CN101152570B - 一种猪瘟病毒表位疫苗及其制备方法 - Google Patents
一种猪瘟病毒表位疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种猪瘟病毒表位疫苗及其制备方法。该疫苗的活性成分蛋白的氨基酸残基序列含有6个拷贝或6个拷贝以上序列1所述的氨基酸残基序列。本发明所提供的猪瘟病毒表位疫苗，其活性成分蛋白选择非常保守的中和表位，去除中和表位的周围序列，不含有病毒的任何其他成分或者病毒的其他蛋白序列，并以GS为连接肽，更集中的发挥表位作用，使得针对该表位的体液应答更为集中和强烈。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪瘟病毒表位疫苗及其制备方法。
背景技术
由猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的猪瘟是危害养猪业的重要病毒性疾病，是世界动物卫生组织确定的法定报告的烈性传染病之一，也是我国确定的一类动物疫病之一，其防制工作受到世界各国的高度重视。目前，除欧盟等一些国家采用非免疫的“扑杀”政策(non-vaccination stamping-out policy)消灭猪瘟病毒外，包括我国在内的世界上许多国家采用疫苗防护政策(immunophylactic policy)。虽然现在有很多新型疫苗正在开发之中，但大多数离真正投入实际应用，仍有很多的工作要做。目前，市场上最为普遍的猪瘟病毒疫苗是减毒活疫苗，包括使用范围非常广泛的中国“54-III系”疫苗(由Shimen株充分适应兔体后获得的猪瘟兔化弱毒疫苗，又称C株)、由ALD株得到的低温细胞适应株GPE株(日本)和由Alfort株得到的低温细胞适应株Thiverval株(法国)。这些疫苗在猪瘟防制上曾经甚至仍然起着非常重要的作用。但近年来，也时有免疫失败的报道。目前认为，这些疫苗在长期使用中造成免疫失败的原因是多方面的。此外，弱毒疫苗与野毒在血清学上不能有效区分(缺乏“标记”功能)，也越来越成为制约这些疫苗继续使用的一个重要因素。猪瘟病毒疫苗的更新换代已经成为一种趋势。
欧盟国家目前已经批准上市了基于猪瘟病毒结构蛋白的基因重组亚单位疫苗(subunit vaccine)。该类疫苗的有效成分是利用昆虫-杆状病毒系统表达的猪瘟病毒主要保护性抗原E2蛋白。该疫苗对于猪瘟病毒攻击能起到有效的防护，并且也能从血清学上将疫苗免疫的猪只同野毒感染的猪只区分开来。相对于传统的减毒活疫苗，该疫苗具有“标记疫苗”的优势，但同时在保护效力和生产成本上却处于劣势地位。
亚单位疫苗同传统疫苗比较所存在的不足，并不是绝对的。现代分子生物学的基因工程手段，使得效力更好、生产成本更低的新型猪瘟病毒基因重组亚单位疫苗成为可能。基于抗原结构域(antigenic domain)和免疫显性多肽(immunodominantpeptide)的候选疫苗也已经有所发展。表位疫苗(epitope vaccine)是基因重组亚单位疫苗的一种特殊形式。由于有效成分十分明确，不含有其他任何干扰成分，表位疫苗还是一种理想的标记疫苗，具有特殊的发展优势和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪瘟病毒表位疫苗及其制备方法。
本发明所提供的猪瘟病毒表位疫苗，其抗原多肽的氨基酸残基序列含有6个拷贝或6个拷贝以上序列1所述的氨基酸残基序列。序列表中序列1所述的氨基酸残基序列为猪瘟病毒的一个中和表位的序列，具有9个氨基酸残基。
所述序列1所述的氨基酸残基序列之间可用氨基酸残基序列(接头序列)连接和分隔开；所述接头序列优选为Gly-Ser(GS)。
所述抗原多肽的氨基酸残基序列优选含有6个拷贝的序列1所述的氨基酸残基序列。
为了便于纯化，所述抗原多肽的氨基端可连接便于表达和纯化的担体蛋白，谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione-S-transferase，GST)是一种可供选用的担体蛋白。所述谷胱甘肽S-转移酶蛋白的核苷酸编码序，GenBank编号为U78872。
本发明所提供的猪瘟病毒表位疫苗的制备方法，是构建含有编码6个或6个以上拷贝的序列1所示氨基酸残基序列的重组表达载体，并将其在大肠杆菌中表达得到猪瘟病毒表位疫苗的活性成分蛋白。
