は、通常、哺乳動物血清、特に胎児ウシ血清のようなおおむね規定された成分で補充される。血清置換はまた、昆虫細胞培養に適用されており、そしてＥｘ−Ｃｅｌｌ ４００（商標）およびＳｆ９００のような血清非含有培地が市販される。

昆虫細胞は一般に固体支持体上でおよび懸濁液中で増殖するが、固体支持体上で増殖される場合にウイルスのより高い収量を与えることが報告される。感染は、細胞が指数関数増殖期において感染される場合に最も効果的であるが、細胞当たりの生成される多角体およびウイルスの量は、細胞周期の異なる段階で感染された細胞間で有意に変化しない。細胞密度は、ウイルス生成に対して大きな影響を有する。昆虫細胞は接触阻害の形態を示し得、より高い細胞密度で減少されたウイルス生成を生じる。

初回感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）は、細胞当たりの感染性ウイルスの数であり、一般に感染の終了時での感染された細胞の画分および細胞当たりの多角体の数の両方に影響する。ウイルス生成についての至適なｍ．ｏ．ｉ．は一般に、約２０〜３０であると考えられる。β-ガラクトシダーゼを発現する組換えバキュロウイルスでの研究（LicariおよびBailey、Biotech.Bioeng.、３７：２３８〜２４６、１９９１）において、Ｓｆ−９細胞は、０と１００との間のｍ．ｏ．ｉ．値で感染された。β-ガラクトシダーゼの収量は増加され、そして細胞密度は、ｍ．ｏ．ｉ．の増加とともに減少した。ｍ．ｏ．ｉ．を増加することおよび減少することは、感染された細胞当たりの組換えタンパク質の最大に達成可能な収量に対して制限された効果のみを有すると一般に考えられる。しかし、低いｍ．ｏ．ｉ．を選択することは、感染に必要なウイルスストックの減少を許容し、そしてバキュロウイルスの欠陥妨害粒子の生成の危険性を最小にする。昆虫細胞のバッチ培養が高いｍ．ｏ．ｉ．（＞５）で感染される場合、次の感染プロセスは本質的に同時進行される（すなわち、全ての細胞は、同時に感染周期を経る）。細胞がバッチ培養においてｍ．ｏ．ｉ.１〜５で感染される場合、培養物はもはや同時進行されない。全ての細胞が感染されそして所望のタンパク質の生成が終わるまで、培養物は、最初は非感染細胞と個々の感染周期における異なる時点の細胞とからなる。一般的にはこのような培養物において生成レベルははるかに低い。培養物の挙動は、それぞれ生成の異なる相にある個々の細胞の組み合わせの挙動であり；至適な状態に及ばない生成レベルを説明する。連続的な培養において、非感染細胞が連続的に添加され、そして培養物は明らかに非同時進行的に感染される。

数学的モデルの設計を介して、低いｍ．ｏ．ｉ．で細胞を感染する場合または連続的な培養系中でウイルスを増殖する場合に観察される挙動のような複雑な挙動を予測することが可能であると考えられる。同じ現象についての純粋に経験的な分析は、不可能でないにしても非常に困難であると考えられる。現在、３つのモデル、Licari & Baileyモデル、de Gooijerモデル、およびPower & Nielsenモデルが知られる。これらは、それらの複雑性およびそれらを詳しく開発した努力にもかかわらず、全て第１世代のモデルであり、ポリヘドリンプロモーターの制御下で発現されるモデル組換えタンパク質（β-ガラクトシダーゼ）を発現するバキュロウィルスの挙動について推論する。これらは、大部分、DNAおよびRNA集積ならびに感染周期を無視して、ブラックボックス系としてみる場合、バキュロウイルスと昆虫細胞との間の相互作用についての本発明者らの定量的な理解をまとめる。結合および最初の感染プロセスはなお、定量的に十分には理解されておらず、この分野におけるさらなる研究が非常に必要とされる。

バキュロウイルス発現系は、組換えタンパク質の生成のための強力な道具を提供する。いくつかの細胞培養配置が、大規模生成のために使用され得る。しかし、これらの系は、それらの可能性の十分な利点を採用するためにさらなる至適化を必要とする。商業的な適用について、大規模および低コストの生成が極めて重要である。大規模細胞培養において報告される多角体生成系は、価格競合製品についての商業的要求を満たすために劇的に改善されるべきである。

本発明は、所望のタンパク質の増加されたまたは改善された収量を許容する、バキュロウイルス発現系を使用する大規模で組換えタンパク質を生成するための方法を提供する。本発明は、昆虫細胞培養物において、組換えタンパク質を生成するおよび組換えタンパク質の収量を改善するための方法を提供し、当該タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスを選択する工程、培養容器において増殖培地中で昆虫細胞を増殖する工程、および０．０１未満の感染多重度で細胞を感染する工程を包含する。

好ましい実施態様において、本発明は昆虫細胞培養物において生成される組換えタンパク質の収量を増加するための方法を提供し、当該タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスを選択する工程、培養容器において増殖培地中で昆虫細胞を増殖する工程、および０．０１未満の感染多重度を用いて少なくとも１つのバキュロウイルスの接種物で細胞を感染する工程を包含する。漸増する収量は、いくつかの研究グループの主題である。たとえば、Chenら（Drug metabolism and Disposition：２４ ３９９〜４０５頁、１９９７）は、同時感染アプローチのためにＭＯＩを至適化する可能性を研究し、これによって２つの異なるバキュロウイルス発現タンパク質が昆虫細胞培養物において生成された。本明細書中に記載される結果と反対に、彼らは、彼らの２つのタンパク質について約０．０１５〜０．０３の最も良好なＭＯＩを見出した。ＭＯＩを０．０１未満に減少することにより、Chenらの同時感染系の収量は減少した。Radfordら（Cytotechnology ２４、７３〜８１、１９９７）は、同時感染系を研究することによって妨げられず、１よりも大きいＭＯＩが常に最終的なプロセス収量を最大にするために使用されるべきであることを明らかに示し、本発明の知見に反対することを再度教示する。彼らは、低いＭＯＩを使用して細胞当たりより大きな量のタンパク質およびウイルスを生成することは不可能であることを述べ、そしてその代わりに感染時間（ＴＯＩ）を調節することを示唆する。

Nguyenら（J.Biotech.３１、２０５〜２１７、１９９３）のように他は、ＭＯＩの変化における解決を見出さないが、流加培養法を適用することによって収量を増加することにねらいを向けるか、またはウイルスが増殖する温度を変化し（Wuら、Cytotechnology、９、１４１〜１４７、１９９２；Kingら、Biotechnol. Bioeng、３８、１０９１〜１０９９、１９９１）、そして０．０１未満のＭＯＩ下でのウイルスの増殖を回避する。

これらの初期の結果は、本明細書中の記載において提供される結果とは明らかに異なり（たとえば図１を参照のこと）、本明細書中の記載において培養物は０．０１未満（たとえば、０．００３、０．００１、またはさらに０．０００１）のＭＯＩで感染され、０．０１または０．１のＭＯＩで感染される培養物よりも高い収量を達成する。

本発明の好ましい実施態様は、単層培養において増殖されない昆虫細胞培養物において組換えタンパク質を生成するおよび組換えタンパク質の収量を改善するための方法を提供する。小量でバキュロウイルス発現ベクター系においてタンパク質を生成するための従来の実験室の方法は、培養フラスコ中の昆虫細胞の単層培養物を使用する。これらの静置培養物は、同時進行性の感染を確実にするために、通常、高いＭＯＩで感染される。単層がコンフルエントになる前に全ての細胞が感染されることが極めて重要である。なぜなら、接触阻害が細胞中の代謝変化に導き、これが最終産物の収量を影響し得るからである。単層培養物中の細胞密度を正確に確立することは困難であるので、ＭＯＩ実験を行うことは不可能である。培養物を感染するために低いＭＯＩ（０．０１未満）を使用することはさらにより役に立たない。感染時の細胞密度の過剰評価および過小評価の両方は、有意に至適な状態に及ばないタンパク質の収量を導く。日常的に、高いＭＯＩを使用し、これは全細胞集団の同時進行性の感染を保証する。このことは、至適な収量を達成するために、大量のウイルスストックが単層培養物を感染するために必要とされることを意味する。

単層培養物を使用するタンパク質生成の規模拡大は、より多くの組織培養フラスコを使用することを単に意味する。単層培養物を使用する大量のタンパク質の生成は、非常に労働集中的である。さらに、溶解された酸素濃度およびｐＨのような重要な培養パラメーターを調節および／またはモニタすることは可能でない。

本発明は今や、全ての昆虫細胞培養物に適切な方法を提供する。本発明は、低いＭＯＩが単層培養物以外の昆虫培養物における収量を至適化するために有益であるという洞察を提供する。

異なるタイプの培養容器が、単層培養以外において昆虫細胞を培養するために使用され得る。全ての発酵器設計の目的は、十分な通気および高い細胞密度を達成するが、可能な限り低い剪断力を維持することである（Tramperら、Recent advantages in biotechnology（Vardar-SukanおよびSukan編 １９９２）。文献において記載される大多数の場合において、気体噴霧器を備えた攪拌タンクバイオリアクターが使用される。このタイプの容器において、均一性が回転翼を使用することによって達成される。このタイプの発酵器は、異なる方法において操作され得る。先ず第１に、バッチ法である。これは、最も簡単なおよび単純な方法である。細胞が培養され、ウイルスが添加され、そして産物が感染の終了時に採集される。より複雑な方法は、流加培養法である。栄養素の濃縮混合物が培養容器に添加され、より高い細胞密度およびより高い容量の産物収量が達成される（Nguyenら、１９９３ Journal of Biotechnology 第３１巻、２０５〜２１７頁）。これは制限される栄養素がなんであるのか常には明らかでないので、より複雑化される。１つの栄養素制限をこの基質を添加することによって取り消すことにより、別の基質制限が直接的に導かれ得、したがって必ずしもより高い産物収量が導かれないかもしれない。

混合する異なる方法が、空中補給バイオリアクターにおいて使用される（Wuら、１９９２ Cytotechnology 第９巻 １４１〜１４７頁）。このタイプの容器は２つのシリンダからなる。最も小さな直径を備えるシリンダ（ドラフト管）は、より大きな直径を備えるシリンダ（降下管）の内側に配置される。中央のシリンダにおいて空気および別の気体が散布され、上昇流を作製する。発酵器の上部で、気体は液体を残し、そして液体は中央のシリンダの外側を下がる。この方法において、通気および均一性の両方が、ドラフト管および降下管における密度の差異に起因して気体のみの噴霧を使用することによって達成される。この方法は、ずり応力を減少し得る。しかし、連続的な通気速度が、正確な混合を達成するために必要とされる。

発酵器中の生存細胞密度を増加するための別の方法は、スピンフィルタまたは別の細胞保持デバイスを含むことによる。これは灌流と呼ばれる。これは、発酵器中に細胞を保持しながら、発酵器から不用な培地を除去し新鮮な培地を添加することを許容する。この方法は、多くの特別の装置およびより困難な発酵器操作を生じる（Caronら、１９９４ Biotechnology and Bioengineering 第４３巻、８８１〜８９１頁）。さらに、多孔質床およびゲルマトリクス中の固定化のような方法が報告される。このタイプの方法は、マトリクス上のまたは内側の細胞の固定化に依存し、細胞培養物を希釈することなく不用な培地の除去および新鮮な培地の添加を可能にさせる。細胞密度、接触阻害、および単層培養の他の関連の問題が処理可能である場合、本発明の方法は、上述の種々の培養系において適用され得るのみでなく、単層培養においてもまた適用され得る。

