JP2007254482A - バキュロウイルスベクター発現系におけるタンパク質の発現 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記工程を含む古典的ブタ熱ウイルスE2バキュロウイルスタンパク質を含むワクチンの製造方法。当該タンパク質をエンコードする組換えバキュロウイルを選択する工程、少なくとも2リットルの十分な容量を備える培養容器において増殖培地中で昆虫細胞を増殖する工程、1×105〜1×106個/mlの密度の当該細胞を0.01未満のMOIにて当該バキュロウイルスの接種物で感染する工程、前記細胞の約半分以上が細胞変性効果を示すまで前記細胞を培養し、増殖培地中のE2たんぱく質の最終濃度が100〜300μg/mlのときに、細胞性物質を除去する工程、免疫アフィニティ精製することなく、ワクチンを調製する工程。当該製造法はさらに、組換え卵胞刺激ホルモンの製造に適用可能である。
【選択図】なし
Description
フラビウイルス科のペスチウイルス属は、従来、伝統的なブタ熱ウイルス(CSFV)、ボーダ病ウイルス(BDV)、およびウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV)からなる。いくつかのBVDVおよびCSFV株のゲノムは配列決定されている(Renardら、1987 EP特許出願第0208672号;Collettら、1988、Virology 165、191〜199;DengおよびBrock、1992、Virology 1991、865〜679;Meyersら、1989、Virology 171、555〜567;Moormannら、1990、Virology 177、184〜188)。BDVについて、未だ不完全なゲノムヌクレオチド配列のみが利用可能である。ペスチウイルスゲノムは、1つの大きなオープンリーディングフレームを含有する約12.5キロベースのポジティブ鎖RNA分子である。オープンリーディングフレームは、約4,000アミノ酸の推定のポリタンパク質に翻訳され、これはウイルスおよび細胞にコードされるプロテアーゼによりプロセスされる。オープンリーディングフレームは、2つの高度に保存された小さな非翻訳領域により隣接され、これらはおそらくゲノムの複製に関与する。5'非コード領域はまた、翻訳の開始において役割を果たす。
rbFSH)を適用することにより、有益であり得るようである。
1.SF21細胞の産生細胞培養物(PCS)の調製例
SF21作業用細胞種子(WCS)1.5mlを容れた凍結バイアル(細胞総数、4〜10×106細胞/ml)を20〜30℃の温度で融解する。融解後、バイアルの内容物を、無血清培地SF900II8.5mlを含む15ml容量ファルコンチューブに移し、懸濁させる。懸濁後、ファルコンチューブの内容物を100〜200×gで10分間遠沈し、細胞を沈殿させる。培地を廃棄し、ペレットを4〜6mlのSF900IIに懸濁する。懸濁した細胞を、10mlのSF900IIを容れた100ml容量の振盪フラスコに移す。フラスコを軌道旋回式シェーカの台上にのせ、40〜80rpm、26〜30℃で3〜7日間、細胞を培養する。細胞の増殖と細胞生存度は、工程途上サンプルを取出しモニタする。細胞密度が1.0〜6.5×106細胞/mlに達したとき、それぞれ100mlのSF900IIを容れた2個の500ml容量振盪フラスコに移す。これは10倍希釈の細胞に相当する。再度、フラスコを軌道旋回式シェーカの台上にのせ、40〜80rpm、26〜30℃で3〜7日間、細胞を培養する。細胞の増殖と細胞生存度は定常的に工程内コントロールによりする。細胞密度が1.0〜6.5×106細胞/mlに達したとき、二度目として、今回はそれぞれ100mlのSF900IIを容れた6〜11個の500ml容量振盪フラスコに移す。過剰の細胞材料は廃棄する。また、この場合、10倍の希釈を達成する。フラスコを軌道旋回式シェーカの台上にのせ、40〜80rpm、26〜30℃で3〜7日間、細胞を培養する。細胞の増殖と細胞生存度は定常的に工程内コントロールによりモニタする。細胞密度が1.0〜6.5×106細胞/mlに達したとき、該細胞を含む懸濁液500mlまたは1000mlを、それぞれ約4.5リットルまたは9リットルのSF900IIを容れた5リットルまたは10リットル醗酵槽に移す。これは10倍希釈の細胞に相当する。この細胞を26〜30℃で3〜7日間培養する。この懸濁液を定常的に攪拌する(50〜100rpm)。細胞の増殖と細胞生存度は定常的に工程内コントロールによりモニタする。細胞密度が1.0〜6.5×106細胞/mlに達したとき、5リットル容量醗酵槽の内容物を、約40リットルのSF900IIを容れた50L醗酵槽に移す。この細胞を、密度が±5〜15×105細胞/mlに達するまで26〜30℃で培養する。この懸濁液を定常的に攪拌する(50〜100rpm)。サンプルを工程内コントロール用に採取する。