所述重组表达载体中还含有连接于谷胱甘肽S-转移酶蛋白的核苷酸编码序列。
所述序列1所示氨基酸残基序列的编码序列之间是通过同尾酶BglII和BamHI粘性末端连接成连接肽GS的编码序列。
本发明所提供的猪瘟病毒表位疫苗，其抗原多肽选择非常保守的中和表位，且仅仅采用该中和表位，并去除该中和表位的周围序列，不含有病毒的任何其他成分或者其他病毒蛋白序列，表位之间以GS连接，更集中的发挥表位作用，使得针对该表位的体液应答更为集中和强烈。实验证明，本发明的疫苗蛋白具有的表位拷贝数使本发明的疫苗具有更好的反应原性和免疫原性：无论是从体液免疫应答的强度上，还是从体液应答的反应速度上，高表位拷贝数都具有明显的优势；更为重要的是，在利用兔定型热反应模型进行的猪瘟病毒攻毒/防护试验(challenge/protectiontest)中，用本发明所提供的疫苗免疫的大耳白兔，可以诱导产生保护性应答，抵御高剂量的猪瘟病毒攻击，并得到完全防护，阻止病毒感染，而低表位拷贝数的重组抗原免疫的大耳白兔则不能抵御高剂量猪瘟病毒攻击。
本发明的表位疫苗所用表位TAVSPTTLR是猪瘟病毒特异性的和毒种内高度保守的，所以本发明提出的猪瘟病毒新型亚单位/表位疫苗的设计具有潜在的针对不同猪瘟病毒毒株感染的广谱防护能力，在猪瘟防制中具有巨大的潜在开发价值，将发挥重要的作用。
本发明的猪瘟病毒基因重组表位疫苗的制备方法，使用生物工程的方法发酵而成，生产工艺成熟，重复性好。
附图说明
图1a为扩增E表位的基因序列和标记片段M的序列的引物序列分析图
图1b为标记片段M的序列
图1c为BamHI和BglII同尾酶连接方式图
图2为T-E-M、T-2E-M、T-3E-M、T-4E-M、T-5E-M、T-6E-M用BglII/XhoI进行鉴定的图谱
图3为GST-E、GST-2E、GST-4E、GST-5E、GST-6E SDS PAGE图谱
图4为GST-E、GST-2E、GST-3E、GST-4E、GST-5E、GST-6E序列
图5为猪瘟病毒疫苗GST-E、GST-2E、GST-4E、GST-5E、GST-6E的抗原性酶联免疫吸附鉴定结果
图6为猪瘟病毒疫苗GST-E、GST-2E、GST-4E、GST-5E、GST-6E的抗原性免疫印迹鉴定结果
图7a为攻毒/保护试验中免疫的大耳白兔攻毒后体温曲线图
图7b为攻毒/保护试验中没有定型热的试验兔血清(接种后96小时)中感染性病毒颗粒的检测
图7c为本发明猪瘟病毒疫苗免疫后的大耳白兔攻毒后脾脏中是否有猪瘟病毒抗原的检测结果
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
猪瘟病毒主要保护性抗原E2蛋白上一个B细胞表位，该表位的序列(TAVSPTTLR，序列1)在猪瘟病毒中是高度保守的，将该抗原表位命名为E表位。
本发明的猪瘟病毒表位疫苗的抗原多肽含有一个或一个以上拷贝上述表位序列，宜选在6个以上，优选为6个。表位序列之间可用氨基酸残基序列(接头序列)连接和分隔开，优选用Gly-Ser(GS)连接。为了便于纯化，所述疫苗的活性成分蛋白的氨基端可选用便于表达和纯化的担体蛋白，谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione-S-transferase，GST)是一种可供选用的担体蛋白。谷胱甘肽-S-转移酶蛋白的核苷酸编码序列，GenBank编号为U78872。本发明的猪瘟病毒表位疫苗的活性成分蛋白(下述实施例中直接称猪瘟病毒表位疫苗)的具体制备方法和效果实验如下述实施例所述。
实施例1、本发明的猪瘟病毒表位疫苗的表达和纯化及其抗原性检测
一、猪瘟病毒表位疫苗的表达和纯化
1、可表达猪瘟病毒表位疫苗的载体的构建
1)引物和标记片段的获得
以猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白基因组一段序列作为标记片段(将其命名为M，序列表中序列2，图1b)，标记序列的引入，是为了便于分子构建的操作。也可以选用其他序列作为标记序列，符合本实施实例要求的标记该序列应该满足的条件是在大小上超过100bp，在序列内部应没有BglII和XhoI位点，最好也没有BamHI位点。
图1b中所示的序列5’端的阴影区与下述引物EMF中3’端一段序列完全相同，3’端的阴影区与下述引物EMR中的3’一段序列反向互补。
