CN105504052B - 抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用 - Google Patents

抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105504052B
CN105504052B CN201510958516.1A CN201510958516A CN105504052B CN 105504052 B CN105504052 B CN 105504052B CN 201510958516 A CN201510958516 A CN 201510958516A CN 105504052 B CN105504052 B CN 105504052B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
sequence
scfv
variable region
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510958516.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105504052A (zh
Inventor
李德山
郭笑辰
任桂萍
曹宏雪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Kangyuan Ruiao Biomedical Technology Co., Ltd.
Original Assignee
Jiangsu Kangyuan Ruiao Biomedical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Kangyuan Ruiao Biomedical Technology Co Ltd filed Critical Jiangsu Kangyuan Ruiao Biomedical Technology Co Ltd
Priority to CN201510958516.1A priority Critical patent/CN105504052B/zh
Publication of CN105504052A publication Critical patent/CN105504052A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105504052B publication Critical patent/CN105504052B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/10011—Birnaviridae
    • C12N2720/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。本发明提供的scFv‑XC抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；重链可变区为如下（a）或（b）：（a）由序列1第1‑123位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的蛋白质；轻链可变区为如下（c）或（d）：（c）由序列1第139‑244位氨基酸残基组成的蛋白质；（d）将（c）经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的蛋白质。本发明本发明提供的scFv‑XC抗体，是利用抗原‑抗体共表达的细菌展示技术筛选获得的，该scFv‑XC抗体的中和活性比已授专利权的scFv‑D抗体高60倍以上，具有特异性强、治疗效果更好等优点。