たとえば、本発明の好ましい実施態様は、昆虫細胞培養物において組換えタンパク質を生成するおよび組換えタンパク質の収量を改善するための方法が提供され、当該タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスを選択する工程、少なくとも２リットルを含むのに十分な容量を備える培養容器において増殖培地中で昆虫細胞を増殖する工程、および当該バキュロウイルス／細胞の０．０１未満のＰＦＵのｍ．ｏ．ｉ．で少なくとも１つのバキュロウイルスの接種物で昆虫細胞を感染する工程を包含する。本発明は、たとえば１〜５のｍ．ｏ．ｉ．よりもかなり低い感染多重度が使用され、非同時進行的に感染される培養物を導く方法を提供する。本発明により提供されるようなｍ．ｏ．ｉ．を使用してバキュロウイルスで昆虫培養物を感染することによって、至適な平衡が、細胞の複製の速度とウイルスの複製の速度との間で達成され、それによって所望のタンパク質の至適な発現を許容する。本発明によって提供される方法は、同様にｍ．ｏ．ｉ．を調整することによってより高いおよびより低い細胞密度に容易に調整され得、ここでは本発明によって提供される効率および密度にしたがって、複製の種々の相における細胞を感染するために利用可能であるウイルス粒子の相対比が残存する。本発明の方法の好ましい実施態様は、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも５０または２５０リットルの増殖培地を含むのに十分な容量を備える培養容器において細胞を増殖し、それによって非相同タンパク質を発現するバキュロウイルス培養物の規模拡大を許容する工程を包含する。たとえば、存在する増殖培地の容量について必要とされるよりも大きな容量を備える培養培地を使用し得る。たとえば、２０〜７０リットルの細胞培養物を培養するために１００Ｌの培養容器を使用し得る。本発明の方法の好ましい実施態様は、１×１０⁵〜５×１０⁶細胞／ｍｌ、より好ましくは５×１０⁵〜１．５×１０⁶細胞/mlの細胞密度で細胞を感染し、それによって容易に操作可能な範囲内にウイルス接種の実際の容量を維持する工程を包含する。本発明の方法のなお別の実施態様は、０．００５未満（たとえば、０．００３、０．００１、０．０００５、または０．０００２５）のｍ．ｏ．ｉ．で細胞を感染し、それによって接種物をできるだけ小さく維持する工程を包含する。本発明の方法の好ましい実施態様はｐ１０プロモーターの制御下で所望のタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスを選択する工程を包含する。Ｐ１０プロモーターは、細胞溶解において役割を果たし、ｐ１０タンパク質の不在は、感染された細胞をインタクトなままにさせ、そして感染された細胞からの多角体の放出を妨ぎ、それによって再感染速度を減少するが、感染力自身は減少しない。ウイルス感染の全プロセスは、ポリヘドリン遺伝子、したがって多角体がなお存在するという事実に起因して、現在視覚的にチェックされ得る。ウイルス感染は、細胞核中に集積する高密度のタンパク質粒子として観察され得る。本発明の方法の別の実施態様は、バッチ培養系において昆虫細胞を増殖し、それによって未だ未感染の細胞の感染および複製を損ない得る欠陥妨害バキュロウイルスウイルス粒子の集積を最小化する工程を包含する。本発明により提供される別の方法は、懸濁液中で、好ましくは攪拌され得る（中程度に）発酵器のような培養容器中で昆虫細胞を増殖する工程を包含する。（攪拌された）懸濁培養物の使用は、特にウイルス増殖を視覚的にチェックするために所望のタンパク質がｐ１０プロモーターの制御下にある組換えバキュロウイルスの使用と組み合わされる場合（しかし、ＣＰＥを観察するようなチェックする他の方法（たとえば、ポリヘドリンプロモーターを使用する場合において）がまた利用可能である）、培養のより良好な制御を許容する。

懸濁液の中程度の攪拌は、基質勾配が作られないおよび細胞が高すぎる剪断力を受けない均一な培養を保証する。さらに、攪拌は、感染された細胞から非感染細胞へのウイルスの効率的な移動を生じ、細胞のウイルス感染のより高い効率を与える。最初は約０．１〜０．３％の細胞のみが感染されるので、残りの９９．７〜９９．９％の細胞は成長および増殖を許容される。

本発明は、種々の起源の組換えタンパク質を発現および生成するための方法を提供する。本発明によって提供される例は、ペスチウイルス由来のタンパク質を、増殖培地中に、少なくとも１００、１２０、または１５０μg/ml、より好ましくは少なくとも２００、またはさらに３００μg/mlの収穫の当該タンパク質の濃度に生成することである。所望のタンパク質はまた、獣医学的および医学的使用のために、たとえば、ワクチン中におよび診断試験において組込まれた抗原性物質を調製するために使用され得る。本発明の方法によって生成される所望のタンパク質は、たとえば、ワクチンを調製するために使用され得る。

本発明によって提供される例は、ペスチウイルスＥ２タンパク質またはそのフラグメントであり、これはたとえば、ペスチウイルス感染（たとえば、ブタにおける伝統的なブタ熱）に対するワクチンを調製するために使用され得る。好ましい実施態様において、本発明は、組換えペスチウイルスのＥ２タンパク質もしくはＥ^rnsタンパク質、またはそのフラグメントを含有し、イムノアフィニティ精製されておらずおよび好ましくは１用量での単回のワクチン接種後にＰＤ９５レベルでペスチウイルスに対して防御を付与するという点で特徴付けられるワクチンを提供する。これは、ＣＳＦＶワクチン接種に特に関連する。適用される場合、ＣＳＦＶワクチン接種は一般に、ＣＳＦＶの発生が生じた領域において大規模なキャンペーンの間に行われる。これは、比較的短い期間における多数の動物の迅速なワクチン接種を必要とする。このような大規模なキャンペーンにおいて、十分な防御レベル（野生型ウイルス感染に対して防御されるブタの数）が迅速に達成されることが差し迫って重要である。防御を達成するために第２のワクチン接種について、第１のワクチン接種後に数週間待つことは、疾患の制御を大きく妨げおよび遅延する。組換え的に発現されるＥ２タンパク質を生成するための種々の方法の間には、バキュロウイルスにおいて発現されるＥ２（フラグメント）と比較する場合であっても、差異が存在する。初期に報告されたＥ２タンパク質生成培養において、Ｅ２タンパク質（フラグメント）の収量は、２０〜９０μg/mlの間で変化し（Hulstら、J.Virol. ５４３５〜５４４２、１９９３；HulstおよびMoormann、Cytotechnology ２０:２７１〜２７９、１９９６）、単回注射のワクチン接種のために必要なおよび関連のＥ２抗原質量を得るためにモノクローナル抗体でのイムノアフィニティ精製をさらに必要とする。別の方法（ＥＰ ０３８９０３４において記載されるＥ２のフラグメントを使用する）は、さらなるイムノアフィニティ精製を伴わずに昆虫細胞の上清から採集されたＥ２を使用し、満足する（防御的な）免疫応答が得られる前に２回注射されるＥ２ベースのワクチンを得る。Ｅ２抗原を含有するワクチン（ProcilisRPesti）が現在登録されているが、所望の免疫応答を提供するために４週間の間隔で少なくとも２回のワクチン接種を行うので、このワクチンは２回適用されなくてはならず、それによって、所望の免疫応答を提供するために４週間の間隔で少なくとも２回のワクチン接種を行うので、このワクチンでの伝統的なブタ熱感染に対するワクチン接種の有用性は、妨げられる。

これらの問題（これらは、本発明により解決される）は、特に、ワクチンが調製される開始材料（たとえば、細胞培養上清）中の関連の抗原性物質（この場合においてＥ２タンパク質（フラグメント））の低い濃度に関連する。理論的に、抗原質量をさらに集積し得え、精製および濃縮法は当該分野において知られるが、これは商業的に魅力的なワクチンの生成を導かず、用量当たり高いコストを引き起こす。別の例は、ペスチウイルスＥ^rnsタンパク質であり、これはまたワクチン中でおよび診断試験において、または他の（治療学的）物質中で使用され得る。

たとえば、Ruggliら（Virus Genes １０:１１５〜１２６、１９９５）は、単層昆虫細胞培養物中でＥ２を発現するバキュロウイルスを、５〜１０μg/１０⁶細胞以下の最大収量に増殖した。さらに、Moserら（Vet.Microbiol. ５１:４１〜５３）は、５のMOIを使用して単層昆虫細胞培養物中でRuglliらのＥ２を増殖し、そしてＥＬＩＳＡの目的のために未濃縮の形態において十分な抗原を生成し得ない。彼らの経験において、ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィによるタンパク質のさらなる精製が、ELISAの操作を単純にし、そしてＥＬＩＳＡの質を改善するために前もって必要である。したがって調製されたＥ２タンパク質を用いるワクチン調製は意図されていない。

ワクチンが研究の目的であった場合、ワクチン接種は、防御のある基準を達成するために免疫精製されたＥ２タンパク質を使用して、２回行われることが必要であったことが見出された。たとえば、Hulstら（J.Virol. ６７:５４３５〜５４４２、１９９３）、ＷＯ ９５／３５３８０、およびvan Rijnら（J. Gen. Virol. ７７:２７３７〜２７４５、１９９６）において、Ｅ２は単層中で生成され、そしてイムノアフィニティ精製されて、防御ワクチンを達成した。

本発明によって提供される例は、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質（フラグメント）を含有するワクチンであり、タンパク質は今や十分に多くの量が生成され得、動物が１用量で単回のワクチン接種を受けた２〜３週間以内に伝統的なブタ熱ウイルス感染に対する防御を付与する（９５％の防御用量レベル（ＰＤ９５）で）ワクチン中に取り込まれる前にイムノアフィニティ精製される必要がもはやない。本発明によって提供される方法は、組換えペスチウイルスＥ２タンパク質もしくはＥ^rnsタンパク質またはそのフラグメントを含有するワクチンを提供し、ワクチンは、１用量での単回のワクチン接種後にペスチウイルス感染に対して防御を付与し、一方タンパク質（フラグメント）は、イムノアフィニティによって精製されていない。本発明はまた、本発明によって提供されるタンパク質を含有し、さらにアジュバントを含有するワクチンを提供する。適切なアジュバント（たとえば、フロインドアジュバント、または水酸化アルミニウム、または乳濁液（たとえば、油中水乳濁液、二重油中水乳濁液、または水中油乳濁液））は当業者に公知である。所望のタンパク質はまた、他の物質（たとえば、獣医学的または医学的使用）を調製するために使用され得る。本発明によって提供されるなお別の例は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ、αユニットおよび／またはβユニット、ならびにその複合体およびフラグメント）のようなホルモン様物質であり、これはたとえば、培養物中でαユニットを発現する１つのバキュロウイルスでおよび／またはβユニットを発現する別のバキュロウイルスで、昆虫細胞培養物を感染することによって生成され得る。本発明の方法はまた、生物殺虫剤としての（組換え）バキュロウイルスの大規模および低コストの生成のために使用され得る。好ましい実施態様は、生物殺虫剤の生成において外来遺伝子の発現のためにｐ１０プロモーターを利用する組換えウイルスの使用である。なぜなら、昆虫は一般に多角体遺伝子を欠陥するバキュロウイルスによりあまり十分には感染されないからである。本発明の方法を用いて、他の組換えタンパク質を発現する他の組換えバキュロウイルスを培養すること、ならびに殺虫剤の、医学的、治療学的、および／または抗原性の物質または産物中に組込むためのこのようなウイルスタンパク質の生成および/または使用は、当業者の範囲内である。本発明はさらに、実施例において説明されるが、それらに制限されない。