上記の細胞懸濁液に、±107TCID50/mlを含む作業種子ウイルス(WVS)(BacE2[−])1〜2mlを添加する。細胞の70〜100%が細胞変性効果を示すまで、28℃にて3〜8日間培養する。培養の間に工程内コントロール用にサンプルを採取する。次に、この懸濁液を精密濾過による細胞除去により清澄とする。得られた濾液(すなわち、抗原溶液)を集め、不活化工程(3.3)を始めるまで≦−20℃にて保存する。工程内コントロール用にサンプルを採取する。抗原含量を定量するために、サンプルを、たとえば、抗原質量を定量するために、酵素結合免疫アッセイで、または水中タンパク質容量あたりの実質重量を定量するために、タンパク質アッセイで、あるいはかかる方法の併用により試験する。
ウイルスに臭化2−ブロモエチルアンモニウム(BEA)を10ミリモル/Lの濃度に加えることにより不活化する。pHを8.2〜8.7に、温度を34〜37℃に調節することにより、BEAを臭化2−ブロモエチル−インミン(BEI)に変換する。BEIはウイルスを不活化する活性成分である。ウイルス殺滅は工程内コントロール用サンプルを採取することによりチェックする。不活化には24〜72時間を要する。不活化後、10000リットルあたり1個未満の感染性粒子が存在する。ウイルスの不活化後、チオ硫酸ナトリウムを5〜25ミリモル/L添加し、pHを5.7〜6.3に調整することによりBEIを中和する。工程内コントロール用にサンプルを採取する。不活化し、中和した抗原溶液を1リットルおよび/または5リットル容量のバッグに移し、≦−20℃にて保存する。
凍結した抗原溶液を22〜28℃で融解し、SF900IIまたはPBSにより希釈し、50μg/mlの抗原溶液とする。抗微生物剤としてチオメルサールを100μg/mlまで加える。工程内コントロール用にサンプルを採取する。この溶液(すなわち、第1水相)を2〜8℃にて<3日間保存する。この間、マルコール(Marcol)52とモンタニド(Montanide)80とを混合する(9:1)ことにより油相を調製する。また、この溶液も2〜8℃にて3日を超えない範囲で保存する。油相は0.22μm−無菌フィルタにより無菌濾過する。工程内コントロール用にサンプルを採取する。最後に、第2水相をリン酸バッファー塩溶液(PBS)またはSF900IIをモンタノックス(Montanox)80と混合することにより調整し(98:2)、チオメルサールを最終濃度100μg/mlまで添加する。この溶液を使用時まで2〜8℃にて保存する(<3日間)。使用前、第1水相を無菌濾過する。工程内コントロール用にサンプルを採取する。第1水相と油相とを混合(1:1.1)することにより第1エマルジョンを調製する。このエマルジョンを2〜8℃にて3日以内保存する。工程内コントロール用にサンプルを採取する。二重油中水エマルジョンは、第1エマルジョンを第2水相で乳化することにより(2.1:1)調製する。二重エマルジョンはバイアルに詰めるまで隔離保存室内に2〜8℃にて保存する。工程内コントロール用にサンプルを採取する。
清浄室内において、二重エマルジョン溶液をクラスAゾーンにて無菌的に充填する。充填量は50、100または250mlバイアルに、それぞれ51、102または255mlである。充填容量は濾過容積の重量をチェックすることにより定常的にモニタする。充填直後、バイアルには栓をし、キャップを被せる。最後に、バイアルは隔離保存室内に2〜8℃で保存し、その後の品質管理を開始する。
目的
異なる正常条件下、長期間培養後の感染細胞培養物(MOI*0.0001)におけるE2タンパク質の安定性を検討するため。細胞培養におけるバキュロウイルス感染過程の溶菌性のために、感染サイクルの後期培地にプロテアーゼが放出されていると思われる。このことがE2タンパク質の分解と容量タンパク質レベルの低下に至らしめるのか否かが、本実験の命題である。
培地またはSF900IIと記載されている場合、0.2%プルロニックF68含有SF900II培地を意味する。