Description

抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法 氏囊病制剂中的应用
技术领域
本发明涉及抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。
背景技术
鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）引起的一种急性、高度接触性传染病，IBDV主要侵害3-12周龄的雏鸡和青年鸡，损伤鸡的中枢免疫器官——法氏囊。具有传播速度快、传染性强、感染率及死亡率均高的特点。该病目前在全球范围内均有分布，是养禽业最重要疾病之一，并且因免疫失败而造成的经济损失巨大。
IBDV可在雏鸡法氏囊中的淋巴细胞，尤其是B淋巴细胞中迅速繁殖，导致免疫抑制,从而可增强机体对其它病原体的易感性并且降低对其它疫苗的反应性。抗体药物目前是有效的治疗药物，高免血清和卵黄抗体在发病早期均可起到良好的效果，但是由于工业化生产可控性差和存在水平传播疾病等原因而受到限制。本发明利用抗原-抗体共表达的细菌展示技术筛选获得了具有较高中和活性抗IBDV的scFv抗体。抗体药物抗病毒的中和活性与治疗效果成正比，中和活性越高，其治疗效果越好。本发明提供的scFv抗体的中和活性显著提高，将具有更好的治疗效果。
发明内容
本发明的目的是提供抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。该scFv抗体的中和活性比已授专利权的scFv-LTH抗体（专利“scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用”中的scFv抗体在此专利中命名为scFv-LTH抗体）高60倍以上，在预防及治疗IBD将具有更好的效果。该scFv抗体与scFv-LTH抗体的核苷酸的同源性为88.66%，氨基酸的同源性为79.67%，说明两株scFv是完全不同的两种抗体。
本发明提供了一种单链抗体，命名为scFv-GXC抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；
所述重链可变区为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1自N末端第1-123位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述轻链可变区为如下（c）或（d）：（c）由序列表中序列1自N末端第139-244位氨基酸残基组成的蛋白质；（d）将（c）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
所述单链抗体具体可为如下（e）或（f）：（e）由序列表中序列1所示的蛋白质；（f）将（e）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
编码所述单链抗体的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下（1）或（2）或（3）：（1）序列表的序列2自5’末端第1-369位核苷酸所示的DNA分子；（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3）与（1）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下（4）或（5）或（6）：（4）序列表的序列2自5’末端第415-732位核苷酸所示的DNA分子；（5）在严格条件下与（4）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6）与（4）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述基因具体可为如下（7）或（8）或（9）或（10）：（7）序列表的序列2自5’末端第1-732位核苷酸所示的DNA分子；（8）序列表的序列2所示的DNA分子；（9）在严格条件下与（7）或（8）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10）与（7）或（8）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5% SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1% SDS和1×SSC、0.1% SDS各洗膜一次。
含有以上任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
基于所述单链抗体的其它形式的抗体也属于本发明的保护范围。所述其它形式的抗体可为Fab形式的抗体、IgG形式的抗体等。
本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（Ⅰ）、（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）检测鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅱ）辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅲ）预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（Ⅳ）预防和/或治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。
含有所述单链抗体或所述其它形式的抗体的产品也属于本发明的保护范围；所述产品的功能为如下（Ⅰ）、（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）检测鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅱ）辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅲ）预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（Ⅳ）预防和/或治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。
本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒中的应用。所述应用为非疾病诊断方法。
本发明提供了一种单链抗体（即scFv-GXC抗体），scFv-GXC抗体具有与VP2蛋白及多种IBDV毒株特异性结合的能力，可阻断IBDV对鸡胚成纤维细胞产生CPE且其中和活性比已授专利权的scFv-LTH抗体高60倍以上。免疫血清和卵黄抗体在使用过程中存在制备繁琐、生产成本高、效果不稳定、工业化生产质量难以控制及引发水平传播疾病等弊端。本发明提供的scFv-GXC抗体可以克服上述弊端，具有特异性强、治疗效果更好，工业化生产质量可控，避免了卵黄抗体引起的水平传播疾病等优点。
附图说明
图1为scFv-GXC抗体溶液的SDS-PAGE图谱。
图2为scFv-GXC抗体溶液的SEC-HPLC图谱。
图3为ELISA检测scFv-GXC抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力的结果。
图4为ELISA检测scFv-GXC抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pET-27b(+)载体：购自Novagen公司，Cat. No. 69337-3。大肠杆菌Rosetta：购自Novagen公司，Cat. No.71403-4。DF1细胞（鸡成纤维细胞）：购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，Cat. No.3131C0001000400030。SPF雏鸡：购自哈尔滨兽医研究所。鸡新城疫灭活疫苗（La Sota株），购买自哈兽研维科生物公司，编号080012008。
鸡传染性法氏囊病活疫苗（Gt株）：哈兽研维科生物公司，编号080012122。鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗（NF8株）：扬州威克生物工程有限公司，编号101042056。鸡传染性法氏囊病活疫苗（1-65株）：Shafit InterGumboro，编号S20651010A。鸡传染性法氏囊病活疫苗（BJ836株）：上海海利生物药品有限公司，编号090202026。鸡传染性法氏囊病活疫苗（MB株）：ABIC，编号20621150B。鸡传染性法氏囊病活疫苗（B87株）：湖南省中岸生物药业有限公司，编号180022026。
质粒pHisSUMO：参考文献：姜媛媛, 尹成凯, 李晋南, 任桂萍, 张薇, 李德山.利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究. 东北农业大学学报, 2008, 39(10):57-62；李璐, 尹成凯, 李德山. 高效表达可溶性重组蛋白表达载体——pHisSUMO. 生物技术, 2009, 19(3): 11-14.。