実施例
フラビウイルス科のペスチウイルス属は、従来、伝統的なブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、ボーダ病ウイルス（ＢＤＶ）、およびウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）からなる。いくつかのＢＶＤＶおよびＣＳＦＶ株のゲノムは配列決定されている（Renardら、１９８７ EP特許出願第０２０８６７２号；Collettら、１９８８、Virology １６５、１９１〜１９９；DengおよびBrock、１９９２、Virology １９９１、８６５〜６７９；Meyersら、１９８９、Virology １７１、５５５〜５６７；Moormannら、１９９０、Virology １７７、１８４〜１８８）。ＢＤＶについて、未だ不完全なゲノムヌクレオチド配列のみが利用可能である。ペスチウイルスゲノムは、１つの大きなオープンリーディングフレームを含有する約１２．５キロベースのポジティブ鎖ＲＮＡ分子である。オープンリーディングフレームは、約４，０００アミノ酸の推定のポリタンパク質に翻訳され、これはウイルスおよび細胞にコードされるプロテアーゼによりプロセスされる。オープンリーディングフレームは、２つの高度に保存された小さな非翻訳領域により隣接され、これらはおそらくゲノムの複製に関与する。５'非コード領域はまた、翻訳の開始において役割を果たす。

細胞およびウイルスのプロテアーゼによって、翻訳と同時におよび翻訳後にプロセスされるポリタンパク質は、ウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質の全てを含む（C.M. Rice：Fields Virology、第３版、１９９６ フラビウイルス科：ウイルスおよびそれらの複製：第３０章：９３１〜９５９頁を参照のこと）。ウイルス構造タンパク質、特にエンベロープタンパク質のＥ^rns、Ｅ１、およびＥ２はポリタンパク質のＮ末端部分に位置される。非構造タンパク質、特にセリンプロテアーゼＮＳ３ならびにＲＮＡレプリカーゼ複合体ＮＳ５ＡおよびＮＡ５Ｂは、ポリタンパク質のＣ末端部分に位置される。

ペスチウイルスで感染される動物は、Ｅ^rns、Ｅ２、およびＮＳ３に対する抗体を発生する。しかし、Ｅ２に対して指向される抗体のみが強力にウイルスを中和化し、一方Ｅ^rnsおよびＮＳ３に対して指向される抗体は、ごく低いウイルス中和化能力を有するか、または全く有しない。この知見は、ＣＳＦサブユニットマーカーワクチンとしてのＥ２の適切性を評価することを開始するように本発明者らを促した。この設定において、Ｅ^rnsおよび／またはＮＳ３は、Ｅ２マーカーワクチンを付随する診断試験の開発のために使用され得た。

今日までに、ＢＤＶおよびＢＶＤＶは、異なる種から単離されているが、ＣＳＦＶはブタに制限されるようである。ペスチウイルスは構造的におよび抗原的に密接に関連する。エンベロープ糖タンパク質のＥ２は最も免疫原性であり、およびペスチウイルスの最も可変性のタンパク質である。本発明者らは、多くの異なるペスチウイルス株のＥ２遺伝子をクローン化し、シカおよびキリンからの株を含んだ。Ｅ２遺伝子を一過的に発現し、モノクローナル抗体で特徴づけし、配列決定し、そしてP.A. van Rijnら、１９９７、Virology、２３７：３３７〜３４８に比較した。これらのデータに基づいて、本発明者らは、ペスチウイルス属内に６つの主要な群を示し得た。４つの群は規定された遺伝子型に対応したが、２つの他の群は、ペスチウイルス属内の新規な遺伝子型であった。１つの群は、ブタから単離されたＣＳＦＶ株を含む。第２の群は、ヒツジから単離されたＢＤＶ株Moredun、Ｌ８３、およびＸ８１８、ならびにブタ由来のＦ株からなる。第３の群は、ヒツジ由来のＢＤ７８株、ブタ由来の５２５０株、およびウシ由来の１７８００３株を含む。Ｅ２に基づいて、これらのウイルスは、ウシウイルス性下痢の急性の重篤な発生と関連するＢＶＤＶ株（いわゆる、２型ＢＶＤＶ）に非常に類似する。第４の群は、ウシに優先的に由来するＢＶＤＶ株からなる。このＢＶＤＶ群は、２つの亜型または亜群のＢＶＤＶ−１ａおよび１ｂに分けられ得：ＢＶＤＶ−１ａは、ＮＡＤＬおよびＯｒｅｇｏｎのような米国に由来するウイルス、ならびに欧州に由来する１５００２２および１１３８のような他のウイルスを含む。亜群ＢＶＤＶ−１ｂは、Ｏｓｌｏｓｓ株およびいくつかのオランダ単離物を含む。第５および第６の「群」は、２つの新規な遺伝子型として提唱され得、それぞれ、Ｄｅｅｒ株およびＧｉｒａｆｆｅ株を含む。

獣医学的使用のためのマーカーワクチンの開発は、家畜のウイルス疾患の経済的に重要な制御および根絶のための新しい概念を導いた。マーカーワクチンの使用は、ワクチン接種された動物と野外ウイルスに感染された動物との間の血清学的な区別を許容し、それによってウイルスを制御して排除をできる。大部分のメンバにおいて、たとえば、アウエスキー病（ＡＤ）に対するＥＵワクチン接種の状況は、ｇＥネガティブなワクチンのみで許容される。ＡＤ野外ウイルスで感染された動物は、ｇＥに対する抗体を発生する。これらの抗体を検出するＥＬＩＳＡ試験が、感染された動物の検出のために（続いて感染された動物は集団から除去され得る）、および（長期間の）ワクチン接種キャンペーンの間、集団における野外ウイルス感染の状況をモニタするために使用される。最終的に、目的は、集団の野外ウイルスがない状態を達成することである。次いで、ワクチン接種は中止され、そしてこの状況を保護する血清学的な監視プログラムが行われる。したがって、マーカーワクチンでのワクチン接種は、感染された個々の動物のみのではなく感染された集団の撲滅にかかる根絶運動の費用を有意に減少し、および十分に大きな規模で、および十分に長期間、結果的に行われる場合であっても、ブタ集団の野外ウイルスがない状態を達成するためには、撲滅よりも早い方法であり得る。

現在および今後、ＡＤのような現在の風土病が根絶された場合、たとえば、集団から根絶された疾患および日常的なワクチン接種がない疾患の発生を制御するために、マーカーワクチンはなお使用される。このような場合において、動物集団が血清学的にネイティブである場合、非常に伝染性の疾患が爆発的に広がり得、次いで莫大な経済的な損失を引き起こし得る。

バキュロウイルス系が非相同タンパク質の高レベルの発現を支持するという多くの例が示された。高レベルの発現は非常に有利である。なぜなら、デッドサブユニットワクチンは、一般に、大量の抗原が適用される場合に防御的な免疫応答を誘発し得るのみであるからである。本発明者らの最初のアプローチにおいて、２つの組換えバキュロウイルス（一方はＴＭＲを伴ってＥ２を発現する（ＢａｃＥ２[+]）および他方はＴＭＲを伴わないでＥ２を発現する（ＢａｃＥ２[−]））が構築された（Hulstら、１９９３、J. Virol. ６７：５４３５〜５４４２）。この刊行物および他の比較可能な刊行物において、Ｅ２は未だその古い名称のＥ１で表されることに注意のこと。ＴＭＲを伴わないＥ２は、細胞培養培地に分泌されるが、ＴＭＲを伴うＥ２は分泌されなかった。さらに、両方のＥ２は、Ｅ２上の４つの抗原性ドメインのそれぞれを提示するモノクローナル抗体と同一に反応する。このことは、細胞会合性Ｅ２および分泌性Ｅ２の抗原特性が同一であることを示唆し、そして分泌性Ｅ２が細胞会合性Ｅ２よりも非常に高いレベル（10倍以上の高さ）に生成されたので、ブタにおけるワクチン接種試行において分泌性の免疫アフィニティ精製されたＥ２を試験することが決定された。二重水-油アジュバント中に２０μg Ｅ２/mlおよび１００μg Ｅ２/mlを含有する２つのワクチン処方物を調製した。２つのＳＰＦブタの４つの群のうち、２つの群を２０μg Ｅ２で、および２つの群を１００μg Ｅ２で筋肉内にワクチン接種した。２８日後、２０μg Ｅ２でワクチン接種された１つの群および１００μg Ｅ２でワクチン接種された１つの群を、同じ用量のＥ２で再ワクチン接種した。４２日目に、全ての動物を病原性ＣＳＦＶ株のＢｒｅｓｃｉａで鼻腔内に攻撃した。適用されたワクチン用量にかかわらず、全てのワクチン接種されたブタは、異なるレベルにであったが28日目で中和化抗体をマウントした。攻撃の日にちの４２日まで、抗体力価は、全ての動物において、それらが追加免疫されようがなかろうが高レベルに上昇したままであった。それゆえ、２０μgの免疫アフィニティ精製されたＥ２の用量で一回のみワクチン接種された動物であっても、ＣＳＦに対して既に完全に防御されたということは驚くことではない（Hulstら、１９９３ J. Virol. ６７:５４３５〜３４４２）。

ペスチウイルスで感染された動物は、第２のウイルスエンベロープ糖タンパク質のＥ^rnsに対する抗体を必ず生成するので（Kwangら、１９９２、Vet.Microbiol. ３２:２８１〜２９２）、これはＥ２と組み合わせて診断試験を開発するために最も適切なウイルスタンパク質の１つである。しかし、Ｅ^rnsがＣＳＦに対するブタの防御のために重要な抗原であり得たことを示唆する１つの報告がまたある（Konigら、１９９５、J. Virol. ６９：６４７９〜６４８６）。これらの研究において、Ｅ^rnsは生存ウイルスワクシニアベクターで発現された。注射部位あたり５×１０⁷ＰＦＵのワクシニア−Ｅ^rns組換えウイルスで３つの異なる経路（皮内、静脈内、および腹腔内）により同時にワクチン接種された動物は、ワクチン接種の５週間後での致死用量のＣＳＦＶ株Ａｌｆｏｒｔでの攻撃でも生存し、ＣＳＦの任意の徴候を示さなかった。

デッドサブユニットワクチンとしてのＥ^rnsの適切性を評価するために、バキュロウイルスにより発現されたＢｒｅｓｃｉａ株のＥ^rns（Hulstら、１９９４、Virology、２００:５５８〜５６５）を、ブタにおいて試験した。６匹のＳＰＦブタの群を、それぞれ、５．０および２０μg Ｅ^rnsで筋肉内に１回ワクチン接種した（Moormannら、１９９６、Proc. １４^th Intern. Pig. Vet. Society Congress、２５〜２９頁、Bologna、Italy）。４匹のワクチン接種されなかったＳＰＦブタの第３の群は、コントロールとして作用した。ワクチン接種の３週間後、全ての動物を、１０⁵ ＴＣＩＤ₅₀のBehring株で筋肉内に攻撃した。攻撃の５日後以内に、最も低い用量のE^rnsでワクチン接種された全ての動物は、CSFの重篤な徴候を発症した。攻撃の14日後以内に、２匹の動物が死亡し、３匹は瀕死の状態になったときに殺傷され、１匹は見かけ上、回復した。回復した１匹を含むこれらの動物のうちの５匹は、ＩＦＴにおいてポジティブであった。攻撃後、最も高い容量のＥ^rnsでワクチン接種された全ての動物は、数日間多かれ少なかれＣＳＦの重篤な徴候および高熱を示したが、１４日以内に、６匹のうちの４匹の動物が回復し、１匹の動物は死亡し、そして残りの１匹は瀕死の状態になったときに殺傷された。４匹の生存する動物のうちの１匹のみが、ＩＦＴにおいてポジティブであるようであった。対照的に、全てのコントロール動物が、攻撃後５日以内にＣＳＦの重篤な徴候を示し、攻撃後14日以内に死亡し、ＩＦＴにおいてポジティブであった（Moormannら、1996、Proc. 14^th Intern. Pig. Vet. Society Congress、２５〜２９頁、Bologna、Italy）。