図1のデータおよび図2のグラフに見られるように、フラスコ2および3の細胞増殖曲線はおおよそ類似している。191hpiの後、それ以上の細胞計数はなされなかったが、その理由は事実上すべての細胞が死滅し、感染したからである。フラスコ2の139hpiサンプルはグラフから除外する。このサンプルの細胞計数は、前記のサンプルおよび以下のサンプル両方よりもはるかに高い。このことは、恐らくある種の沈殿がサンプル採取の前後に起こり、その結果、トリパンブルー溶液と混合したサンプルが不正確となったことを示している。この仮定は生存率と感染率両方が予測した結果と一致するという事実により確認される。このことは、感染培養物それ自体にはなんら異常なことが起こっていないことを意味する。この不正確なサンプル採取は、サンプル中のE2濃度になんら影響を与えることはないだろう。というのは、E2は培地には存在するが、細胞内には存在しないからである。
7.MOI実験例
目的
MOI(感染多重度、細胞当たりのウイルス数)、最大細胞密度、および容量計測E2含量間の関係をさらに検討すること。一方で、完全な細胞母集団の感染は培地が消費し尽くされるまでに完了しなければならないが、他方で、低細胞濃度の総母集団の感染は最適以下のタンパク質収量に至る。
培地というときは、SF900II培地を意味する。
この結果は、MOIと最適細胞密度との間に、さらに重要なことは、MOIとE2タンパク質収率との間に良好な相関があることを示す。このことは、MOI 0.001で感染した培養物の最大容量E2タンパク質収率を100%とした場合のグラフに見て取れる。それは容量E2タンパク質収率がMOIの減少とともに増大することを示す。0.0001のMOIまでは、細胞密度は、最大達成可能細胞密度に達する前に感染される。0.00001またはそれ以下のMOIを用いると、培養物の感染が終了する前に培地が消耗されてしまうという感染結果となり、最適以下のタンパク質収率となる。したがって、引き出される結論は、感染過程とE2の産生が完了するまでに培地が消尽しない限り、使用されるMOIが低い程、E2タンパク質収率が高くなるということである。
bFSHαおよび/またはbHSFβを発現する組換えバキュロウイルス
伝達ベクターpDW−アルファ−9.1およびpDW−ベータ−3.1を構築した。Sf21細胞はpDW−アルファ−9.1またはpDW−ベータ−3.1、および細胞外ウイルス粒子から単離した野生型(wt)AcNPV/M021DNA(PCT出願:WO96/25696)により同時移入した。β−ガラクトシダーゼ発現ポリヘドリン陽性プラークを単離し、bFSHαまたはbFSHβを発現するかについて、培地のELISAにより分析した。一つのプラーク精製したbFSHαウイルス(AcNPVα3.4)および一つのプラーク精製したbFSHβ(AcNPVβ1.4)を用い、それぞれ約107と108のTCID50をもつウイルス原液を調製した。FSHの産生は上記方法により生じ、産生レベルは17〜33μg/mlとなった。
病毒力の強いCSFV株ブレスシア(Brescia)100LD50の攻撃に対し、予防接種したブタの95%(PD50)を予防する、1回の予防接種後に必要とするE2用量(μg)の評価。
26頭の特異病原体陰性(SPF)ブタ(6〜7週令)を到着順に無作為に、8頭ずつの3群(A〜C)と2頭の1群(D)に分けた。これらの動物をID−DLOの高度封じ込め設備内にある家畜小屋B18、B19、B20およびB21に収容した。動物は3日間順化させる。動物は1日に1度、飼い葉桶で完全食物ペレット(ホープ・ファームス)として給餌し、水は給水器(niple ad libitum)から飲むことができた。
二重油中水型アジュバント添加ワクチンの3種の製剤を上記のように調製し、それぞれ異なるE2抗原濃度、32.0、8.0および2.0μg/投与量とした。ブタには筋肉内に一度接種したが、各ブタは左耳の後方2cmのところに1回量(A:2μgのE2、B:8μgのE2、C:32μgのE2、D:0μgのE2)を受けた。対照群DはDOEアジュバントのみを接種し、前哨用のブタにはまったく接種しなかった。予防接種の3週間後に前哨用を除く各動物に、CSFV株ブレスシア456610の100 50%致死量(=100Va LD50)を鼻腔内攻撃した。攻撃直前に前哨用をその群から隔離し、24時間後に戻した。接種物のウイルス含量は家畜小屋から戻した後に採取したサンプルの滴定により定量した。
ブタは動物飼育係が毎日チェックし、異常が見つかり次第記録し、要すれば、監督者の獣医を呼んだ。各群は給餌時および小屋の清掃前およびその間に1日少なくとも15分間観察した。
体温(直腸)は予防接種後9日間、また、攻撃後20日間記録した。