包被液（pH9.6）：取Na2CO3 0.15g、NaHCO3 0.293g，溶于水并用水定容至100mL。
PBS缓冲液：取NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4.12H2O 3.58g、KH2PO4 0.24g，溶于1L水。
实施例1、scFv-GXC抗体（单链抗体）及其编码基因的发现
1、抗体库的构建
取IBDV免疫后的鸡脾脏，提取RNA后反转录成cDNA。根据GenBank上的抗体序列，设计出克隆抗体可变区的基因引物，以cDNA为模板，使用PCR的方法克隆抗体可变区。将VH与VL片段分别插入到pTlinker载体的Linker的上游和下游，构建出scFv抗体库。将scFv抗体库进行酶切并与细菌展示载体pBFD-Ab-VP2进行连接，构建抗IBDV抗原抗体共表达的细菌表面展示文库。VH约380bp、VL约320bp，VH-Tlinker-VL约740bp。
2、抗体库的筛选
收集转化后全部克隆，经IPTG（0.25mmol/L）诱导4h，经EDTA-MgCl2处理，与抗兔VP2蛋白的多克隆抗体（即实施例4制备的多克隆抗体溶液，工作浓度为1:5000倍稀释）及FITC标记的羊抗兔二抗（P3838购自sigma公司，工作浓度为1:500倍稀释）各孵育1h，PBS洗涤后利用流式细胞仪对其进行筛选。
经三轮筛选后，通过多克隆抗体及FITC标记的二抗得到一个与VP2蛋白具有结合能力的单克隆抗体，将其命名为scFv-GXC抗体。
scFv-GXC抗体（为单链抗体，又称scFv-GXC蛋白）如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2所示。
实施例2、scFv-GXC抗体的制备
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5' –CGCCATATGGCCGTGACGTTGGACGAG-3'；
R1：5' –CCCAAGCTTTTAACCTAGGACGGTCAGGG-3'。
3、用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切pET-27b(+)载体，回收约5367bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在pET-27b(+)载体的NdeI和HindIII酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。
6、将步骤5得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌。
7、将步骤6得到的重组菌接种至含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃、100r/min振荡培养至OD600nm=0.3；加入IPTG并使其浓度为0.25mmol/L，37℃、 100r/min振荡培养4h。
8、取15L完成步骤7的培养体系，4℃、4000r/min离心30min并收集菌体沉淀。
9、取步骤8得到的菌体沉淀，用PBS缓冲液重悬，加入溶菌酶溶液（购自Amresco）并使溶菌酶的浓度为1mg/ml，4℃放置1h，然后进行超声破碎（25瓦的功率，3min），4℃、10000g离心30min，收集沉淀。
10、使用AKTA Purifier 100蛋白层析系统(购自GE公司)纯化目的蛋白
取步骤9得到的沉淀，用100毫升溶解缓冲液(8mol/L尿素水溶液，pH8.0)充分溶解，然后上样于HiLoad 16/60 Superdex75 pg柱子(购自GE公司)，然后用500毫升复性缓冲液（2mol/L尿素水溶液，pH8.0）洗脱并收集过柱后的洗脱液，然后在PBS缓冲液中透析过夜，得到溶液即为scFv-GXC抗体溶液。所有步骤均在4℃环境下。scFv-GXC抗体溶液的SDS-PAGE图谱见图1，显示约为28KD的条带，与预期相符。
11、取步骤10得到的scFv-GXC抗体溶液，进行SEC-HPLC分析
硅胶填充物，型号为G-3000swxl；将scFv-GXC抗体溶液上样后，用流速为0.5ml/min的洗脱液（pH8.0，溶剂为水，含50mM Na3PO4和150mM NaCl）进行洗脱。SEC-HPLC图谱见图2，目的蛋白的纯度可达90%。
实施例3、VP2蛋白的制备
一、重组质粒的构建
1、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。
2、以步骤合成的双链DNA分子为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F2：5’-GAAGACTTAGGT ACAAACCTGCAAGATCAA-3’；
R2：5’-GGATCCTTA TGCTCCTGCAATCTTCAG-3’。
3、用限制性内切酶BbsⅠ和BamHI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BbsⅠ和BamHI双酶切质粒pHisSUMO，回收约5700bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。重组质粒中，VP2蛋白的编码基因和载体骨架上的分子伴侣SUMO的编码序列、以及载体骨架上的His标签的编码序列（位于SUMO的编码序列的上游，由6个组氨酸残基组成）融合，形成融合基因，表达融合蛋白（融合蛋白自N端至C端依次为His标签、分子伴侣SUMO和VP2蛋白）。
二、VP2蛋白的制备和纯化
1、将步骤一得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌。
2、将步骤1得到的重组菌接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基， 37℃、100r/min振荡培养至OD600nm=0.3；加入IPTG并使其终浓度为0.4mmol/L，25℃、 65r/min振荡培养10h。
3、取完成步骤2的培养体系，4℃、4000r/min离心30min，并收集菌体沉淀。
4、取步骤3得到的菌体沉淀，用Binding buffer重悬，加入溶菌酶溶液（购自Amresco）并使溶菌酶的浓度为1mg/ml，4℃放置1h，然后进行超声破碎（25瓦的功率，3min），4℃、10000g离心30min，收集上清液。
5、取步骤4得到的上清液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为10ml。
洗脱过程：先用5倍柱体积的杂蛋白洗脱液（溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：40mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3PO4；pH7.4）洗脱以去除杂蛋白，流速为1ml/min；然后用3倍柱体积的目的蛋白洗脱液（溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：500mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3PO4；pH7.4）洗脱，流速为1ml/min，280nm波长监测，收集目标峰（即峰值高于80mAU的峰），即为融合蛋白溶液。
6、采用HiPrepTM 26/10 Desalting将步骤5得到的融合蛋白溶液进行脱盐。
7、取步骤6得到的溶液，用SUMO蛋白酶I（SUMO蛋白酶I与融合蛋白的摩尔比为1:50）和终浓度为2mmol/L的DTT 4℃切割过夜。
8、取步骤7得到的溶液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为15ml，280nm波长监测，收集目标峰（即峰值高于30mAU的峰），即为VP2蛋白溶液。将VP2蛋白溶液进行聚丙烯凝胶电泳，显示分子量约为42KDa的单一蛋白条带，回收蛋白条带并测序，N端前15个氨基酸残基如序列表的序列3自N末端第1至15位氨基酸残基所示。
实验例4、抗兔VP2多克隆抗体的制备和纯化
一、免疫家兔
1、用实验例3得到的VP2蛋白与等体积的弗氏完全佐剂，置于混合器上剧烈振荡混匀，形成“油包水”状乳悬液，充分乳化后采取背部多点皮下免疫注射，每点注射约100μL，免疫剂量为0．5 mg。
2、2周后用同样剂量蛋白质与等体积的弗氏不完全佐剂混合后进行加强免疫。
3、一周后用同样剂量蛋白质与等体积的弗氏不完全佐剂混合后进行加强免疫。
4、一周后用同样剂量蛋白质与等体积的弗氏不完全佐剂混合后进行加强免疫。
5、6 d后，颈静脉采血，先放37℃1h，再放4℃过夜，取血清。
二、多克隆抗体的纯化
1、取步骤一得到的血清，进行protein A亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为20ml。