本発明者らは、バキュロウイルスにより発現されたＥ^rnsは、バキュロウイルスにより発現されたＥ２投与よりも非常に低い効率であるが、非相同ＣＳＦＶ攻撃に対してブタを防御し得ることを結論した。

卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、下垂体（黄体形成ホルモン、ＬＨ；甲状腺刺激ホルモン、ＴＳＨ）においてまたは胎盤（ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ｈＣＧ；妊馬血清ゴナドトロピン、ＰＭＳＧ）においてのいずれかで生成される糖タンパク質ホルモンのファミリに属する。種内で、これらのホルモンのそれぞれは共通のαサブユニットからなり、これはホルモン特異的なβサブユニットに非共有結合される。単独でまたはＬＨと組み合わせて投与された精製されたＦＳＨは、ウシを含む多くの種において過剰排卵応答を誘導するために広範に使用される。

ウシにおける問題は、ウシＦＳＨがウシ下垂体から実質的な量において精製することが困難であることである。この理由のために、ヒツジのＦＳＨ（ｏＦＳＨ）、ブタのＦＳＨ（ｐＦＳＨ）、またはウマのＦＳＨ（ｅＦＳＨ、ＰＭＳＧ）起源のＦＳＨがウシの過剰排卵処理のために一般に使用される。しかし、ウシにおいてウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、およびおそらくヒトにおいてクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）の変形を引き起こし得るプリオン様タンパク質の潜在的な存在に起因して、脳組識に由来する材料の適用は危険がなくはない。さらに、胎盤由来の材料の使用は、生物学的半減期が非常に長いという不利益を有し、これは特異的な抗体の注射によるその中和化を必要とする。最後に、全ての現在使用されるＦＳＨ調製物は、過剰排卵の結果において観察される大きな変分を少なくとも一部担うと考えられるいくつかのＬＨ活性を含む。

これらの理由のために、ウシの過剰排卵処理は、昆虫細胞（バキュロウイルス発現系）のような非哺乳動物細胞において生成される組換えウシＦＳＨ(
ｒｂＦＳＨ）を適用することにより、有益であり得るようである。

材料と方法
１．ＳＦ２１細胞の産生細胞培養物（ＰＣＳ）の調製例
ＳＦ２１作業用細胞種子（ＷＣＳ）１．５ｍｌを容れた凍結バイアル（細胞総数、４〜１０×１０⁶細胞／ｍｌ）を２０〜３０℃の温度で融解する。融解後、バイアルの内容物を、無血清培地ＳＦ９００ＩＩ８．５ｍｌを含む１５ｍｌ容量ファルコンチューブに移し、懸濁させる。懸濁後、ファルコンチューブの内容物を１００〜２００×ｇで１０分間遠沈し、細胞を沈殿させる。培地を廃棄し、ペレットを４〜６ｍｌのＳＦ９００ＩＩに懸濁する。懸濁した細胞を、１０ｍｌのＳＦ９００ＩＩを容れた１００ｍｌ容量の振盪フラスコに移す。フラスコを軌道旋回式シェーカの台上にのせ、４０〜８０ｒｐｍ、２６〜３０℃で３〜７日間、細胞を培養する。細胞の増殖と細胞生存度は、工程途上サンプルを取出しモニタする。細胞密度が１．０〜６．５×１０⁶細胞／ｍｌに達したとき、それぞれ１００ｍｌのＳＦ９００ＩＩを容れた２個の５００ｍｌ容量振盪フラスコに移す。これは１０倍希釈の細胞に相当する。再度、フラスコを軌道旋回式シェーカの台上にのせ、４０〜８０ｒｐｍ、２６〜３０℃で３〜７日間、細胞を培養する。細胞の増殖と細胞生存度は定常的に工程内コントロールによりする。細胞密度が１．０〜６．５×１０⁶細胞／ｍｌに達したとき、二度目として、今回はそれぞれ１００ｍｌのＳＦ９００ＩＩを容れた６〜１１個の５００ｍｌ容量振盪フラスコに移す。過剰の細胞材料は廃棄する。また、この場合、１０倍の希釈を達成する。フラスコを軌道旋回式シェーカの台上にのせ、４０〜８０ｒｐｍ、２６〜３０℃で３〜７日間、細胞を培養する。細胞の増殖と細胞生存度は定常的に工程内コントロールによりモニタする。細胞密度が１．０〜６．５×１０⁶細胞／ｍｌに達したとき、該細胞を含む懸濁液５００ｍｌまたは１０００ｍｌを、それぞれ約４．５リットルまたは９リットルのＳＦ９００ＩＩを容れた５リットルまたは１０リットル醗酵槽に移す。これは１０倍希釈の細胞に相当する。この細胞を２６〜３０℃で３〜７日間培養する。この懸濁液を定常的に攪拌する（５０〜１００ｒｐｍ）。細胞の増殖と細胞生存度は定常的に工程内コントロールによりモニタする。細胞密度が１．０〜６．５×１０⁶細胞／ｍｌに達したとき、５リットル容量醗酵槽の内容物を、約４０リットルのＳＦ９００ＩＩを容れた５０Ｌ醗酵槽に移す。この細胞を、密度が±５〜１５×１０⁵細胞／ｍｌに達するまで２６〜３０℃で培養する。この懸濁液を定常的に攪拌する（５０〜１００ｒｐｍ）。サンプルを工程内コントロール用に採取する。

２．Ｅ２抗原の産生例
上記の細胞懸濁液に、±１０⁷ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌを含む作業種子ウイルス（ＷＶＳ）（ＢａｃＥ２［−］）１〜２ｍｌを添加する。細胞の７０〜１００％が細胞変性効果を示すまで、２８℃にて３〜８日間培養する。培養の間に工程内コントロール用にサンプルを採取する。次に、この懸濁液を精密濾過による細胞除去により清澄とする。得られた濾液（すなわち、抗原溶液）を集め、不活化工程（３．３）を始めるまで≦−２０℃にて保存する。工程内コントロール用にサンプルを採取する。抗原含量を定量するために、サンプルを、たとえば、抗原質量を定量するために、酵素結合免疫アッセイで、または水中タンパク質容量あたりの実質重量を定量するために、タンパク質アッセイで、あるいはかかる方法の併用により試験する。

３．ウイルス不活化例
ウイルスに臭化２−ブロモエチルアンモニウム（ＢＥＡ）を１０ミリモル／Ｌの濃度に加えることにより不活化する。ｐＨを８．２〜８．７に、温度を３４〜３７℃に調節することにより、ＢＥＡを臭化２−ブロモエチル−インミン（ＢＥＩ）に変換する。ＢＥＩはウイルスを不活化する活性成分である。ウイルス殺滅は工程内コントロール用サンプルを採取することによりチェックする。不活化には２４〜７２時間を要する。不活化後、１００００リットルあたり１個未満の感染性粒子が存在する。ウイルスの不活化後、チオ硫酸ナトリウムを５〜２５ミリモル／Ｌ添加し、ｐＨを５．７〜６．３に調整することによりＢＥＩを中和する。工程内コントロール用にサンプルを採取する。不活化し、中和した抗原溶液を１リットルおよび／または５リットル容量のバッグに移し、≦−２０℃にて保存する。

４．製剤化例
凍結した抗原溶液を２２〜２８℃で融解し、ＳＦ９００ＩＩまたはＰＢＳにより希釈し、５０μｇ／ｍｌの抗原溶液とする。抗微生物剤としてチオメルサールを１００μｇ／ｍｌまで加える。工程内コントロール用にサンプルを採取する。この溶液（すなわち、第１水相）を２〜８℃にて＜３日間保存する。この間、マルコール（Marcol）５２とモンタニド（Montanide）８０とを混合する（９：１）ことにより油相を調製する。また、この溶液も２〜８℃にて３日を超えない範囲で保存する。油相は０．２２μｍ−無菌フィルタにより無菌濾過する。工程内コントロール用にサンプルを採取する。最後に、第２水相をリン酸バッファー塩溶液（ＰＢＳ）またはＳＦ９００ＩＩをモンタノックス（Montanox）８０と混合することにより調整し（９８：２）、チオメルサールを最終濃度１００μｇ／ｍｌまで添加する。この溶液を使用時まで２〜８℃にて保存する（＜３日間）。使用前、第１水相を無菌濾過する。工程内コントロール用にサンプルを採取する。第１水相と油相とを混合（１：１．１）することにより第１エマルジョンを調製する。このエマルジョンを２〜８℃にて３日以内保存する。工程内コントロール用にサンプルを採取する。二重油中水エマルジョンは、第１エマルジョンを第２水相で乳化することにより（２．１：１）調製する。二重エマルジョンはバイアルに詰めるまで隔離保存室内に２〜８℃にて保存する。工程内コントロール用にサンプルを採取する。

５．充填および施栓例
清浄室内において、二重エマルジョン溶液をクラスＡゾーンにて無菌的に充填する。充填量は５０、１００または２５０ｍｌバイアルに、それぞれ５１、１０２または２５５ｍｌである。充填容量は濾過容積の重量をチェックすることにより定常的にモニタする。充填直後、バイアルには栓をし、キャップを被せる。最後に、バイアルは隔離保存室内に２〜８℃で保存し、その後の品質管理を開始する。

６．Ｅ２安定性実験例
目的
異なる正常条件下、長期間培養後の感染細胞培養物（ＭＯＩ^*０．０００１）におけるＥ２タンパク質の安定性を検討するため。細胞培養におけるバキュロウイルス感染過程の溶菌性のために、感染サイクルの後期培地にプロテアーゼが放出されていると思われる。このことがＥ２タンパク質の分解と容量タンパク質レベルの低下に至らしめるのか否かが、本実験の命題である。

材料と方法
培地またはＳＦ９００ＩＩと記載されている場合、０．２％プルロニックＦ６８含有ＳＦ９００ＩＩ培地を意味する。

ＳＦ２１細胞を容れたバイアルを融解し、１００ｍｌ容量振盪フラスコ中、１０ｍｌのＳＦ９００ＩＩにより、インキュベータ内軌道旋回式シェーカ台座上、培養する。細胞培養が必要とする細胞密度に達したところで、細胞を５００ｍｌ振盪フラスコ中、１０倍に希釈して１００ｍｌとする。この細胞培養が必要とする細胞密度に達したところで、再度、１０倍に希釈し１００ｍｌとし、過剰の細胞性物質を廃棄した。この細胞培養が必要とする細胞密度に達したところで、これを１０倍に希釈し、３個の５００ｍｌ振盪フラスコに各フラスコ１００ｍｌ容量ずつ入れた。過剰の物質を廃棄した。振盪フラスコをＩＫＳ軌道旋回式シェーカ台座に載せ、２８℃のインキュベータ中７０ｒｐｍで攪拌する。細胞密度１ｍｌ当たり０．６１２×１０５細胞で、１００倍希釈のウイルス懸濁液６３μｌをフラスコ番号２および３に加える。振盪フラスコ番号１は未感染ブランクとして維持する。培養物を感染させたＭＯＩは（０．０６３×０．０１×０．８×１０７）／（１００×０．６１２×１０５）＝０．００００８である。

使用した１００倍希釈ウイルス懸濁液は以下に概説したように調製した。ＭＳＶバイアル２５３をＱＣにより融解し、ＴＣ１００培地に１００倍希釈し、１０％ＦＢＳ（ロット番号９７ＱＣ０１３９）を添加し、０．５ｍｌずつに分割して−７０℃に保存した。

細胞培養条件を決定するために、定期的にサンプルを感染振盪フラスコ培養物と非感染振盪フラスコの両方から採取する。サンプル採取は以下に概括したように実施した。

細胞物質約１．１ｍｌを１５ｍｌ容量のファルコンチューブ中、ＩＥＣセントラＧＰ８Ｒ遠心分離機により１０００ｒｐｍで６分間遠心分離する。次いで、上清をゲルマン・アクロディスク・シリンジフィルタにより０．４５μｍで濾過し、なお残存する細胞を廃棄する。サンプル０．４ｍｌを後の分析用にナルゲン低温バイアル中に−７０℃で保存する。

