DE69834346T2 - Proteinexpression in baculovirus-vektor expressionsystemen - Google Patents

Proteinexpression in baculovirus-vektor expressionsystemen Download PDF

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Erhöhen der Expression von Proteinen oder Polypeptiden in Baculovirus-Expressions-Vektor-Systemen. Als rekombinante DNA-Techniken entwickelt wurden, waren die Erwartungen in Bezug auf die Proteinproduktion in großem Maßstab mittels genetisch veränderter Bakterien hoch. Die Mehrzahl der Proteine, die kommerziell attraktiv sind, unterliegen jedoch notwendigerweise posttranslationellen Veränderungen, bevor sie biologisch aktive Proteine werden können. Infolgedessen werden heutzutage häufiger Tierzellen zur Herstellung rekombinanter Proteine verwendet.
  • Unter den Tierzellen gewinnen Insektenzellen eine immer größere Bedeutung für die Produktion von rekombinanten Proteinen. Ein brauchbares und vielseitiges Baculovirus-Vektor-System, das Insektenzellen verwendet, wurde entwickelt. Daten zur Physiologie von Insektenzellen sind recht spärlich vorhanden, dennoch werden Vakzine, die mittels rekombinanter Baculoviren hergestellt werden, im Allgemeinen gut vertragen. Ein Beispiel ist die Verwendung eines Baculovirus exprimierten gp160 Hüllproteins des humanen Immunodefizienz-Virus-Typ I als ein möglicher AIDS-Impfstoff in klinischen Tests.
  • Bis jetzt ist die industrielle Produktion von Baculovirus exprimierten Proteinen in Insektenzellen beschränkt auf Bioreaktoren bis zu etwa 10 Litern. Für eine Produktionssteigerung bieten Suspensionskulturen die besten Möglichkeiten. Bei Produktionen in großem Maßstab (siehe Tramper et al., Rec. Adv. Biotech., 1992, 263-284; Power and Nielsen, Cytotechnology 20: 209-219, 1996) sollte besondere Beachtung solchen Faktoren gelten, die das Zellwachstum und die Virusproduktion beeinflussen. Abweichungen bei diesen Faktoren haben einen großen Einfluss auf das Endniveau der Produktion rekombinanter Proteine.
  • Baculoviren sind gekennzeichnet durch stäbchenförmige Viruspartikel, die im Allgemeinen durch Einschlusskörper (auch Polyhedra genannt) eingeschlossen sind. Die Familie der Baculoviridae kann in zwei Unterfamilien unterteilt werden: die Eubaculovirinae, enthaltend zwei Arten von eingeschlossenen Viren: den nuklearen Polyhedrosis-Virus (NPV) und den Granulose-Virus (GV), sowie die Unterfamilie der Nudobaculovirinae, enthaltend nicht-eingeschlossene Viren. Die Zell- und Molekularbiologie der Autographa californica (Ac) NPV wurde genauer untersucht.
  • Viele Proteine wurden in Insektenzellen exprimiert, die mit einem rekombinanten Baculovirus, der dieses Protein kodiert, infiziert waren. Kodieren bedeutet, dass diese Viren mit einer Nuklein-Säuresequenz, die ein heterologisches Protein kodiert, versehen werden, und diese desweiteren häufig mit regulierenden Nuklein-Säuresequenzen, wie beispielsweise einem Promoter, versehen werden. In den meisten Fällen wird der Polyhedrin-Promotor dazu verwendet, um ein Fremdgen zu exprimieren, der p10-Promotor ist jedoch genauso zweckdienlich und wird auch benutzt.
  • Für die Infektion mit rekombinanten Baculoviren gibt es verschiedene Zelllinien. Die Zelllinie SF-21 stammt vom Ovarialgewebe des Eulenfalters (Spodoptera frugiperda). Ein klonales Isolat, das SF-9, erhältlich aus der American Type Culture Collection (CRL 1711), stellt mehr oder weniger eine Standard-Zelllinie für In-Vitro-Produktionen rekombinanter Viren dar und soll bei der Herstellung rekombinanter Viren besser sein. Andere Zelllinien sind z.B. die Hi-Five-Zelllinie und die Tn-368- und Tn-368A-Zelllinien, die von der Kohlspannerraupe (Trichoplusia ni) abstammen. Die am meisten verwendeten Medien, in denen Insektenzellen gezüchtet werden, sind das TNM-FH, BML-TC/10 und IPL-41. Diesen Medien werden normalerweise mehr oder weniger festgelegte Komponenten zugesetzt, wie zum Beispiel Seren von Säugetieren, insbesondere das Serum von Kalbsföten. Serum-Ersatzstoffe wurden auch auf Insektenzellen-Kulturen hin angewendet, und serumfreie Medien wie das Ex-cell 400TM und Sf900 sind handelsüblich.
  • Insektenzellen wachsen im Allgemeinen genauso auf soliden Trägern wie in Suspensionen, es wird jedoch berichtet, dass sie eine größere Ausbeute von Viren bereitstellen, wenn sie auf soliden Trägern wachsen. Die Infektion ist am wirksamsten, wenn Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase infiziert werden, die Menge an Polyhedrin und Viren, die pro Zelle produziert werden, weicht dennoch nicht signifikant von den Zellen ab, die während anderer Stadien des Zell-Zyklus infiziert wurden. Die Zelldichte hat einen großen Einfluss auf die Virusproduktion. Insektenzellen können eine Art von Kontakthemmung aufweisen, woraus sich eine reduzierte Virusproduktion bei einer höheren Zelldichte ergibt.
  • Die anfängliche Infektionsmultiplizität (MOI), welche die Anzahl der infektiösen Viren pro Zelle angibt, beeinflusst im Allgemeinen sowohl die infizierten Zellen als auch die Anzahl der Polyhedra pro Zelle am Infektionsende. Die optimale MOI für die Virenproduktion wird im Allgemeinen bei etwa 20–30 angesiedelt. In einer Studie (Licari and Bailey, Biotech. Bioeng., 37: 238-246, 1991) mit einer rekombinanten Baculovirus β-Galaktosidase-Expression wurden Sf-9-Zellen mit MOI-Werten zwischen 0 und 100 infiziert. Die β-Galaktosidase-Ausbeute stieg an und die Zelldichte nahm mit der Zunahme der MOI ab. Es wird allgemein davon ausgegangen, dass die Zu- oder Abnahme der MOI nur einen begrenzten Einfluss auf die maximal erreichbare Ausbeute eines rekombinanten Proteins pro infizierter Zelle hat. Bei der Wahl einer niedrigen MOI kann der Virenbestand, der für die Infektion nötig ist, jedoch reduziert werden und das Risiko, defekte störende Partikel des Baculovirus zu erzeugen, wird verringert. Wenn eine Batch-Kultur mit Insektenzellen mit einer hohen MOI infiziert wird (> 5), läuft der darauf folgende Infektionsprozess weitgehend synchron ab, so dass z.B. alle Zellen simultan den Infektionszyklus durchlaufen. Wenn Zellen in einer Batch-Kultur mit einer MOI von 1–5 infiziert werden, laufen die Vorgänge in der Kultur nicht mehr synchron ab. Die Kultur besteht zu Anfang aus nichtinfizierten Zellen und Zellen in unterschiedlichen Stadien ihres individuellen Infektions-Zyklus, bis alle Zellen infiziert wurden und die Produktion des gewünschten Proteins beendet ist. Im Allgemeinen sind die Produktionsniveaus in solchen Kulturen erheblich niedriger. Das Verhalten in der Kultur ist die Kombination des Verhaltens der einzelnen Zellen, die sich in unterschiedlichen Phasen der Produktion befinden; dies erklärt das suboptimale Produktionsniveau. In einer kontinuierlichen Kultur werden ständig nichtinfizierte Zellen hinzugegeben und die Kultur wird demnach asynchron infiziert.
  • Mit Hilfe von mathematischen Modellen hält man es für möglich, komplexe Verhaltensweisen wie jene, die man bei der Infektion von Zellen bei einer niedrigen MOI oder bei der Ausbreitung von Viren in einem kontinuierlichen Kultur-System beobachtet hat, vorherzusagen. Eine rein empirische Analyse der gleichen Phänomene wird als sehr schwierig eingestuft, wenn nicht als unmöglich. Derzeit sind drei Modelle bekannt, das Licari & Bailey, das de Gooijer und das Power & Nielsen-Modell. Diese sind, trotz ihrer Komplexität und den Bemühungen, die in ihre Entwicklung gesteckt wurden, alles Modelle der ersten Generation, denn sie fordern für die Erklärung des Verhaltens der exprimierten Baculoviren ein Modell für das unter der Kontrolle eines Polyhedrin-Promotors exprimierte rekombinante Protein (β-Galaktosidase). Diese Modelle fassen umfangreich unser derzeitiges quantitatives Verständnis der Interaktion von Baculovirus und Insektenzellen zusammen, wenn es sich als Black Box System darlegt, bei dem der DNA- und RNA-Akkumulation und dem Infektionszyklus keine Beachtung geschenkt werden. Die bindenden und anfänglichen Infektionsprozesse werden immer noch wenig quantitativ verstanden und weitere Forschungsarbeiten auf diesem Gebiet sind dringend notwendig.
  • Die Baculovirus-Expressions-Systeme stellen ein wirksames Werkzeug für die Produktion von rekombinanten Proteinen dar. Für größere Produktionen können verschiedene Anordnungen von Zellkulturen verwendet werden. Diese Systeme müssen jedoch weiterhin optimiert werden, damit ihr Potenzial voll ausgenutzt werden kann. Für die kommerzielle Anwendung ist eine kostengünstige Produktion in industriellem Maßstab eine Grundvoraussetzung. Polyhedra-Produktionssysteme müssen für großangelegte Zellkulturen erheblich verbessert werden, um dem Bedarf des Marktes nach einem wettbewerbsfähigen Produkt gerecht zu werden.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren für eine umfangreiche Produktion des rekombinanten Pestivirusproteins E2 oder Erns oder der immunogenischen Fragmente dieses Proteins bzw. FSH bereit durch Anwendung des Baculovirus-Expressions-Systems, um dadurch die Ausbeute des gewünschten Proteins zu steigern oder zu verbessern. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Produktion und Erhöhung der Ausbeute eines rekombinanten Proteins in einer Kultur mit Insektenzellen bereit, die die Auswahl eines rekombinanten Baculovirus, der das besagte Protein kodiert, sowie die Aufzucht von Insektenzellen in einem Zuchtmedium in einem Kulturbehälter und die Infektion der Zellen mit einer MOI zwischen 0,005 und 0,00025 beinhaltet.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Steigerung der Ausbeute eines rekombinanten Pestivirusproteins E2 oder Erns oder immunogenischer Fragmente dieses Proteins bzw. FSH bereit, welche in einer Kultur mit Insektenzellen produziert werden, was die Auswahl eines rekombinanten Baculovirus, der das besagte Protein kodiert, das Züchten von Insektenzellen in einem Wachstumsmedium in einer Kulturschale und die Infektion der Zellen mit einem Inokulum von mindestens einem Baculovirus mit einer MOI von < 0,01 beinhaltet. Die Steigerung der Ausbeute war Gegenstand verschiedenster Forschungsgruppen. So untersuchten zum Beispiel Chen et al (Drug metabolism and Disposition: 24, 399-405, 1997) die Möglichkeit, die MOI für einen Versuch der Koinfektion zu optimieren, wobei zwei verschiedene Baculovirus exprimierte Proteine in einer Kultur mit Insektenzellen hergestellt wurden. Im Gegensatz zu den bis dato beschriebenen Ergebnissen setzen die Autoren für ihre zwei Proteine die optimale MOI bei etwa 0,015 bis 0,03 fest. Die Abnahme der MOI auf < 0,01 reduzierte die Ausbeute des nach Chen et al. entwickelten Koinfektionssystems. Radford et al. (Cytotechnology 24, 73-81, 1997), die sich nicht davon abbringen ließen, ein System der Koinfektion zu untersuchen, weisen klar darauf hin, dass die MOIs stets > 1 sein müssen, um die Ausbeute am Ende des Prozesses zu maximieren, wobei auch dies im Gegensatz zu den Forschungsergebnissen der vorliegenden Erfindung steht. Sie erklären, dass es unmöglich ist, größere Mengen an Proteinen und Viren pro Zelle unter Verwendung einer niedrigen MOI herzustellen und empfehlen stattdessen eine Anpassung der Infektionsdauer (TOI).
  • Andere wie Nguyen et al (J. Biotech. 31, 205-217, 1993) sehen keine Lösung in einer Veränderung der MOI, zielen jedoch darauf ab, die Ausbeute durch die Verwendung von Fed-Batch-Kulturen oder durch Veränderungen der Temperatur, bei der der Virus gezüchtet wird (Wu et al., Cytotechnology, 9, 141-147, 1992; King et al., Biotechnol., Bioeng, 38, 1091-1099, 1991) sowie die Vermeidung des Virus-Wachstums unterhalb einer MOI von < 0,01, zu erhöhen.
  • Diese früheren Ergebnisse unterscheiden sich deutlich von denjenigen, die diese Beschreibung liefert (siehe zum Beispiel 1), bei der Kulturen mit einer MOI von < 0,01 (z.B. 0,003, 0,001, oder sogar 0,0001) infiziert wurden und eine höhere Ausbeute erzielten als solche, die mit einer MOI von 0,01 oder 0,1 infiziert wurden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zur Produktion und Steigerung der Ausbeute eines rekombinanten Proteins in Kulturen mit Insektenzellen bereit, die nicht in Monolayer-Kulturen gezüchtet werden. Herkömmliche Labormethoden zur Herstellung von kleinen Mengen von Proteinen im Baculovirus-Expressions-Vektorsystem verwenden Monolayer-Kulturen mit Insektenzellen in Kulturfläschchen. Diese statischen Kulturen werden normalerweise mit einer hohen MOI infiziert, um eine synchrone Infektion zu gewährleisten. Es ist von besonderer Wichtigkeit, dass alle Zellen infiziert sind, bevor der Monolayer konfluent geworden ist, da die Kontakthemmung zu metabolischen Veränderungen in den Zellen führt, was die Ausbeute des Endproduktes beeiträchtigen kann. Da es schwierig ist, die Zelldichte in Monolayer-Kulturen akkurat zu bestimmen, ist es unmöglich, MOI-Experimente durchzuführen. Es ist sogar noch nutzloser, für die Infektion der Kulturen eine niedrige MOI (< 0,01) festzulegen. Sowohl die Über- als auch die Unterschätzung der Zelldichte im Moment der Infektion führt zu einer signifikant suboptimalen Ausbeute des Proteins. Routinemäßig arbeitet man mit einer hohen MOI, die eine synchrone Infektion der gesamten Zellpopulation gewährleistet. Hierbei sind jedoch große Virus-Bestände nötig, um die Monolayer-Kultur zu infizieren und eine optimale Ausbeute zu erreichen.