以每分钟0.5 ml的速度将抗血清上到柱上,为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液（溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质: 50 mM/L Tris, 150 mM/L NaCl；pH7.4）清洗柱子去除杂蛋白，后加洗脱缓冲溶液(溶剂为水，含有如下浓度的溶质50 mM/L甘氨酸； pH2.7 )，以0.5ml/min的速度洗脱，280nm波长监测，收集目标峰，即为多克隆抗体。将多克隆抗体溶液进行聚丙烯凝胶电泳，显示分子量约为50 kDa和25 kDa的两条蛋白条带。
实施例5、ELISA检测scFv-GXC抗体的亲和力和特异性
一、ELISA检测scFv-GXC抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力
1、分别用蛋白浓度为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml的scFv-GXC抗体溶液（即实施例2制备的scFv-GXC抗体溶液，用包被液调整蛋白浓度）包被酶标板，4℃过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
2、每孔加入100μl蛋白浓度为40μg/ml的VP2蛋白溶液（即实施例3制备的VP2蛋白溶液，用PBS缓冲液调整蛋白浓度），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
3、加入抗兔VP2多克隆抗体（即实施例4制备的多克隆抗体溶液，工作浓度为1:5000倍稀释），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
4、加入HRP标记的羊抗兔抗体（ HAF008购自R&D system公司，工作浓度为1:8000倍稀释），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
5、加入TMB底物显色液，37℃避光显色5min。
6、每孔加入50μl 2mol/L的H2SO4水溶液，用酶标仪于波长450nm下检测OD值。
设置用等体积的PBS缓冲液代替步骤1中的scFv-GXC抗体溶液、步骤2中的VP2蛋白溶液和步骤3中的抗兔VP2多克隆抗体的PBS组。步骤1中用蛋白浓度为200μg/ml的scFv-GXC抗体溶液包被酶标板时：设置步骤2中不加入VP2蛋白溶液的对照组1，步骤3中不加入抗兔VP2多克隆抗体的对照组2，步骤2中不加入VP2蛋白溶液且步骤3中不加入抗兔VP2多克隆抗体的对照组3，用等体积且等蛋白浓度的BSA溶液代替VP2蛋白溶液的对照组4。
每个处理设置3个复孔。
结果见图3。ELISA结果表明，scFv-GXC抗体可以与VP2蛋白特异性结合。
二、ELISA检测scFv-GXC抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力
1、用蛋白浓度为400μg/ml的scFv-GXC抗体溶液（即实施例2制备的scFv-GXC抗体溶液，用包被液调整蛋白浓度）包被酶标板，4℃过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
2、每孔加入100μl IBDV病毒液（病毒剂量为106.2 TCID50），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
3、加入抗兔VP2多克隆抗体（即实施例4制备的多克隆抗体溶液，工作浓度为1:5000倍稀释），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
4、加入HRP标记的羊抗兔抗体（ HAF008购自R&D system公司，工作浓度为1:8000倍稀释），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
5、加入TMB底物显色液，37℃避光显色5min。
6、每孔加入50μl 2mol/L的H2SO4水溶液，用酶标仪于波长450nm下检测OD值。
分别采用如下IBDV的毒株进行上述实验：Gt株、NF8株、1-65株、BJ836株、MB株、B87株。
设置用等体积的PBS缓冲液代替步骤1中的scFv-GXC抗体溶液、步骤2中的IBDV病毒液和步骤3中的抗兔VP2多克隆抗体的PBS组。设置步骤2中不加入IBDV病毒液的对照组1，步骤3中不加入抗兔VP2多克隆抗体的对照组2，步骤2中不加入IBDV病毒液且步骤3中不加入抗兔VP2多克隆抗体的对照组3，用等体积等滴度的新城疫病毒液代替IBDV病毒液的对照组4。
每个处理设置3个复孔。
结果见图4。ELISA结果表明，scFv-GXC抗体可以与不同IBDV毒株特异性结合，对不同的IBDV毒株具有不同的亲和力。
实施例6、scFv-GXC抗体的中和活性
一、IBDV滴度的测定
将处于对数生长期的DF1细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基101至1012梯度稀释的IBDV病毒液（B87株）接种到单层细胞中（每孔100μl），每一稀释度接种8个细胞孔；设置不加入IBDV病毒液的对照组。将细胞培养板放到细胞培养箱中，37℃、5% CO2培养，连续观察7天，每天记录细胞生长状态。计算病毒滴度，第7天结果见表1。
表1 IBDV滴度的测定的结果
按照Reed-Muench两氏法计算TCID50=10-6.2/0.1ml。
二、scFv-GXC抗体的中和活性
将处于对数生长期的DF1细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基梯度稀释后的scFv-GXC抗体溶液（即实施例2制备的scFv-GXC抗体溶液）和100 TCID50的IBDV病毒液（ B87株）等体积混合并37℃孵育1h，然后接种到单层细胞中，每一梯度接种8个细胞孔；设置不加入抗体溶液且不加入病毒液的正常对照，设置只不加入抗体溶液只加入病毒液的病毒对照。将细胞培养板放到细培养箱中，37℃，5% CO2培养连续观察7天，每天记录细胞生长状态。第7天结果见表2。
表2 scFv-GXC抗体的中和活性的测定的结果
结果表明，scFv-GXC抗体具有中和活性，阻断或抑制CPE的最小蛋白浓度为0.037μg/ml。
序列表
<110> 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司
<120> 抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
<130>
<160> 4
<210> 1
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Gly Ala Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ser Trp Ser Leu Asn Val Gly Ser Ile Asp Ala Trp Gly
100 105 110
His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ser
130 135 140
Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Thr Cys Ser Gly
145 150 155 160
Ser Ser Gly Cys Gly Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser
165 170 175
Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asn Asn Asn Asn Arg Pro Ser Asp Ile
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ser
210 215 220
Ala Asp Ser Ser Ser Thr Gly Ala Pro Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu Gly
<210> 2
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtctgcaagg cctccgggtt caccttcagc agttatgcca tgggttgggt gcgacaggcg 120
cccggcaaag ggctggagtg gcttgcaggt attagcagca gtggtagata cacatactac 180
ggggcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct actactgcgc caaagattct 300
tggagtctta atgttggtag tatcgacgca tggggccacg ggaccgaagt catcgtctcc 360
tccgctagcg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctg gtggtggtgg atccgcgctg 420