結果と結論
図１のデータおよび図２のグラフに見られるように、フラスコ２および３の細胞増殖曲線はおおよそ類似している。１９１ｈｐｉの後、それ以上の細胞計数はなされなかったが、その理由は事実上すべての細胞が死滅し、感染したからである。フラスコ２の１３９ｈｐｉサンプルはグラフから除外する。このサンプルの細胞計数は、前記のサンプルおよび以下のサンプル両方よりもはるかに高い。このことは、恐らくある種の沈殿がサンプル採取の前後に起こり、その結果、トリパンブルー溶液と混合したサンプルが不正確となったことを示している。この仮定は生存率と感染率両方が予測した結果と一致するという事実により確認される。このことは、感染培養物それ自体にはなんら異常なことが起こっていないことを意味する。この不正確なサンプル採取は、サンプル中のＥ２濃度になんら影響を与えることはないだろう。というのは、Ｅ２は培地には存在するが、細胞内には存在しないからである。

フラスコ２のＥ２濃度は非常に急速に上昇して、１３９ｈｐｉ近辺で＞１９０μｇ／ｍｌの最大値となるが、そこからゆっくり低下して２１５ｈｐｉで１７０μｇ／ｍｌとなる。次いで、Ｅ２−含量がさらに急速に降下して、３０６．５ｈｐｉで＜１００μｇ／ｍｌの最終レベルとなる。

フラスコ３のプロフィールはおおよそ同じである。最大Ｅ２タンパク質含量もまた１３９ｈｐｉ付近で到達するが、フラスコ２よりもわずかに高いだけである。Ｅ２濃度は１３９ｈｐｉでの２３３μｇ／ｍｌから１９１ｈｐｉでの２１２μｇ／ｍｌにゆっくりと低下するが、それ以後はより急速に低下し、２１５ｈｐｉで１４１μｇ／ｍｌに至る。フラスコ２および３は良好な相関性を示す。

ｔ＝４４．２５ｈｐｉで、振盪フラスコ番号１（ブランク）についても計測した。生存細胞密度は２．４３５×１０６細胞／ｍｌ、死滅細胞密度は０．１９０×１０６細胞／ｍｌであり、総細胞密度は２．６２５×１０６細胞／ｍｌであって、生存度は９２．８％となった。生存細胞密度はフラスコ２および３両方よりも有意に高く、感染が細胞増殖をすでに減速しつつあることを示している。このブランクを次いで濾過した。

以下の表はフラスコ２のサンプル抜粋物について実施した免疫ブロッティングアッセイの結果を示す。

この表に見られるように、エピトープＶ３およびＶ８は、０および４４ｈｐｉサンプルでなお検出不可である。この結果はＥ２−ＥＬＩＳＡの結果とよく相関する。Ｖ３およびＶ８はともにＥ２バンドに検出されるので、１１５ｈｐｉ以降のサンプルにはインタクトのＥ２が検出される。

１９１ｈｐｉ以降には、より小さいタンパク質からの第２バンドがゲル上に目視できる。２つの個々のブロットにおけるＶ３とＶ８での免疫ブロッティングは、分解産物がＶ３エピトープを含み、Ｖ８エピトープを含まないことを示す。Ｖ８はブロット上のいずれの場所にも検出されないが、未処理Ｅ２バンドには検出される。このアッセイは、Ｅ２タンパク質の分解がプロテアーゼの存在により起こることを明瞭に示している。事実、これがＥ２タンパク質含量降下の原因であり、この降下はバルクＥ２抗原溶液の精密濾過工程の際に観察される。この下流の処理加工段階で、細胞はウイルスの不活化が始まる前に除かれる。

したがって、恐らくプロテアーゼの存在がＥ２タンパク質分解の原因である。
７．ＭＯＩ実験例
目的
ＭＯＩ（感染多重度、細胞当たりのウイルス数）、最大細胞密度、および容量計測Ｅ２含量間の関係をさらに検討すること。一方で、完全な細胞母集団の感染は培地が消費し尽くされるまでに完了しなければならないが、他方で、低細胞濃度の総母集団の感染は最適以下のタンパク質収量に至る。

材料と方法
培地というときは、ＳＦ９００ＩＩ培地を意味する。

細胞懸濁液７６ｍｌを、１０００ｍｌ容量ボトル中、４４４ｍｌのＳＦ９００ＩＩに希釈し、ゆるやかに混合する。培養物希釈直前の生存細胞密度は、３．４１×１０６細胞／ｍｌ、死滅細胞密度は０．１９０×１０６細胞／ｍｌであり、生存率は９４．８％となる。この希釈により、細胞密度は±５×１０５細胞／ｍｌとなる。

さらに、ゲンタマイシンを加え、最終濃度１０μｇ／ｍｌとした。細胞懸濁液を５０ｍｌずつ２５０ｍｌ振盪フラスコ中に９分割し、過剰の細胞は廃棄した。最初の５０ｍｌを振盪フラスコ１に移し、最後の５０ｍｌを振盪フラスコ５に移した。フラスコ番号１および６はＭＯＩ＝０（ブランク）に使用し、番号２および７はＭＯＩ＝０．０００００１用とし、番号３および８はＭＯＩ＝０．００００１用とし、番号４および９はＭＯＩ＝０．０００１用とし、番号５はＭＯＩ＝０．００１とする。

ウイルス原液の調製は以下のようにする。希釈範囲は、１００倍希釈したウイルス懸濁液を入れたバイアルから調製する（該バイアルは１ｍｌ当たり０．８×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）を含む）。この１００倍希釈したウイルス原液は以下のように調製した。マスター種子ウイルスを融解し、ＴＣ１００培地に１００倍希釈し、１０％ＦＢＳを添加して、０．５ｍｌに分割、−７０℃にて保存する。

この１００倍希釈したウイルス溶液０．４ｍｌをＳＦ９００ＩＩ培地３．６ｍｌで希釈して希釈ファクタ１０^-1とし、この溶液１ｍｌを培地９ｍｌに加えて希釈ファクタ１０^-2とし、この溶液１ｍｌを培地９ｍｌに加えて希釈ファクタ１０^-3とし、そしてこの溶液１ｍｌを１０倍に希釈して希釈ファクタ１０^-4とする。細胞培養物を含む振盪フラスコ１および６（ブランクフラスコ）に培地３．１ｍｌを加える。ウイルス希釈液１０^-2、１０^-3および１０^-4をそれぞれ振盪フラスコ４と９、３と８、および２と７に加える。これらの振盪フラスコにはすでに細胞培養物を入れてある。

３．１ｍｌのウイルス希釈液１０^-2には、３．１×１０^-2×０．８×１０⁵＝２．５×１０³ｐｆｕが存在する。５０ｍｌの細胞懸濁液を容れた振盪フラスコには、０．５×１０⁶×５０＝２．５×１０⁷の細胞が存在する。そこで、５０ｍｌの細胞懸濁液に３．１ｍｌのウイルス希釈液１０^-2を加えると、ＭＯＩが２．５×１０³／２．５×１０⁷＝０．０００１となる。他のウイルス希釈液について同等の計算をすると、細胞培養物５０ｍｌに添加したウイルス希釈液１０^-3と１０^-4については、ＭＯＩ計数０．００００１と０．０００００１が得られる。最終的に、２．８５ｍｌの希釈液１０^-1を振盪フラスコ番号５に加えると、ＭＯＩが０．００１ではなく０．０００９２となる。

サンプル３．１ｍｌを、ウイルス添加直後、各振盪フラスコに取る。サンプル中の細胞は１５ｍｌファルコンチューブ中、ＩＥＣセントラＧＰ８Ｒ遠心分離機により遠沈する（１０分、１０００ｒｐｍ）。サンプル採取は低ＭＯＩから始めて高ＭＯＩについて実施し、高ＭＯＩの感染細胞懸濁液から低ＭＯＩ感染細胞懸濁液にウイルスが伝播するのを防止する。遠心分離後、サンプルを０．４５μｍで濾過し（上清になお存在する可能性のある細胞を除去するため）、３個のナルゲン低温バイアルに分割し、後の試験用に−７０℃にて保存する。

振盪フラスコ１および５の細胞密度はウイルス添加直後に定量した。これらは細胞接種すべき最初と最後のフラスコであった。細胞密度が殆ど一致したので、すべてのフラスコは両方の細胞計数平均値に等しい細胞密度を有すると見なした。当初の生存細胞密度は０．４２３×１０⁶細胞／ｍｌであり、一方、０．０１２×１０⁶細胞が死滅していたので、生存率は９７．３％となった。

すべてのフラスコをラボテック３００軌道旋回式シェーカ台座に載せ、２８℃の室内にて約７５ｒｐｍで攪拌した。

２３、９５、１２５、１４４、１７３および１９４ｈｐｉ（感染後の時間）に、すべてのフラスコからサンプル採取した。細胞密度を定量したサンプルは容量が３．３ｍｌあり、その０．２ｍｌを用いて細胞密度を定量した。残り３．１ｍｌはｔ＝０サンプルのために上記のように取扱う。計測しなかった培養物サンプルは容量が３．１ｍｌあった。１９４ｈｐｉでの細胞密度を定量し、この実験を終えた。残りの細胞懸濁液（約３０ｍｌ）は、その１ｍｌ、３部をナルゲン低温バイアルに、約６ｍｌの４部を１５ｍｌファルコンチューブに入れ、保存した。

結果と結論
この結果は、ＭＯＩと最適細胞密度との間に、さらに重要なことは、ＭＯＩとＥ２タンパク質収率との間に良好な相関があることを示す。このことは、ＭＯＩ ０．００１で感染した培養物の最大容量Ｅ２タンパク質収率を１００％とした場合のグラフに見て取れる。それは容量Ｅ２タンパク質収率がＭＯＩの減少とともに増大することを示す。０．０００１のＭＯＩまでは、細胞密度は、最大達成可能細胞密度に達する前に感染される。０．００００１またはそれ以下のＭＯＩを用いると、培養物の感染が終了する前に培地が消耗されてしまうという感染結果となり、最適以下のタンパク質収率となる。したがって、引き出される結論は、感染過程とＥ２の産生が完了するまでに培地が消尽しない限り、使用されるＭＯＩが低い程、Ｅ２タンパク質収率が高くなるということである。
ｂＦＳＨαおよび／またはｂＨＳＦβを発現する組換えバキュロウイルス
伝達ベクターｐＤＷ−アルファ−９．１およびｐＤＷ−ベータ−３．１を構築した。Ｓｆ２１細胞はｐＤＷ−アルファ−９．１またはｐＤＷ−ベータ−３．１、および細胞外ウイルス粒子から単離した野生型（ｗｔ）ＡｃＮＰＶ／Ｍ０２１ＤＮＡ（ＰＣＴ出願：ＷＯ９６／２５６９６）により同時移入した。β−ガラクトシダーゼ発現ポリヘドリン陽性プラークを単離し、ｂＦＳＨαまたはｂＦＳＨβを発現するかについて、培地のＥＬＩＳＡにより分析した。一つのプラーク精製したｂＦＳＨαウイルス（ＡｃＮＰＶα３．４）および一つのプラーク精製したｂＦＳＨβ（ＡｃＮＰＶβ１．４）を用い、それぞれ約１０⁷と１０⁸のＴＣＩＤ５０をもつウイルス原液を調製した。ＦＳＨの産生は上記方法により生じ、産生レベルは１７〜３３μｇ／ｍｌとなった。