  • Die Massenproduktion von Proteinen durch Monolayer-Kulturen bedeutet lediglich, dass mehr Gewebekulturfläschchen verwendet werden. Die Produktion einer großen Menge von Proteinen unter Verwendung von Monolayer-Kulturen ist sehr laborintensiv. Es ist außerdem nicht möglich, bedeutsame Kulturparameter wie die Konzentration von gelöstem Sauerstoff und den pH-Wert zu regulieren und/oder zu beobachten.
  • Die Erfindung stellt nun ein für alle Insektenkulturen brauchbares Verfahren bereit sowie die Erkenntnis, dass eine niedrige MOI anders als in Monolayer-Kulturen bei Insektenkulturen günstig für die Optimierung der Ausbeute ist.
  • Anders als bei Monolayer-Kulturen können verschiedene Arten von Kulturschalen für die Aufzucht von Insektenzellen verwendet werden. Das Ziel bei der Einrichtung eines Fermenters ist es, eine genügende Belüftung und eine hohe Zelldichte zu ermöglichen und die Schubkräfte gleichzeitig so niedrig wie möglich zu halten (Tramper et al. In: Recent advantages in biotechnology (eds. Vardar-Sukan and Sukan) 1992). Bei der Mehrheit der Fälle, die in der Literatur beschrieben werden, wird ein Bioreaktor Rührtank, der mit einem Gas Sparger ausgestattet ist, benutzt. Bei dieser Art von Behältern wird Homogeneität durch die Verwendung eines Impellers hergestellt. Dieser Typus von Fermentern kann in verschiedenen Weisen betrieben werden. Zunächst mit der Batch-Methode. Diese ist die unkomplizierteste und einfachste Methode. Zellen werden kultiviert, der Virus hinzugefügt und das Produkt wird am Ende der Infektion entnommen. Eine kompliziertere Methode ist die Fed-Batch-Kultur. Eine konzentrierte Mischung aus Nährstoffen wird der Kulturschale beigefügt, um eine höhere Zelldichte und eine höhere volumetrische Ausbeute des Produktes zu erreichen (Nguyen et al., 1993, Journal of Biotechnology Vol. 31, 205-217). Dies ist komplizierter, da nicht immer klar ist, welcher der limitierende Nährstoff ist. Das Weglassen einer Nährstofflimitierung und die Hinzufügung dieses Substrats führt sofort zu einer anderen Substratlimitierung und demnach nicht notwendigerweise zu einer gesteigerteren Ausbeute des Produktes.
  • Eine andere Mischmethode wird in Airlift-Bioreaktoren angewandt (Wu et al. 1992 Cytotechnology Vol. 9, 141-147). Dieser Typus von Behältern besteht aus zwei Zylindern. Der Zylinder mit dem kleinsten Durchmesser (Entnahmeröhrchen) wird in den Zylinder mit dem größeren Durchmesser (Downcomer) eingesetzt. Im inneren Zylinder wird Luft oder ein anderes Gas verteilt, so dass dadurch ein ansteigender Strom entsteht. Ganz oben auf dem Fermenter verlässt das Gas den Strom und läuft an der Außenseite des inneren Zylinders nach unten. Auf diese Weise wird, bedingt durch den Unterschied der Dichte im Entnahmeröhrchen und im Downcomer, allein durch die Gas-Durchleitung sowohl Belüftung als auch Homogeneität erreicht. Diese Methode kann die Schubkraft reduzieren. Indes wird eine kontinuierliche Belüftungsrate benötigt, um eine geeignete Mixtur zu erhalten.
  • Ein anderes Verfahren zur Erhöhung der Dichte der Lebendzellen in einem Fermenter besteht in der Hinzufügung eines Spinfilters oder einer anderen Vorrichtung zur Retention der Zellen. Dies wird Perfusion genannt. Dadurch wird es möglich, Abfallstoffe aus dem Fermenter zu entfernen und frisches Medium hinzuzufügen, während die Zellen im Fermenter zurückgehalten werden. Diese Methode bedarf vieler zusätzlicher Ausstattungselemente und eines komplizierteren Fermenter-Betriebs (Caron et al. 1994 Biotechnology and Bioengineering Vol. 43, 881-891). Desweiteren wird von Methoden wie dem makroporösen Bett und der Sperre in einer Gel-Matrix berichtet. Diese Methoden beruhen auf dem Zurückhalten der Zellen auf oder in einer Matrix, um dadurch Abfallstoffe entfernen und frisches Medium hinzufügen zu können, ohne die Zellkultur zu verdünnen. Wären Zelldichte, Kontakthemmung und andere damit zusammenhängende Probleme von Monolayer-Kulturen in den Griff zu bekommen, könnte ein Verfahren gemäß der Erfindung nicht nur in den verschiedenen obigen Kultur-Systemen, sondern auch in der Monolayer-Kultur Anwendung finden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt zum Beispiel ein Verfahren zur Produktion und Steigerung der Ausbeute eines rekombinanten Proteins in Kulturen mit Insektenzellen bereit, welches die Auswahl eines rekombinanten Baculovirus, der besagtes Protein kodiert, umfasst, das Züchten von Insektenzellen in einem Wachstumsmedium in einer Kulturschale mit genügendem Volumen, um mindestens 2 Liter zu fassen und die Infektion der Insektenzellen mit einem Inokulum von mindestens einem Baculovirus mit einer MOI von < 0,01 PFU oder besagtem Baculovirus/Zelle. Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, bei dem erheblich niedrigere MOIs als zum Beispiel die MOI von 1–5, die zu einer asynchron infizierten Kultur führt, verwendet werden. Durch die Infektion der Insektenkulturen mit einem Baculovirus und einer MOI, wie sie die Erfindung bereitstellt, wird ein optimaler Ausgleich zwischen der Replikationsgeschwindigkeit der Zellen und der Replikationsgeschwindigkeit des Virus erreicht, so dass eine optimale Expression des gewünschten Proteins stattfindet. Ein Verfahren, das die Erfindung bereit stellt, kann problemlos an höhere oder niedrigere Zelldichten angepasst werden, indem gleichzeitig die MOI angepasst wird, wobei das relative Verhältnis von verfügbaren Viruspartikeln für die Infektion der Zellen in den verschiedenen Phasen der Replikation entsprechend der MOIs und der Dichten, die die Erfindung bereitstellt, beibehalten wird. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung umfasst das Züchten der Zellen in einer Kulturschale mit einem genügenden Volumen, um mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20 und insbesondere mindestens 50 oder 250 Liter Wachstumsmedium aufzunehmen, so dass die in der Baculovirus-Kultur exprimierten heterologischen Proteine erhöht werden können. So kann man zum Beispiel eine Kulturschale mit einem Volumen verwenden, das größer ist, als das für das Wachstumsmedium benötigte Volumen. Zum Beispiel kann man einen 100-Liter-Kulturbehälter verwenden, um 20–70 Liter Zellkultur zu züchten. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung umfasst die Infektion der Zellen bei einer Zelldichte von 1 × 105 bis 5 × 106 Zellen/ml, vorzugsweise bei 5 × 105 bis 1,5 × 106 Zellen/ml, wobei das aktuelle Volumen des Virusinokulums innerhalb der leicht zu handhabenden Grenzen bleiben sollte. Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung umfasst die Infektion der Zellen mit einer MOI von ≤ 0,005, wie z.B. 0,003, 0,001, 0,0005 oder 0,00025, wobei das Inokulum so gering wie möglich gehalten wird. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung umfasst die Auswahl eines rekombinanten Baculovirus, der das gewünschte Protein unter der Kontrolle eines p10-Promotors exprimiert. Der p10-Promotor spielt eine wichtige Rolle in der Zelllyse, denn das Nichtvorhandensein des p10-Proteins führt dazu, dass die infizierten Zellen intakt bleiben und verhindert damit die Freisetzung von Polyhedra aus den infizierten Zellen, wodurch Neuinfektionsraten verringert werden, nicht jedoch die Infektiösität an sich. Der gesamte Prozess der Virus-Infektion kann jetzt mit dem Auge verfolgt werden, da die Polyhedrin-Gene – und demnach das Polyhedra – immer noch vorhanden sind. Virus-Infektionen können als dichte Proteinpartikel beobachtet werden, die sich im Zellkern häufen. Eine andere Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung umfasst das Züchten der Insektenzellen in einem Batch-Kultur-System, welches die Häufung von fehlerhaften störenden Baculovirus-Partikeln, die die Infektion und Replikation von noch nicht infizierten Zellen gefährden können, reduziert. Eine andere Ausführungsform des Verfahrens, das die Erfindung bereitstellt, umfasst das Züchten der Insektenzellen in einer Suspension, vorzugsweise in einem Kulturbehälter wie einem Fermenter, welcher (moderat) gerührt werden kann. Die Verwendung von (gerührten) Suspensionskulturen, vor allem in Kombination mit einem rekombinanten Baculovirus, wobei sich das gewünschte Protein unter der Kontrolle eines p10-Promotors befindet, um visuell das Viruswachstum mitzuverfolgen (auch andere Prüf-Verfahren wie die CPE-Kontrolle sind z.B. bei der Verwendung eines Polyhedrin-Promotors möglich), gewährleistet eine optimalere Kontrolle der Kultur.
  • Moderates Rühren der Suspension gewährleistet eine homogene Kultur, in der sich kein Substratanstieg aufbaut und in der die Zellen keinen zu hohen Schubkräften ausgesetzt sind. Desweiteren führt das Rühren zu einem wirksamen Transfer der Viren von den infizierten zu den nicht infizierten Zellen, so dass eine höhere Effizienz bei der Virus-Infektion der Zellen erreicht wird. Da am Anfang nur etwa 0,1–0,3% der Zellen infiziert sind, müssen sich die verbleibenden 99,7–99,9 der Zellen entwickeln und multiplizieren.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Expression und Produktion rekombinanter Proteine verschiedener Herkünfte bereit. Ein Beispiel, das die Erfindung bereitstellt, ist die Produktion des aus dem Pestivirus abgeleiteten Proteins in einer Konzentration des besagten Proteins in einem Züchtungsmedium mit einer Ausbeute von mindestens 100, 120 oder 150 μg/ml, vorzugsweise von mindestens 200 oder sogar 300 μg/ml. Das gewünschte Protein kann auch zur Herstellung von Antigensubstanzen für die Verwendung in der Tier- oder Humanmedizin verwendet werden, z.B. in einem Vakzin oder in einem diagnostischen Test. Das gewünschte Protein, das durch ein Verfahren gemäß der Erfindung hergestellt wird, kann zum Beispiel zur Herstellung eines Impfstoffes verwendet werden.
  • Ein Protein, das die Erfindung bereitstellt, ist das Pestivirusprotein E2 oder dessen Fragmente, die zum Beispiel zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Infektionen mit dem Pestivirus, wie das klassische Schweinefieber bei Schweinen, verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Vakzin bereit, das das rekombinante Pestivirusprotein E2 oder Erns enthält oder Fragmente dessen, dadurch gekennzeichnet, dass es nicht immunoaffinitätsgereinigt ist und insbesondere Schutz gegen eine Infektion mit dem Pestivirus bei einem Niveau von PD95 nach einer Impfung mit einer Einmaldosis bietet. Dies ist besonders relevant bei der CSFV-Impfung. Deren Anwendung findet im Allgemeinen im Rahmen von Massenimpfungen in Gebieten statt, in denen ein Ausbruch von CSFV festgestellt wurde. Hier besteht der Bedarf an einer schnellen Impfung einer großen Anzahl von Tieren in einer relativ kleinen Zeiteinheit. Bei einer solchen Massenimpfung ist es von größter Bedeutung, dass ein adäquates Schutzniveau (die Anzahl der Schweine, die gegen die Infektion mit dem Virus des Wildtyps geschützt sind) schnell erreicht wird. Das wochenlange Warten nach einer ersten Impfung auf eine zweite Impfung, um einen Schutz herzustellen, verhindert und verzögert die Kontrolle der Krankheit erheblich. Die Verfahren zur Produktion des rekombinant exprimierten E2-Proteins sind trotz der Verwendung eines vergleichbaren in Baculoviren exprimierten E2 (Fragmente), unterschiedlich. Bei früheren Produktionen von Kulturen des E2-Proteins bewegte sich die Ausbeute des E2-Proteins (Fragmente) zwischen 20–90 μg/ml (Hulst et al., J. Virol. 5435-5442, 1993; Hulst and Moormann, Cytotechnology 20: 271-279, 1996), des Weiteren benötigte man eine Immunoaffinitätsreinigung mit monoklonalen Antikörpern, um die notwendige und relevante E2-Antigenmasse für eine Einmalimpfung zu erhalten. Ein anderes Verfahren (unter Verwendung eines E2-Fragmentes, das in EP 0389034 beschrieben ist), bei der E2 ohne zusätzliche Immunoaffinitätsreinigung aus dem Überstand von Insektenzellen gewonnen wird, ergibt ein auf E2 basierendes Vakzin, das zweimal injiziert werden muss, bevor eine zufriedenstellende (protektive) Immunreaktion eintritt. Obwohl ein Impfstoff (Porcilis®Pesti) mit dem E2-Antigen derzeit verzeichnet ist, muss dieser Impfstoff zweimal verabreicht werden, was die Zweckmäßigkeit der Impfung gegen Infektionen mit dem klassischen Schweinefieber mittels dieses Impfstoffes erheblich in Frage stellt, da mindestens zwei Impfungen in einem Zeitintervall von 4 Wochen nötig sind, um die gewünschte Immunreaktion bereitzustellen.
  • Diese Probleme (die durch die vorliegende Erfindung gelöst werden), hängen – unter anderem – mit einer niedrigen Konzentration der relevanten Antigensubstanz zusammen, in diesem Fall dem E2-Protein (Fragmente) im Ausgangsmaterial, z.B. dem Überstand der Zellkultur, aus dem das Vakzin hergestellt wird. Theoretisch können Antigene auch mittels in Fachkreisen bekannten Reinigungs- und Kondensationsmethoden hergestellt werden. Dies wird jedoch aufgrund der hohen Kosten pro Impfdosis nicht zu einer kommerziell attraktiven Produktion von Impfstoffen führen. Ein anderes Beispiel ist das Pestivirus Erns-Protein, das auch in Impfstoffen und diagnostischen Tests oder anderen (therapeutischen) Substanzen zur Anwendung kommen kann.