actcagccgt cctcggtgtc agcaaacccg ggagaaaccg tcaagatcac ctgctccggg 480
agtagtggct gtggttatgg ctggtaccag cagaagtctc ctggcagtgc ccctgtcact 540
gtgatctata acaacaacaa cagaccctcg gacatccctt cacgattctc cggttccaaa 600
tccggctcca cagccacatt aaccatcact ggggtccaag ccgaggacga ggctgtctat 660
tactgtggga gtgcagacag cagcagtact ggtgctccat ttggggccgg gacaaccctg 720
accgtcctag gt 732
<210> 3
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser
1 5 10 15
Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr Leu
20 25 30
Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr Val
35 40 45
Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro Gly
50 55 60
Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr Lys
65 70 75 80
Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr Asn
85 90 95
Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr Leu
100 105 110
Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr Phe
115 120 125
Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu Met
130 135 140
Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val Gly
145 150 155 160
Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly Tyr
165 170 175
Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys Met
180 185 190
Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile Thr
195 200 205
Ala Ala Asn Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly Val
210 215 220
Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu Ser
225 230 235 240
Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile Leu
245 250 255
Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile Thr
260 265 270
Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn Leu
275 280 285
Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro Ile
290 295 300
Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln Ala
305 310 315 320
Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr Ile
325 330 335
His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val Ala
340 345 350
Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val Ser
355 360 365
Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Ile Thr
370 375 380
Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu Ile
385 390 395 400
Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr Arg
405 410 415
Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu Asn
420 425 430
Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala
435 440
<210> 4
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60
ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120
gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180
cctggtttcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240
aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300
ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcatta 360
aacggaacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420
tacaatgggt tgatgtctgc gacggccaac atcaacgaca aaatcgggaa cgtcctagta 480
ggggaagggg taactgtcct cagcttaccc acatcatatg atctggggta tgtgagactc 540
ggtgacccca ttcccgctat agggcttgac ccaaagatgg tagcaacatg tgacagcagt 600
gataggccca gagtctacac cataactgca gccaatgact accaattctc atcacagtac 660
caagcaggtg gagtgacaat cacactgttc tcagcaaaca tcgatgccat cacaagcctc 720
agcatcgggg gagaacttgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttatact gggcgctacc 780
atctacctta taggcttcga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcagacaat 840
gggctaacgg ccggcactga caaccttatg ccattcaata ttgtgattcc aaccagcgag 900
ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtta cctccaaaag tggtggtcag 960
gcgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt gggagcctag cagtgacgat ccacggtggc 1020
aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggctacagga 1080
tctgtcgtta cggtcgccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140
aagaacctga tcacagaata cggccgattt gacccagggg ccatgaacta cacaaaactg 1200
atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtgt ggccaacaag ggagtacacc 1260
gactttcgcg agtactttat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320
gca 1323