标记片段M可通过人工合成或者亚克隆获得，下述所用的标记片段M。
设计扩增E表位的基因序列和标记片段M的序列的上游引物(EMF)和下游引物(EMR)，引物序列如下所述：
EMF：5′cgcagatctacagcagtgagcccaacaactctgagaggatccgagaatgccagacaggg3′(序列表中序列3)；
EMR：5′tatactcgagctattaggatccctattaggcataggcaccaaacc 3′(序列表中序列4)。
上述引物序列图如图1a所示，上游引物EMF编码TAVSPTTLR表位的核苷酸序列(粗下滑线)，并且在3’端有一段序列(阴影部分)与一个标记序列(M)的5’端有重合；下游引物EMR的3’端则有部分序列(阴影部分)和该标记序列的3’端反向互补。此外，在EMF中引入了两个限制性内切酶位点(BglII和BamHI)，BamHI位点(GGATCC)以及BamHI和BglII的融合位点(GGATCT)都编码接头序列GS；在EMR中引入了两个限制性内切酶位点(XhoI和BamHI)，并在这两个位点间加入了两个终止密码子(TAA和TAG)的反相互补序列。两条引物的5’端都附加了保护性碱基。
限制性内切酶位点的设计，一方面考虑了pGEX-6p-1载体多克隆位点上的BamHI和XhoI；另一方面，也考虑到了BamHI和BglII是一对同尾酶(isocaudarner)，两个分别由同尾酶处理的片段可以连接，但连接以后产生的新序列就不能再为两个同尾酶中的任何一个所识别(图1c)。图1c中所示的是一个片段被BglII在5’端切开，与另一个被BamHI在3’端切开的片段发生的连接，其融合序列GAATCT与BamHI识别的序列GAATCC，都编码同一个二肽序列，即Gly-Ser(GS)。
2)含有E表位以及标记片段M的核苷酸序列的获得
以标记序列M(序列表中序列2，人工合成)为模板， 以EMF和EMR为上下游引物，用Pfu DNA polymerase进行PCR，扩增得到含有E表位和M标记序列的核苷酸片段E-M。PCR反应条件按照产品说明书进行设定。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，使用商品化的DNA凝胶回收试剂盒进行回收。
将该回收的产物用Taq DNA polymerase进行加A处理后，连入pGEM-T-easy载体(Promega)。将得到的重组载体转化大肠杆菌XL1-Blue，然后涂布于含(预先涂)有X-gal和IPTG的LB固体培养基上，37℃培养14小时左右，通过蓝白斑筛选，挑选LB培养板上的白斑，即为阳性克隆，将阳性克隆接种到5ml LB液体培养基中进行37℃振荡培养14小时、碱裂解法提质粒，对质粒进行酶切鉴定：用BglII和XhoI酶切，释放出与E-M序列大小相当的片段；用BamHI和XhoI酶切，电泳有两条带，一条在3kb以上，一条在100bp左右与M大小相当的质粒，即为正确的质粒。将酶切鉴定正确的质粒进行测序，将测序结果表明得到含有E表位的基因序列和标记片段M的序列的正确的重组载体命名为T-E-M。
将获得的T-E-M用BglII和XhoI双酶可将含有标记片段M和E表位编码序列的片段E-M(BglII/XhoI)从pGEM-T-easy载体上释放出来，用BamHI和XhoI双酶切得到去除标记片段M但含有E表位编码序列和pGEM-T-easy载体序列的片段T-E(BamHI/XhoI)；将上述两个片段连接，就可以得到含有两个拷贝的E表位编码序列的重组质粒，按照上述方法进行筛选阳性克隆并提质粒进行酶切和测序鉴定，将测序表明正确的含有两个拷贝的E表位编码序列的重组质粒命名为T-2E-M。
将T-2E-M继续按照上述方法分别用BglII和XhoI双酶切、BamHI和XhoI双酶切，将得到的两个片段连接，得到含有三个拷贝的TAVSPTTLR编码序列的重组质粒并将其命名为T-3E-M；以此类推，得到T-4E-M、T-5E-M、T-6E-M、……T-nE-M，将这些质粒用BglII/XhoI进行鉴定，然后测序鉴定，结果表明获得的质粒均为设计的正确的质粒，其中T-E-M、T-2E-M、T-3E-M、T-4E-M、T-5E-M、T-6E-M用BglII/XhoI进行鉴定的图谱如图2所示。
3)可表达猪瘟病毒疫苗GST融合蛋白的载体的构建