  • So züchteten z.B. Ruggli et al (Virus Genes 10: 115-126, 1995) ein Baculovirus exprimiertes E2 in einer Monolayer-Kultur mit Insektenzellen und erzielten eine maximale Ausbeute von nicht mehr als 5–10 μg/106 Zellen. Desweiteren züchteten Moser et al (Vet. Microbiol. 51: 41-53) das E2 von Ruggli et al in einer Monolayer-Kultur mit Insektenzellen unter Verwendung einer MOI von 5 und konnten nicht genügende Antigene in unkonzentrierter Form für das ELISA-Vorhaben herstellen. Laut ihrer Erfahrung ist die nachfolgende Reinigung des Proteins durch eine Nickel-Chelate-Affinitätschromatographie eine Grundvoraussetzung, um die Handhabung zu vereinfachen und die ELISA-Qualität zu erhöhen. Keine Herstellung eines Impfstoffs wurde im Hinblick auf eine dementsprechende Aufbereitung des E2-Proteins in Betracht gezogen.
  • Bei Forschungsarbeiten zum Thema Impfung stellte sich heraus, dass Impfungen zweifach und unter Verwendung eines immunogereinigten E2-Proteins durchgeführt werden müssen, um ein gewisses Schutzniveau herzustellen. So produzierten z.B. Hulst et al (J. Virol. 67: 5435-5442, 1993), WO 95/35380, und van Rijn et al (J. Gen. Virol. 77: 2737-2745, 1996) E2 in Monolayer-Kulturen und mittels Immunoaffinitätsreinigung, um einen Schutzimpfstoff zu erhalten.
  • Ein Beispiel, das die Erfindung bereitstellt, ist ein Impfstoff aus einem rekombinanten CSFV E2-Protein (Fragmente), welches, da nun genügende Mengen produziert werden können, nicht mehr immunoaffinitätsgereinigt werden muss, bevor es in einen Impfstoff (mit einem protektiven Dosislevel von 95% (PD95)) gegen eine Infektion mit dem Virus des klassischen Schweinefiebers eingebunden wird, welcher dann innerhalb von zwei oder drei Wochen, nachdem den Tieren die Einmalimpfung mittels einer Einmaldosis verabreicht wurde, Schutz verleiht. Ein Verfahren, das die Erfindung bereitstellt, umfasst einen Impfstoff, der das rekombinante Pestivirusprotein E2 oder Erns oder Fragmente dessen enthält und der angesichts einer Infektion mit dem Pestivirus schon nach einer einzigen Impfung mit einer Dosis Schutz bietet, wobei das Protein (Fragment) nicht immunoaffinitätsgereinigt wurde. Die Erfindung stellt ebenso einen Impfstoff bereit, der ein Protein enthält, das die Erfindung bereitstellt und welches des Weiteren einen Hilfsstoff beinhaltet. Brauchbare Hilfsstoffe sind in Fachkreisen bekannt, z.B. Freund Adjuvante oder Aluminium-Hydroxide bzw. -Emulsionen wie Wasser-in-Öl- oder doppelte Wasser-in-Öl- oder Öl-in-Wasser-Emulsionen. Das gewünschte Protein kann auch zur Herstellung anderer Substanzen in beispielsweise der Human- oder Tiermedizin verwendet werden. Noch ein weiteres Beispiel, das die Erfindung bereitstellt, ist eine hormonähnliche Substanz wie das follikelstimulierende Hormon (FSH, α-Einheiten und/oder β-Einheiten sowie Komplexe und Fragmente dessen), welches zum Beispiel durch die Infektion einer Kultur mit Insektenzellen mit einer Baculovirus exprimierten α-Einheit und/oder einer anderen Baculovirus exprimierten β-Einheit in der Kultur hergestellt werden kann. Ein Verfahren gemäß der Erfindung kann auch für Massen- und Low-Cost-Produktionen (rekombinanter) Baculoviren als Bioinsektizide verwendet werden. Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung des rekombinanten Virus unter Verwendung des p10-Promotors zur Expression von Fremdgenen bei der Herstellung von Bioinsektiziden, da Insekten im Allgemeinen weniger gut durch den Baculovirus infiziert werden, da ihnen das Polyhedra-Gen fehlt. Das Züchten anderer Proteine durch Expression anderer rekombinanter Baculoviren mittels eines Verfahrens gemäß der Erfindung und die Produktion und/oder Verwendung eines solchen Virus-Proteins für insektentötende, medizinische, therapeutische und/oder Antigensubstanzen oder -produkte liegt in den Händen des Fachmanns. Die Erfindung wird des Weiteren im experimentellen Teil veranschaulicht, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Experimenteller Teil
  • Die Gattung des Pestivirus aus der Familie der Flaviviridae besteht aus dem Virus des klassischen Schweinefiebers (CSFV), dem Border Disease Virus (BDV) und der Bovinen Virusdiarrhoe (BVDV). Die Genome verschiedener BVDV- und CSFV-Stämme sind sequenziert worden (Renard et al., 1987 EP application 0208672; Collett et al., 1988, Virology 165, 191-199; Deng and Brock, 1992, Virology 1991, 865-679; Meyers et al., 1989, Virology 171, 555-567; Moormann et al., 1990, Virology 177, 184-188). Für den BDV liegen bisher nur unvollständige genomische Sequenzen der Nukleotide vor. Das Pestivirus-Genom ist ein RNA-Molekül in Positivstrangordnung mit etwa 12,5 Kilobasen, enthaltend einen großen offenen Leserahmen. Der offene Leserahmen wird übersetzt in ein hypothetisches Polyprotein von etwa 4000 Aminosäuren, das durch virus- und zellkodierte Protease bearbeitet wird. Der offene Leserahmen grenzt an zwei kleine hochkonservierte und nicht übersetzte Regionen, die wahrscheinlich eine Rolle bei der Replikation der Genome spielen. Die 5'-nichtkodierte Region ist außerdem bei der Initiation der Translation wichtig.
  • Das Polyprotein, welches co- und posttranslational durch zelluläre und virale Protease weiterbearbeitet wird, enthält alle viralen Struktur- und Nichtstrukturproteine (siehe dazu C.M. Rice: In Fields Virology, Dritte Auflage, 1996 Flaviviridae: The Viruses and their Replication; Kapitel 30: 931-959). Die viralen Strukturproteine, darunter die Hüllproteine Erns, E1 und E2, befinden sich im N-Terminal des Polyproteins. Die Nichtstrukturproteine unter ihnen, mit der Serin-Protease N53 und dem RNA Replikase-Komplex NS5A und NS5B, befinden sich im C-Terminal des Polyproteins.
  • Tiere, die mit dem Pestivirus infiziert sind, entwickeln Antikörper gegen Erns, E2 und NS3. Jedoch sind nur die Antikörper gegen E2 nachhaltig virusneutralisierend, während diejenigen gegen Erns und NS3 nur eine geringe oder gar keine virusneutralisierende Fähigkeit haben. Diese Erkenntnis veranlasste uns dazu, die Brauchbarkeit von E2 als CSF-Untereinheit Markerimpfstoff zu untersuchen. Bei dieser Anordnung könnten Erns und/oder NS3 zur Entwicklung des diagnostischen Tests in Begleitung des E2 Markerimpfstoffes verwendet werden.
  • Bis dato wurden BDV und BVDV aus verschiedenen Spezies isoliert, während CSFV auf Schweine beschränkt zu sein scheint. Pestiviren sind sich in ihrer Struktur und den Antigenen sehr ähnlich. Das Hüllglykoprotein E2 ist am stärksten immunogenisch und auch das variabelste Protein der Pestiviren. Wir haben E2-Gene vieler verschiedener Pestivirus-Stämme geklont, inklusive solche eines Hirschen und einer Giraffe. Die E2-Gene wurden vorübergehend exprimiert, gekennzeichnet durch monoklonale Antikörper und dann sequenziert und verglichen (P.A. van Rijn et al., 1997, Virology, 237: 337-348). Basierend auf diesen Daten können wir sechs Hauptgruppen innerhalb der Pestivirus-Gattung verzeichnen. Vier Gruppen entsprechen dem definierten Genotypus, während die anderen zwei Gruppen neue Genotypen innerhalb der Pestivirus-Gattung darstellen. Eine Gruppe umfasst vom Schwein isolierte CSFV-Stämme. Eine zweite Gruppe umfasst die BDV-Stämme Moredun L83 und X818, die vom Schaf isoliert wurden und den F-Stamm vom Schwein. Eine dritte Gruppe enthält den BD78-Stamm vom Schaf, den 5250-Stamm vom Schwein und den 178003-Stamm vom Rind. Auf der Basis von E2 sind diese Viren den BVDV-Stämmen, die mit akuten heftigen Ausbrüchen der Bovinen Virusdiarrhoe, dem sogenannten Typ 2 BVDV, in Zusammenhang gebracht werden, sehr ähnlich. Die vierte Gruppe umfasst BVDV-Stämme, die überwiegend vom Rind stammen. Diese BVDV-Gruppe kann in zwei Subtypen bzw. die Subgruppen BVDV-1a und 1b unterteilt werden: BVDV-1a enthält Viren aus den USA, wie NADL und Oregon, sowie einige weitere wie 150022 und 1138 aus Europa. Die Subgruppe BVDV-1b enthält den Osloss Stamm und verschiedene niederländische Isolate. Die fünfte und sechste „Gruppe" kann als zwei neue Genotypen vorgeschlagen werden und enthält Stämme vom Hirschen bzw. von der Giraffe.
  • Die Entwicklung von Markerimpfstoffen für veterinäre Zwecke hat zu neuen Konzepten der Überwachung und Eradikation von ökonomisch bedeutsamen viralen Erkrankungen des Lebensbestandes geführt. Die Verwendung eines Markerimpfstoffes gestattet eine serologische Unterscheidung zwischen geimpften und mit Feldviren infizierten Tieren, und dadurch eine kontrollierte Eliminierung des Virus. So ist zum Beispiel in den meisten Mitgliedsstaaten der EU die Impfung gegen die Aujeszkysche Krankheit (AD) nur mit gE-negativen Impfstoffen erlaubt. Tiere, die sich mit einem AD-Feldvirus infiziert haben, entwickeln Antikörper gegen den gE. Ein ELISA-Test, der diese Antikörper feststellt, wird für die Erkennung der infizierten Tiere verwendet, welche anschließend aus der Herde entfernt werden, um den Infektionsstatus mit dem Feldvirus in einer Herde während einer (verlängerten) Impfkampagne zu beobachten. Schließlich ist eine Herde, die frei vom Feldvirus ist, das Ziel. Impfungen können daraufhin eingestellt werden und ein serologisches Überwachungsprogramm zur Beibehaltung dieses Status kann in Kraft treten. Dementsprechend werden Impfungen mit einem Markerimpfstoff die Kosten von Ausrottungskampagnen, die auf der Markierung der gesamten infizierten Herde statt auf der Markierung des einzelnen Tieres beruhen, signifikant reduzieren, und bei einer konsequenten Durchführung in einem genügend großen Rahmen kann dies sogar eine schnellere Methode sein, um eine Schweinepopulation vom Feldvirus zu befreien, als die Markierung nur der kranken Tiere.
  • Jetzt und in der Zukunft, wenn gegenwärtige endemische Krankheiten wie AD ausgerottet sind, können Markerimpfstoffe dennoch weiterhin Verwendung finden: Zum Beispiel bei der Kontrolle von Ausbrüchen solcher Krankheiten, die in der Population ausgerottet waren bzw. wenn keine routinemäßigen Impfungen mehr durchgeführt werden. In solchen Fällen, in denen eine Tierpopulation serologisch naiv ist, können sich hochansteckende Krankheiten explosiv ausbreiten, was dann zu enormen Kostenverlusten führen kann.
  • Viele Beispiele haben gezeigt, dass das Baculovirus-System ein hohes Expressionsniveau der heterologischen Proteine unterstützt. Ein hohes Expressionsniveau ist um vieles vorteilhafter, da tote Untereinheits-Impfstoffe im Allgemeinen nur protektive Immunreaktionen hervorrufen können, wenn eine große Anzahl an Antigenen Anwendung findet.
  • Bei unserem ersten Ansatz wurden zwei rekombinante Baculoviren – einer exprimierte E2 mit einem TMR (BacE2 [+]) und der andere exprimierte E2 ohne ein TMR (BacE2 [-]) – hergestellt (Hulst et al., 1993, J. Virol. 67: 5435-5442). Man beachte, dass in dieser Publikation und anderen vergleichbaren Publikationen das E2 immer noch mit seiner alten Bezeichnung E1 versehen ist. Das E2 ohne ein TMR wurde in ein Medium mit einer Zellkultur sezerniert, wohingegen das E2 mit einem TMR nicht sezerniert wurde. Beide E2s reagierten identisch mit monoklonalen Antikörpern und wiesen alle vier Antigen-Domains auf dem E2 auf. Dies war ein Hinweis darauf, dass die Antigen-Eigenschaften des zellassoziierten und sezernierten E2 identisch waren, und da das sezernierte E2 bei einem viel höheren Niveau hergestellt wurde als das zellassoziierte E2 (zehnmal höher), wurde entschieden, das sezernierte immunoaffinitätsgereinigte E2 in einem Impftest bei Schweinen zu testen. Zwei Formeln für Impfstoffe mit 20 μg E2/ml und 100 μg E2/ml wurden in einem doppelten Wasser-in-Öl-Hilfsstoff zubereitet. Von vier Gruppen zu jeweils 2 SPF-Schweinen wurden zwei IM mit 20 μg E2, und zwei mit 100 μg E2 geimpft. Nach 28 Tagen wurde die Gruppe, die mit 20 μg E2 und die Gruppe, die mit 100 μg E2 geimpft worden war, mit der gleichen Dosis E2 erneut geimpft. Am Tag 42 wurden alle Tiere intranasal mit dem virulenten CSFV Stamm Brescia gechallenged. Unabhängig von der Impfdosis, die verabreicht worden war, hatten alle Schweine am Tag 28 erhöhte neutralisierende Antikörper, jedoch in unterschiedlichem Maße. Bis zum Tag 42, dem Tag der Challenge, stiegen die Antikörper-Titer bei allen Tieren weiterhin auf ein hohes Niveau, unabhängig davon, ob sie nochmal geimpft worden waren, oder nicht. Aus diesem Grunde war es nicht überraschend, dass sogar Tiere, die nur ein einziges Mal mit einer Dosis von 20 μg immunoaffinitätsgereinigtem E2 geimpft worden waren, schon vollständig gegen CSF geschützt waren (Hulst et al., 1993 J. Virol. 67: 5435-5442).