EDTA−血液サンプルを攻撃後、0、2、4、7、10および14日目に採取し、白血球および血小板数の変化をモニタした。血中の白血球(血球減少症)および血小板(血小板減少症)数減少はCSFの典型的な徴候の一つである。通常のブタでは、白血球細胞と血小板に対する正常細胞計数は、それぞれ11〜23×109/Lおよび320〜720×109/Lの範囲にある。SPFのブタでは、これらの値がやや小さい;6〜12×109/Lおよび300〜700×109/L。双方言及の範囲は各ブタで変動する。血液細胞の分析はメドニックRCA570クールタ計数器により実施した。血球減少症および血小板減少は、細胞/血小板計数が、好ましくは1日以上、上記の最小数よりも顕著に低い場合と定義した。。
体温、白血球細胞と血小板計数、および前哨のセロコンバーションをパラメーターとして使用し、接種した動物からこれらの動物へとウイルスが伝播したことを検出した。死後の組織サンプルは以下の器官から採取した:扁桃腺、脾臓、腎臓、および回腸について、ウイルス抗原の存在につき直接免疫蛍光法により試験した。これら組織サンプルからの低温維持切片(厚さ4μm、各器官2切片)を固定化し、ポリクローナルブタ抗ペスチウイルスFITC−接合血清と培養した。洗浄後、切片を蛍光顕微鏡下で読取った。結果を陽性(=蛍光性)または陰性(=非蛍光性)として表した。
すべてのブタの血清を予防接種後、0、2および3週目、および死亡時に採取した。サンプルを−20℃にて保存し、ウイルス中和試験(VNT)およびセディテスト(CeditestR)(CSF特異抗体を検出するためのELISA)によりアッセイした。血清中のCSFV中和抗体タイタをミクロタイタシステムにより定量した。血清の段階2倍希釈液を、30〜300TCID50含有のCSFV(ブレスシア株)懸濁液等容量と混合した。CO2インキュベータ内37℃で1時間培養した後、ウエル当たり約25.000PK15細胞を添加した。4日後に、マイクロタイタプレートを上記のように処理し、顕微鏡下に読取った。CSFV中和タイタは、すべてのウイルスを中和する最高希釈の逆数として表した。
95%防御的用量の決定は、≧50のCSFV中和Abタイタが完全な防御を表わすという仮定にもとづいた。
本セクション全体を通して動物数については表7または表8に示す。
予防接種はブタに何ら悪影響を及ぼさず、食餌摂取も体温も正常のままであった。A群およびC群には、軽い下痢、食欲不振、およびうつ症状が、予防接種後3日目に見られた。A群からの1頭(no.448)は全期間にわたり定常的に嘔吐し、成長が遅れた。B群からのブタno.438は一度嘔吐した。ブタno.434(C群、前哨)は体温がわずかに上昇したが、この動物は右後肢の跛行をわずらっていた。食餌摂取量は、予防接種から攻撃までの期間、1日1群当たり3kgから6kgに増加した。
非予防接種対照動物は、攻撃後3日目(no.59)および6日目(no.60)にCSFの徴候を示し始めた。発熱、群がり行動、震え、食欲喪失およびうつ症状が攻撃から10日後の死亡時まで見られた。さらに、この動物は、チアノーゼ、後肢不全麻痺、下痢および重症の嘔吐を示した。両動物は瀕死の状態のときに殺した。
攻撃後の血液分析
A群からは、ブタ(450)1頭のみ(前哨用)が明瞭な白血球減少および血小板減少を示した。ブタno.445および446は攻撃後、7日目および10日目に、また、ブタ449は10日目および14日目に血小板減少となった。B群からのブタ1頭(440)は白血球減少および血小板減少を示したが、他は正常であった。両前哨用は14日目に血小板減少となり始める徴候を示した。C群では、前哨用も含めて、白血球減少も血小板減少も検出しなかった。
攻撃後のウイルス拡散およびウイルス抗原検出
家畜小屋から戻って後、接種量を逆滴定して、ウイルス力価を2.55TCID50/mlとした。CSFVウイルス抗原(表7)は、A群およびB群から選択した対照と前哨用の組織サンプルすべてに検出された。A群およびB群において、6頭の接種した動物の内、1頭が陽性であった。C群では前哨用も含めて陽性がなかった。
CSFVでのセロコンバーションはVNTにおいて力価≧25と定義した。VNTに用いたブレスシアウイルスの量を定量するための逆滴定の結果は、41TCID50/ウエルであった。