将上述得到的T-E-M、T-2E-M、T-3E-M、T-4E-M、T-5E-M、T-6E-M、……、T-nE-M分别用BglII/XhoI双酶切后从pGEM-T-easy载体上释放含有标记片段M和E表位编码序列的片段E-M、2E-M、3E-M、……、nE-M(BglII/XhoI)，将E-M、2E-M、3E-M、……、nE-M分别与BamHI/XhoI双酶切后的pGEX-6p-1(GE Healthcare)载体连接，按照步骤2)的方法进行转化大肠杆菌XL1-Blue，挑选克隆提取质粒。将得到的质粒用BamHI进行酶切鉴定，将能释放大小与标记序列相当片段的质粒，进行测序，将测序表明正确含有GST基因和标记片段M和E表位编码序列的片段的重组质粒分别命名为6p-E-M、6p-2E-M、……、6p-nE-M；将6p-E-M、6p-2E-M、……、6p-nE-M分别用BamHI酶切后，回收大片段，自连得到去除标记片段M的含有不同拷贝数TAVSPTTLR(E表位序列)的重组质粒，用BamHI进行酶切鉴定，挑选酶切只得到大于5kb的一条带的质粒进行测序，将测序表明正确可表达猪瘟病毒疫苗GST融合蛋白的重组质粒命名为6p-E、6p-2E、……、6p-nE。
3、表达猪瘟病毒疫苗GST融合蛋白(GST-nE)的表达和纯化
1)可表达猪瘟病毒疫苗GST融合蛋白的重组质粒6p-E、6p-2E、……、6p-nE的表达
将获得的6p-E、6p-2E、……、6p-nE分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，然后涂布于预先涂有X-gal和IPTG的LB固体培养基上，37℃培养10小时左右，挑选一个克隆接种于5ml液体LB培养基，37℃振荡培养10小时，转入200ml液体LB摇瓶，于37℃振荡培养3小时，将摇瓶转入16℃振荡培养，至摇瓶中菌液温度降低到16℃，加入IPTG，使终浓度为0.4mM，继续在16℃振荡培养7小时，离心收集细菌，低温冻存，以备纯化。在本实施例后后续的实施例中选择表达了6p-E、6p-2E、6p-4E、6p-5E和6p-6E质粒，同时按照相同的方法诱导表达了pGEX-6p-1质粒作为对照(表达出来的蛋白是GST)。
2)猪瘟病毒疫苗GST融合蛋白的纯化
①将收集的冻存细菌用pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS；含5.54g/L Na2HPO4·12H2O，0.39g/L NaH2PO4·2H2O，8.5g/L NaCl的溶液)重悬后，用超声破碎的方法在冰水混合浴中裂解细菌。当细菌裂解彻底后，于4℃用高速离心(18,000rpm，30min)分离上清和沉淀，收集上清，置于冰浴上。
②将保存在体积百分含量为20％的乙醇溶液中的亲和层析柱材(GlutathioneSepharoseTM4B，GE Health)装入层析柱，放干乙醇溶液，并用去离子水平衡10个柱床体积，然后再用3ml 6M盐酸胍洗涤柱材后，用去离子水平衡10个柱床体积，然后用3M NaCl洗涤柱材后，用去离子水平衡10个柱床体积。用含1％Triton的PBS(v/v)平衡柱材20个柱床体积以上，处理好的亲和层析柱，浸浴在1％Triton的PBS中，备用。
③将步骤①得到的细菌裂解液上清液经0.45μm孔径的滤膜进行过滤后，缓慢的穿流过步骤②处理后的层析柱1～2遍。
④用含1.0M NaCl的PBS洗涤菌液穿流过的柱材(一般在30个柱床体积以上)，去除非特异性结合的蛋白，直到用考马斯亮蓝G-250不能检测出流出液中含有蛋白时为止。
⑤将步骤④去除了非特异性结合的蛋白的层析柱材用还原性谷胱甘肽洗脱结合在柱材上的GST融合蛋白，具体方法为：每次用1ml还原性谷胱甘肽溶液(10mM还原性谷胱甘肽，用50mM pH8.0 Tris-HCl配制)，并收集流出液，流出液用考马斯亮蓝G-250检测是否有蛋白被洗脱下来，洗脱过程持续到考马斯亮蓝G-250不能检测出流出液中含有蛋白时为止；用透析或者脱盐的方式将洗脱下来的GST融合蛋白更换缓冲液为PBS。