ＰＤ₅₀試験
病毒力の強いＣＳＦＶ株ブレスシア（Brescia）１００ＬＤ₅₀の攻撃に対し、予防接種したブタの９５％（ＰＤ５０）を予防する、１回の予防接種後に必要とするＥ２用量（μｇ）の評価。

動物
２６頭の特異病原体陰性（ＳＰＦ）ブタ（６〜７週令）を到着順に無作為に、８頭ずつの３群（Ａ〜Ｃ）と２頭の１群（Ｄ）に分けた。これらの動物をＩＤ−ＤＬＯの高度封じ込め設備内にある家畜小屋Ｂ１８、Ｂ１９、Ｂ２０およびＢ２１に収容した。動物は３日間順化させる。動物は１日に１度、飼い葉桶で完全食物ペレット（ホープ・ファームス）として給餌し、水は給水器（niple ad libitum）から飲むことができた。

予防接種および攻撃
二重油中水型アジュバント添加ワクチンの３種の製剤を上記のように調製し、それぞれ異なるＥ２抗原濃度、３２．０、８．０および２．０μｇ／投与量とした。ブタには筋肉内に一度接種したが、各ブタは左耳の後方２ｃｍのところに１回量（Ａ：２μｇのＥ２、Ｂ：８μｇのＥ２、Ｃ：３２μｇのＥ２、Ｄ：０μｇのＥ２）を受けた。対照群ＤはＤＯＥアジュバントのみを接種し、前哨用のブタにはまったく接種しなかった。予防接種の３週間後に前哨用を除く各動物に、ＣＳＦＶ株ブレスシア４５６６１０の１００ ５０％致死量（＝１００Ｖａ ＬＤ₅₀）を鼻腔内攻撃した。攻撃直前に前哨用をその群から隔離し、２４時間後に戻した。接種物のウイルス含量は家畜小屋から戻した後に採取したサンプルの滴定により定量した。

臨床的観察
ブタは動物飼育係が毎日チェックし、異常が見つかり次第記録し、要すれば、監督者の獣医を呼んだ。各群は給餌時および小屋の清掃前およびその間に１日少なくとも１５分間観察した。

食餌摂取の減少した群または個々の動物に注目した。
体温（直腸）は予防接種後９日間、また、攻撃後２０日間記録した。

攻撃後の血液分析
ＥＤＴＡ−血液サンプルを攻撃後、０、２、４、７、１０および１４日目に採取し、白血球および血小板数の変化をモニタした。血中の白血球（血球減少症）および血小板（血小板減少症）数減少はＣＳＦの典型的な徴候の一つである。通常のブタでは、白血球細胞と血小板に対する正常細胞計数は、それぞれ１１〜２３×１０⁹／Ｌおよび３２０〜７２０×１０⁹／Ｌの範囲にある。ＳＰＦのブタでは、これらの値がやや小さい；６〜１２×１０⁹／Ｌおよび３００〜７００×１０⁹／Ｌ。双方言及の範囲は各ブタで変動する。血液細胞の分析はメドニックRＣＡ５７０クールタ計数器により実施した。血球減少症および血小板減少は、細胞／血小板計数が、好ましくは１日以上、上記の最小数よりも顕著に低い場合と定義した。。

ウイルス拡散／排出およびウイルス検出
体温、白血球細胞と血小板計数、および前哨のセロコンバーションをパラメーターとして使用し、接種した動物からこれらの動物へとウイルスが伝播したことを検出した。死後の組織サンプルは以下の器官から採取した：扁桃腺、脾臓、腎臓、および回腸について、ウイルス抗原の存在につき直接免疫蛍光法により試験した。これら組織サンプルからの低温維持切片（厚さ４μｍ、各器官２切片）を固定化し、ポリクローナルブタ抗ペスチウイルスＦＩＴＣ−接合血清と培養した。洗浄後、切片を蛍光顕微鏡下で読取った。結果を陽性（＝蛍光性）または陰性（＝非蛍光性）として表した。

血清学的応答
すべてのブタの血清を予防接種後、０、２および３週目、および死亡時に採取した。サンプルを−２０℃にて保存し、ウイルス中和試験（ＶＮＴ）およびセディテスト（CeditestR）（ＣＳＦ特異抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ）によりアッセイした。血清中のＣＳＦＶ中和抗体タイタをミクロタイタシステムにより定量した。血清の段階２倍希釈液を、３０〜３００ＴＣＩＤ₅₀含有のＣＳＦＶ（ブレスシア株）懸濁液等容量と混合した。ＣＯ₂インキュベータ内３７℃で１時間培養した後、ウエル当たり約２５．０００ＰＫ１５細胞を添加した。４日後に、マイクロタイタプレートを上記のように処理し、顕微鏡下に読取った。ＣＳＦＶ中和タイタは、すべてのウイルスを中和する最高希釈の逆数として表した。

統計的評価
９５％防御的用量の決定は、≧５０のＣＳＦＶ中和Ａｂタイタが完全な防御を表わすという仮定にもとづいた。

結果
本セクション全体を通して動物数については表７または表８に示す。

予防接種後の臨床的観察
予防接種はブタに何ら悪影響を及ぼさず、食餌摂取も体温も正常のままであった。Ａ群およびＣ群には、軽い下痢、食欲不振、およびうつ症状が、予防接種後３日目に見られた。Ａ群からの１頭（ｎｏ．４４８）は全期間にわたり定常的に嘔吐し、成長が遅れた。Ｂ群からのブタｎｏ．４３８は一度嘔吐した。ブタｎｏ．４３４（Ｃ群、前哨）は体温がわずかに上昇したが、この動物は右後肢の跛行をわずらっていた。食餌摂取量は、予防接種から攻撃までの期間、１日１群当たり３ｋｇから６ｋｇに増加した。

攻撃後の臨床的観察
非予防接種対照動物は、攻撃後３日目（ｎｏ．５９）および６日目（ｎｏ．６０）にＣＳＦの徴候を示し始めた。発熱、群がり行動、震え、食欲喪失およびうつ症状が攻撃から１０日後の死亡時まで見られた。さらに、この動物は、チアノーゼ、後肢不全麻痺、下痢および重症の嘔吐を示した。両動物は瀕死の状態のときに殺した。

２μｇのＥ２で予防接種したブタ（Ａ群）はすべて攻撃の２〜３日後に病気の徴候を示し始め、主に、発熱、群がり、うつ症状および食欲不振を示した。発熱は２〜１０日に及び、最高体温（Ｔ_max）は４０．７〜４２．２℃で変動した。７日目以降、ブタの内、４４３〜４４６は発熱が収まり、食餌摂取量も攻撃前の量まで増大した。しかし、４４８のブタは９日目に死亡しているのが見つかり、４４７のブタは急性のＣＳＦ（痙攣、後肢不全麻痺）に懸り、同日瀕死の状態であるときに殺した。両前哨用は攻撃７〜９日後まで正常であったが、その後、急性のＣＳＦとなり、２０日目、瀕死の状態であるときに殺した。

Ｂ群およびＣ群の動物は、疾患の臨床徴候および持続期間が、Ｅ２抗原の有効量増大とともに軽くなった。

Ｂ群では、発熱（４３５〜４３９）が２７日目まで続き、Ｔ_maxは４０．２℃と４１．７℃の間で変動した。ブタｎｏ．４３６は非常に軽度の臨床徴候で攻撃に抵抗した。１頭のブタ（ｎｏ．４４０）は１８日後に急性のＣＳＦで死亡したが、瀕死の状態であるときに殺した。残り、Ｂ群からの５頭の動物は回復した。両前哨用は攻撃後１１〜１２日目まで正常であったが、その後、急性のＣＳＦとなり、２０日目に死亡させた。

Ｃ群では、４〜６日目から６頭の内２頭（４３０、４３１）に軽い発熱が見られ、Ｔ_maxは４０．５℃〜４１．２℃で変動した。臨床的徴候は、攻撃後６日目にわずかなうつ症状が見られた以外、注目すべきものはなかった。従前どおり、攻撃ブタｎｏ．４３０は嘔吐した。

両前哨用は実験終了時まで正常であった。
攻撃後の血液分析
Ａ群からは、ブタ（４５０）１頭のみ（前哨用）が明瞭な白血球減少および血小板減少を示した。ブタｎｏ．４４５および４４６は攻撃後、７日目および１０日目に、また、ブタ４４９は１０日目および１４日目に血小板減少となった。Ｂ群からのブタ１頭（４４０）は白血球減少および血小板減少を示したが、他は正常であった。両前哨用は１４日目に血小板減少となり始める徴候を示した。Ｃ群では、前哨用も含めて、白血球減少も血小板減少も検出しなかった。

両対照動物（ｎｏ．５９および６０）は７日目以降から血小板減少となった。
攻撃後のウイルス拡散およびウイルス抗原検出
家畜小屋から戻って後、接種量を逆滴定して、ウイルス力価を２．５５ＴＣＩＤ５０／ｍｌとした。ＣＳＦＶウイルス抗原（表７）は、Ａ群およびＢ群から選択した対照と前哨用の組織サンプルすべてに検出された。Ａ群およびＢ群において、６頭の接種した動物の内、１頭が陽性であった。Ｃ群では前哨用も含めて陽性がなかった。

血清学的応答
ＣＳＦＶでのセロコンバーションはＶＮＴにおいて力価≧２５と定義した。ＶＮＴに用いたブレスシアウイルスの量を定量するための逆滴定の結果は、４１ＴＣＩＤ５０／ウエルであった。

対照（Ｄ）または前哨用動物は本実験の間、セロコンバーションを受けなかった（表８）。Ａ群の動物６頭の内２頭が３週間後にセロコンバーションを受けた。しかし、６頭の内４頭は攻撃後、追加刺激を受けた（表８）。Ｂ群およびＣ群は予防接種後２１日目にセロコンバーションを受けたが、この動物はすべて攻撃後に追加刺激を受けた。後者のみが、当該動物において攻撃ウイルスの複製が成功していることを物語っている。

結論
動物１頭当たりのＰＤ₉₅投与量を一回につきＤＯＥアジュバント２ｍｌ中３２μｇのＥ２と決定した。この投与量により、毒性の非常に高いＣＳＦＶ株を攻撃したことによる疾患の臨床徴候が最小に止まり、接触した動物へのウイルス拡散も発生しない。要約すると、６頭のブタ４群（Ａ〜Ｄ）につき、筋肉内投与により、アジュバント（ＤＯＥ）２ｍｌ当たりそれぞれ３２（Ａ）、８（Ｂ）、２（Ｃ）および０μｇ（Ｄ）で予防接種した。２頭の非予防接種ブタを各群（Ａ〜Ｃ）内に置き、接触感染の原因となるウイルスの排出を検出した（前哨用）。３週間後、鼻腔内投与により毒性の非常に高いＣＳＦＶ株ブレスシア１００ＬＤ₅₀で動物を攻撃した。臨床学的、ウイルス学的および血清学的パラメーターを測定し、Ｅ２サブユニットワクチンの効能を評価した。予測どおりに、Ｃ群の動物は他の群の動物よりもより良好に攻撃に抵抗した。ウイルス抗原は、Ｅ２の最大投与量（３２μｇ）を接種した動物の組織サンプルに検出されず、この群には疾病も存在しなかった。ＰＤ₉₅用量は、≧５０のＮＰＬＡ力価（予防接種後２１日目）が完全な予防効果を与える（ウイルスの拡散がない）という仮定にもとづき計算した。この結果がＰＤ₉₅用量３２μｇ／頭である。