動物1頭当たりのPD95投与量を一回につきDOEアジュバント2ml中32μgのE2と決定した。この投与量により、毒性の非常に高いCSFV株を攻撃したことによる疾患の臨床徴候が最小に止まり、接触した動物へのウイルス拡散も発生しない。要約すると、6頭のブタ4群(A〜D)につき、筋肉内投与により、アジュバント(DOE)2ml当たりそれぞれ32(A)、8(B)、2(C)および0μg(D)で予防接種した。2頭の非予防接種ブタを各群(A〜C)内に置き、接触感染の原因となるウイルスの排出を検出した(前哨用)。3週間後、鼻腔内投与により毒性の非常に高いCSFV株ブレスシア100LD50で動物を攻撃した。臨床学的、ウイルス学的および血清学的パラメーターを測定し、E2サブユニットワクチンの効能を評価した。予測どおりに、C群の動物は他の群の動物よりもより良好に攻撃に抵抗した。ウイルス抗原は、E2の最大投与量(32μg)を接種した動物の組織サンプルに検出されず、この群には疾病も存在しなかった。PD95用量は、≧50のNPLA力価(予防接種後21日目)が完全な予防効果を与える(ウイルスの拡散がない)という仮定にもとづき計算した。この結果がPD95用量32μg/頭である。
0 BVDV株4800、150022および178003を用い、実験的E2サブユニットワクチンを生成させた。これらの株のE2遺伝子はバキュロウイルス発現系において発現させた(ハルスト(Hulst)ら、1993、J. Viol. 67:5435〜5442)(リジュン(P.A.van Rijn)ら、1996、I)、Gen. Virol.、77:2737〜2745)。スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞系SF21を、組換えバキュロウイルスの増殖とE2タンパク質の生産に用いた。SF21細胞は無血清SF900培地(ギブコBRL)中28℃にて増殖した。SF21細胞の集密単層を組換えバキュロウイルスにより、細胞当たり5TCID50(50%組織培養感染用量)の感染多重度にて感染させた。4〜5日後、培養は80〜90%の細胞変性効果を示した。細胞を1500×gで10分間遠心分離し、バキュロウイルスとE2を含むその上清を収集し、−20℃にて保存する。バキュロウイルスを不活化するために、臭化2−ブロモエチル−インミン(BEI)での処理を標準手法に従い実施した。手短に説明すると、BEI 600μlと1M−NaOH600μlとを混合した。20℃、30分後、上清150mlを加え、20℃で24時間攪拌した。次いで、25%チオ硫酸20mlを加えた。バキュロウイルスの不活化はSF21細胞上、上清の滴定により確認した。
4 この開発された生産工程は、昆虫細胞内バキュロウイルスに挿入された遺伝子がエンコードする非相同タンパク質の最適生産を達成することを目的とする。バキュロウイルス発現ベクター系(BEVS)は異なる組換えタンパク質の産生に非常によく適合する。その理由は、正しいタンパク質の折りたたみと正確な翻訳後プロセシングが、動物とヒトへの応用のために生物学的に活性なタンパク質に至らしめるからである。バキュロウイルスは2つの非本質的遺伝子を含み、それは非常に強力なプロモーター、p10およびポリヘドリンプロモーターから転写される。p10遺伝子の欠失突然変異誘発(バン・オアーズ(van Oers)ら、J. Gen Virol. 74:563〜574;1993)は、それが細胞培養におけるウイルスの複製にとって必須ではないが、p10が細胞溶解において一つの役割を演じており、p10タンパク質が存在しないと、感染した細胞が損なわれないままに存在することの原因となり、感染細胞からの多角体の放出を妨ぎ、それによって再感染率を降下させるが、それ自体感染性ではないということを示した。遺伝子産物(p10(またはフィブリリン)およびポリヘドリン)は感染段階の後期に発現される。これらの遺伝子を、必要とするタンパク質の遺伝子に置換えても(ポリヘドリンプロモーターの場合)、理論的に、昆虫細胞培養の総タンパク質生産収率は50%までとなるが、発現レベルは培養1リットル当たりポリヘドリンタンパク質1グラムを超えるものとなる(マイオレラ(Maiorella)ら、(1988) 組換えタンパク質生産のための大規模昆虫細胞培養。Bio/technology、6、1406〜1410)。感染多重度(MOI、1ml当たりのウイルス密度と1ml当たりの細胞密度の比)は、タンパク質生産の最適化にとって重要なパラメーターである。感染多重度の低い感染であることの明白な理由は、ウイルス植菌量をできるだけ少なくしていることにある。もし感染が、50L醗酵槽内でMOIを0.1として1ml当たり2百万の細胞密度で起こるならば、その場合は、1×1010のウイルスが必要となる。このことは約1リットルの植菌量を必要とすることである。