⑥将步骤⑤得到的蛋白溶液进行蛋白质电泳(SDS PAGE)鉴定目的蛋白的纯度及是否在表达、纯化过程中有降解，结果表明猪瘟病毒疫苗GST融合蛋白都成功的表达了，将上述验证正确的6p-E、6p-2E、……、6p-nE表达的蛋白分别命名为GST-E、GST-2E、……、GST-nE，其中其中GST-E、GST-2E、GST-4E、GST-5E、GST-6E SDS PAGE结果如图3所示，表明通过用Glutathione SepharoseTM4B柱材经一步纯化，已经可以得到较高纯度。测序表明，上述表达的蛋白的序列为如图4所示，图4中下划线所示的序列为E表位序列，GST表示谷胱甘肽S-转移酶序列，GS为连接肽。在产量方面，每500ml菌液经诱导后，GST、GST-E、GST-2E、GST-4E、GST-5E和GST-6E分别可获得11.80、7.00、6.62、6.54、1.42和1.74mg。
二、本发明猪瘟病毒疫苗的抗原性质鉴定
1、酶联免疫吸附测定(ELISA)
1)E表位特异性抗体的制备
a、猪瘟病毒兔高免血清的制备
将100个兔体最小感染量(100个RMID)的猪瘟病毒兔化弱毒疫苗(乾元浩生物股份有限公司)经静脉接种大耳白兔。第一次接种后，以2周为间隔，进行反复接种(剂量仍是100个RMID)。于第三次接种后7天起，采血，制备猪瘟病毒兔高免血清。
b、表位特异性亲和柱的制备
①合成具有两个拷贝E表位的多肽抗原：CTAVSPTTLRGSTAVSPTTLR(标有下划线的序列为E表位)；用去离子水配制高浓度的多肽抗原溶液(4-10mg/ml)，并用耦联缓冲液(0.1M，pH7.7的NaHCO3溶液)将多肽溶液稀释至0.25mg/ml；
②取NHS-activated SepharoseTM 4 Fast Flow(GE Healthcare)柱材0.5ml，加入4.5ml 1mM盐酸，混匀，1500rpm离心1分钟，弃去上清，重复2次；加入4.5ml耦联缓冲液(0.1M，pH7.7的NaHCO3溶液)，混匀，1500rpm离心1分钟，弃去上清；在沉淀中加入250μl步骤①得到的多肽溶液，混匀，室温反应2-4小时或4℃反应过夜；
③加入4.5ml封闭液(0.1M，pH8.3的Tris-HCL缓冲液)，混匀，室温封闭2-4小时或4℃封闭过夜；1500rpm离心1分钟，弃去上清；
④加入1.5ml低pH值缓冲液(含0.5MNaCl的0.1M乙酸缓冲液)，振荡，1500rpm离心1分钟，弃去上清；加入1.5ml封闭液，振荡，1500rpm离心1分钟，弃去上清；重复此步骤3～6次；得到耦联了具有两个拷贝E表位的多肽抗原的E表位特异性亲和柱材，用20％的乙醇保存耦联好的柱材，并保存于4℃，备用。
c、从猪瘟病毒高免血清中制备E表位特异性的抗体
①血清预处理：
将PK-15细胞培养于37℃，5％CO2，含5％胎牛血清的DMEM培养基中；用胰酶-EDTA-Na2消化液(含有质量百分含量0.25％胰酶，0.02％EDTA-Na2，PBS)消化已经致密生长的细胞，用生理盐水洗涤后，将细胞沉淀冻存备用；
在步骤a制备的高免血清中加入上述制备的PK-15细胞，在4℃搅拌过夜；4500rpm离心，去除沉淀(PK-15细胞成分可以吸附一部分与细胞成分反应的血清抗体)；加入二氧化硅粉末，在室温搅拌30min；4500rpm离心，去除沉淀(二氧化硅能吸附脂蛋白)；
②装柱：将步骤b制备的E表位特异性亲和柱材装柱，注意确认柱子底部的筛板有很好的通透性；用pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)平衡亲和柱；
③上样：将步骤①预处理后的血清先用0.45μm的微孔滤膜进行过滤；然后将滤液过柱收集其流出液，再反复上样多次；然后用5倍柱床体积以上的PBS(pH7.2)洗柱，直到流出液用考马斯亮蓝G-250不能检测到蛋白
④洗脱：待柱上的PBS流出后，向柱上加入1ml洗脱液(0.1M，pH2.5甘氨酸缓冲液)，并用预先加有200μl 1M pH9.0 Tris-HCl缓冲液的收集管收集留出液，用考马斯亮蓝G-250进行检测；显示有蛋白存在的各收集管中，得到的是纯化的抗体；
重复上面步骤，继续用1ml的洗脱液进行洗脱，直到考马斯亮蓝G-250检测不到蛋白的存在；得到纯化的E表位特异性的多克隆抗体。
2)酶联免疫吸附测定
将pGEX-6p-1按照步骤一中的步骤3所述方法表达并纯化得到谷胱甘肽S-转移酶GST。