  • Da Tiere, die mit Pestiviren infiziert sind, ausnahmslos Antikörper gegen Erns entwickeln (Kwang et al., 1992, Vet.Microbiol. 32: 281-291), ist ein zweites virales Hüllglykoprotein eines der brauchbarsten viralen Proteine für die Entwicklung diagnostischer Tests in Verbindung mit E2. Nichtsdestotrotz gibt es nur einen Report, der Erns als ein bedeutendes Antigen für den Schutz von Schweinen gegen CSF empfiehlt (König et al, 1995, J. Virol. 69: 6479-6486). In diesen Untersuchungen wurde das Erns mit dem Vacciniavektor eines lebenden Virus exprimiert. Tiere, die gleichzeitig auf drei verschiedenen Wegen (intradermal, intravenös und intraperitonal) mit 5 × 107 PFU des Vaccinia-Erns rekombinanten Virus pro Einstichstelle geimpft worden waren, überlebten eine IN-Challenge mit einer Letaldosis des CSFV Alfort Stammes 5 Wochen nach der Impfung, ohne irgendein Anzeichen von CSF aufzuweisen.
  • Um die Brauchbarkeit von Erns als einen toten Untereinheits- Impfstoff zu überprüfen, wurde Baculovirus exprimiertes Erns des Brescia Stammes (nach Hulst et al., 1994, Virology, 200: 558-565) an Schweinen getestet. Gruppen von 6 SPF-Schweinen wurden einmal IM mit 5.0 und respektive mit 20 μg Erns geimpft (Moormann et al., 1996, Proc. 14th Intern. Pig. Vet. Society Congress, 25-29, Bologna, Italien). Eine dritte Gruppe von 4 nichtgeimpften SPF-Schweinen diente als Kontrollgruppe. Drei Wochen nach der Impfung wurden alle Tiere IM mit 105 TCID50 des Behring Stammes gechallenged. Innerhalb von 5 Tagen nach der Challenge entwickelten alle Tiere, die mit der niedrigsten Dosis Erns geimpft worden waren, starke Anzeichen von CSF. Innerhalb von 14 Tagen nach der Challenge starben 2 Tiere, 3 wurden moribund getötet und 1 Tier erholte sich offensichtlich. Fünf dieser Tiere, eingeschlossen das Tier, das sich erholte, waren IFT-positiv. Nach der Challenge zeigten alle Tiere, die mit der höchsten Dosis Erns geimpft worden waren, mehr oder weniger starke Anzeichen von CSF und hatten einige Tage lang hohes Fieber. Innerhalb von 14 Tagen jedoch erholten sich 4 von 6 Tieren, 1 Tier starb und ein anderes wurde moribund getötet. von den 4 überlebenden Tieren stellte sich nur eines als IFT-positiv heraus. Im Gegensatz dazu zeigten alle Kontrolltiere ernsthafte Anzeichen von CSF innerhalb von 5 Tagen nach der Challenge und starben IFT-positiv innerhalb von 14 Tagen nach der Challenge (Moormann et al., 1996, Proc. 14th Intern. Pig. Vet. Society Congress, 25-29, Bologna, Italien).
  • Wir schlossen daraus, dass das Baculovirus exprimierte Erns die Schweine gegen eine Challenge mit dem heterologischen CSFV schützen kann, allerdings mit einer niedrigeren Wirksamkeit als das Baculovirus exprimierte E2.
  • Das follikelstimulierende Hormon (FSH) gehört zur Familie der Glykoproteinhormone, die entweder in der Hypophyse (Luteinisierungshormon, LH; schilddrüsenstimulierendes Hormon, TSH) oder in der Plazenta (humanes Choriongonadotropin, hCG; Pregnant Mare Serum Gonadotropin, PMSG) produziert werden. Innerhalb einer Gattung besteht jedes dieser Hormone aus einer gemeinsamen Alpha-Untereinheit, die non-konvalent an eine hormonspezifische Beta-Untereinheit gebunden ist. Gereinigtes FSH, das allein oder in Kombination mit LH verabreicht wird, wird üblicherweise verwendet, um eine superovulatorische Reaktion bei vielen Gattungen, inklusive beim Rind, hervorzurufen.
  • Ein Problem bei der Kuh besteht darin, dass es schwierig ist, das bovine FSH in großen Mengen aus der Rinder-Hypophyse zu gewinnen. Aus diesem Grunde wird FSH vom Rind (oFSH), Schwein (pFSH) oder Pferd (eFSH, PMSG) im Allgemeinen auch zur Superovulationsbehandlung bei Kühen verwendet. Dennoch ist die Nutzung von Material aus dem Hirngewebe aufgrund des möglichen Vorhandenseins von Prionen wie Proteinen, die die Bovine Spongiforme Encephalopathie (BSE) bei Kühen oder eine mögliche Form der Creutzfeld-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen hervorrufen kann, nicht frei von Risiken. Desweiteren hat die Verwendung von Material aus der Plazenta den Nachteil einer sehr langen biologischen Halbwertszeit, die durch die Injektion spezifischer Antikörpern neutralisiert werden muss. Schließlich enthalten alle gegenwärtig verwendeten FSH-Präparationen einige LH-Aktivitäten, was zumindest teilweise für die beobachtete große Bandbreite bei den Ergebnissen der Superovulation verantwortlich gemacht werden kann.
  • Aus diesen Gründen liegt es auf der Hand, dass Superovulationsbehandlungen bei Kühen von der Anwendung des rekombinanten bovinen FSH (rbFSH), das in Nichtsäugetier-Zellen wie zum Beispiel in Insektenzellen (Baculovirus-Expressions-System), produziert wird, profitieren können.
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • 1. Beispiel der Herstellung einer Zellkulturproduktion (PCS) mit SF21-Zellen:
  • Ein Cryofläschchen mit 1,5 ml SF21 WCS-Zellen (die Gesamtzahl der Zellen beträgt 4–10 × 106 Zellen/ml) wird auf eine Temperatur von 20–30 °C aufgetaut. Nach dem Auftauen wird der Inhalt des Fläschchens in ein 15 ml Falcon-Röhrchen gegeben, welches 8,5 ml serumfreies SF900II Medium enthält, und suspendiert. Nach der Suspension wird der Inhalt des Röhrchens bei 100–200 xg 10 Minuten lang zentrifugiert, um die Zellen auszufällen. Das Medium wird ausgesondert und das Pellet wird in 4–6 ml SF900II suspendiert. Die suspendierten Zellen werden in ein 100 ml Schüttelfläschchen gegeben, das 10 ml SF900II enthält. Die Zellen werden 3–7 Tage lang bei 26–30 °C kultiviert, wobei die Fläschchen auf einer kreisförmigen Schüttelplattform bei 40–80 rpm stehen. Zellwachstum und Zellviabilität werden durch Inprozessproben überwacht. Wenn die Zelldichte bei 1,0–6,5 × 106 Zellen/ml liegt, werden die Zellen in zwei 500 ml Schüttelfläschchen gegeben, wobei jedes Fläschchen 100 ml SF900II enthält. Dies entspricht einer zehnfachen Verdünnung der Zellen. Die Zellen werden nochmals 3–7 Tage lang bei 26–30 °C durch Platzieren der Fläschchen auf einer kreisförmigen Schüttelplattform, die das Fläschchen bei 40–80 rpm schüttelt, kultiviert. Zellwachstum und Zellviabilität werden ständig mittels Inprozesskontrollen überwacht. Wenn die Zelldichte bei 1,0–6,5 × 106 Zellen/ml liegt, werden die Zellen ein zweites Mal und diesmal auf sechs bis elf 500 ml Schüttelfläschchen verteilt, welche jeweils 100 ml SF900II enthalten. Überschüssiges Zellmaterial wird ausgesondert. Auch in diesem Fall erhält man eine zehnfache Verdünnung. Die Zellen werden 3–7 Tage lang bei 26–30 °C und durch Platzierung der Fläschchen auf einer kreisförmigen Schüttelplattform bei 40–80 rmp kultiviert. Zellwachstum und Zellviabilität werden ständig durch Inprozesskontrollen überwacht. Wenn die Zelldichte bei 1,0–6,5 × 106 Zellen/ml liegt, werden 500 oder 1000 ml der Suspension, die die Zellen enthält, in einen 5- oder 10-Liter-Fermenter, der etwa 4,5 bzw. 9 Liter SF900II enthält, gegeben. Dies entspricht einer zehnfachen Verdünnung der Zellen. Die Zellen werden 3–7 Tage lang bei 26–30 °C kultiviert. Die Suspension wird ständig gerührt (50–100 rpm). Zellwachstum und Zellviabilität werden ständig durch Inprozesskontrollen überwacht. Wenn die Zelldichte bei 1,0–6,5 × 106 Zellen/ml liegt, wird der Inhalt des 5-Liter-Fermenters in einen 50-Liter-Fermenter gegeben, der etwa 40 Liter SF900II enthält. Die Zellen werden bei 26–30 °C kultiviert, bis eine Dichte von + 5–15 × 105 Zellen/ml erreicht ist. Die Suspension wird ständig gerührt (50–100 rpm). Proben werden für Inprozesskontrollen entnommen.
  • 2. Beispiel der Produktion des E2-Antigens
  • Zu der oben genannten Zellsuspension werden 1–2 ml WVS-Viren (BacE2 [-]), enthaltend + 107 TCID50/ml, hinzugefügt. Die Suspension wird bei 28 °C 3–8 Tage lang inkubiert, bis 70–100% der Zellen eine zytopathische Wirkung zeigen. Während der Inkubation werden Proben für Inprozesskontrollen entnommen. Als nächstes wird die Suspension gereinigt, indem die Zellen durch Mikrofiltration entnommen werden. Die erhaltenen Filtrate (z.B. die Antigen-Lösung) wird aufgefangen und bei ≤ –20 °C aufbewahrt, bis die Inaktivierung (3.3) beginnt. Proben werden für Inprozesskontrollen entnommen. Zur Bestimmung des Antigengehaltes werden Proben beispielsweise in einem Enzym-linked Tmmuno Assay getestet, um die Antigenmasse zu bestimmen oder in einem Proteinassay, um das aktuelle Gewicht pro Volumen des Wasserproteins zu bestimmen, bzw. durch eine Kombination solcher Methoden.
  • 3. Beispiel der Virusinaktivierung
  • Das Virus wird durch Hinzugabe von 2-Bromoethyl-Ammoniumbromid (BEA) in einer Konzentration von 10 mmol/l inaktiviert. Durch Einstellen des pH-Wertes auf 8,2–8,7 und der Temperatur auf 34–37 °C, wird BEA in 2-Bromoethyl-Imminebromid (BEI) umgewandelt, welches der aktive Komponent bei der Inaktivierung des Virus ist. Das Abtöten der Viren wird durch Probenentnahmen in Inprozesskontrollen überwacht. Die Inaktivierung dauert 24–72 Stunden. Nach der Inaktivierung sind < 1 infektiöse Partikel pro 10.000 Liter vorhanden. Nach der Virusinaktivierung wird BEI durch die Hinzugabe von Sodiumthiosulfaten bei einer Konzentration von 5–25 mmol/l und das Einstellen des pH-Wertes auf 5,7–6,3 neutralisiert. Proben werden für Inprozesskontrollen entnommen. Die inaktivierte und neutralisierte Antigen-Lösung wird in 1- und/oder 5-Liter-Beutel gegeben und bei ≤ –20 °C aufbewahrt.
  • 4. Formelbeispiel
  • Die gefrorene Lösung mit dem Antigen wird auf 22–28 °C aufgetaut und mit SF900II oder PBS zu einer Antigen-Lösung von 50 μg/ml verdünnt. Thiomersal wird als antimikrobiologischer Agent auf 100 μg/ml hinzugefügt. Proben werden für Inprozesskontrollen entnommen. Diese Lösung (d.h. die erste Wasser-Phase) wird < 3 Tage bei 2–8 °C aufbewahrt. Währenddessen wurde die Öl-Phase durch Vermischen von Marcol 52 mit Montanid 80 (9:1) zubereitet. Auch diese Lösung wird bei 2–8 °C nicht länger als 3 Tage aufbewahrt. Die Öl-Phase wird mittels eines 0,22 μm sterilen Filters sterilgefiltert. Proben werden für Inprozesskontrollen entnommen. Schließlich wird die zweite Wasser-Phase durch Vermischen der phosphatgepufferten Saline (PBS) des SF900II Mediums mit Montanox 80 (98:2) hergestellt, und Thiomersal wird zu der Endkonzentration von 100 μg/ml hinzugegeben. Diese Lösung wird bei 2–8 °C bis zu ihrer Verwendung (< 3 Tage) aufbewahrt. Vor der Verwendung wird die erste Wasser-Phase sterilgefiltert. Proben werden für Inprozesskontrollen entnommen. Die erste Emulsion wird zubereitet durch Vermischen der ersten Wasser-Phase mit der Öl-Phase (1:1:1). Diese Emulsion darf nicht länger als 3 Tage bei 2–8 °C gelagert werden. Proben werden für Inprozesskontrollen entnommen. Die doppelte Wasser-in-Öl-Emulsion wird aufbereitet durch Emulgieren mit der zweiten Wasser-Phase (2:1:1). Die doppelte Emulsion wird bei 2–8 °C im Quarantäne-Kühlraum aufbewahrt, bis sie in Fläschchen gefüllt wird. Proben werden für Inprozesskontrollen entnommen.
  • 5. Beispiel für das Abfüllen und Verschließen
  • Die Lösung mit der doppelten Emulsion wird aseptisch in einem sterilen Raum der Klasse A abgefüllt. Das Füllvolumen beträgt 51, 102 oder 255 ml in entweder 50, 100 oder 250 ml-Fläschchen. Das Füllvolumen wird ständig durch Prüfen des Gewichtes des Füllvolumens überwacht. Sofort nach dem Abfüllen werden die Fläschchen zugestöpselt und verschlossen. Schließlich werden die Fläschchen in einem Quarantäne-Kühlraum bei 2–8 °C gelagert und die Qualitätskontrolle beginnt.