さらに、かかる植菌量を造るための余分な生産工程が必要となる。付着培養の2つの主な欠点は、効率の悪い培地の使用と酸素量が制限されることである。水性液での酸素溶解度が比較的乏しいという事実のために、単層培養での細胞にとって、酸素は制限のある基質である。静置培養での最大細胞密度の決定因子は利用可能な表面である。その表面が細胞の単層で一旦被われると、細胞増殖は停止してしまうことになる。その結果、細胞密度は培地1ml当たり約1×106に留まる。懸濁培養では酸素の制限が存在せず、他の基質の利用可能性が細胞密度にとっての制限因子となる。この制限は酸素の制限よりもより高い細胞密度で起こり、したがって、細胞密度が静置培養におけるよりもより高くなる。酸素の制限は、溶解酸素濃度をモニタする酸素電極を使用することにより防止される。酸素がある値以下に落ちると、酸素は自動的に、培養槽の上部空間を経て散布によりまたは添加により、懸濁液に添加される。懸濁液を適度に攪拌することは均一な培養を保証し、そこでは基質の勾配が形成されず、また、細胞も過度に高い剪断力にさらされることがない。さらに、攪拌は感染細胞のウイルスを非感染細胞に効率的に移動させることになり、細胞のウイルス感染効率を高めることとなる。最初、細胞はわずかに約0.1〜0.3%が感染しているだけなので、残り99.7〜99.9%の細胞は増殖し、複製することが可能となる。感染細胞内で産生されるウイルス粒子は、感染後12〜20時間で放出される(ディーおよびシュラ(Dee,K.U. and Shuler, M.L.)1997、Biotechnology Progress, 13、14〜24)。細胞当たりに放出されるウイルス粒子数は100〜200であり、それが新たなサイクルにおいてそれまで非感染であった細胞を感染させる。ウイルス粒子が十分に産生され、培養物内に存在するすべての細胞を感染させるまでには、数回のサイクルを要する。目指すところは、培地が使い尽くされ、すべての代謝工程が停止するようになるまでに、最終の感染経路のタンパク質産生を完遂することである。また、最適以下の細胞密度で完全な感染を達成させることも望ましくない。というのは、培地が効率的に使用されなければ非相同タンパク質の容量収率も低くなるからである。ウイルス感染の全工程は、ポリヘドリン遺伝子がなお存在するという事実により、目視によりチェックすることができる。ウイルスの感染は細胞核に蓄積する密集したタンパク質粒子として観察することができる。細胞に対する剪断損傷を防止するためには、プルロニックF−68を最終濃度が0.2%となるように培地に添加する。さらに、要すれば、消泡剤Aを加えて、過度の泡立ちを防止するが、これもまた細胞死を招く。50Lの培養に添加される消泡剤Aの総量は平均で20mlである。細胞を感染させる最適ウイルス密度は計算することができる。この密度は、細胞の増殖率、新たなウイルス粒子が放出されるまでの感染後の時間、および感染細胞当たりに産生される新たなウイルス粒子の数に依存する。本発明により提供される方法の例証となるのはペスチウイルスE2タンパク質の産生である。このタンパク質は活性の高い抗原として知られていたが、ワクチン用または診断試験用のE2(フラグメント)の生産は常に不成功である。PD50は2μgと低い(特に、免疫原E2フラグメントを用いる場合)にもかかわらず、問題は、多数動物群の防御的予防接種を1頭当たり単回の予防接種で可能とするために、商業的に魅力のある方法で、十分な抗原性部分をもつワクチンの投与に十分な量を如何に集めるかである。この問題はとりわけ、CSFVの予防接種に関連性がある。投与に際しては、CSFVの予防接種は、一般に、CSFVが突然発生した地域での集団活動で実施される。この場合には、膨大な数の動物を、比較的短期間で、迅速に予防接種することを求められる。かかる集団活動においては、適切な防御レベル(野生型ウイルスの感染に対し防御されるブタの数)を迅速に達成することが差し迫って重要である。防御を達成するために、最初の予防接種後二回目の予防接種まて数週間も待つことは、この疾患の制御を著しく妨害し、遅らせる。組換えにより発現したE2タンパク質を産生させる様々な方法の間には、バキュロウイルスで発現したE2(フラグメント)を比較するだけでも、違いが存在する。初期に報告されたE2タンパク質産生培養において、E2タンパク質(フラグメント)の収量は20〜90μg/mlの間で変動する(ハルスト(Hulst)ら、J. Vir. 5435〜5442、1993;ハルストおよびムーアマン(Hulst and Moormann)、Cytotechnology、20:271〜279、1996)が、単回投与予防接種に必要な関連するE2抗原性部分を得るためには、モノクローナル抗体による免疫アフィニティ精製をさらに必要とする。