予防接種２週間および３週間後の１００ＬＤ₅₀毒性ＣＳＦＶによる攻撃に対し、その防御効果のレベルをさらに評価するために、６頭のブタ２群（Ａ〜Ｂ）を３２μｇのＥ２により筋肉内経路で予防接種した。２頭の非予防接種ブタを各群内（Ａ〜Ｂ）に置き、接触感染の原因となる予防接種ブタからのウイルスの排出を検出した。２週（Ａ）および３週（Ｂ）後、予防接種した動物および対照の動物を毒性の非常に高いＣＳＦＶ株ブレスシア１００ＬＤ₅₀で鼻腔内経路により攻撃した。予防接種の２週間および３週間後、臨床学的、ウイルス学的および血清学的パラメーターを測定し、Ｅ２サブユニットワクチンの効能を評価した。予測どおりに、Ｂ群はＡ群よりも臨床徴候が少なく、攻撃に抵抗した。前哨用へのウイルスの伝播はＡ群にのみ起こり、両群からの動物すべての白血球フラクションにウイルスが検出された。Ｂ群の動物１頭のみが予防接種の１４日目にセロコンバーションを受けていた（ｎｏ．４１４）。同一群からの動物１頭は２１日後にもセロコンバーションを受けなかったが、防御されており、発熱は２日間のみであり、攻撃後１１日以内にセロコンバーションを受けた。対照と前哨用の１頭（Ａ群）のみが白血球減少症と血小板減少症に罹患した。Ａ群およびＢ群動物からの組織サンプルいずれにもウイルス抗原は検出されなかった。結論として、動物はすべて単回投与での予防接種後２週間および３週間目の攻撃に対し防御されていた。

予防接種３ヵ月および６ヵ月後の１００ＬＤ₅₀毒性ＣＳＦＶによる攻撃に対し、その予防効果のレベルをさらに評価するために、６頭のブタ２群（Ａ〜Ｂ）を３２μｇのＥ２により筋肉内経路で予防接種した。２頭の非予防接種ブタを各群内（Ａ〜Ｂ）に置き、接触感染の原因となる予防接種ブタからのウイルスの排出を検出した。３ヵ月（Ａ）および６ヵ月（Ｂ）後、予防接種した動物および対照の動物を毒性の非常に高いＣＳＦＶ株ブレスシア１００ＬＤ₅₀で鼻腔内経路により攻撃した。この期間の後、臨床学的、ウイルス学的および血清学的パラメーターを測定し、Ｅ２サブユニットワクチンの効能を評価した。Ａ群およびＢ群からの動物はすべて攻撃に抵抗し、臨床徴候はわずかであった。そして対照のみが白血球減少症と血小板減少症に罹患した。前哨用へのウイルスの伝播は起こらなかった。また、両群から選択された白血球フラクションのいずれにもウイルスは検出されなかった。Ｂ群の動物１頭のみが予防接種後の２８日目にセロコンバーションを受けていた（ｎｏ．１９８３）。Ａ群、Ｂ群および前哨用動物のいずれの組織サンプルにもウイルス抗原は検出されなかった。結論として、すべての動物が単回投与での予防接種後３ヵ月および６ヵ月目の攻撃に対し防御されており、ウイルス伝播は起こらなかった。
０ ＢＶＤＶ株４８００、１５００２２および１７８００３を用い、実験的Ｅ２サブユニットワクチンを生成させた。これらの株のＥ２遺伝子はバキュロウイルス発現系において発現させた（ハルスト（Hulst）ら、1993、J. Viol. 67：5435〜5442）（リジュン（P.A.van Rijn）ら、1996、I)、Gen. Virol.、77：2737〜2745）。スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞系ＳＦ２１を、組換えバキュロウイルスの増殖とＥ２タンパク質の生産に用いた。ＳＦ２１細胞は無血清ＳＦ９００培地（ギブコＢＲＬ）中２８℃にて増殖した。ＳＦ２１細胞の集密単層を組換えバキュロウイルスにより、細胞当たり５ＴＣＩＤ₅₀（５０％組織培養感染用量）の感染多重度にて感染させた。４〜５日後、培養は８０〜９０％の細胞変性効果を示した。細胞を１５００×ｇで１０分間遠心分離し、バキュロウイルスとＥ２を含むその上清を収集し、−２０℃にて保存する。バキュロウイルスを不活化するために、臭化２−ブロモエチル−インミン（ＢＥＩ）での処理を標準手法に従い実施した。手短に説明すると、ＢＥＩ ６００μｌと１Ｍ−ＮａＯＨ６００μｌとを混合した。２０℃、３０分後、上清１５０ｍｌを加え、２０℃で２４時間攪拌した。次いで、２５％チオ硫酸２０ｍｌを加えた。バキュロウイルスの不活化はＳＦ２１細胞上、上清の滴定により確認した。

１ 実験的ＢＶＤＶワクチンは二重油中水エマルジョン中、Ｅ２含有上清からなっていた。該油は９０％マルコール５２（エッソ）および１０％モンタニド８０（セピック）を含んでいた。水性フラクション（ＰＢＳ＋）は９８％リン酸バッファ塩溶液、２％モンタノックス８０（セピック）および１００ｐｐｍチオメルサールを含んでいた。上清、油およびＰＢＳ＋は、１０：１１：１０の比で用いた。まず、上清と油を乳化し、次いでＰＢＳ＋を加え、乳化した。対照のワクチンは、野生型バキュロウイルスで感染させたＳＦ２１細胞の上清から同様に調製した。調製後、ワクチンは無菌であると判定された。

２ ３種ワクチンの抗原量は、発現されたタンパク質の同等性の故にほぼ同じであろうとする我々の当初の仮定は、間違っていた。抗原量の差は恐らく昆虫細胞での発現の差に原因がある。ワクチン１５００２２は用量当たり５５μｇのＥ２を含んでおり、２回の予防接種（０日および２１日目）後、胎児に対し防御的であった（ブラッシェ（Brusche）ら、1997、Vaccine、印刷中）。ワクチン４８００およびワクチン１７８００３は用量当たり１２μｇと１７μｇのＥ２をそれぞれ含んでおり、胎児に対し防御的ではなかった。この結果はＥ２タンパク質量と胎児の防御との間に相関性のあるこを示唆している。しかし、Ｅ２糖タンパク質の免疫原性の差と、攻撃株が胎盤を通過する能力のないことが、攻撃が異なる結果をもたらすことに対する説明となるかも知れない。非相同ＢＶＤＶの攻撃に対し、該ワクチンは防御しなかった。

３ この研究の結果はＢＶＤＶサブユニットワクチンのさらにる開発のために将来有望である。その理由は我々が、エンベロープ糖タンパク質Ｅ２での予防接種により胎児の防御を達成し得ることを示したからである。さらにそれはマーカーワクチンであり、予防接種した動物と野外ウイルス株との間に識別を可能とする。これは将来のＢＶＤＶ撲滅プログラムに照らして有利である。