以上述纯化得到猪瘟病毒疫苗GST-E、GST-2E、GST-4E、GST-5E、GST-6E或GST(阴性对照)作为抗原，分别配成1μg/ml，分别包被酶标板，每孔50μl，4℃过夜。然后用洗液洗涤，用洗液(含由质量百分含量为0.5％Tween-20的PBS溶液)洗涤1次后，加入封闭液(含由质量百分含量为0.25％明胶的PBS溶液)封闭30min，再用洗液(含由质量百分含量为0.5％Tween-20的PBS溶液)洗涤3次后，加入50μl7μg/ml的步骤1)制备的E表位特异性抗体，室温孵育45min；再用洗液洗涤3次后，加入工作浓度的酶标二抗50μl，室温孵育45min；再用洗液洗涤5次后，加入50μl OPD-H2O2底物溶液(10ml含有10mg OPD，pH5.0柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中，临用前加入18μl H2O2)，避光反应10min。用酶标仪(Bio-Rad Model 550)测定OD450，或者加入终止液(2M硫酸)50μl，终止反应后用酶标仪测定OD490。以检测结果/阴性对照≥2.1的结果为阳性。结果如图5所示，结果表明兔抗猪瘟病毒高免血清中的E表位特异性抗体可以显著的、特异性的识别猪瘟病毒疫苗GST-E、GST-2E、GST-4E、GST-5E、GST-6E，但对GST没有识别。猪瘟病毒疫苗融合蛋白中的抗原表位(TAVSPTTLR)成分是识别的基础，猪瘟病毒疫苗蛋白中表位序列拷贝数的增加也加强了反应性。
2、免疫印迹(Western blot)检测
将猪瘟病毒疫苗GST-E、GST-2E、GST-4E、GST-5E、GST-6E或GST(阴性对照)进行蛋白质电泳(SDS-PAGE)，转硝酸纤维素(NC)膜(50mA，过夜)，完成转膜后，将膜取出，用立春红染液染色，将Marker用笔标记，将膜放在小型容器内，加入洗液，进行洗涤，每次3分钟，洗涤5次；用洗液洗涤后，加入质量百分含量为2％的脱脂奶粉溶液(溶剂为PBS)，室温下轻轻晃动，封闭1h，用洗液洗涤5次，每次3分钟；之后将膜放入盛有7μg/ml的E表位特异性抗体溶液的小盒内，室温下轻轻晃动，孵育45min，用洗液洗涤5次，每次3分钟；之后将膜放入盛有酶标二抗的小盒内，室温下轻轻晃动，孵育45min；用洗液洗涤5次，每次3分钟；之后将膜放入新鲜配制的DAB-H2O2底物溶液，观察显色进程，在适当时候(还没有出现非特异性的高本底)把膜转入去离子水中结束反应，结果如图6所示，与ELISA相同，兔抗猪瘟病毒高免血清中的E表位特异性抗体可以显著的、特异性的识别GST-E、GST-2E、GST-4E、GST-5E、GST-6E，但对GST没有识别。融合蛋白中的抗原表位(TAVSPTTLR)成分是识别的基础，表位拷贝数的增加也加强了反应性。
实施例2、高免疫原性猪瘟病毒表位疫苗的筛选鉴定
将猪瘟病毒疫苗GST-E、GST-2E、GST-4E、GST-5E、GST-6E分别按照50μg/只的量免疫大耳白兔(每个疫苗组2只，分别记为A和B)，以GST作为对照，第一次免疫用完全弗氏佐剂，第二次和第三次免疫用不完全弗氏佐剂。第一次免疫后，在第14天进行第二次免疫、第28天进行第三次免疫；从第一次免疫之日算起，在第一次免疫当天免疫前取血制备免疫前血清、第一次免疫后第14天第二次免疫前取血制备第一次免疫后血清、第一次免疫后第21天取血制备第二次免疫后血清和第一次免疫后第35天取血制备第三次免疫后血清。
用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测对血清对E表位的滴度(表1)。酶联免疫吸附测定方法按照实施例1的步骤二步骤1进行，其中包被的抗原为含有2个拷贝的E表位序列的合成肽(氨基酸序列为CTAVSPTTLRGSTAVSPTTLR)。通过ELSIA，检测不同稀释倍数的待检血清同表位合成肽的反应性。以不反应的孔为阴性对照(该孔中不加入二抗)，检测值/阴性值≥2.1为阳性，滴度反映了样品同包被抗原之间具有反应的最大稀释度，应介于检测中最后一个阳性检测值和第一个阴性检测值之间，免疫原性用血清中对表位TAVSPTTLR识别的效价(滴度)来表示。每个稀释度的血清均进行三孔平行试验。结果如表1所示，结果表明含有6个拷贝数E表位序列的GST-6E同低表位拷贝数的GST-E、GST-2E、GST-4E和GST-5E相比，表位在蛋白中的免疫原性得到了显著的加强，对表位的抗体应答不仅滴度高，而且反应快(免疫一次后就有提高)。因此选择含有6个拷贝E表位序列或者6个以上拷贝E表位序列的蛋白作为本发明的猪瘟病毒疫苗。
表1为GST-nE(n为1-6的整数)的免疫原性的比较