他の方法(EP0389034に記載されたE2のフラグメントを使用する)は、この方法では昆虫細胞の上清から取得したE2をさらに免疫アフィニティ精製することなしに使用するが、それがE2ベースのワクチンであって、満足すべき(防御)免疫応答が得られるまでに、2回注射する。これらの問題は、とりわけ、該ワクチンを調製する出発原料、たとえば、細胞培養上清における関連する抗原性物質、この場合にはE2タンパク質(フラグメント)、の低濃度に関係する。理論的には、技術上既知の精製・濃縮法により抗原性部分をさらに蓄積することができるが、しかし、この方法では商業的に魅力のあるワクチン生産法に導き得ず、しかも1用量当たり高コストの原因ともなる。本発明方法により提供される方法を用いる生産工程では、我々の50L容量醗酵槽において、定常的に約200〜300μg/mlのCSFV E2タンパク質フラグメントを生成するに至り、理論的に、1回の培養当たり100,000頭の動物を予防接種するのに十分な量である。細胞はおおよそ107TCID50/mlを含むウイルス菌量1〜10mlにより、0.5〜1.5×106細胞/mlの密度で感染される。この培養では、好ましくは、細胞の >50〜80%がCPEを示したときに収得する。これは感染後約100〜150時間である。初期E2タンパク質生産培養においては、細胞はMOI> 1で(同時に)免疫されるが、タンパク質収量は本発明により提供されるものより3倍低くなる。本発明により提供される方法では、50L容量の醗酵槽は、5Lの醗酵槽内で増殖した細胞懸濁液5Lにより、または10Lの醗酵槽内で増殖した懸濁液のすべて10Lにより接種する。初期細胞密度は約3×105細胞/mlである。細胞は、この懸濁液にウイルスを加える前に、計算した細胞密度まで増殖させる。下流のプロセシングは精密濾過による細胞と多面体の除去とともに始まる。中空糸精密濾過装置を醗酵槽に結合し、原料を0.22μmの孔径をもつ濾過モジュールにポンプ輸送する。保持流動体は醗酵槽を再循環させ、浸透する流動体は100Lの容器に収集する。濾過が完了したとき、現段階で無細胞ではあるが、感染性のバキュロウイルスをなお含む抗原溶液を100L容器中で不活化する。一般に、臭化2−ブロモエチル−アンモニウム(BEA)を、最終濃度が8〜12mMとなるように該懸濁液に加える。2M−NaOHを添加して、pHを約5.8から8.2〜8.7に上昇させる。このpH移動はBEAをBEI(臭化2−ブロモエチル−インミン)に変換する。これはDNA不活化剤である。pHを注意深くモニタして、6〜10に調整し、温度は34〜39℃に維持する。不活化の6時間後に、抗原溶液を第2不活化容器に移す。これにより、容器中のすべての物質がBEIと接触し、その結果、不活化されるであろうことが保証される。ウイルスを含むが、BEIを含まない液体のしずくが第1容器には存在し、第2容器には存在しないはずである。104〜107pfu/mlの濃度で存在するバキュロウイルスは、<10-7pfu/mlの値(10m3当たり<1個のウイルス粒子)まで分解される。これは、宿主動物を感染させ得るウイルスにもとづくウイルスに対して用いたのと同じ水準である(FMD同様)。ブタはバキュロウイルスに対して宿主ではない。不活化した抗原の大部分は、水−油−水エマルジョンに剤形化するまで≦−20℃に保存する。32μgのE2を含む単回投与物(投与容量2ml)は、古典的なブタコレラに対し、予防接種後2週間から少なくとも6ヵ月まで防御効果( >PD95)を与えるに十分である。生産工程は、該工程のスケールアップが簡単で、250Lまたはそれより大きい醗酵槽の使用が可能となるような方法で設計する。静置培養生産のスケールアップもまた簡単である(さらに多くの組織培養フラスコを使用するだけである)。しかし、50L醗酵槽にて定常的に達成される総タンパク質生産には、約7000個のT175組織培養フラスコを必要とする。細胞の増殖と感染は、酸素およびpH−電極が存在するので、醗酵槽中でより良好にモニタし、調整することができる。組織培養フラスコでは、フラスコ同士の変動が多分存在するが、それを量的に決めることはできない。不活化は静置培養生産にて実施したように、容器中でさらにより正確にモニタし、調整することができる。BEVSで発現される他のタンパク質の容量産生レベルは(我々の研究所にて)、もし細胞が本発明により提供される方法で増殖するならば、著しく改善される。たとえば、ウシFSHの収率は、10Lの醗酵槽を用いたとき、3〜4のファクタで増加する。細胞は2種の組換えバキュロウイルスそれぞれについて0.003のMOIで、1.1×106細胞/mlの細胞密度で同時感染させた。BVDVの異なるE2の、およびErnsタンパク質またはBVDVおよび/またはCSFVの収率は、振盪フラスコ中の懸濁培養において3倍に増加した。この方法は他の組換えタンパク質にも適用可能である。
