CN108484759A - 两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公布了两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。发明提供了两种单链抗体(即scFv抗体)，scFv抗体具有与IBDV结构蛋白2(VP2)蛋白及多种IBDV毒株特异性结合的能力，可阻断IBDV对鸡胚成纤维细胞产生细胞病变(CPE)，可保护IBDV感染的青年鸡。免疫血清和卵黄抗体在使用过程中存在制备繁琐、生产成本高、效果不稳定以、工业化生产质量难以控制及引发水平传播疾病等弊端。本发明提供的scFv抗体可以克服上述弊端，具有特异性强、治疗效果好、工业化生产质量可控等优点，避免了卵黄抗体引起的水平传播疾病的问题，将在IBDV的防治史上，乃至整个动物病毒病的防治史上开辟了一个新的局面。

Description

两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性 法氏囊病制剂中的应用
技术领域
本发明涉及两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。
背景技术
鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种急性、高度接触性鸡传染病，具有传播速度快、传染性强、感染率及死亡率均高的特点。该病给养禽业造成重大经济损失。
IBDV可在雏鸡法氏囊中的淋巴细胞，尤其是B淋巴细胞中迅速繁殖，促使B淋巴细胞凋亡，法氏囊极度萎缩，最终导致免疫缺陷和免疫抑制。因此极易造成细菌(大肠杆菌和沙门氏菌)的继发感染，同时可还造成其他疫苗的免疫失败。多克隆抗体(高免血清和卵黄抗体)是目前有效的治疗手段，在发病早期治疗效果良好，但是由于工业化生产可控性差和存在水平传播疾病(鸡白痢、霉形体、减蛋综合症和禽白血病) 以及由一些非特异性抗体引起的过敏性反应等原因而受到限制。
基因工程抗体即将抗体的基因按不同需要进行加工、改造和重新装配，然后导入适当的受体细胞中进行表达的抗体分子。在原核细胞中表达基因工程抗体目前技术已经相对成熟，可实现工业化的生产，产品质量可控均一。同时原核表达系统不存在水平传播传染性疾病的危险。
发明内容
本发明的目的是提供两种单链抗体(scFv抗体)、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。
本发明提供了两种单链抗体，命名为IBDV-VP2 scFv29抗体和IBDV-VP2 scFv30抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；
所述IBDV-VP2 scFv29抗体的重链可变区为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1自N末端第1-129位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述IBDV-VP2 scFv29抗体轻链可变区为如下(c)或(d)：(c)由序列表中序列 1自N末端第145-250位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
所述单链抗体IBDV-VP2 scFv29具体可为如下(e)或(f)：(e)由序列表中序列 1所示的蛋白质；(f)将(e)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
编码所述单链抗体IBDV-VP2 scFv29的基因也属于本发明的保护范围。
所述单链抗体IBDV-VP2 scFv29基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下(1)或(2)或(3)：(1)序列表的序列3自5’末端第1-387位核苷酸所示的DNA 分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的 DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述单链抗体IBDV-VP2 scFv29基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下(4)或(5)或(6)：(4)序列表的序列3自5’末端第433-753位核苷酸所示的DNA 分子；(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的 DNA分子；(6)与(4)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述单链抗体IBDV-VP2 scFv29基因具体可为如下(7)或(8)或(9)或(10)： (7)序列表的序列3自5’末端第1-753位核苷酸所示的DNA分子；(8)序列表的序列2所示的DNA分子；(9)在严格条件下与(7)或(8)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(10)与(7)或(8)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述IBDV-VP2 scFv30抗体的重链可变区为如下(a’)或(b’)：(a’)由序列表中序列2自N末端第1-135位氨基酸残基组成的蛋白质；(b’)将(a’)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述IBDV-VP2 scFv30抗体轻链可变区为如下(c’)或(d’)：(c’)由序列表中序列2自N末端第151-255位氨基酸残基组成的蛋白质；(d’)将(c’)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
所述单链抗体IBDV-VP2 scFv30具体可为如下(e’)或(f’)：(e’)由序列表中序列3所示的蛋白质；(f’)将(e’)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
编码所述单链抗体IBDV-VP2 scFv30的基因也属于本发明的保护范围。