  • Beispiel eines Schemas für einen E2 Untereinheit Impfstoff in einer Größenordnung eines 50 Liter Fermenters Herstellung einer SF21 Zellkulturproduktion (PCS)
    Figure 00270001
  • Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Produktion des E2 Antigens
    Figure 00290002
  • Figure 00300001
  • Virusinaktivierung
    Figure 00310001
  • Formel
    Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Abfüllen und Verschließen
    Figure 00340001
  • 6. Beispiel eines E2-Stabilitäts-Experimentes
  • Zielsetzung
  • Untersuchung der Stabilität des E2-Proteins in einer infizierten Zellkultur (MOI·0,0001) nach einer verlängerten Kultur unter ungewöhnlichen Bedingungen. Bedingt durch die lysierende Eigenschaft des Infektionsprozesses des Baculovirus in der Zellkultur, können Proteasen am Ende des Infektionszyklus im Medium freigesetzt werden. Ob sich dies in einer Verringerung des E2-Proteins und demnach in einer Abnahme des volumentrischen Niveaus des E2-Proteins zeigt, ist Gegenstand dieses Experimentes.
  • Materialien und Verfahren
  • Wenn das Medium oder SF900II erwähnt werden, ist das SF900II Medium mit 0,2% Pluronic F68 gemeint.
  • Ein Fläschchen mit SF21-Zellen wird aufgetaut und in 10 ml SF900II in einem 100 ml Schüttelfläschchen in einem Inkubator auf einer kreisförmigen Schüttelplattform kultiviert. Wenn die Zellkultur die erforderliche Zelldichte erreicht, werden die Zellen zehnfach auf 100 ml in einem 500 ml Schüttelfläschchen verdünnt. Wenn diese Zellkultur die erforderliche Zelldichte erreicht hat, wird sie nochmals zehnfach auf 100 ml verdünnt. Überschüssiges Zellmaterial wird ausgesondert. Wenn diese Zellkultur die erforderliche Zelldichte erreicht hat, wird sie durch Verteilen auf drei 500 ml Schüttelfläschchen mit je 100 ml Volumen pro Fläschchen verdünnt. Überschüssiges Material wird ausgesondert. Die Schüttelfläschchen werden auf eine IKS kreisförmige Schüttelplattform gestellt und bei 70 rpm in einem Inkubator mit 28 °C gerührt.
  • Bei einer Zelldichte von 0,612·105 Zellen pro ml werden 63 μl einer 100fach verdünnten Virus-Suspension zu den Fläschchen Nr. 2 und 3 hinzugegeben. Schüttelfläschchen Nr. 1 wird als nichtinfizierte Leerprobe aufbewahrt. Die MOI, mit der die Kulturen infiziert werden, beträgt (0,063·0,01·0,8·107)/(100·0,612·105) = 0,00008.
  • Die verwendete 100fach verdünnte Virus-Suspension wird wie unten erläutert hergestellt. MSV-Fläschchen 253 wird mittels QC aufgetaut und 100fach in einem TC100 Medium verdünnt, dann durch 10% FBS (Partie Nr. 97QC0139) ergänzt und bei –70 °C in Portionen von 0,5 ml gelagert.
  • Regelmäßig werden Proben sowohl aus den Kulturen der infizierten Schüttelfläschchen als auch aus dem nicht infizierten Schüttelfläschchen entnommen, um den Zustand der Zellkultur zu bestimmen. Die Probenentnahme wird wie unten beschrieben vorgenommen.
  • Etwa 1,1 ml des Zellmaterials wird in 15 ml-Falcon-Röhrchen in einer IEC Centra GP8R-Zentrifuge 6 Minuten lang bei 1000 rpm geschleudert. Dann wird der Überstand zu 0,45 μm mittels eines Gelman Acrodisc Spritzenfilters gefiltert, um noch vorhandene Zellen auszusondern. Proben von 0,4 ml in Nalgene Kryo-Fläschchen werden bei –70 °C für spätere Analysen aufbewahrt.
  • Ergebnisse und Schlussfolgerungen
  • Wie aus den Angaben in 1 und den Diagrammen in 2 ersichtlich, entwickeln sich die Kurven für das Zellwachstum in Fläschchen 2 und 3 mehr oder weniger gleich. Nach 191 hpi wurden keine weiteren Zellzählungen mehr vorgenommen, da so gut wie sicher alle Zellen tot oder infiziert waren. Die 139 hpi-Probe des Fläschchens 2 wurde im Diagramm nicht berücksichtigt. Die Zellzählungen dieser Probe fielen viel höher aus als in der vorhergehenden und nachfolgenden Probe. Dies kann darauf hinweisen, dass möglicherweise eine Präzipation vor oder nach der Probenentnahme aufgetreten ist, was im Anschluss an die Mischung mit der Trypan-Blau-Lösung zu einem falschen Probeergebnis führte. Diese Vermutung wird durch die Tatsache bestätigt, dass sowohl der Prozentsatz der Viabilität als auch der Infektion in Übereinstimmung mit dem vermuteten Ergebnis stehen. Dies bedeutet, dass keine außergewöhnlichen Vorgänge in der infizierten Kultur selbst aufgetreten sind. Diese falsche Probenentnahme wird wahrscheinlich keine Auswirkungen auf die E2-Konzentration in der Probe haben, da das E2 im Medium und nicht intrazellulär vorhanden ist.
  • Die E2-Konzentration in Fläschchen 2 steigt recht schnell auf ein Maximum von > 190 μg/ml bei 139 hpi an und nimmt dann langsam ab auf 170 μg/ml bei 215 hpi. Dann fällt der E2-Gehalt schneller auf ein Endniveau von < 100 μg/ml bei 306,5 hpi.
  • Das Profil von Fläschchen 3 ist mehr oder weniger gleich. Der maximale E2-Protein-Gehalt wird ebenso bei 139 hpi erreicht, ist jedoch geringfügig höher als in Fläschchen 2. Die E2-Konzentration sinkt langsam von 233 μg/ml bei 139 hpi auf 212 μg/ml bei 191 hpi, bevor die Konzentration schneller auf 141μg/ml bei 215 hpi fällt. Fläschchen 2 und 3 zeigen eine gute Korrelation.
  • Bei t = 44,25 hpi wurde auch das nichtinfizierte Fläschchen 1, die Leerprobe, gezählt. Die Dichte der Lebendzellen betrug 2,435·106 Zellen/ml, die Dichte der toten Zellen betrug 0,190·106 und die gesamte Zelldichte 2,625·106 Zellen/ml, was eine Viabilität von 92,8% ergibt. Die Dichte an Lebendzellen ist signifikant höher als in den beiden Fläschchen 2 und 3, was darauf hinweist, dass die Infektion schon das Zellwachstum bremst. Diese Kultur der Leerprobe wurde anschließend weitergegeben.
  • Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse des Immunoblottings, welches anhand einer Auswahl an Proben aus Fläschchen 2 durchgeführt wurde.
    Figure 00380001
    • (-) bedeutet nicht feststellbar
    • (+) bedeutet feststellbar
  • Wie aus der Tabelle ersichtlich, sind die Epitope V3 und V8 in den 0 und 44 hpi-Proben noch nicht feststellbar. Dies korreliert gut mit den E2-ELISA-Ergebnissen. In den Proben ab 115 hpi wurde intaktes E2 festgestellt, da sowohl V3 als auch V8 in der E2-Gruppe festgestellt wurden.
  • Ab 191 hpi ist eine zweite Gruppe eines kleineren Proteins auf dem Gel sichtbar. Immunoblottings mit V3 und V8 in separaten Blots zeigen, dass das Abbauprodukt das V3-Epitop enthält, jedoch nicht das V8-Epitop. Nirgendwo sonst auf dem Blot wurde das V8 festgestellt, außer in der intakten E2-Gruppe. Diese Untersuchung zeigt deutlich, dass der Abbau des E2-Proteins im Auftreten der Protease begründet liegt. In der Tat ist dies wahrscheinlich der Grund für die Abnahme des E2-Protein-Gehaltes, der während des Mikrofiltrierens der Lösung mit der E2-Antigenmasse beobachtet wurde. Nachfolgend werden die Zellen entfernt, bevor die Virus-Inaktivierung beginnt.
  • Aus diesem Grunde ist es am wahrscheinlichsten, dass das Auftreten einer Protease die Abnahme des E2-Proteins verursacht.
  • 7. Beispiel eines MOI-Experimentes
  • Zielvorhaben
  • Um ferner die Beziehung zwischen der MOI (Infektionsmultiplizität (Anzahl der Viren pro Zelle)), der maximalen Zelldichte und dem volumetrischen E2-Gehalt zu untersuchen. Auf der einen Seite muss die Infektion der kompletten Zellpopulation abgeschlossen sein, bevor das Medium aufgebraucht ist, auf der anderen Seite führt die Infektion der Gesamtpopulation bei einer niedrigen Zellkonzentration jedoch zu einer suboptimalen Protein-Ausbeute.
  • Materialien und Verfahren
  • Wenn das Medium erwähnt ist, ist das Medium SF900II gemeint.
  • 76 ml einer Zellsuspension wurden in 444 ml SF900II in einer 1000 ml Flasche verdünnt und vorsichtig gemischt. Die Dichte der Lebendzellen kurz vor der Verdünnung der Kultur betrug 3,41·106 Zellen/ml, die Dichte der toten Zellen betrug 0,190·106, was eine Viabilität von 94,8% ergibt. Die Verdünnung muss eine Zelldichte von ±5·105 Zellen/ml ergeben.
  • Desweiteren wurde Gentamyzin zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml hinzugefügt. Die Zellsuspension wurde aufgeteilt in neun Portionen à 50 ml in 250 ml Schüttelfläschchen und überschüssiges Zellmaterial wurde ausgesondert. Die ersten 50 ml wurden in Schüttelfläschchen 1 gegeben, die verbleibenden 50 ml in Schüttelfläschchen 5.
    Nr. 1 und 6 wurden für eine MOI = 0 verwendet
    Nr. 2 und 7 für eine MOI = 0,000001,
    Nr. 3 und 8 für eine MOI = 0,00001,
    Nr. 4 und 9 für eine MOI = 0,0001,
    Nr. 5 für eine MOI = 0,001.
  • Die Herstellung des Virusbestands geschieht wie folgt. Ein Verdünnungsbereich wird aus einem Fläschchen mit einer 100fach verdünnten Virus-Suspension hergestellt (das Fläschchen enthält 0,8·105 Plaques bildende Einheiten (pfu) pro ml). Diese Lösung des 100fach verdünnten Virusbestands wird wie folgt aufbereitet.
  • Master Virussaat wird aufgetaut und 100fach in einem TC100-Medium verdünnt, ergänzt durch 10% FBS und zu 0,5 ml Portionen bei –70 °C gelagert.
  • 0,4 ml dieser 100fach verdünnten Viruslösung werden mit 3,6 ml SF900II Medium verdünnt, was einen Verdünnungsfaktor von 10?1 ergibt. 1 ml dieser Lösung wird zu 9 ml des Mediums hinzugegeben, was einen Verdünnungsfaktor von 10?2 ergibt. 1 ml dieser Lösung wird zu 9 ml des Mediums gegeben, was einen Verdünnungsfaktor von 10?3 ergibt und 1 ml dieser Lösung wird zehnfach verdünnt, um einen Verdünnungsfaktor von 10?4 zu erreichen. 3.1 ml des Mediums werden in die Schüttelfläschchen 1 und 6 (Leerproben) mit der Zellkultur gegeben. 3,1 ml der Virusverdünnungen 10?2, 10?3, und 10?4 werden in die Schüttelfläschchen 4 und 9 gegeben, respektive 3 und 8 sowie 2 und 7. Diese Schüttelfläschchen enthalten schon die Zellkultur.
  • In 3,1 ml Virusverdünnung 10?2 sind 3,1·10?2·0,8·105 = 2,5·103 pfu enthalten. In einem Schüttelfläschchen mit 50 ml Zellsuspension sind 0,5·106·50 = 2,5·107 Zellen enthalten.
  • Deshalb ergibt die Beigabe von 3,1 ml der Virusverdünnung 10?2 zu 50 ml Zellsuspension eine MOI von 2,5·103/2,5·107 = 0,0001.
  • Um vergleichbare Berechnungen für die anderen Virus-Verdünnungen aufzustellen, werden MOI-Zählungen von 0,00001 und 0,000001 bei Virus-Verdünnungen von 10?3 und 10?4 erreicht, die einer 50 ml Zellkultur beigefügt werden. Schließlich werden 2,85 ml der 10?1 Verdünnung zu Schüttelfläschchen Nr. 5 gegeben, was eine MOI von 0,00092 anstelle von 0,001 ergibt.
  • Eine Probe von 3,1 ml wird sofort nach der Beigabe des Virus aus jedem Schüttelfläschchen entnommen. Die Zellen in den Proben werden in einer IEC Centra GP8R Zentrifuge in 15 ml Falcon-Röhrchen geschleudert (10 Min. bei 1000 rpm). Die Probenentnahme wird durchgeführt und verläuft dabei von einer niedrigen MOI zu einer hohen MOI, um die Virus-Übertragung von einer infizierten Zellsuspension mit einer hohen MOI auf eine infizierte Zellsuspension mit einer niedrigen MOI zu vermeiden. Nach dem Zentrifugieren werden die Proben bei 0,45 μm gefiltert (um Zellen zu entfernen, die noch im Überstand vorhanden sein können), auf 3 Nalgene Cryo-Fläschchen verteilt und bei – 70 °C für weitere Tests gelagert.
  • Die Zelldichte der Schüttelfläschchen 1 und 5 wurde sofort nach der Hinzugabe des Virus bestimmt. Diese Fläschchen waren die ersten und letzten, die mit Zellen geimpft wurden. Da die Zelldichte fast identisch war, wurde daraus geschlossen, dass alle Fläschchen eine Zelldichte entsprechend des Durchschnittswertes beider Zellzählungen aufwiesen. Die anfängliche Dichte an Lebendzellen betrug 0,423·106 Zellen/ml, wobei 0,012·106 Zellen tot waren, was eine Viabilität von 97,3% ergibt.
  • Alle Fläschchen wurden auf die kreisförmige Labotech 300 Schüttelplattform gestellt und bei ungefähr 75 rpm und einer Raumtemperatur von 28 °C gerührt.