Claims (17)
- 培養容器中の増殖培地において昆虫細胞を増殖させ、
膜貫通領域を伴わない古典的ブタ熱ウイルスE2たんぱく質をエンコードする組換えバキュロウイルス接種物で、0.0001〜0.01の前記細胞の感染多重度にて、前記細胞を感染させ、
前記細胞の約半分以上が細胞変性効果を示すまで前記細胞を培養し、
増殖培地から細胞性物質を除去し、
前記細胞性物質から、免疫アフィニティ精製することなく、単回接種で古典的ブタ熱に対してPD95のレベルの防御力を付与し得るE2サブユニットワクチンを調製する
ことを特徴とする膜貫通領域を伴わない古典的ブタ熱ウイルスE2たんぱく質を含むE2サブユニットワクチンの製造方法。 - 前記細胞を5×105〜1.5×106個/mlの密度にて感染させることを特徴とする請求項1記載のE2サブユニットワクチンの製造方法。
- 前記感染多重度が0.001〜0.005であることを特徴とする請求項1記載のE2サブユニットワクチンの製造方法。
- 前記感染多重度が0.001〜0.003であることを特徴とする請求項3記載のE2サブユニットワクチンの製造方法。
- 増殖培地中のE2たんぱく質の最終濃度が100〜300μg/mlのときに、細胞性物質を除去することを特徴とする請求項1記載のE2サブユニットワクチンの製造方法。
- アジュバントを含めることによってE2サブユニットワクチンを調製することを特徴とする請求項1記載のE2サブユニットワクチンの製造方法。
- 前記アジュバントが二重油中水型エマルジョンから成ることを特徴とする請求項6記載のE2サブユニットワクチンの製造方法。
- 培養容器中の増殖培地において昆虫細胞を増殖させ、
膜貫通領域を伴わない古典的ブタ熱ウイルスE2たんぱく質をエンコードする組換えバキュロウイルス接種物で、0.0001〜0.01の前記細胞の感染多重度にて、任意の時点で前記細胞を感染させ、
前記細胞の約半分以上が細胞変性効果を示すまで前記細胞を培養し、
増殖培地から細胞性物質を除去し、
前記細胞性物質から、免疫アフィニティ精製することなく、単回接種で古典的ブタ熱に対してPD95のレベルの防御力を付与し得るE2サブユニットワクチンを調製する
ことを特徴とする膜貫通領域を伴わない古典的ブタ熱ウイルスE2たんぱく質を含むE2サブユニットワクチンの製造方法。 - 前記細胞を5×105〜1.5×106個/mlの密度にて感染させることを特徴とする請求項8記載のE2サブユニットワクチンの製造方法。
- 前記感染多重度が0.001〜0.005であることを特徴とする請求項8記載のE2サブユニットワクチンの製造方法。
- 前記感染多重度が0.001〜0.003であることを特徴とする請求項10記載のE2サブユニットワクチンの製造方法。
- 増殖培地中のE2たんぱく質またはそのフラグメントの最終濃度が100〜300μg/mlのときに、細胞性物質を除去することを特徴とする請求項8記載のE2サブユニットワクチンの製造方法。
- アジュバントを加えることによってE2サブユニットワクチンを調製することを特徴とする請求項8記載のE2サブユニットワクチンの製造方法。
- 前記アジュバントが二重油中水型エマルジョンから成ることを特徴とする請求項13記載のE2サブユニットワクチンの製造方法。
- バキュロウイルス系にて産生される組換え古典的ブタ熱ウイルス(CSFV)E2糖たんぱく質を含むE2サブユニットワクチンにおいて、
前記E2糖たんぱく質は、免疫アフィニティ精製されず、32μgの単回接種でCSFV感染に対してPD95のレベルの防御力を付与し、かつ
前記E2糖たんぱく質は膜貫通領域(TMR)を欠くことを特徴とするE2サブユニットワクチン。 - さらにアジュバントを含むことを特徴とする請求項15記載のE2サブユニットワクチン。
- 前記アジュバントが二重油中水型エマルジョンから成ることを特徴とする請求項16記載のE2サブユニットワクチン。
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