所述单链抗体IBDV-VP2 scFv30基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下(1’)或(2’)或(3’)：(1’)序列表的序列4自5’末端第1-405位核苷酸所示的DNA分子；(2’)在严格条件下与(1’)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3’)与(1’)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述单链抗体IBDV-VP2 scFv30基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下(4’)或(5’)或(6’)：(4’)序列表的序列4自5’末端第451-768位核苷酸所示的DNA分子；(5’)在严格条件下与(4’)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(6’)与(4’)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述单链抗体IBDV-VP2 scFv30基因具体可为如下(7’)或(8’)或(9’)或 (10’)：(7’)序列表的序列4自5’末端第1-768位核苷酸所示的DNA分子；(8’) 序列表的序列2所示的DNA分子；(9’)在严格条件下与(7’)或(8’)限定的DNA 序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(10’)与(7’)或(8’)限定的 DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。
含有以上任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
基于所述两种单链抗体的其它形式的抗体也属于本发明的保护范围。所述其它形式的抗体可为Fab形式的抗体、IgG形式的抗体等。
本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)：(Ⅰ)检测鸡传染性法氏囊病病毒； (Ⅱ)辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；(Ⅲ)预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；(Ⅳ) 预防和/或治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的其它疾病。
含有所述单链抗体或所述其它形式的抗体的产品也属于本发明的保护范围；所述产品的功能为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)：(Ⅰ)检测传染性法氏囊病病毒； (Ⅱ)辅助鉴定传染性法氏囊病病毒；(Ⅲ)预防和/或治疗传染性法氏囊病病毒引起的疾病；(Ⅳ)预防和/或治疗传染性法氏囊病。
本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在辅助鉴定传染性法氏囊病病毒中的应用。所述应用为非疾病诊断方法。
本发明提供了两种单链抗体(即scFv抗体)，scFv抗体具有与IBDV结构蛋白2(VP2)蛋白及多种IBDV毒株特异性结合的能力，可阻断IBDV对鸡胚成纤维细胞产生细胞病变(CPE)，可保护IBDV感染的青年鸡。免疫血清和卵黄抗体在使用过程中存在制备繁琐、生产成本高、效果不稳定以，工业化生产质量难以控制及引发水平传播疾病等弊端。本发明提供的scFv抗体可以克服上述弊端，具有特异性强、治疗效果好，工业化生产质量可控，避免了卵黄抗体引起的水平传播疾病等优点，将在IBDV的防制史上，乃至整个动物病毒病的防治史上开辟了一个新的局面。
附图说明
图1scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗体溶液的SDS-PAGE分析
图2两种scFv抗体溶液的SEC-HPLC分析
图3ELISA检测两种scFv抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力
图4为ELISA检测两种scFv抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力结果
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pET-27b(+)载体：购自Novagen公司，Cat.No.69337-3。大肠杆菌Rosetta：购自Novagen公司，Cat.No.71403-4。DF1细胞(鸡成纤维细胞)：购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，Cat.No.3131C0001000400030。SPF雏鸡：购自哈尔滨兽医研究所。鸡新城疫灭活疫苗(La Sota株)，购买自哈兽研维科生物公司，编号080012008。
鸡传染性法氏囊病活疫苗(Gt株)：哈兽研维科生物公司，编号080012122。鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(NF8株)：扬州威克生物工程有限公司，编号101042056。鸡传染性法氏囊病活疫苗(1-65株)：Shafit InterGumboro，编号S20651010A。鸡传染性法氏囊病活疫苗(BJ836株)：上海海利生物药品有限公司，编号090202026。鸡传染性法氏囊病活疫苗(MB株)：ABIC，编号20621150B。鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87 株)：湖南省中岸生物药业有限公司，编号180022026。
质粒pHisSUMO：参考文献：姜媛媛,尹成凯,李晋南,任桂萍,张薇,李德山. 利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究.东北农业大学学报,2008, 39(10):57-62；李璐,尹成凯,李德山.高效表达可溶性重组蛋白表达载体——pHisSUMO.生物技术,2009,19(3):11-14.。
包被液(pH9.6)：取Na2CO3 0.15g、NaHCO3 0.293g，溶于水并用水定容至100mL。
PBS缓冲液：取NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4.12H2O 3.58g、KH2PO4 0.24g，溶于 1L水。
实施例1：scFv抗体(单链抗体)及其编码基因的发现
1、抗体库的构建
取IBDV免疫后的鸡脾脏，提取RNA后反转录成cDNA。根据GenBank上的抗体序列，设计出克隆抗体可变区的基因引物，以cDNA为模板，使用PCR的方法克隆抗体可变区。将VH与VL片段分别插入到pTlinker载体的Linker的上游和下游，构建出scFv 抗体库。将scFv抗体库进行酶切并与细菌展示载体pBSD进行连接，构建抗IBDV抗体的细菌表面展示文库。VH约380bp、VL约320bp，VH-Tlinker-VL约740bp。