  • Bei 23, 95, 125, 144, 173 und 194 hpi (Stunden nach der Infektion) wurden alle Fläschchen getestet. Proben, von denen die Zelldichte bestimmt wurde, hatten ein Volumen von 3,3 ml, von dem 0,2 ml zur Bestimmung der Zelldichte verwendet wurden. Die verbleibenden 3,1 ml wurden wie bei der beschriebenen t = 0-Probe gehandhabt. Proben der Kulturen, die nicht gezählt wurden, hatten ein Volumen von 3,1 ml. Bei 194 hpi wurde die Zelldichte bestimmt und das Experiment war abgeschlossen. Die verbleibende Zellsuspension (etwa 30 ml) wurde zu 3 Teilen in 1 ml Nalgene Cryo-Fläschchen gelagert; zu 4 Teilen von etwa 6 ml in 15 ml-Falcon-Röhrchen.
  • Ergebnisse und Schlussfolgerungen
  • Die Ergebnisse zeigen eine gute Korrelation zwischen der MOI und der optimalen Zelldichte und, was noch wichtiger ist, zwischen der MOI und der Ausbeute an E2-Proteinen. Dies zeigt das Diagramm, bei dem die maximale volumetrische Ausbeute des E2-Proteins aus infizierten Kulturen mit einer MOI von 0,001 auf 100% eingestellt ist. Dieses Diagramm zeigt, dass die volumetrische Ausbeute des E2-Proteins mit der Abnahme der MOI ansteigt. Bis zu einer MOI von 0,0001 ist die Zelldichte infiziert, bevor die maximale Zelldichte erreicht wird. Bei einer MOI von 0,00001 oder weniger ergibt sich eine Infektion, bei der das Medium aufgebraucht ist, bevor die Infektion der Kultur abgeschlossen ist, was sich in einer suboptimalen Protein-Ausbeute äußert.
  • Daraus ergibt sich: Je niedriger die verwendete MOI, desto höher die Ausbeute an E2-Proteinen, vorausgesetzt, dass das Medium nicht aufgebraucht ist, bevor der Infektionsprozess und die E2-Produktion beendet sind.
  • bFSHa- und/oder bFSHβ-Expression in rekombinanten Baculoviren
  • Es wurden die Transfervektoren pDW-Alpha-9.1 und pDW-Beta-3.1 konstruiert. Sf21-Zellen wurden mit pDW-Alpha-9.1 oder pDW-Beta-3.1 und dem Wildtyp (wt) AcNPV/M021, dessen DNA aus extrazellulären Viruspartikeln (PCT-Anwendung: Wo 96/25696) isoliert wurde, ko-transfiziert. Polyhedrin-positive Plaques, die β-Galactosidase exprimierten, wurden isoliert und für die Expression von bFSHa oder bFSHβ durch ein ELISA des Kulturmediums analysiert. Ein Plaque-gereinigtes bFSHa-Virus (AcNPVa3.4) und ein Plaque-gereinigtes bFSHβ-Virus (AcNPVβ1.4) wurden zur Herstellung eines Virus-Bestands mit einem TCID50 von etwa 107 respektive 108 verwendet. Die Produktion von FSH gestaltete sich entsprechend der oben beschriebenen Verfahren und ergab ein Produktionsniveau, das sich zwischen 17 und 33 μg/ml bewegte.
  • PD95-Versuch
  • Bestimmung der Dosis (μg) des notwendigen E2 nach einer Impfung, um 95% (PD95) der geimpften Schweine gegen eine Challenge mit einem 100 LD50 des virulenten Brescia CSFV-Stammes zu schützen.
  • Tiere
  • Sechsundzwanzig spezifisch pathogenfreie (SPF) Schweine im Alter von 6–7 Wochen wurden bei der Ankunft per Zufallsprinzip in drei Gruppen zu je acht (A-C) und eine Gruppe zu zwei Schweinen (D) unterteilt. Die Tiere wurden in den Ställen B18, B19, B20 und B21 im Inneren von Hochsicherheitsbehältern des ID-DLO untergebracht. Die Tiere akklimatisierten sich drei Tage lang. Die Tiere wurden einmal am Tag mit Komplett-Futter-Pellets (Hope Farms) in einem Trog gefüttert und konnten Wasser aus einem Nippel ad libitum trinken.
  • Impfung und Challenge
  • Drei Formeln eines doppelten Wasser-in-Öl Ergänzungsimpfstoffes wurden wie oben beschrieben zubereitet, jede mit einer unterschiedlichen Konzentration des E2-Antigens; 32,0, 8,0 und 2,0 μg/Dosis. Die Schweine wurden einmal intramuskulär geimpft, wobei jedes Schwein eine Dosis 2 cm hinter dem linken Ohr erhielt (A: 2 μg E2, B: 8 μg E2, C: 32 μg E2, D: 0 μg E2). Die Kontrollgruppe D wurde nur mit dem Hilfsstoff DOE geimpft und die markierten Schweine wurden gar nicht geimpft. Drei Wochen nach der Impfung wurde jedes Tier, außer den markierten Tieren, intranasal mit 100 50%igen Letaldosen (= 100 Va LD50) des CSFV-Stammes Brescia 456610 gechallenged. Kurz vor der Challenge wurden die markierten Schweine von ihrer Gruppe getrennt und 24 Stunden später wieder zurückgebracht. Der virale Gehalt des Impfstoffes wurde durch Titrieren einer Probe, die nach der Rückkehr aus dem Stall entnommen wurde, bestimmt.
  • Klinische Beobachtungen
  • Die Schweine wurden täglich durch Tierpfleger kontrolliert; abnormale Befunde wurden protokolliert und bei Bedarf wurde der beaufsichtigende Tierarzt hinzugezogen. Jede Gruppe wurde mindestens 15 Minuten pro Tag vor und während der Fütterungszeit und während des Reinigens des Stalles beobachtet.
  • Eine Abnahme bei der Futteraufnahme einer Gruppe oder eines einzelnen Tieres wurde schriftlich festgehalten.
  • Die Körpertemperaturen (rektal) wurden neun Tage lang nach der Impfung und 20 Tage lang nach der Challenge gemessen.
  • Blutanalyse nach der Challenge
  • EDTA-Blutproben wurden am Tag 0, 2, 4, 7, 10 und 14 nach der Challenge entnommen, um Veränderungen in der Leukozyten- und Thrombozytenanzahl zu beobachten. Eine Abnahme der Anzahl der Leukozyten (Leukopenie) und der Thrombozyten (Thrombozytopenie) im Blut ist eines der typischen Anzeichen für CSF. Normale Zellzählungen der weißen Blutkörperchen und der Thrombozyten bei herkömmlichen Schweinen bewegen sich zwischen 11–23 109/l bzw. 320–720 109/l. Bei SPF-Schweinen liegen diese Werte etwas höher; 6–12 109/l und 300–700 109/l. Beide Bereiche schwanken beim einzelnen Schwein. Die Analyse der Blutzellen wurde mittels eines Medonic® CA 570 Partikelzählgerätes durchgeführt. Leukopenie und Thrombozytopenie wurden definiert als eine erheblich niedrigere Anzahl an Zellen/Thrombozyten als die oben genannte Mindestanzahl, insbesondere bei mehr als einem Tag.
  • Ausbreitung/Exkretion und Feststellung des Virus
  • Temperatur, Leukozyten- und Thrombozytenanzahl sowie die Serokonversion der markierten Schweine waren die Parameter, die zur Feststellung der Virus-Transmission von den geimpften Tieren zu diesen Tieren verwendet wurden. Proben von postmortem Gewebe wurden folgenden Organen entnommen: Tonsille, Milz, Niere und Ileum wurden mittels der direkten Immunofluoreszenztechnik getestet, um das Vorhandensein des viralen Antigens zu überprüfen. Cryostat-Sektionen (4 μm dick, zwei pro Organ) wurden aus diesen Gewebeproben entnommen und mit einem aus dem polyklonalen FITC Anti-Pestivirus FITC des Schweines konjugierten Serums inkubiert. Nach der Reinigung wurden die Sektionen unter einem Fluoreszenz-Mikroskop abgelesen. Die Ergebnisse wurden als positiv (= Fluoreszenz) oder negativ (= keine Fluoreszenz) ausgedrückt.
  • Serologische Reaktion
  • Das Serum aller Schweine wurde 0, 2 und 3 Wochen nach der Impfung und zum Todeszeitpunkt aufgefangen.
  • Proben wurden bei –20 °C gelagert und in einem Virus-Neutralisierungstest (VNT) und dem Ceditest®, einem ELISA zur Feststellung von CSF-spezifischen Antikörpern, untersucht. CSFV-neutralisierende Antikörpertiter im Serum wurden in einem Mikrotiter-System bestimmt. Fortlaufende Zweifach-Verdünnungen des Serums wurden vermischt mit dem gleichen Volumen einer CSFV (Brescia Stamm)-Suspension, die 30–300 TCID50 enthielt. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde bei 37 °C in einem CO2-Inkubator wurden etwa 25.000 PK-15-Zellen pro Well hinzugefügt. Nach vier Tagen wurden die Mikrotiter- Platten wie oben beschrieben behandelt und mikroskopisch abgelesen. Der CSFV-neutralisierende Titer wurde umkehrt zur höchsten Verdünnung, die alle Viren neutralisierte, ausgedrückt.
  • Statistische Bewertung
  • Die Bestimmung der 95% Schutzdosis basierte auf der Annahme, dass ein CSFV-neutralisierender Ab-Titer mit ≥ 50 einem vollständigen Schutz entspricht.
  • ERGEBNISSE
  • Bezüglich der Anzahl der Tiere dieses Abschnitts vergleiche die Tabellen 1 oder 2.
  • Klinische Beobachtungen nach der Impfung
  • Die Impfung hatte keinerlei negative Wirkung auf die Schweine; Futteraufnahme und Körpertemperatur blieben normal. Bei Gruppe A und C wurden leichte Diarrhoe, Anorexie und Depression an Tag 3 nach der Impfung festgestellt. Ein Schwein aus Gruppe A (Nr. 448) erbrach sich häufig während der gesamten Zeitspanne und blieb in der Entwicklung zurück. Schwein Nr. 438 aus der Gruppe B erbrach sich einmal. Die Temperatur von Schwein Nr. 434 (Gruppe C, markiert) war leicht erhöht, dieses Tier litt an einer Lähmung des rechten Hinterbeines. Die Futteraufnahme erhöhte sich in der Zeitspanne zwischen der Impfung und der Challenge von 3 auf 6 kg pro Gruppe/Tag.
  • Klinische Beobachtungen nach der Challenge
  • Nichtgeimpfte Kontrolltiere entwickelten Anzeichen von CSF an drei (Nr. 59) und sechs (Nr. 60) Tagen nach der Challenge: Fieber, Kauern, Schüttelfrost, Appetitverlust und Depression wurden bis zum Todeszeitpunkt, 10 Tage nach der Challenge, beobachtet. Desweiteren entwickelten die Tiere eine Zyanose, eine posteriore Parese, Diarrhoe und starkes Erbrechen. Beide Tiere wurden moribund getötet.
  • Alle Schweine, die mit 2 μg E2 (Gruppe A) geimpft worden waren, entwickelten 2–3 Tage nach der Challenge Krankheitsanzeichen, die sich vor allem in Fieber, Kauern, Depression und Anorexie äußerten. Das Fieber hielt 2–10 Tage an und die Maximaltemperatur (Tmax) bewegte sich zwischen 40,7–42,2 °C, von Tag sieben an verschwand das Fieber bei den Schweinen 443–446 und die Futteraufnahme stieg an auf die Menge vor der Challenge. Schwein 448 jedoch wurde am Tag neun tot aufgefunden und Schwein 447 entwickelte eine akute CSF (Krämpfe, posteriore Parese) und wurde am selben Tag noch moribund getötet. Beide markierten Schweine blieben bis zum Tag 7–9 nach der Challenge normal, danach entwickelten sie eine akute CSF und wurden an Tag 20 moribund getötet.
  • Bei den Tieren der Gruppen B und C waren die klinischen Anzeichen geringer und die Krankheitsdauer kürzer, da die Menge des E2-Antigens anstieg.
  • In Gruppe B hielt das Fieber (435–439) bis zum Tag 27 an und die Tmax bewegte sich zwischen 40,2 und 41,7 °C. Schwein Nr. 436 widerstand der Challenge mit sehr geringen klinischen Anzeichen. Ein Schwein (Nr. 440) starb an akuter CSF nach 18 Tagen, es wurde moribund getötet. Die verbleibenden fünf Tiere aus Gruppe B erholten sich. Die beiden markierten Tiere blieben bis zum Tag 11–12 nach der Challenge normal, dann entwickelten sie eine akute CSF und wurden am Tag 20 getötet.
  • In Gruppe C wurde bei zwei (430, 431) von sechs Tieren leichtes Fieber festgestellt, das sich von Tag 4 bis 6 mit einer Tmax zwischen 40,5 – 41,2 °C bewegte. Außer einer leichten Depression an Tag sechs nach der Challenge wurden keine klinischen Anzeichen festgestellt. Wie vor der Challenge erbrach sich Schwein Nr. 430.
  • Die beiden markierten Tiere blieben bis zum Ende des Experimentes normal.
  • Blutanalyse nach der Challenge
  • Aus der Gruppe A entwickelte nur ein Schwein, das markierte Schwein (450), eine eindeutige Leukopenie und Thrombozytopenie. Die Schweine Nr. 445 und 446 wurden an Tag 7 und 10 nach der Challenge thrombozytopenisch, Schwein 449 an Tag 10 und 14. Ein Schwein (440) aus der Gruppe B entwickelte Leukopenie und Thrombozytopenie, die anderen blieben normal. Die beiden markierten Tiere zeigten Anzeichen einer beginnenden Thrombozytopenie an Tag 14. Leukopenie und Thrombozytopenie wurden in Gruppe C nicht entdeckt, auch bei den markierten Tieren nicht.
  • Die beiden Kontrolltiere (Nr. 59 und 60) wurden von Tag 7 an thrombozytopenisch.
  • Erfassung der Virusausbreitung und des viralen Antigens nach der Challenge
  • Das Rücktitrieren des Inokulums ergibt einen Virus-Titer von 2,55 TCID50/ml nach der Rückkehr aus dem Stall. Das CSFV virale Antigen (Tabelle 1) wurde in allen ausgewählten Gewebeproben der Kontrolltiere und markierten Tiere der Gruppen A und B festgestellt. Eines von sechs geimpften Tieren war in den Gruppen A und B positiv. Keines der Tiere in Gruppe C war positiv, auch nicht die markierten Tieren.
  • Serologische Reaktion
  • Die Serokonversion des CSFV wurde als ein Titer von ≥ 25 im VNT festgelegt. Das Ergebnis des Rücktitrierens zur Bestimmung der Anzahl der Brescia-Viren, die im VNT verwendet wurden, ergab 41 TCID50/Well.