検討
４ この開発された生産工程は、昆虫細胞内バキュロウイルスに挿入された遺伝子がエンコードする非相同タンパク質の最適生産を達成することを目的とする。バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）は異なる組換えタンパク質の産生に非常によく適合する。その理由は、正しいタンパク質の折りたたみと正確な翻訳後プロセシングが、動物とヒトへの応用のために生物学的に活性なタンパク質に至らしめるからである。バキュロウイルスは2つの非本質的遺伝子を含み、それは非常に強力なプロモーター、ｐ１０およびポリヘドリンプロモーターから転写される。ｐ１０遺伝子の欠失突然変異誘発（バン・オアーズ（van Oers）ら、J. Gen Virol. 74：563〜574；1993）は、それが細胞培養におけるウイルスの複製にとって必須ではないが、ｐ１０が細胞溶解において一つの役割を演じており、ｐ１０タンパク質が存在しないと、感染した細胞が損なわれないままに存在することの原因となり、感染細胞からの多角体の放出を妨ぎ、それによって再感染率を降下させるが、それ自体感染性ではないということを示した。遺伝子産物（ｐ１０（またはフィブリリン）およびポリヘドリン）は感染段階の後期に発現される。これらの遺伝子を、必要とするタンパク質の遺伝子に置換えても（ポリヘドリンプロモーターの場合）、理論的に、昆虫細胞培養の総タンパク質生産収率は５０％までとなるが、発現レベルは培養１リットル当たりポリヘドリンタンパク質１グラムを超えるものとなる（マイオレラ（Maiorella）ら、(1988) 組換えタンパク質生産のための大規模昆虫細胞培養。Bio/technology、6、1406〜1410）。感染多重度（ＭＯＩ、１ｍｌ当たりのウイルス密度と１ｍｌ当たりの細胞密度の比）は、タンパク質生産の最適化にとって重要なパラメーターである。感染多重度の低い感染であることの明白な理由は、ウイルス植菌量をできるだけ少なくしていることにある。もし感染が、５０Ｌ醗酵槽内でＭＯＩを０．１として１ｍｌ当たり２百万の細胞密度で起こるならば、その場合は、１×１０¹⁰のウイルスが必要となる。このことは約１リットルの植菌量を必要とすることである。さらに、かかる植菌量を造るための余分な生産工程が必要となる。付着培養の２つの主な欠点は、効率の悪い培地の使用と酸素量が制限されることである。水性液での酸素溶解度が比較的乏しいという事実のために、単層培養での細胞にとって、酸素は制限のある基質である。静置培養での最大細胞密度の決定因子は利用可能な表面である。その表面が細胞の単層で一旦被われると、細胞増殖は停止してしまうことになる。その結果、細胞密度は培地１ｍｌ当たり約１×１０⁶に留まる。懸濁培養では酸素の制限が存在せず、他の基質の利用可能性が細胞密度にとっての制限因子となる。この制限は酸素の制限よりもより高い細胞密度で起こり、したがって、細胞密度が静置培養におけるよりもより高くなる。酸素の制限は、溶解酸素濃度をモニタする酸素電極を使用することにより防止される。酸素がある値以下に落ちると、酸素は自動的に、培養槽の上部空間を経て散布によりまたは添加により、懸濁液に添加される。懸濁液を適度に攪拌することは均一な培養を保証し、そこでは基質の勾配が形成されず、また、細胞も過度に高い剪断力にさらされることがない。さらに、攪拌は感染細胞のウイルスを非感染細胞に効率的に移動させることになり、細胞のウイルス感染効率を高めることとなる。最初、細胞はわずかに約０．１〜０．３％が感染しているだけなので、残り９９．７〜９９．９％の細胞は増殖し、複製することが可能となる。感染細胞内で産生されるウイルス粒子は、感染後１２〜２０時間で放出される（ディーおよびシュラ（Dee，K.U. and Shuler, M.L.）1997、Biotechnology Progress, 13、14〜24）。細胞当たりに放出されるウイルス粒子数は１００〜２００であり、それが新たなサイクルにおいてそれまで非感染であった細胞を感染させる。ウイルス粒子が十分に産生され、培養物内に存在するすべての細胞を感染させるまでには、数回のサイクルを要する。目指すところは、培地が使い尽くされ、すべての代謝工程が停止するようになるまでに、最終の感染経路のタンパク質産生を完遂することである。また、最適以下の細胞密度で完全な感染を達成させることも望ましくない。というのは、培地が効率的に使用されなければ非相同タンパク質の容量収率も低くなるからである。ウイルス感染の全工程は、ポリヘドリン遺伝子がなお存在するという事実により、目視によりチェックすることができる。ウイルスの感染は細胞核に蓄積する密集したタンパク質粒子として観察することができる。細胞に対する剪断損傷を防止するためには、プルロニックＦ−６８を最終濃度が０．２％となるように培地に添加する。さらに、要すれば、消泡剤Ａを加えて、過度の泡立ちを防止するが、これもまた細胞死を招く。５０Ｌの培養に添加される消泡剤Ａの総量は平均で２０ｍｌである。細胞を感染させる最適ウイルス密度は計算することができる。この密度は、細胞の増殖率、新たなウイルス粒子が放出されるまでの感染後の時間、および感染細胞当たりに産生される新たなウイルス粒子の数に依存する。本発明により提供される方法の例証となるのはペスチウイルスＥ２タンパク質の産生である。このタンパク質は活性の高い抗原として知られていたが、ワクチン用または診断試験用のＥ２（フラグメント）の生産は常に不成功である。ＰＤ５０は２μｇと低い（特に、免疫原Ｅ２フラグメントを用いる場合）にもかかわらず、問題は、多数動物群の防御的予防接種を１頭当たり単回の予防接種で可能とするために、商業的に魅力のある方法で、十分な抗原性部分をもつワクチンの投与に十分な量を如何に集めるかである。この問題はとりわけ、ＣＳＦＶの予防接種に関連性がある。投与に際しては、ＣＳＦＶの予防接種は、一般に、ＣＳＦＶが突然発生した地域での集団活動で実施される。この場合には、膨大な数の動物を、比較的短期間で、迅速に予防接種することを求められる。かかる集団活動においては、適切な防御レベル（野生型ウイルスの感染に対し防御されるブタの数）を迅速に達成することが差し迫って重要である。防御を達成するために、最初の予防接種後二回目の予防接種まて数週間も待つことは、この疾患の制御を著しく妨害し、遅らせる。組換えにより発現したＥ２タンパク質を産生させる様々な方法の間には、バキュロウイルスで発現したＥ２（フラグメント）を比較するだけでも、違いが存在する。初期に報告されたＥ２タンパク質産生培養において、Ｅ２タンパク質（フラグメント）の収量は２０〜９０μｇ／ｍｌの間で変動する（ハルスト（Hulst）ら、J. Vir. 5435〜5442、1993；ハルストおよびムーアマン（Hulst and Moormann）、Cytotechnology、20：271〜279、1996）が、単回投与予防接種に必要な関連するＥ２抗原性部分を得るためには、モノクローナル抗体による免疫アフィニティ精製をさらに必要とする。他の方法（ＥＰ０３８９０３４に記載されたＥ２のフラグメントを使用する）は、この方法では昆虫細胞の上清から取得したＥ２をさらに免疫アフィニティ精製することなしに使用するが、それがＥ２ベースのワクチンであって、満足すべき（防御）免疫応答が得られるまでに、２回注射する。これらの問題は、とりわけ、該ワクチンを調製する出発原料、たとえば、細胞培養上清における関連する抗原性物質、この場合にはＥ２タンパク質（フラグメント）、の低濃度に関係する。理論的には、技術上既知の精製・濃縮法により抗原性部分をさらに蓄積することができるが、しかし、この方法では商業的に魅力のあるワクチン生産法に導き得ず、しかも１用量当たり高コストの原因ともなる。本発明方法により提供される方法を用いる生産工程では、我々の５０Ｌ容量醗酵槽において、定常的に約２００〜３００μｇ／ｍｌのＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質フラグメントを生成するに至り、理論的に、１回の培養当たり１００，０００頭の動物を予防接種するのに十分な量である。細胞はおおよそ１０⁷ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌを含むウイルス菌量１〜１０ｍｌにより、０．５〜１．５×１０⁶細胞／ｍｌの密度で感染される。この培養では、好ましくは、細胞の >５０〜８０％がＣＰＥを示したときに収得する。これは感染後約１００〜１５０時間である。初期Ｅ２タンパク質生産培養においては、細胞はＭＯＩ> １で（同時に）免疫されるが、タンパク質収量は本発明により提供されるものより３倍低くなる。本発明により提供される方法では、５０Ｌ容量の醗酵槽は、５Ｌの醗酵槽内で増殖した細胞懸濁液５Ｌにより、または１０Ｌの醗酵槽内で増殖した懸濁液のすべて１０Ｌにより接種する。初期細胞密度は約３×１０⁵細胞／ｍｌである。細胞は、この懸濁液にウイルスを加える前に、計算した細胞密度まで増殖させる。下流のプロセシングは精密濾過による細胞と多面体の除去とともに始まる。中空糸精密濾過装置を醗酵槽に結合し、原料を０．２２μｍの孔径をもつ濾過モジュールにポンプ輸送する。保持流動体は醗酵槽を再循環させ、浸透する流動体は１００Ｌの容器に収集する。濾過が完了したとき、現段階で無細胞ではあるが、感染性のバキュロウイルスをなお含む抗原溶液を１００Ｌ容器中で不活化する。一般に、臭化２−ブロモエチル−アンモニウム（ＢＥＡ）を、最終濃度が８〜１２ｍＭとなるように該懸濁液に加える。２Ｍ−ＮａＯＨを添加して、ｐＨを約５．８から８．２〜８．７に上昇させる。このｐＨ移動はＢＥＡをＢＥＩ（臭化２−ブロモエチル−インミン）に変換する。これはＤＮＡ不活化剤である。ｐＨを注意深くモニタして、６〜１０に調整し、温度は３４〜３９℃に維持する。不活化の６時間後に、抗原溶液を第２不活化容器に移す。これにより、容器中のすべての物質がＢＥＩと接触し、その結果、不活化されるであろうことが保証される。ウイルスを含むが、ＢＥＩを含まない液体のしずくが第１容器には存在し、第２容器には存在しないはずである。１０⁴〜１０⁷ｐｆｕ／ｍｌの濃度で存在するバキュロウイルスは、<１０^-7ｐｆｕ／ｍｌの値（１０ｍ³当たり<１個のウイルス粒子）まで分解される。これは、宿主動物を感染させ得るウイルスにもとづくウイルスに対して用いたのと同じ水準である（ＦＭＤ同様）。ブタはバキュロウイルスに対して宿主ではない。不活化した抗原の大部分は、水−油−水エマルジョンに剤形化するまで≦−２０℃に保存する。３２μｇのＥ２を含む単回投与物（投与容量２ｍｌ）は、古典的なブタコレラに対し、予防接種後２週間から少なくとも６ヵ月まで防御効果（ >ＰＤ９５）を与えるに十分である。生産工程は、該工程のスケールアップが簡単で、２５０Ｌまたはそれより大きい醗酵槽の使用が可能となるような方法で設計する。静置培養生産のスケールアップもまた簡単である（さらに多くの組織培養フラスコを使用するだけである）。しかし、５０Ｌ醗酵槽にて定常的に達成される総タンパク質生産には、約７０００個のＴ１７５組織培養フラスコを必要とする。細胞の増殖と感染は、酸素およびｐＨ−電極が存在するので、醗酵槽中でより良好にモニタし、調整することができる。組織培養フラスコでは、フラスコ同士の変動が多分存在するが、それを量的に決めることはできない。不活化は静置培養生産にて実施したように、容器中でさらにより正確にモニタし、調整することができる。ＢＥＶＳで発現される他のタンパク質の容量産生レベルは（我々の研究所にて）、もし細胞が本発明により提供される方法で増殖するならば、著しく改善される。たとえば、ウシＦＳＨの収率は、１０Ｌの醗酵槽を用いたとき、３〜４のファクタで増加する。細胞は２種の組換えバキュロウイルスそれぞれについて０．００３のＭＯＩで、１．１×１０⁶細胞／ｍｌの細胞密度で同時感染させた。ＢＶＤＶの異なるＥ２の、およびＥ^rnsタンパク質またはＢＶＤＶおよび／またはＣＳＦＶの収率は、振盪フラスコ中の懸濁培養において３倍に増加した。この方法は他の組換えタンパク質にも適用可能である。

長期培養実験におけるＥ２の安定性のデータを示す図である。 培養実験におけるＥ２の安定性のグラフである。 培養実験におけるＥ２の安定性のグラフである。 培養実験におけるＥ２の安定性のグラフである。 ＭＯ１実験のデータを示す図である。 ＭＯ１実験のデータを示す図である。 ＭＯ１実験のデータを示す図である。 ＭＯ１実験のグラフである。 ＭＯ１実験のグラフである。 ＭＯ１実験のグラフである。 ＭＯ１実験のグラフである。 ＭＯ１実験のグラフである。 ＭＯ１実験のグラフである。 ＭＯ１実験のグラフである。

Claims (17)

1. 培養容器中の増殖培地において昆虫細胞を増殖させ、
   膜貫通領域を伴わない古典的ブタ熱ウイルスＥ２たんぱく質をエンコードする組換えバキュロウイルス接種物で、０．０００１〜０．０１の前記細胞の感染多重度にて、前記細胞を感染させ、
   前記細胞の約半分以上が細胞変性効果を示すまで前記細胞を培養し、
   増殖培地から細胞性物質を除去し、
   前記細胞性物質から、免疫アフィニティ精製することなく、単回接種で古典的ブタ熱に対してＰＤ_９５のレベルの防御力を付与し得るＥ２サブユニットワクチンを調製する
   ことを特徴とする膜貫通領域を伴わない古典的ブタ熱ウイルスＥ２たんぱく質を含むＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
2. 前記細胞を５×１０^５〜１．５×１０^６個／ｍｌの密度にて感染させることを特徴とする請求項１記載のＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
3. 前記感染多重度が０．００１〜０．００５であることを特徴とする請求項１記載のＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
4. 前記感染多重度が０．００１〜０．００３であることを特徴とする請求項３記載のＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
5. 増殖培地中のＥ２たんぱく質の最終濃度が１００〜３００μｇ／ｍｌのときに、細胞性物質を除去することを特徴とする請求項１記載のＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
6. アジュバントを含めることによってＥ２サブユニットワクチンを調製することを特徴とする請求項１記載のＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
7. 前記アジュバントが二重油中水型エマルジョンから成ることを特徴とする請求項６記載のＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
8. 培養容器中の増殖培地において昆虫細胞を増殖させ、
   膜貫通領域を伴わない古典的ブタ熱ウイルスＥ２たんぱく質をエンコードする組換えバキュロウイルス接種物で、０．０００１〜０．０１の前記細胞の感染多重度にて、任意の時点で前記細胞を感染させ、
   前記細胞の約半分以上が細胞変性効果を示すまで前記細胞を培養し、
   増殖培地から細胞性物質を除去し、
   前記細胞性物質から、免疫アフィニティ精製することなく、単回接種で古典的ブタ熱に対してＰＤ_９５のレベルの防御力を付与し得るＥ２サブユニットワクチンを調製する
   ことを特徴とする膜貫通領域を伴わない古典的ブタ熱ウイルスＥ２たんぱく質を含むＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
9. 前記細胞を５×１０^５〜１．５×１０^６個／ｍｌの密度にて感染させることを特徴とする請求項８記載のＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
10. 前記感染多重度が０．００１〜０．００５であることを特徴とする請求項８記載のＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
11. 前記感染多重度が０．００１〜０．００３であることを特徴とする請求項１０記載のＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
12. 増殖培地中のＥ２たんぱく質またはそのフラグメントの最終濃度が１００〜３００μｇ／ｍｌのときに、細胞性物質を除去することを特徴とする請求項８記載のＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
13. アジュバントを加えることによってＥ２サブユニットワクチンを調製することを特徴とする請求項８記載のＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
14. 前記アジュバントが二重油中水型エマルジョンから成ることを特徴とする請求項１３記載のＥ２サブユニットワクチンの製造方法。
15. バキュロウイルス系にて産生される組換え古典的ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）Ｅ２糖たんぱく質を含むＥ２サブユニットワクチンにおいて、
    前記Ｅ２糖たんぱく質は、免疫アフィニティ精製されず、３２μｇの単回接種でＣＳＦＶ感染に対してＰＤ_９５のレベルの防御力を付与し、かつ
    前記Ｅ２糖たんぱく質は膜貫通領域（ＴＭＲ）を欠くことを特徴とするＥ２サブユニットワクチン。
16. さらにアジュバントを含むことを特徴とする請求項１５記載のＥ２サブユニットワクチン。
17. 前記アジュバントが二重油中水型エマルジョンから成ることを特徴とする請求項１６記載のＥ２サブユニットワクチン。

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