| 免疫原 | 编号 | 免疫前血清 | 第一次免疫后血清 | 第二次免疫后血清 | 第三次免疫后血清 |
| GST | A | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 |
| B | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | |
| GST-E | A | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 |
| B | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | |
| GST-2E | A | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 |
| B | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | |
| GST-4E | A | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | 1∶1600-1∶6400 | 1∶6400-1∶25600 |
| B | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | 1∶1600-1∶6400 | 1∶1600-1∶6400 | |
| GST-5E | A | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | 1∶6400-1∶25600 | 1∶6400-1∶25600 |
| B | ＜1∶1600 | ＜1∶1600 | 1∶1600-1∶6400 | 1∶6400-1∶25600 | |
| GST-6E | A | ＜1∶1600 | 1∶1600-1∶6400 | ＞1∶25600 | ＞1∶25600 |
| B | ＜1∶1600 | 1∶1600-1∶6400 | 1∶6400-1∶25600 | ＞1∶25600 |
实施例3、本发明的猪瘟病毒疫苗的保护效果鉴定
1、将实施实例2中免疫GST(GST免疫组)、GST-E(GST-E免疫组)、GST-6E(GST-6E免疫组)的试验兔在第三次免疫后两周，用猪瘟兔化弱毒疫苗(乾元浩生物股份有限公司)进行攻毒/保护试验，每只兔接种100个最小兔体感染量(100RMID)，接种后记录96小时内测定体温曲线，所测体温为兔直肠温度(肛温)。以未免疫过且未接触过猪瘟病毒的健康大耳白兔(未免疫组)为阴性对照。结果如图7a所示，结果表明GST-6E免疫的大耳白兔在攻毒试验中没有定型热出现，而其他免疫组的两只兔子全部产生了定型热反应。
产生定型热的过程表明病毒在所接种试验兔体内成功建立感染，而没有定型热的过程既可能是由于试验兔体内并没有受到感染(机体被保护了)，也可能是该兔受到了隐性感染或对感染无反应(机体没有被保护)，需要进一步试验的确定。因此进行如下步骤2所述的实验。
2、将在96小时内未产生明显体热反应的兔子(GST-6E免疫组的兔A和B)，在结束体热反应观察时分别采血并制备血清，同时将兔安乐死后取得脾脏。
将上述GST-6E免疫组的兔A(图7b中B)或GST-6E免疫组的兔B(图7b中C)制备的血清(1ml)分别接种两只未接触过猪瘟病毒的健康大耳白兔(接种兔A和接种兔B)。用一只在攻毒/防护试验中确定为感染的兔(此处用的是攻毒后感染的未免疫兔)的血清作为阳性对照(图7b中A)，接种一只健康兔。接种后记录体温曲线；接种2周后，再用100RMID的猪瘟病毒兔化弱毒(乾元浩生物股份有限公司)攻击这些试验兔(二次攻毒)，记录病毒攻击后的体温曲线(图7b中D、E、F)。若在第一次接种时产生定型热反应(在第二次攻毒中就不会产生定型热反应)，为待检血清样品中含有感染性病毒颗粒(待检血清的兔在攻毒试验中没有得到防护)；若在第一次接种后没有产生定型热反应，而在第二次攻毒后产生定型热反应的，为血清样品中不含有感染性病毒颗粒(则待检血清的兔在攻毒试验中确实得到防护)；若在第一次接种中不产生定型热反应而在第二次攻毒中也不产生定型热反应的，为待检血清样品中含有感染性病毒颗粒，只是第一次接种是造成隐性感染或兔本身是不反应兔(待检血清的兔在攻毒试验中没有得到防护)。结果如图7b所示，结果表明，GST-6E免疫兔的攻毒后血清接种大耳白兔不引起被接种兔产生定型热反应，并通过二次攻毒试验证实，说明GST-6E免疫兔在攻毒后，血清中不含有感染性病毒颗粒，也就是GST-6E诱导产生了免疫防护，使得病毒没有在GST-6E免疫的兔子上成功建立感染。