  • Keines der Kontrolltiere (D) oder der markierten Tiere serokonvertierte während des Experimentes (Tabelle 2). Zwei von sechs Tieren der Gruppe A serokonvertierten nach drei Wochen. Vier von sechs Tieren jedoch boosterten nach der Challenge (Tabelle 2). Die Gruppen B und C hatten am Tag 21 nach der Impfung serokonvertiert und alle Tiere boosterten nach der Challenge. Bei den letzteren zeigte sich lediglich eine erfolgreiche Replikation des Challenge-Virus im Tier.
  • Schlussfolgerung
  • Die PD95-Dosis pro Tier wurde festgesetzt auf 32 μg E2 in einer Einmaldosis von 2 ml DOE Adjuvant. Bei dieser Dosis blieben die klinischen Anzeichen der Krankheit nach der Challenge mit dem hoch virulenten CSFV Stamm minimal und eine Ausbreitung des Virus auf Kontakttiere kam nicht vor. Zusammenfassend wurden vier Gruppen (A-D) zu sechs Schweinen intramuskulär mit respektive 32 (A), 8 (B), 2 (C) und 0 μg Ed (D) pro 2 ml Adjuvant (DOE) geimpft. Zwei nichtgeimpfte Schweine wurden in jeder Gruppe (A-C) gehalten, um festzustellen, ob eine Virus-Exkretion durch Kontaktinfektionen (markierte Schweine) stattfindet. Nach drei Wochen wurden die Schweine intranasal mit 100 LD50 des hochvirulenten CSFV Brescia Stammes gechallenged. Klinische, virologische und serologische Parameter wurden gemessen, um die Wirksamkeit dieses E2-Untereinheit Impfstoffes zu bestimmen. Wie vorhergesehen, widerstanden die Tiere in der C-Gruppe der Challenge besser als die Tiere aus den anderen Gruppen. In Gewebeproben der Tiere, die mit der höchsten Dosis des E2 (32 μg) geimpft worden waren, wurde kein virales Antigen festgestellt und die Krankheit brach in dieser Gruppe nicht aus. Die PD95-Dosis wurde auf der Annahme berechnet, dass ein NPLA-Titer von ≥ 50 (an 21 Tagen nach der Impfung) vollen Schutz verleiht (keine Ausbreitung des Virus). Dies ergab eine PD95-Dosis von 32 μg/Tier.
  • Um ferner das Schutzniveau gegen eine Challenge von 100 LD50 virulentem CSFV 2 und 3 Wochen nach der Impfung zu bestimmen, wurden zwei Gruppen (A-B) zu jeweils sechs Schweinen intramuskulär mit 32 μg E2 geimpft. Zwei nichtgeimpfte Schweine wurden in jeder Gruppe (A-B) gehalten, um die von den geimpften Schweinen ausgehende Virus-Exkretion durch Kontaktinfektionen festzustellen. Nach zwei (A) und drei (B) Wochen wurde den geimpften Schweinen und den Kontrolltieren intranasal 100 LD50 des hochvirulenten CSFV Brescia Stammes verabreicht. Klinische, virologische und serologische Parameter wurden gemessen, um die Wirksamkeit des E2-Untereinheit Impfstoffes zwei und drei Wochen nach der Impfung zu bestimmen. Wie vermutet, widerstand die Gruppe B der Challenge mit geringeren klinischen Symptomen als die Gruppe A. Eine Übertragung des Virus auf die markierten Schweine trat nur in Gruppe A auf und in den Leukofraktionen aller Tiere aus beiden Gruppen wurde der Virus festgestellt. Nur ein Tier aus Gruppe B zeigte eine Serokonversion an Tag 14 nach der Impfung (Nr. 414). Aus der gleichen Gruppe hatte ein Tier nach 21 Tagen nicht serokonvertiert, war jedoch geschützt und hatte nur zwei Tage lang Fieber und hatte elf Tage nach der Challenge serokonvertiert. Nur die Kontrolltiere und eines der markierten Tiere (Gruppe A) entwickelten Leukopenie und Thrombozytopenie. Es wurde kein virales Antigen in den Gewebeproben der Tiere der Gruppen A und B festgestellt. Daraus lässt sich schließen, dass alle Tiere zwei und drei Wochen nach der Impfung mit einer Einmaldosis gegen die Challenge geschützt waren.
  • Um ferner das Schutzniveau gegen die Challenge mit dem 100 LD50 virulenten CSFV 3 und 6 Monate nach der Impfung zu bestimmen, wurden zwei Gruppen (A-B) zu jeweils sechs Schweinen intramuskulär mit 32 μg E2 geimpft. Zwei nichtgeimpfte Schweine wurden in jeder Gruppe (A-B) gehalten, um die Virus-Exkretion von den geimpften Schweinen durch Kontaktinfektion festzustellen. Nach drei (A) und sechs (B) Monaten wurden die geimpften Tiere und die Kontrolltiere intranasal einer Challenge mit 100 LD50 des hochvirulenten CSFV Brescia Stammes unterzogen. Klinische, virologische und serologische Parameter wurden gemessen, um die Wirksamkeit des E2-Untereiheit Impfstoffes nach dieser Zeitspanne zu bestimmen. Alle Tiere der Gruppen A und B widerstanden der Challenge mit geringfügigen klinischen Symptomen. Und nur die Kontrolltiere entwickelten Leukopenie und Thrombozytopenie. Eine Übertragung des Virus auf die markierten Tiere fand nicht statt. Der Virus wurde in keiner der aus den beiden Gruppen ausgewählten Leukofraktionen entdeckt. Nur ein Tier aus Gruppe B serokonvertierte am Tag 28 nach der Impfung (Nr. 1983). In keiner der Gewebeproben der Tiere der Gruppen A, B und der markierten Tiere wurde das virale Antigen entdeckt. Daraus lässt sich schließen, dass alle Tiere drei und sechs Monate nach der Impfung mit einer Einmaldosis gegen die Challenge geschützt waren, und eine Übertragung des Virus nicht auftrat.
  • Die BVDV-Stämme 4800, 150022 und 178003 wurden verwendet, um experimentelle E2-Untereinheit Impfstoffe herzustellen. Die E2-Gene dieser Stämmme wurden im Baculovirus-Expressions-System exprimiert (Hulst et al., 1993, J. Virol. 67: 5435-5442), (P.A. van Rijn et al., 1996, I), (Gen. Virol., 77: 2737-2745). Die Spodoptera frugiperda Zelllinie, SF21, wurde zur Verbreitung des rekombinanten Baculovirus und zur Produktion des E2-Proteins verwendet. SF21-Zellen wurden bei 28 °C in einem serumfreien SF900 Medium (GIBCO BRL) gezüchtet. Konfluierende Monolayer der SF21-Zellen wurden mit dem rekombinanten Baculovirus bei einer MOI von 5 TCID50 (50% Infektionsdosis aus Gewebekultur) pro Zelle infiziert. Nach 4–5 Tagen zeigten die Kulturen einen zytopathischen Effekt von 80–90%. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 1500·g zentrifugiert und der Überstand mit dem Baculovirus und dem E2 wurde entnommen und bei –20 °C gelagert. Um den Baculovirus zu inaktivieren, wurde eine 2-Bromoethyl-Iminbromid (BEI)-Behandlung entsprechend der standardmäßigen Vorgehensweise durchgeführt. Kurz gesagt, es wurden 600 μl BEI und 600 μl 1 M NaOH gemischt. Nach 30 Minuten bei 20 °C wurden 150 ml des Überstands hinzugegeben und dies 24 Stunden lang bei 20 °C gerührt. Dann wurden 20 ml von 25%igem Thiosulfat hinzugegeben. Die Inaktivierung des Baculovirus wurde durch das Titrieren des Überstands auf SF21-Zellen bestätigt.
  • Die experimentellen BVDV-Impfstoffe bestanden aus Überständen, enthaltend E2, in einer doppelten Wasser-Öl-Emulsion. Das Öl enthielt 90% Marcol 52 (Esso) und 10% Montanid 80 (Seppic). Der Wasseranteil (PBS+) enthielt 98% phosphatgepufferte Saline, 2% Montanox 80 (Seppic) und 100 ppm Thiomersal. Der Überstand, das Öl und das PBS+ wurden in einem Verhältnis von 10:11:10 verwendet. Zunächst wurden der Überstand und das Öl emulgiert und dann das PBS+ hinzugefügt und emulgiert. Ein Kontroll-Impfstoff wurde auf ähnliche Weise aus dem Überstand von SF21-Zellen, die mit dem Wildtyp des Baculovirus infiziert waren, hergestellt. Nach der Zubereitung wurden die Impfstoffe für steril befunden.
  • Unsere vorangehende Annahme, dass die Menge des Antigens in den drei Impfstoffen aufgrund der Vergleichbarkeit des exprimierten Proteins ähnlich sein würde, war falsch. Die Unterschiede in der Menge des Antigens werden wahrscheinlich durch Unterschiede bei der Expression in den Insektenzellen hervorgerufen. Der Impfstoff 150022 enthielt 55 μg E2 pro Dosis und schützte den Fötus nach zweimaliger Impfung (Tag 0 und Tag 21). (Brusche et al., 1997, Vaccine in press). Der Impfstoff 4800 und der Impfstoff 178003 enthielten 12 μg bzw. 17 μg E2 pro Dosis und schützten den Fötus nicht. Dieses Ergebnis legt eine Korrelation zwischen der Menge des E2-Proteins und dem fötalen Schutz nahe.
  • Allerdings können auch Unterschiede in der Immunogenität des E2-Glykoproteins und das Unvermögen der Challenge-Stämme, die Plazenta zu durchqueren, eine Erklärung für die unterschiedlichen Auswirkungen der Challenge sein. Keiner der Impfstoffe schützte gegen die heterologische BVDV-Schädigung.
  • Die Ergebnisse dieser Studie verlangen eine Weiterentwicklung der Impfstoffe der BVDV-Untereinheit, da wir zeigen konnten, dass der Schutz des Fötus durch die Impfung mit dem Hüllglykoprotein E2 erreicht werden kann. Desweiteren ist es ein Markerimpfstoff, der die Unterscheidung zwischen geimpften Tieren und denen, die mit dem Stamm eines Feldvirus infiziert sind, gestattet. Dies ist hinsichtlich zukünftiger BVDV-Ausrottungsprogramme nützlich.