2、抗体库的筛选
收集转化后全部克隆，经IPTG(0.25mmol/ml)诱导4h，经EDTA-MgCl2处理，与 FITC标记的VP2蛋白孵育1h，PBS洗涤后利用流式细胞仪对其进行筛选。
经三轮筛选后，得到两个与FITC标记的VP2蛋白具有结合能力的单链抗体，将其命名为IBDV-VP2 scFv29抗体和IBDV-VP2 scFv30抗体。
IBDV-VP2 scFv29抗体(为单链抗体，又称scFv蛋白)如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列3所示。
IBDV-VP2 scFv30抗体(为单链抗体，又称scFv蛋白)如序列表的序列2所示，其编码基因如序列表的序列4所示。
实施例2、scFv抗体的制备
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用F1和R1组成的引物以流式筛选阳性菌所提取质粒为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5'–CATGCCATGGGCCGTGACGTTGGACGAG-3'；
R1：5'–CCCAAGCTTTTAACCTAGGACGGTCAGGG-3'。
3、用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切pET-27b(+)载体，回收约5367bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在pET-27b(+)载体的NcoI和HindIII酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。
6、将步骤5得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌。
7、将步骤6得到的重组菌接种至含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃、100r/min振荡培养至OD600nm＝0.35；加入IPTG并使其浓度为0.25mmol/L，37℃、100r/min 振荡培养4h。
8、取25L完成步骤7的培养体系，4℃、4000r/min离心30min并收集菌体沉淀。
9、取步骤8得到的菌体沉淀，用PBS缓冲液重悬，加入溶菌酶溶液(购自Amresco)并使溶菌酶的浓度为1mg/ml，4℃放置1h，然后进行超声破碎(25瓦的功率，3min)，4℃、10000g离心30min，收集沉淀。
10、使用AKTA Purifier 100蛋白层析系统(购自GE公司)纯化目的蛋白
取步骤9得到的沉淀，用100毫升溶解缓冲液(8mol/L尿素水溶液，pH8.0)充分溶解，然后上样于HiLoad 16/60Superdex75pg柱子(购自GE公司)，然后用500毫升复性缓冲液(2mol/L尿素水溶液，pH8.0)洗脱并收集过柱后的洗脱液，然后在PBS 缓冲液中透析过夜，得到溶液即为scFv抗体溶液。所有步骤均在4℃环境下。scFv 抗体溶液的SDS-PAGE图谱见图1，显示约为28KD的条带，与预期相符。
11、取步骤10得到的scFv抗体溶液，进行SEC-HPLC分析
硅胶填充物，型号为G-3000swxl；将scFv抗体溶液上样后，用流速为0.5ml/min 的洗脱液(pH8.0，溶剂为水，含50mM Na3PO4和150mM NaCl)进行洗脱。SEC-HPLC图谱见图2，目的蛋白的纯度可达90％。
实施例3、VP2蛋白的制备
一、重组质粒的构建
1、合成序列表的序列5所示的IBDV vp2双链DNA分子。
2、以步骤合成的双链DNA分子为模板，用F2和R2组成的引物对vp2进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。
F2：5’-GAAGACTTAGGT ACAAACCTGCAAGATCAA-3’；
R2：5’-GGATCCTTATGCTCCTGCAATCTTCAG-3’。
3、用限制性内切酶BbsⅠ和BamHI双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BbsⅠ和BamHI双酶切质粒pHisSUMO，回收约5700bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。重组质粒中，VP2蛋白的编码基因和载体骨架上的分子伴侣SUMO的编码序列、以及载体骨架上的His标签的编码序列(位于SUMO的编码序列的上游，由6个组氨酸残基组成)融合，形成融合基因，表达融合蛋白(融合蛋白自N端至C端依次为His 标签、分子伴侣SUMO和VP2蛋白)。
二、VP2蛋白的制备和纯化
1、将步骤一得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌。
2、将步骤1得到的重组菌接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、100r/min振荡培养至OD600nm＝0.35；加入IPTG并使其浓度为0.4mmol/L，25℃、65r/min 振荡培养10h。
3、取完成步骤2的培养体系，4℃、4000r/min离心30min，并收集菌体沉淀。
4、取步骤3得到的菌体沉淀，用Binding buffer重悬，加入溶菌酶溶液(购自Amresco)并使溶菌酶的浓度为1mg/ml，4℃放置1h，然后进行超声破碎(25瓦的功率，3min)，4℃、10000g离心30min，收集上清液。
5、取步骤4得到的上清液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为10ml。
洗脱过程：先用5倍柱体积的杂蛋白洗脱液(溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：40mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3PO4；pH7.4)洗脱以去除杂蛋白，流速为1ml/min；然后用3倍柱体积的目的蛋白洗脱液(溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：500mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3PO4； pH7.4)洗脱，流速为1ml/min，280nm波长监测，收集目标峰(即峰值高于80mAU 的峰)，即为融合蛋白溶液。