Claims (8)

1.一种单链抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；
所述重链可变区为如下（a）：（a）由序列表中序列1自N末端第1-123位氨基酸残基组成的蛋白质；
所述轻链可变区为如下（b）：（b）由序列表中序列1自N末端第139-244位氨基酸残基组成的蛋白质。
2.如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于：所述单链抗体为如下（c）：（c）由序列表中序列1所示的蛋白质。
3.编码权利要求1或2所述单链抗体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：
所述基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下（1）：（1）序列表的序列2自5’末端第1-369位核苷酸所示的DNA分子；
所述基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下（2）：（2）序列表的序列2自5’末端第415-732位核苷酸所示的DNA分子。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于：
所述基因为如下（3）或（4）：（3）序列表的序列2自5’末端第1-732位核苷酸所示的DNA分子；（4）序列表的序列2所示的DNA分子。
6.含有权利要求3至5中任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
7.权利要求1所述单链抗体或权利要求2所述单链抗体在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（Ⅰ）、（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）检测鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅱ）辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅲ）预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（Ⅳ）预防和/或治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。
8.含有权利要求1所述单链抗体或权利要求2所述单链抗体的产品；所述产品的功能为如下（Ⅰ）、（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）检测鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅱ）辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅲ）预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（Ⅳ）预防和/或治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。
CN201510958516.1A 2015-12-21 2015-12-21 抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用 Active CN105504052B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510958516.1A CN105504052B (zh) 2015-12-21 2015-12-21 抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510958516.1A CN105504052B (zh) 2015-12-21 2015-12-21 抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105504052A CN105504052A (zh) 2016-04-20
CN105504052B true CN105504052B (zh) 2019-03-01