  • Diskussion
  • Der Produktionssprozess wurde mit dem Ziel entwickelt, eine optimale Produktion des heterologischen Proteins, das durch Gene kodiert wird, die in Baculoviren in Insektenzellen eingefügt sind, zu erreichen. Das Baculovirus-Expressions-Vektorsystem (BEVS) eignet sich gut für die Produktion verschiedener rekombinanter Proteine, da eine korrekte Proteinfaltung und ein akkurater posttranslationaler Ablauf biologisch aktive Proteine für die Anwendung bei Tier und Mensch ergeben. Das Baculovirus umfasst 2 nichtessentielle Gene, die von sehr einflussreichen Promotoren transkribiert werden, dem p10 und dem Polyhedrin-Promotor. Die Deletionsmutagenese des p10-Gens (van Oers et al., J. Gen. Virol. 74: 563-574; 1993) zeigte, dass dieses für die Virus-Replikation in der Zellkultur nicht essentiell ist, das p10 dagegen für die Zelllyse wichtig ist und dass die Abwesenheit des p10-Proteins dazu führt, dass infizierte Zellen intakt bleiben und damit die Freisetzung von Polyhedra aus den infizierten Zellen verhindert wird, wodurch die Neuinfektionsraten reduziert werden, nicht aber die Infektivität an sich. Die Produkte der Gene (P10 (oder Fibrillin) und Polyhedrin) werden erst zu einem späten Zeitpunkt der Infektionsphase exprimiert. Der Austausch dieser Gene durch das Gen des gewünschten Proteins kann (im Fall des Polyhedrin-Promotors) theoretisch zu einer Ausbeute von bis zu 50% der gesamten Proteinproduktion der Kultur mit den Insektenzellen führen, was sich in Expressionsniveaus von mehr als 1 Gramm Polyhedrin-Protein pro Liter in der Kultur ausdrückt (Maiorella et al., (1988) Large-scale insect cell culture for recombinant protein production. Bio/technology, 6, 1406-1410). Die Infektionsmultiplizität (MOI, Verhältnis der Virusdichte pro ml zur Zelldichte pro ml) ist ein Schlüssel-Parameter bei der Optimierung der Proteinproduktion. Ein ersichtlicher Grund für die Infektion mit einer niedrigen MOI liegt darin, den Virus-Impfstoff so gering wie möglich zu halten. Wenn die Infektion bei einer Dichte von 2 Mio. Zellen pro ml mit einer MOI von 0,1 in einem 50L-Fermenter stattfindet, werden 1·1010 Viren benötigt. Dies würde ein Inokulum von ungefähr 1 Liter erfordern. Desweiteren würde ein zusätzlicher Schritt zur Herstellung eines solchen Inokulums benötigt. Zwei wesentliche Nachteile von gebundenen Kulturen sind die ineffiziente Verwendung des Mediums und die Sauerstofflimitierung. Bedingt durch die Tatsache, dass die Lösbarkeit von Sauerstoff in Wasserflüssigkeiten relativ arm ist, ist Sauerstoff das limitierende Substrat für die Zellen in einer Monolayer-Kultur. Der begrenzende Faktor für die maximale Zelldichte in statischen Kulturen ist die verfügbare Oberfläche. Sobald die Oberfläche mit einem Monolayer der Zellen bedeckt ist, stoppt das Zellwachstum. Dies ergibt ein Medium mit einer Zelldichte von etwa 1·106 Zellen/ml. In Suspensionskulturen gibt es keine Sauerstofflimitierung und die Verfügbarkeit anderer Substrate ist der begrenzende Faktor für die Zelldichte. Diese Limitierung tritt ein, wenn die Zelldichte höher als die Sauerstofflimitierung ist, weshalb die Zelldichte höher wird als in statischen Kulturen. Der Sauerstofflimitierung kann vorgebeugt werden durch Verwendung einer Sauerstoffelektrode, um die Konzentration des gelösten Sauerstoffs zu beobachten. Sobald diese einen bestimmten Wert unterschreitet, wird der Suspension automatisch Sauerstoff hinzugefügt, entweder durch einen Sparger oder durch Hinzufügen über den Kopfraum des Fermenters. Moderates Rühren der Supension gewährleistet eine homogene Kultur, in der sich keine Substratgradienten aufbauen und in der die Zellen nicht zu hohen Schubkräften ausgesetzt sind. Desweiteren werden durch das Rühren die Viren effizienter von den infizierten zu den nichtinfizierten Zellen übertragen. Da am Anfang nur etwa 0,1–0,3% der Zellen infiziert sind, müssen die verbleibenden 99,7–99,9% der Zellen wachsen und sich vervielfachen. Viruspartikel, die in den infizierten Zellen produziert werden, werden 12–20 Stunden nach der Infektion freigesetzt (Dee, K.U. and Shuler, M.L. 1997. Biotechnology Progress, 13, 14-24). Die Anzahl der freigesetzten Viruspartikel gro Zelle beträgt 100–200, welche die bis dato nichtinfizierten Zellen in einem neuen Zyklus infizieren können. Es dauert mehrere Zyklen, bis genügende Viruspartikel zur Infektion aller Zellen in der Kultur hergestellt sind. Das Ziel ist es, die Proteinproduktion der letzten Infektionsweitergabe zu Ende zu führen, bevor das Medium aufgebraucht ist und alle metabolischen Vorgänge zum Stillstand kommen. Es ist außerdem nicht wünschenswert, die vollständige Infektion bei einer suboptimalen Zelldichte durchzuführen, da das Medium dann nicht effizient genug ausgenutzt wird und eine geringere volumetrische Ausbeute des heterologischen Proteins die Folge ist. Der gesamte Prozess der Virus-Infektion kann visuell mitverfolgt werden, da das Polyhedrin-Gen immer noch vorhanden ist. Die Virus-Infektion kann als dichte Proteinpartikel, die sich im Zellkern häufen, beobachtet werden. Um Schäden an den Zellen durch Schubkräfte zu vermeiden, wird Pluronic F-68 dem Medium hinzugegeben, so dass sich eine Endkonzentration von 0,2% ergibt. Desweiteren wird, falls notwendig, Antischaum A hinzugegeben, um ein exzessives Schäumen zu verhindern, welches ebenso zum Zelltod führt. Die Gesamtmenge an Antischaum A, das zu einer 50 L-Kultur hinzugegeben wird, liegt durchschnittlich bei 20 ml. Die optimale Virusdichte zur Infektion der Zellen kann berechnet werden. Diese Dichte hängt ab von der Wachstumsrate der Zellen, der Zeit nach der Infektion, zu der neue Viruspartikel freigesetzt werden und der Anzahl an neuen Viruspartikeln, die pro infizierter Zelle produziert werden. Das Verfahren, das die Erfindung bereitstellt, wird durch die Produktion des E2 Pestivirus-Proteins veranschaulicht. Obwohl dieses Protein als ein potentes Antigen bekannt war, ist die E2-Produktion (Fragment) für einen Impfstoff oder einen diagnostischen Test nicht immer erfolgreich. Trotz eines niedrigen PD50 bei 2 μg (unter Verwendung eines besonders immunogenischen E2-Fragmentes), ist es ein Problem, genügende Mengen an Impfdosen mit einer ausreichenden Antigenmasse in einer kommerziell attraktiven Weise herzustellen, um Schutzimpfungen einer großen Gruppe von Tieren durch eine einzige Impfung pro Tier zu ermöglichen. Dies ist besonders relevant bei CSFV-Impfungen. Deren Anwendung findet normalerweise im Zuge von Massenimpfungen in Gegenden statt, in denen ein Ausbruch von CSFV stattgefunden hat. Hierbei sind schnelle Impfungen einer großen Anzahl von Tieren in einer relativ kurzen Zeitspanne gefragt. Bei solchen Massenimpfungen ist es von größter Bedeutung, dass ein adäquates Schutzniveau (die Anzahl der Schweine, die gegen die Infektion mit dem Wildtyp geschützt sind) schnell erreicht wird. Das wochenlange Warten nach der ersten Impfung auf eine zweite Impfung, um einen Schutz herzustellen, erschwert und verzögert die Überwachung der Krankheit. Unterschiede zwischen den verschiedenen Verfahren zur Herstellung des rekombinant exprimierten E2-Proteins, selbst wenn vergleichbare E2 (Fragmente) in Baculoviren exprimiert werden, sind vorhanden. Frühere Reporte zu Kulturen zur Herstellung von E2-Proteinen verweisen darauf, dass sich die Ausbeute des E2-Proteins (Fragment) zwischen 20–90 μg/ml bewegt (Hulst et al., J. Vir. 5435-5442, 1993; Hulst and Moormann, Cytotechnology 20: 271-279, 1996), wobei man ferner eine Immunoaffinitätsreinigung mit monoklonalen Antikörpern benötigte, um die notwendige und relevante E2-Antigenmasse für eine Einmalimpfung zu erhalten. Ein anderes Verfahren (unter Verwendung eines Fragmentes des E2, beschrieben in EP 0389034 ), bei dem E2 aus dem Überstand von Insektenzellen gewonnen wird, ohne dass eine weitere Immunoaffinitätsreinigung durchgeführt wird, ergibt einen auf E2 basierenden Impfstoff, der zweimal injiziert wird, bevor eine zufriedenstellende (protektive) Immunreaktion eintritt. Diese Probleme beruhen unter anderem auf einer niedrigen Konzentration der relevanten Antigen-Substanz, in diesem Fall dem E2-Protein (Fragmente) des Startmaterials, z.B. dem Überstand der Zellkultur, aus dem der Impfstoff hergestellt wird. Theoretisch kann man des Weiteren Antigenmasse durch heute bekannte Reinigungs- und Kondensationsmethoden gewinnen; dies ergibt jedoch keine kommerziell attraktive Produktion eines Impfstoffes, sondern verursacht hohe Kosten pro Impfdosis. Die Produktion wird mittels der Verwendung eines Verfahrens durchgeführt, wie es die Erfindung in unserem 50L-Fermenter bereitstellt, welche routinemäßig zu einer Ausbeute von etwa 200–300 μg/ml CSFV E2-Proteinfragmenten führt, was ausreicht, um theoretisch 100.000 Tiere pro Kultur zu impfen. Die Zellen werden bei einer Dichte von 0,5 bis 1,5·106 Zellen/ml mit 1 bis 10 ml Virusinokulum, enthaltend etwa 107 TCID50/ml, infiziert. Die Kultur wird vorzugsweise entnommen, wenn > 50–80% der Zellen CPE aufweisen. Dies ist etwa 100–150 Stunden nach der Infektion der Fall. Bei früheren Kulturen zur Herstellung des E2-Proteins wurden die Zellen (synchron) mit einer MOI > 1 infiziert, was zu einer dreimal schwächeren Proteinausbeute führte als diejenige, die die vorliegende Erfindung bereitstellt. Bei einem Verfahren, das die Erfindung bereitstellt, wird ein 50L-Fermenter geimpft mit 5 L einer Zellsuspension, die in einem 5L-Fermenter oder in 10 L der gesamten Suspensionen gezüchtet wurde. Die anfängliche Zelldichte liegt bei etwa 3·105 Zellen/ml. Die Zellen werden bis zur berechneten Zelldichte angezüchtet, dann wird der Virus in die Suspension gegeben. Danach wird mit der Entfernung der Zellen und der Polyhedra durch Mikrofiltration weiter verfahren. Ein Gerät zur Mikrofiltration mit Hohlfieber wird an den Fermenter angeschlossen und das Material wird durch das Filtrationsmodul mit einer Porengröße von 0,22 μm gepumpt. Der Retentatfluss wird über den Fermenter zurückgeleitet und der Permeatfluss wird in einem 100L-Behälter gesammelt. Nach Beendigung der Filtration wird die Antigen-Lösung, die nun zellfrei ist, jedoch immer noch infektiöse Baculoviren enthält, in einem 100L-Behälter inaktiviert. Im Allgemeinen wird 2-Bromoethyl-Ammoniumbromid (BEA) zu der Suspension gegeben, um eine Endkonzentration von 8–12 mM zu erhalten. Der pH-Wert wird angehoben auf etwa 5,8 bis 8,2–8,7, indem 2M NaOH hinzugegeben wird. Diese Veränderung des pH-Wertes wandelt BEA in BEI um (2-Bromoethyl-Imminebromid). Dies ist der DNA-inaktivierende Agent. Der pH-Wert wird sorgfältig beobachtet und auf 6–10 eingestellt, die Temperatur wird bei 34–39 °C gehalten. Nach einer Inaktivierung von 6 Stunden wird die Antigen-Lösung in einen zweiten Inaktivierungsbehälter gegeben. Dies gewährleistet, dass alles Material aus dem Behälter in Kontakt mit dem BEI gekommen ist und demnach inaktiviert ist. Tropfen mit der Flüssigkeit, die den Virus, jedoch nicht das BEI enthalten, können im ersten Behälter, nicht jedoch im zweiten Behälter auftreten. Baculoviren in einer Konzentration von 104–105 pfu/ml werden auf einen Wert von < 10?7 pfu/ml abgesenkt (< 1 Viruspartikel pro 10 m3). Dies ist die gleiche Norm, die auch auf virale Impfstoffe angewendet wird, die auf Viren basieren, die in der Lage sind, Wirtstiere zu infizieren (wie FMD). Schweine sind keine Wirte für Baculoviren. Die inaktivierte Antigenmasse wird bei ≤ –20 °C aufbewahrt, bis sie in einer Wasser-Öl-Emulsion verwendet wird. Eine Einzeldosis von 32 μg E2 (Dosisvolumen 2 ml) reicht aus, um schon nach 2 Wochen und spätestens nach 6 Monaten nach der Impfung Schutz (> PD95) gegen das klassische Schweinefieber zu verleihen. Der Herstellungsprozess ist so gestaltet, dass die Produktion in großem Umfang klar mit einbezogen wird, und die Verwendung von 250L- oder sogar größeren Fermentern möglich ist. Eine statische Kulturproduktion in großem Umfang wurde ebenso in Betracht gezogen; hierbei müssen lediglich mehr Gewebekulturfläschchen verwendet werden. Dennoch bräuchte man für die gesamte Proteinproduktion, die im 50L-Fermenter routinemäßig erreicht wird, etwa 7000 Tl75-Gewebekulturfläschchen. Zellwachstum und Infektion können besser in einem Fermenter beobachtet und reguliert werden, da hier eine Sauerstoff- und pH-Elektrode vorhanden ist. Bei Gewebekulturfläschchen sind Variationen von Fläschchen zu Fläschchen wahrscheinlich, können aber nicht quantifiziert werden. Die Inaktivierung kann in den Behältern wesentlich akkurater beobachtet und reguliert werden als in der statischen Kulturproduktion. Volumetrische Produktionsniveaus anderer Proteine, die in den BEVS (in unserem Institut) exprimiert wurden, werden ebenso erheblich erhöht, wenn Zellen mit einem Verfahren, wie es die Erfindung bereitstellt, gezüchtet werden. So wurde z.B. die Ausbeute an bovinem FSH mit einem Faktor von 3–4 erhöht, wenn ein 10L-Fermenter benutzt wurde. Zellen wurden bei einer MOI von 0,003 von jeweils 2 rekombinanten Baculoviren bei einer Zelldichte von 1,1·106 Zellen/ml koinfiziert. Die Ausbeute der unterschiedlichen E2-Proteine des BVDV und des Erns Proteins oder BVDV und/oder CSFV in Suspensionskulturen in Schüttelfläschchen wuchs um das Dreifache an. Das Verfahren kann auch auf andere rekombinante Proteine angewandt werden. Tabelle 1. Bestimmung des viralen Antigens durch Immunofluoreszenztechniken in Cryostat-Sektionen unterschiedlicher Gewebe.
    Figure 00600001
    • - = keine Fluoreszenz festgestellt
    • + = Fluoreszenz festgestellt
    • --- = keine Daten
    • * = Tiere wurden am Ende des Experimentes 20 dpc. geschlachtet
    Tabelle 2. Ergebnisse des Virus-Neutralisierungs-Tests
    Figure 00620001
    • --- = keine Daten

Claims (9)

  1. Verfahren zum Erhöhen der Ausbeute eines rekombinanten Pestivirus E2- oder Erns-Proteins oder immunogener Fragmente davon, oder eines FSH, das in einer Insektenzellkultur erzeugt wird, welches umfasst: – Auswählen eines rekombinanten Baculovirus, der das Protein codiert, und – Züchten von Insektenzellen mit einer Zelldichte von 1 × 105 bis 5 × 106 Zellen/ml, bevorzugter 5 × 105 bis 1,5 × 105 Zellen/ml, in einem Züchtungsmedium in einem Kulturbehälter mit ausreichendem Volumen, um wenigstens zwei Liter Züchtungsmedium aufzunehmen und – Infizieren der Zellen mit einem Inokulum (Impfkultur) wenigstens eines Baculovirus mit einer aus einer Verdünnungsrate eines Virusbestandes berechneten Multiplizität der Infektion zwischen 0,005 und 0,00025.
  2. Verfahren nach Anspruch 2, welche das Auswählen eins rekombinanten Baculovirus umfasst, der eine Expression des gewünschten Proteins unter der Kontrolle des p10-Promotors zeigt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, welches das Züchten der Insektenzellen in Suspension, bevorzugt in einem Kulturbehälter, wie z.B. einem Fermenter, umfasst, welcher moderat gerührt werden kann.
  4. Anwenden eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Erzeugen einer Antigensubstanz.
  5. Anwenden nach Anspruch 4, wobei die Antigensubstanz ein Pestivirusprotein oder ein immunogenes Fragment davon, bevorzugt ein klassisches Schweinepestvirusprotein oder ein immunogenes Fragment davon ist.
  6. Vakzin, das ein rekombinantes Pestivirusprotein und ein inaktiviertes Baculovirus aufweist, die gemäß dem Verfahren von einem der Ansprüche 1 bis 3 erzeugt wurden, wobei das Protein eine Baculovirusproduktion-Systemglykolisierung zeigt, und wobei das Vakzin einen Schutz gegen das klassische Schweinepestvirus nach nur einer einzigen Impfung ohne Immunoaffinitätsreinigung verleiht.
  7. Vakzin nach Anspruch 6, welches zusätzlich ein Hilfsmittel aufweist, wobei das Hilfsmittel bevorzugt eine doppelte Wasser-in-Öl-Emulsion aufweist.
  8. Anwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Erzeugen eines rekombinanten FSH.
  9. Anwendung nach Anspruch 8, um ein rekombinantes FSH zur Einnahme in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung sich ausbreitender Krankheiten zu erzeugen.
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