6、采用HiPrepTM 26/10Desalting将步骤5得到的融合蛋白溶液进行脱盐。
7、取步骤6得到的溶液，用SUMO蛋白酶I(SUMO蛋白酶I与融合蛋白的摩尔比为1:50)和终浓度为2mmol/L的DTT 4℃切割过夜。
8、取步骤7得到的溶液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为15ml，280nm波长监测，收集目标峰(即峰值高于30mAU的峰)，即为VP2蛋白溶液。将VP2蛋白溶液进行聚丙烯凝胶电泳，显示分子量约为42KDa 的单一蛋白条带，回收蛋白条带并测序，N端前15个氨基酸残基如序列表的序列 6自N末端第1至15位氨基酸残基所示。
实施例4、ELISA检测scFv抗体的亲和力和特异性
一、ELISA检测IBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力。
1、分别用蛋白浓度为300μg/ml、60μg/ml、12μg/ml、2.4μg/ml的scFv抗体溶液(即实施例2制备的scFv抗体溶液，用包被液调整蛋白浓度)包被酶标板，4℃过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
2、每孔加入100μl蛋白浓度为40μg/ml的VP2蛋白溶液(即实施例3制备的 VP2蛋白溶液，用PBS缓冲液调整蛋白浓度)，37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤 3次，每次2min。
3、加入卵黄抗体(B87株免疫蛋鸡得到的，工作浓度为1:200倍稀释)，37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
4、加入HRP标记的兔抗鸡抗体(Cat.No.11-7018购自eBioscience公司，工作浓度为1:7500倍稀释)，37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
5、加入TMB底物显色液，37℃避光显色5min。
6、每孔加入50μl2mol/L的H2SO4水溶液，用酶标仪于波长450nm下检测OD值。
设置用等体积的PBS缓冲液代替步骤1中的scFv抗体溶液、步骤2中的VP2蛋白溶液和步骤3中的卵黄抗体的PBS组。步骤1中用蛋白浓度为300μg/ml的scFv抗体溶液包被酶标板时：设置步骤2中不加入VP2蛋白溶液的对照组1，步骤3中不加入卵黄抗体的对照组2，步骤2中不加入VP2蛋白溶液且步骤3中不加入卵黄抗体的对照组3，用等体积且等蛋白浓度的BSA溶液代替VP2蛋白溶液的对照组4。
每个处理设置3个复孔。
结果见图3。ELISA结果表明，IBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗体可以与VP2蛋白特异性结合。
二、ELISA检测sIBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力
1、用蛋白浓度为300μg/ml的scFv抗体溶液(即实施例2制备的scFv抗体溶液，用包被液调整蛋白浓度)包被酶标板，4℃过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次 2min。
2、每孔加入100μl IBDV病毒液(病毒滴度为100TCID50，TCID50＝10-6.8/0.1ml)， 37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
3、加入卵黄抗体(B87株免疫蛋鸡得到的，工作浓度为1:200倍稀释)，37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
4、加入HRP标记的兔抗鸡抗体(Cat.No.11-7018购自eBioscience公司，工作浓度为1:7500倍稀释)，37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
5、加入TMB底物显色液，37℃避光显色5min。
6、每孔加入50μl 2mol/L的H2SO4水溶液，用酶标仪于波长450nm下检测OD值。
分别采用如下IBDV的毒株进行上述实验：Gt株、NF8株、1-65株、BJ836株、MB 株、B87株。
设置用等体积的PBS缓冲液代替步骤1中的scFv抗体溶液、步骤2中的IBDV病毒液和步骤3中的卵黄抗体的PBS组。设置步骤2中不加入IBDV病毒液的对照组1，步骤3中不加入卵黄抗体的对照组2，步骤2中不加入IBDV病毒液且步骤3中不加入卵黄抗体的对照组3，用等体积等滴度的新城疫病毒液代替IBDV病毒液的对照组4。
每个处理设置3个复孔。
结果见图4。ELISA结果表明，IBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗体可以与不同IBDV毒株特异性结合，对不同的IBDV毒株具有不同的亲和力。
实施例5、IBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗体的中和活性
一、IBDV滴度的测定
将处于对数生长期的DF1细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基101至 1011梯度稀释的IBDV病毒液(B87株)接种到单层细胞中(每孔100μl)，每一稀释度接种8个细胞孔；设置不加入IBDV病毒液的对照组。将细胞培养板放到细胞培养箱中，37℃、5％CO2培养，连续观察7天，每天记录细胞生长状态。计算病毒滴度，第 7天结果见表1。
表1 IBDV滴度的测定的结果
稀释度 出现CPE的细胞孔的数目 未出现CPE的细胞孔的数目 CPE百分比
101 8 0 100％
102 8 0 100％
103 8 0 100％
104 8 0 100％
105 8 0 100％
106 4 4 50％
107 3 5 37.5％
108 0 8 0％
109 0 8 0％
1010 0 8 0％
1011 0 8 0％
1012 0 8 0％
按照Reed-Muench两氏法计算TCID50＝10-6.8/0.1ml。
二、scFv抗体的中和活性
将处于对数生长期的DF1细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基梯度稀释后的scFv抗体溶液(即实施例2制备的scFv抗体溶液)和100TCID50的IBDV病毒液(B87株)等体积混合并37℃孵育1h，然后接种到单层细胞中，每一梯度接种8个细胞孔；设置不加入病毒液的对照组和不加入scFv抗体溶液的对照组。将细胞培养板放到细培养箱中，37℃，5％CO2培养连续观察7天，每天记录细胞生长状态。第7天结果见表2a和2b。
表2a IBDV-VP2 scFv29抗体中和活性的测定结果
结果表明，IBDV-VP2 scFv29抗体具有中和活性，阻断或抑制CPE的最小蛋白浓度为9.375μg/ml。
表2b IBDV-VP2 scFv30抗体中和活性的测定结果
结果表明，IBDV-VP2 scFv29抗体具有中和活性，阻断或抑制CPE的最小蛋白浓度为4.688μg/ml。
实施例6、scFv抗体对IBDV感染鸡的保护作用
传染性法氏囊病病毒HB/11株：参考文献：黄显明、张小飞、丁美娟、尹秀凤、许秀梅、王伟、靳宇田，传染性法氏囊病病毒强毒株HB/11的分离与鉴定，《中国动物传染病学报》2012年第5期，8-11页。
一、安全性检测
取10只13日龄SPF雏鸡，分别胸肌注射蛋白浓度为2mg/ml的scFv抗体溶液(即实施例2制备的scFv抗体溶液，用PBS缓冲液调整蛋白浓度)，每只1ml，观察14天。无注射局部及全身不良反应。
二、IBDV半致死率的测定
取9日龄的鸡胚，分成9组，每组10只，第1组至第8组，分别注射200μL用 PBS缓冲液稀释后的稀释梯度为101-108的传染性法氏囊病病毒HB/11株病毒液，第9 组为生理盐水的对照组(每胚注射200μl生理盐水)。观察3-6天，记录鸡胚存活情况。
6天后的半致死率为105.5EID50。
三、抗体效力试验
13日龄SPF鸡分为五组，每组10只。
第一组：每只胸肌注射0.2ml PBS缓冲液；
第二组：接种B87株病毒液(每0.2ml含有的病毒剂量为104.0EID50)，每只胸肌注射0.2ml；
第三组：每只胸肌注射scFv抗体溶液(1mg蛋白/kg体重)，每只注射0.2ml；
第四组：每只胸肌注射scFv抗体溶液(0.5mg蛋白/kg体重)，每只注射0.2ml；
第五组：每只胸肌注射scFv抗体溶液(0.1mg蛋白/kg体重)，每只注射0.2ml。
免疫21天后检测中和抗体效价并接种传染性法氏囊病病毒HB/11株病毒液(每只胸肌注射0.2ml，含有的病毒剂量为105.5EID50)进行攻毒。
中和抗体效价的测定方法(微量滴定法)：(1)取血清，56℃水浴灭活30min，自然冷却，用Hank’s血清作2倍系列稀释(从1：2稀释到1：4096)，每种稀释液加入等体积病毒悬液(100TCID50/ml)充分震荡混合，37℃培养1h；将(2)鸡成纤维细胞接种于细胞培养板，每孔100微升，每孔加入100微升步骤(1)得到的混合液；设置不加入病毒悬液的对照组和不加入血清的对照组；37℃，5％CO2培养，连续观察3-5 天，若抗体有中和活性，则DF1细胞不会出现病变，计算第7天的抗体效价(即能抑制DF1细胞发生病变的最大稀释度)。结果见表3a和3b。
攻毒72h后，统计每组中死亡鸡的只数。结果见表3a和3b。
表3a IBDV-VP2 scFv29抗体效价结果和每组的死亡鸡数
组别 中和抗体效价 死亡鸡数
第一组 1：23 6/10
第二组 1：212 0/10
第三组 1：27 3/10
第四组 1：26 4/10
第五组 1：24 6/10
表3b IBDV-VP2 scFv30抗体效价结果和每组的死亡鸡数
组别 中和抗体效价 死亡鸡数
第一组 1：23 6/10
第二组 1：212 0/10
第三组 1：28 2/10
第四组 1：27 4/10
第五组 1：26 4/10
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 1
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtctgcaagg gctccgggtt cgacttcagt agccatggca tggcctgggt gcgacaggcg 120
cccggcaaag ggctggaatg ggtcgctggt attggcagca gtagtagtgg cacagcatac 180
gggtcggcgg tgcagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct actactgcgc caaaagtgtt 300
ggtgattgtg cttatggtta tagttgtgct gctggtggta tcgacgcatg gggccacggg 360
accgaagtca tcgtctcctc cgctagcggt ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctggt 420
ggtggtggat ccgtgctgac tcagccgtcc tcggtgtcag caaacccggg agaaaccgtc 480
aagatcacct gctccggggg tggtggcagc tacggctggt tccagcagaa gtctcctggc 540
agtgcccctg tcactgtgat ctataacaac aacaacagac cctcggacat cccttcacga 600
ttctccggtt ccaaatccgg ctccacagcc acattaacca tcactggggt ccaagccgag 660
gacgaggctg tttattactg tggtgggagt gaagacagca gtgctggcta tgttggtata 720
tttggggccg ggacaaccct gaccgtccta ggttaa 756
<210> 2
<211> 251
<212> PRT
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 2
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser His
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Ser Ser Ser Ser Gly Thr Ala Tyr Gly Ser Ala Val
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Val Gly Asp Cys Ala Tyr Gly Tyr Ser Cys Ala Ala Gly
100 105 110
Gly Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
145 150 155 160
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Trp Phe Gln Gln
165 170 175
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asn Asn Asn Asn
180 185 190
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gly Gly Ser Glu Asp Ser Ser Ala Gly Tyr Val Gly Ile
225 230 235 240
Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly
245 250
<210> 4
<211> 735
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 4
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtctgcaagg gctccgggtt cgacttcagc agttatcaga tgaactggat acgacaggct 120
cccggcaagg ggctggagtt cgtcgctgct attaacagat ttggcaatag cacgggttat 180
ggggcggcgg tggatggccg tgccaccatc tcaagggacg atgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga gcaacctcag ggctgaggac accggcacct actactgtgc caagggtgct 300
tacggttatt gtggtagtgg tagttggtgt gctcctggta acatcgacga atggggccac 360
gggaccgaag tcatcgtctc ctccgctagc ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct 420
ggtggtggtg gatccgcgct gactcagccg tcctcggtgt cagcaaaccc gggaggaacc 480
gtcaagatca tctgctccgg ggatagcagc tactatggct ggtaccagca gatggcacct 540
ggcagtgccc ctgtcactct gatctatagc aacgacaaga gaccctcgaa catcccttca 600
cgattctccg gttccaaatc tggctccaca cacacattaa ccatcactgg ggtccaagcc 660
gacgacgagg ctatctatta ctgtgggagc atagacacct ttggggccgg gacaaccctg 720
accgtcctag gttaa 735
<210> 4
<211> 244
<212> PRT
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 4
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gln Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Arg Phe Gly Asn Ser Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val
50 55 60
Asp Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asp Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ala Tyr Gly Tyr Cys Gly Ser Gly Ser Trp Cys Ala Pro
100 105 110
Gly Asn Ile Asp Glu Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser
115 120 125
Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Gly Thr
145 150 155 160
Val Lys Ile Ile Cys Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Tyr Gly Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Met Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Ser Asn Asp
180 185 190
Lys Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
195 200 205
Ser Thr His Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala
210 215 220
Ile Tyr Tyr Cys Gly Ser Ile Asp Thr Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu Gly
<210> 5
<211> 1323
<212> DNA
<213> 鸡传染性法氏囊病病毒(Gallus gallus)
<400> 5
atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60
ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120
gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180
cctggtttcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240
aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300
ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcatta 360
aacggaacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420
tacaatgggt tgatgtctgc gacggccaac atcaacgaca aaatcgggaa cgtcctagta 480
ggggaagggg taactgtcct cagcttaccc acatcatatg atctggggta tgtgagactc 540
ggtgacccca ttcccgctat agggcttgac ccaaagatgg tagcaacatg tgacagcagt 600
gataggccca gagtctacac cataactgca gccaatgact accaattctc atcacagtac 660
caagcaggtg gagtgacaat cacactgttc tcagcaaaca tcgatgccat cacaagcctc 720
agcatcgggg gagaacttgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttatact gggcgctacc 780
atctacctta taggcttcga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcagacaat 840
gggctaacgg ccggcactga caaccttatg ccattcaata ttgtgattcc aaccagcgag 900
ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtta cctccaaaag tggtggtcag 960
gcgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt gggagcctag cagtgacgat ccacggtggc 1020
aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggctacagga 1080
tctgtcgtta cggtcgccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140
aagaacctga tcacagaata cggccgattt gacccagggg ccatgaacta cacaaaactg 1200
atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtgt ggccaacaag ggagtacacc 1260
gactttcgcg agtactttat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320
gca 1323
<210> 6
<211> 441
<212> PRT
<213> 鸡传染性法氏囊病病毒(Gallus gallus)
<400> 6
Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg
1 5 10 15
Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr
20 25 30
Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr
35 40 45
Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro
50 55 60
Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr
65 70 75 80
Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr
85 90 95
Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr
100 105 110
Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr
115 120 125
Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu
130 135 140
Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val
145 150 155 160
Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly
165 170 175
Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys
180 185 190
Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile
195 200 205
Thr Ala Ala Asn Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly
210 215 220
Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu
225 230 235 240
Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile
245 250 255
Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile
260 265 270
Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn
275 280 285
Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro
290 295 300
Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln
305 310 315 320
Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr
325 330 335
Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val
340 345 350
Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val
355 360 365
Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Ile
370 375 380
Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu
385 390 395 400
Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr
405 410 415
Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu
420 425 430
Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala
435 440

Claims (10)

1.两种单链抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；
所述IBDV-VP2scFv29抗体重链可变区为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1自N末端第1-129位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述IBDV-VP2scFv29抗体轻链可变区为如下(c)或(d)：(c)由序列表中序列1自N末端第145-250位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述IBDV-VP2scFv30抗体重链可变区为如下(a’)或(b’)：(a’)由序列表中序列2自N末端第1-130位氨基酸残基组成的蛋白质；(b’)将(a’)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述IBDV-VP2scFv30抗体轻链可变区为如下(c’)或(d’)：(c’)由序列表中序列2自N末端第146-244位氨基酸残基组成的蛋白质；(d’)将(c’)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的两种单链抗体，其特征在于：
所述IBDV-VP2scFv29单链抗体为如下(e)或(f)：(e)由序列表中序列1所示的蛋白质；(f)将(e)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述IBDV-VP2scFv30单链抗体为如下(e’)或(f’)：(e’)由序列表中序列3所示的蛋白质；(f’)将(e’)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
3.编码权利要求1或2所述单链抗体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：
所述IBDV-VP2scFv29单链抗体基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下(1)或(2)或(3)：(1)序列表的序列3自5’末端第1-387位核苷酸所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；
所述IBDV-VP2scFv29单链抗体基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下(4)或(5)或(6)：(4)序列表的序列3自5’末端第433-753位核苷酸所示的DNA分子；(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(6)与(4)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；
所述IBDV-VP2scFv30单链抗体基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下(1’)或(2’)或(3’)：(1’)序列表的序列4自5’末端第1-390位核苷酸所示的DNA分子；(2’)在严格条件下与(1’)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3’)与(1’)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；
所述IBDV-VP2scFv30单链抗体基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下(4)或(5)或(6)：(4)序列表的序列4自5’末端第436-732位核苷酸所示的DNA分子；(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(6)与(4)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于：
所述IBDV-VP2scFv29单链抗体基因为如下(7)或(8)或(9)或(10)：(7)序列表的序列3自5’末端第1-753位核苷酸所示的DNA分子；(8)序列表的序列3所示的DNA分子；(9)在严格条件下与(7)或(8)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(10)与(7)或(8)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；
所述IBDV-VP2scFv30单链抗体基因为如下(7’)或(8’)或(9’)或(10’)：(7’)序列表的序列4自5’末端第1-732位核苷酸所示的DNA分子；(8’)序列表的序列4所示的DNA分子；(9’)在严格条件下与(7’)或(8’)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(10’)与(7)或(8’)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
6.含有权利要求3至5中任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
7.基于权利要求1或2所述单链抗体的其它形式的抗体。
8.权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)：(Ⅰ)检测传染性法氏囊病病毒；(Ⅱ)辅助鉴定传染性法氏囊病病毒；(Ⅲ)预防和/或治疗传染性法氏囊病病毒引起的疾病；(Ⅳ)预防和/或治疗传染性法氏囊病。
9.含有权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体的产品；所述产品的功能为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)：(Ⅰ)检测传染性法氏囊病病毒；(Ⅱ)辅助鉴定传染性法氏囊病病毒；(Ⅲ)预防和/或治疗传染性法氏囊病病毒引起的疾病；(Ⅳ)预防和/或治疗传染性法氏囊病。
10.权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体在辅助鉴定传染性法氏囊病病毒中的应用。
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