Family

ID=55712400

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510958516.1A Active CN105504052B (zh) 2015-12-21 2015-12-21 抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105504052B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108484759A (zh) * 2018-03-01 2018-09-04 东北农业大学 两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
CN113493509B (zh) * 2021-07-23 2023-04-28 东北农业大学 抗鸡传染性法氏囊病毒的四价高亲和力抗体及其制备和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103333242A (zh) * 2013-07-23 2013-10-02 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
CN103483449A (zh) * 2013-08-20 2014-01-01 东北农业大学 两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
CN104761639A (zh) * 2015-04-16 2015-07-08 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防乙肝制剂中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103333242A (zh) * 2013-07-23 2013-10-02 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
CN103483449A (zh) * 2013-08-20 2014-01-01 东北农业大学 两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
CN104761639A (zh) * 2015-04-16 2015-07-08 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防乙肝制剂中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Generation of chicken single chain antibody variable;S. I. Sapats等;《Arch Virol》;20021210;497-515
鸡传染性法氏囊病的研究进展;李潭清等;《安徽农业科学》;20081210;15481-15484

Also Published As

Publication number Publication date
CN105504052A (zh) 2016-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103483449A (zh) 两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
CN103333242B (zh) scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
CN105384815B (zh) 一种scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
Wang et al. Virus-like particles of hepatitis B virus core protein containing five mimotopes of infectious bursal disease virus (IBDV) protect chickens against IBDV
AU2020103111A4 (en) Preparation Method of Feline Feline panleukopenia virus Therapeutic Antibody
CN1610697A (zh) 戊型肝炎病毒单克隆抗体或其结合活性片段及其用途
CN114891074B (zh) 一种季节性甲型流感通用病毒样颗粒及其制备方法与应用
CN115998856A (zh) 一种新冠流感免疫原性组合物及其制备方法和应用
CN104211784B (zh) 用于制备戊型肝炎病毒样颗粒的蛋白质和方法
CN107488217A (zh) 一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗
CN109111518A (zh) 防治猫瘟热的特异性卵黄抗体及其制备方法
CN110845624B (zh) 一种sumo-cp融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法
CN109678937A (zh) H3n2亚型流感病毒血凝素蛋白的突变体及其应用
CN105504052B (zh) 抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
CN102397559B (zh) 广谱型流感疫苗及其制备方法
CN101879312B (zh) 广谱型流感疫苗及其制备方法
CN103694321B (zh) 金黄色葡萄球菌mSEB突变体及其制备方法和应用
CN105541977B (zh) 鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白及制备方法与应用
CN109966483A (zh) 一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及其制备方法和应用
CN108348596A (zh) 用牛免疫缺陷病毒Gag蛋白的重组病毒样颗粒
CN108484759A (zh) 两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
CN106480070A (zh) 一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途
CN101152570B (zh) 一种猪瘟病毒表位疫苗及其制备方法
CN108503696A (zh) 一种酵母细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗
CN103570835B (zh) 金黄色葡萄球菌itc融合蛋白及制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20181226

Address after: 222001 No. 58 Haichang South Road, Haizhou District, Lianyungang City, Jiangsu Province

Applicant after: Jiangsu Kangyuan Ruiao Biomedical Technology Co., Ltd.

Address before: Room 314, Science Park, Northeast Agricultural University, 59 Wood Street, Xiangfang District, Harbin, Heilongjiang Province, 150030

Applicant before: Harbin Boao Bio-Medical Technology Development Company

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant