CN101121748A - 抗传染性法氏囊病病毒vp4蛋白单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP4蛋白单克隆抗体属于生物技术领域，涉及基因工程。将IBDV VP4基因克隆于原核表达载体pET－28a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达；分离包涵体，用8M尿素溶解，经镍螯合亲和层析纯化获得VP4重组蛋白。用VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，以HAT培养基选择性培养后，以VP4重组蛋白和IBDV感染细胞进行双重ELISA筛选和有限稀释法克隆化，获得分泌抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中4C3、6A4和6H8腹水的ELISA效价分别为：6.4×10⁵、2.6×10⁶和5.2×10⁶，均能特异识别IBDV感染细胞的病毒蛋白，其Ig亚型重链为IgG1，轻链为κ。

Description

抗传染性法氏囊病病毒VP4蛋白单克隆抗体

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体为抗传染性法氏囊病病毒VP4蛋白单克隆抗体。

背景技术

传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)是传染性法氏囊病(IBD)的病原，主要侵害3-6周龄雏鸡的法氏囊中枢免疫器官，破坏表面带有sIgM的B淋巴细胞，并引起脾脏、胸腺及外周血液淋巴细胞的凋亡，导致以淋巴细胞衰竭、坏死为主要特征的免疫缺陷性和免疫抑制性疾病。该病发病率高，病程短，除疾病自身可造成机体损伤外，还可导致多种疫苗免疫失败，严重危害养禽业的健康发展。IBDV属双RNA病毒科(Birnaviridae)禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)，无囊膜，具有单层衣壳，呈20面体立体对称，病毒基因组由双链双节段RNA组成，大节段A全长3259个核苷酸，含有两个部分重叠的开放阅读框架(ORF)，大ORF全长共3036个核苷酸，按NH2-VP2-VP4-VP3-COOH的顺序编码分子量为110kDa的多聚前体蛋白(VP2/4/3)，并剪切加工成为VP2蛋白前体(pVP2)、VP3和VP4蛋白，pVP2进一步加工成为成熟的VP2蛋白和4条多肽(pep46、pep7a、pep7b和pep11)；小ORF全长共435-447个核苷酸，编码VP5非结构蛋白。小节段B全长2827个核苷酸，只有一个ORF编码VP1蛋白。

VP4由243个氨基酸组成，分子量约为28kDa，属于丝氨酸蛋白酶，具有水解蛋白活性，主要作用是对多聚前体蛋白VP2/4/3进行自我水解，使之水解成为pVP2、VP3和VP4三种病毒蛋白，其中pVP2-VP4和VP4-VP3确切剪切位点分别定位于L512A↓A513和M755A↓A756。此外，VP4还能激活VP1的合成，与病毒在感染细胞后形成的微管状结构有关，有可能也参与了病毒组装，但不诱导凋亡。由于IBDV病毒粒子不存在VP4蛋白，无法获得自然状态下的VP4病毒蛋白，严重制约VP4蛋白特性和功能的研究，利用VP4重组蛋白制备特异性单克隆抗体可为VP4研究提供必要的试剂和技术手段，对探讨VP4蛋白在IBDV病毒粒子形成及其致病方面的作用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体是用纯化的IBDV VP4重组蛋白为抗原，通过杂交瘤细胞方法获得的，能特异识别IBDV感染细胞病毒蛋白的单克隆抗体。IBDV VP4重组蛋白是将IBDV VP4基因克隆于原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，分离包涵体，用8M尿素溶解，经镍螯合亲和层析纯化获得的表达蛋白。

该单克隆抗体的具体制备方法如下：

1、根据IBDV VP4基因cDNA序列设计一对引物，通过PCR扩增得到全长VP4基因。将IBDV VP4基因克隆于原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达IBDVVP4蛋白；裂解表达菌体，分离包涵体，用8M尿素溶液溶解表达蛋白，经镍螯合亲和层析纯化，获得IBDV VP4重组蛋白。

2、用IBDV VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，以HAT培养基选择性培养后，以VP4重组蛋白和IBDV感染细胞进行双重ELISA筛选和有限稀释法克隆化，获得分泌抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞注入经降殖烷致敏的BALB/c小鼠诱生腹水，对获得抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体特性进行鉴定。

3、以ELISA测定抗IBDVVP4蛋白单克隆抗体的腹水效价，间接免疫荧光鉴定抗IBDVVP4蛋白单克隆抗体与IBDV病毒蛋白的反应性和特异性，用单克隆抗体亚型测定试剂盒鉴定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的Ig亚类。

本发明的优点是：(1)本发明提供的IBDV VP4重组蛋白制备方法简单，纯度高；(2)本发明提供抗IBDV VP4蛋白的单克隆抗体特异性强，制备方法简单；(3)抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体可用于VP4蛋白的特性和功能研究。

附图说明

图1为IBDV VP4重组表达质粒pET28a-VP4的鉴定图，图中1是阴性对照，2是质粒pET28a-VP4的PCR产物，3是100bp DNA ladder。

图2为IBDV VP4表达蛋白的SDS-PAGE鉴定图，图中1是蛋白质Marker，2是BL21(DE3)/pET-28a诱导表达菌体，3是BL21(DE3)/pET28a-VP4诱导表达菌体。

图3为抗VP4蛋白单克隆抗体的IFA鉴定图，图中A和B分别是单克隆抗体6A4与IBDVNB株感染及正常鸡胚成纤维细胞(CEF)的反应结果，C和D分别是单克隆抗体6H8与IBDVNB株感染及正常CEF的反应结果，E和F分别是单克隆抗体4C3与IBDV NB株感染及正常CEF的反应结果。

具体实施方式

1、IBDV VP4重组蛋白的制备：根据IBDV NB株A节段核苷酸序列设计引物，PCR扩增IBDV VP4基因，将其克隆于原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达IBDV VP4蛋白；收集表达菌体，冻融3次后，离心分离包涵体，用8M尿素溶液溶解表达蛋白，经镍螯合亲和层析纯化，获得IBDV VP4重组蛋白。

2、抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的制备：用等量弗氏佐剂乳化纯化的VP4重组蛋白，免疫6-8周龄BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇作用下进行细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养；以纯化的VP4重组蛋白和IBDV感染CEF裂解物为检测抗原，用双重ELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行筛选，阳性杂交瘤经连续5次有限稀释法克隆化，获得稳定分泌抗VP4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以降殖烷致敏BALB/c小鼠后，将杂交瘤细胞注入致敏小鼠腹腔诱生腹水，获得抗IBDVVP4蛋白单克隆抗体。

3、抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的特性鉴定：以纯化VP4重组蛋白为检测抗原用间接ELISA方法测定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的腹水效价；以间接免疫荧光鉴定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体与IBDV病毒蛋白的反应性和特异性；用SBA公司ClonotypingTMSystem/HRP亚型测定试剂盒鉴定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体重链和轻链的Ig亚型。

实施例1IBDV VP4重组表达质粒的构建

根据IBDV NB株A节段核苷酸序列(EF517528.1)设计合成特异性引物，上游引物5’-CGTCGTCCATGGCCGACAAGGGGTACGAGGTAGTC-3’(下划线为NcoI位点)，下游引物5’CGTCGTCTCGAGCATGGCAAGGTGGTACTGGCGTCC-3’((下划线为XhoI位点)。以PCR从IBDVA节段质粒中扩增IBDV VP4基因，引入NcoI/XhoI酶切位点，PCR产物经NcoI/XhoI双酶酶切消化后，连接到原核表达载体pET-28a的NcoI/XhoI位点间，转化大肠杆菌Top10，提取转化细菌的质粒，以PCR鉴定重组表达质粒(图1)，经序列测定验证，获得IBDV VP4重组表达质粒pET28a-VP4。

实施例2IBDVVP4重组蛋白的表达与纯化

以氯化钙法将重组表达质粒pET28a-VP4转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取阳性克隆接种LB液体培养基(含50μg/mL Kan)，37℃250r/min振荡培养过夜，次日按1∶100的比例接种于含10mL新鲜LB培养基100mL锥形瓶中，37℃300r/min振荡培养，当0D₆₀₀＝0.6时，加入终浓度为1mM IPTG诱导表达2h，4℃12000r/min离心30sec，收集菌体，冻融三次，4℃12000r/min离心10min，SDS-PAGE分析裂解菌体的上清和沉淀，分析IBDV VP4蛋白的表达情况(图2)。加入5倍体积8M尿素溶解沉淀，振荡至溶液澄清，4℃12000r/min离心10min，弃沉淀，上清转移至镍离子亲和层析柱中，振荡1h，使带有His标签的VP4表达蛋白与镍离子鳌合，先后用2倍柱床体积pH＝8.0的8M尿素溶液，3倍柱床体积pH＝6.3的8M尿素，3倍柱床体积pH＝5.9的8M尿素和5倍柱床体积pH＝4.5的8M尿素洗脱柱床，收集洗脱液1ml/管；用SDS-PAGE分析洗脱液，获得高纯度的VP4重组蛋白。

实施例3小鼠免疫

分别将纯化的IBDV VP4重组蛋白与弗氏佐剂等比例混合，充分乳化，制备VP4免疫抗原，免疫6-8周龄BALB/c纯系小鼠10只。首免以弗氏完全佐剂免疫抗原，背部皮下、皮内多点注射，每只100μg(0.2mL)；间隔20天，用弗氏不完全佐剂免疫抗原进行第二次免疫，腹腔注射，每只100μg(0.2mL)；间隔20天，用不加佐剂的VP4免疫抗原进行三免，肌肉注射，每只100μg(0.2mL)；免疫15天后，尾静脉采血，以VP4重组蛋白为检测抗原，用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清的抗体水平，免疫小鼠抗体滴度达到1∶4000以上，表明小鼠获得良好免疫效果。

实施例3杂交瘤细胞株的建立

1、细胞融合

细胞融合前3天，进行超强免疫，以不加佐剂的VP4重组蛋白尾静脉注射小鼠，每只50μg(0.1mL)。免疫小鼠经眼眶放血，收集血清，拉颈致死后，无菌取小鼠脾脏，分离脾细胞，经台盼兰染色计数，按5∶1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞(2×10⁷)混合，在PEG4000作用下进行细胞融合；融合细胞经洗涤后，用HAT选择培养基重悬，置5％CO₂ 37℃进行选择性培养，5天后半量换液，10天后改为HT培养基。待细胞克隆长至1/5-1/2培养孔时，吸取细胞培养上清检测分泌抗体。

2、杂交瘤细胞筛选

分别用纯化的VP4重组蛋白和IBDV感染CEF裂解物作为检测抗原，对杂交瘤细胞培养上清中的分泌抗体进行双重ELISA检测，筛选阳性杂交瘤细胞。用0.05M碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)稀释纯化的VP4重组蛋白或IBDV感染CEF裂解物，加入酶标板，100μL/孔，37℃包被1h后转入4℃包被过夜；用含0.05％吐温20的PBS缓冲液(PBST)洗涤3次，加5％脱脂奶粉37℃封闭1h，每孔加入杂交瘤细胞培养上清100μL，37℃孵育2h；PBST洗3次，加入1∶5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育1h，PBST洗4次，加入显色底物OPD-H₂O₂，避光反应10min后，用2MH₂SO₄终止反应，用酶标仪读取OD₄₉₀值，以与阴性OD₄₉₀值的比值大于2.1判为阳性。VP4重组蛋白和IBDV感染细胞两种抗原检测均呈阳性的杂交瘤细胞孔为阳性克隆。

3、有限稀释法克隆化

用HT培养基制备阳性杂交瘤细胞悬液，取样进行台盼兰染色和计数；以HT培养基将杂交瘤细胞稀释至20个/mL和10个/mL，将稀释细胞悬液分别加入96孔培养板，每孔0.1mL，细胞含量分别为2个/孔和1个/孔，置5％CO₂ 37℃培养，5-7天观察细胞克隆生长情况，选取单克隆生长孔细胞上清，以ELISA检测分泌抗体；对阳性克隆进行连续5次克隆，使其抗体分泌阳性率达95％以上，扩大培养，冻存细胞，获得稳定分泌抗VP4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其中的3株分别为4C3、6A4和6H8。

实施例4抗VP4蛋白单克隆抗体的制备

用降植烷腹腔注射成年雌性BALB/c小鼠，0.2mL/只，致敏1周后，腹腔注射杂交瘤细胞悬液5×10⁶-1×10⁷，7-10天后采集小鼠腹水，12000g离心3min，收集上清，-70℃冻存，获得单克隆抗体4C3、6A4和6H8腹水6.5-8mL。

实施例5抗VP4蛋白单克隆抗体的腹水效价测定

用PBS缓冲液1000倍稀释抗VP4蛋白单克隆抗体腹水，经倍比稀释后，分别加入VP4重组蛋白(2μg/mL)包被的酶标板，100μL/孔，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，加入1∶5000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤后，加入显色底物OPD-H₂O₂，避光反应10min，用2M H₂SO₄终止反应，用酶标仪读取OD₄₉₀值，以与阴性OD₄₉₀值的比值大于2.1判为阳性，以阳性孔的最大稀释度为抗VP4蛋白单克隆抗体腹水效价。结果测得单克隆抗体4C3、6A4和6H8腹水的ELISA效价分别为：6.4×10⁵、2.6×10⁶和5.2×10⁶。

实施例6抗VP4蛋白单克隆抗体与IBDV病毒蛋白的反应性与特异性鉴定

以间接免疫荧光测定抗VP4蛋白单克隆抗体与IBDV病毒蛋白的反应性与特异性。鸡胚成纤维细胞经IBDV感染24h，PBS漂洗两次；加入甲醛∶丙酮＝1∶1的固定液，100μL/孔，固定1h；弃固定液，通风干燥；分别加入单克隆抗体4C3、6A4t和6H8的细胞培养上清，100μL/孔，37℃孵育1h；PBS洗涤3次，加入1∶100稀释的FITC标记羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育30min；PBS洗涤后，每孔加入PBS 100μL，荧光显微镜观察并照相。结果单克隆抗体4C3、6A4和6H8均特异识别IBDV感染CEF的病毒蛋白(图3)。

实施例7抗VP4蛋白单克隆抗体的Ig亚型测定

利用SBA公司ClonotypingTM System/HRP亚型测定试剂盒测定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体Ig亚型。结果显示，单克隆抗体4C3、6A4和6H8的重链均为IgG1，轻链为κ。

序列表：

上游引物：

5’CGTCGTCCATGGCCGACAAGGGGTACGAGGTAGTC-3’(下划线为NcoI位点)；

下游引物：

5’-CGTCGTCTCGAGCATGGCAAGGTGGTACTGGCGTCC-3’(下划线为XhoI位点)。

Claims (2)

1.一种抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP4蛋白单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体是用纯化的IBDV VP4重组蛋白为抗原，通过杂交瘤细胞方法获得的，特异识别IBDV感染细胞中的VP4病毒蛋白的单克隆抗体。

2.如权利要求1所述一种抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP4蛋白单克隆抗体，其特征在于：IBDV VP4重组蛋白是将IBDV VP4基因克隆于原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，分离包涵体，用8M尿素溶解，经镍螯合亲和层析纯化获得的表达蛋白。

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