3、用猪瘟病毒抗原检测试剂盒(IDEXX CSFV Antigen Test Kit)(北京爱德士元亨生物科技有限公司)检测步骤2中获得的脾脏中是否有猪瘟病毒抗原。如图7c所示，检测采用双孔，每一行为一个样品，样品边上记录了该行的检测结果(根据产品说明书进行处理后的矫正值)以及由该检测结果得出的样品中是否含有病毒特异性抗原的结论。第一行，阴性对照(试剂盒提供)；第二行，阳性对照(试剂盒提供)；第三行，一只未产生定型热兔(步骤1所述攻毒保护实验中的GST-6E免疫兔A)的脾脏(接种后96小时)；第四行，另外一只未产生定型热反兔(步骤1所述攻毒保护实验中的GST-6E免疫兔B)的脾脏(接种后96小时)；第五行，一只产生定型热的兔(步骤1所述攻毒保护实验中的未免疫组兔)。阴性结果表明脾脏中没有猪瘟病毒特异性抗原(感染没有建立)；阳性结果表明脾脏中有猪瘟病毒特异性抗原(感染建立)。结果表明，取自GST-6E免疫的大耳白兔攻毒后的脾脏，没有检测到猪瘟病毒特异性抗原；而取自感染的大耳白兔的脾脏，检测到了猪瘟病毒特异性抗原。GST-6E免疫的大耳白兔产生了对猪瘟病毒的免疫力，阻止了病毒感染的建立。
序列表
<160>4
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>猪瘟病毒(classical swine fever virus)
<400>1
Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg
1 5
<210>2
<211>111
<212>DNA
<213>猪瘟病毒(classical swine fever virus)
<400>2
gagaatgcca gacagggagc agcgagggta acatcttggc tcgggaggca actcagaatt 60
gccgggagga ggttggaggg tagaagcaaa acctggtttg gtgcctatgc c 111
<210>3
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
cgcagatcta cagcagtgag cccaacaact ctgagaggat ccgagaatgc cagacaggg 59
<210>4
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
tatactcgag ctattaggat ccctattagg cataggcacc aaacc 45
Claims (8)
1.一种猪瘟病毒表位疫苗，其活性成分蛋白的氨基酸残基序列为6个拷贝的序列1所示的氨基酸残基序列。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述序列1所示的氨基酸残基序列之间用接头序列连接。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于：所述接头序列为GS。
4.根据权利要求1或2或3所述的疫苗，其特征在于：所述活性成分蛋白的氨基端还连接有方便纯化的担体蛋白。
5.根据权利要求4所述疫苗，其特征在于：所述担体蛋白为谷胱甘肽S-转移酶。
6.权利要求1所述的猪瘟病毒表位疫苗的制备方法，是构建含有6个序列1所示氨基酸残基序列的编码序列的重组表达载体，将其在大肠杆菌中表达得到猪瘟病毒表位疫苗的活性成分蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中还含有连接于所述6个拷贝的序列1所示氨基酸残基序列的编码序列的5’端的谷胱甘肽S-转移酶蛋白的核苷酸编码序列。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述序列1所示氨基酸残基序列的编码序列之间通过同尾酶BglII和BamHI粘性末端连接有连接肽GS的编码序列。
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