CN102242083B - 抗新i型鸭肝炎病毒3d蛋白单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明是一种新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单克隆抗体，属于分子生物学技术领域，涉及基因工程和免疫学技术。将新I型鸭肝炎病毒3D蛋白抗原纯化。用纯化抗原免疫BALB/c小鼠，经融合、间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞和有限稀释法克隆化后，获得分泌抗鸭肝炎IC型病毒3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9，保藏号为CGMCC-4580；其ELISA效价为1×10^-6以上，能特异识别新I型鸭肝炎病毒感染细胞的病毒3D蛋白，其Ig亚型重链为IgG1，轻链为κ。本发明为新I型鸭肝炎病毒的检测、新I型鸭肝炎病毒3D蛋白结构和功能研究以及病毒的致病机理研究奠定了基础。

Description

抗新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单克隆抗体

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体为涉及抗新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单克隆抗体。

背景技术

I型鸭病毒性肝炎是由I型鸭病毒性肝炎病毒(duck hepatitisvirus serotype I，DHV-I)引起雏鸭的一种急性高度致死性传染病。I型鸭肝炎病毒(DHV-1C)属小RNA病毒科(Picornaviridae)，其病毒核衣壳为对称的二十面体，无囊膜，无血凝性，直径大小为20-40nm。1994年Kim等在韩国发现一种新I型鸭肝炎病毒，命名为DHV-1C，并报道了此新I型鸭肝炎病毒基因序列，分析结果表明DHV-1与DHV-1C属于同一个病毒属的不同血清型，同源性为68.5％-73.2％。由5′非编码区(5′UTR)、一个大的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)、3′非编码区(3′UTR)和Poly(A)尾巴组成，ORF编码2249个氨基酸多聚蛋白。该蛋白在病毒包装过程中，裂解为结构蛋白VP0、VP1、VP3和非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。全长为7792bp，3D基因位于基因组的6050bp-7408bp，全长1358bp，编码453个氨基酸(Kim M C，Kwon Y K，Joll S J.Recent Korean isolates of duck hepatitis virus reveal the presence of anew gene-and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 typestratus.Arch Virol，2007，152(11)：2059-2072.)。3D蛋白是病毒RNA依赖的RNA聚合酶，又称病毒相关抗原，是非结构蛋白，催化病毒RNA的合成。

本研究以纯化的新I型鸭肝炎病毒3D蛋白为抗原进行抗新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单抗的制备，期望筛选到能与新I型鸭肝炎病毒反应的单抗。以新I型鸭肝炎病毒3D重组蛋白制备特异性单克隆抗体可为新I型鸭肝炎病毒的研究提供必要的试剂和技术手段，对探讨3D蛋白在新I型鸭肝炎病毒形成及其致病方面具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供抗DHV-1C 3D蛋白单克隆抗体。

本发明的单抗隆抗体是用纯化的DHV-1C 3D重组蛋白为抗原，通过杂交瘤细胞方法获得的，能够特异识别DHV-1C感染细胞病毒3D蛋白的单克隆抗体。DHV-1C 3D重组蛋白是将DHV-1C 3D基因克隆与原核表达载体pET-30a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，纯化的3D重组蛋白。

该单克隆抗体的具体制备方法如下：

1、根据DHV-1C 3D基因cDNA序列设计一对引物，通过PCR扩增得到全长3D基因，将DHV-1C N株3D基因克隆于原核表达载体pET-30a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达3D蛋白；进行SDS-PAGE检测及Westernblot分析鉴定后，裂解表达菌体，分离包涵体，用pH 8.0的尿素裂解沉淀，离心后取上清经镍亲和层析过柱纯化(购自Qiagen公司，Valencia，CA公司)，将纯化后蛋白用6mol/L尿素进行梯度透析复性获得3D重组蛋白。

2、用DHV-1C 3D重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，以HAT培养基(购自Invitrogen公司)选择性培养后，经3D重组蛋白和His蛋白进行双重ELISA筛选和有限稀释法克隆化，获得分泌抗3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9；将杂交瘤细胞注BALB/c小鼠诱生腹水，对获得抗3D蛋白单克隆抗体特性进行鉴定。

3、以ELISA测定抗3D蛋白单克隆抗体的腹水效价，间接免疫荧光鉴定抗3D蛋白单克隆抗体与DHV-1C病毒蛋白的反应性和特异性，用单克隆抗体亚型测定试剂盒(Zymed Laboratories，Inc.)鉴定抗3D蛋白单克隆抗体的Ig亚类。

本发明的优点是：(1)本发明提供的DHV-1C 3D重组蛋白制备方法简单，纯度高；(2)本发明提供抗DHV-1C 3D蛋白的单克隆抗体特异性强，制备方法简单；(3)抗DHV-1C 3D蛋白单克隆抗体可用于3D蛋白结构和功能研究。

具体地，在一个方面，本发明提供分泌抗新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏号为CGMCC No.4580。

另一方面，本发明提供针对新I型鸭肝炎病毒3D蛋白的单克隆抗体，其由保藏号为CGMCC No.4580的杂交瘤细胞系分泌。

再一方面，本发明提供用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的药物组合物，其包含上述定义的单克隆抗体。

在另一个发明，本发明提供用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的试剂盒，其包含上述定义的单克隆抗体。

在另一个方面，本发明提供上述定义的单克隆抗体在制备用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的药物中的应用。

在又一个方面，本发明涉及所述单克隆抗体在制备检测新I型鸭肝炎病毒的药物中的应用。

杂交瘤细胞株2D9，于2011年2月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，保藏号为CGMCC No.4580。

附图说明

图1为DHV-1C 3D基因PCR产物(A)和pET 30a-3D酶切鉴定图(B)，其中A中的泳道1：3D基因的PCR产物；泳道M：DNA分子质量标准；B中的泳道1：pET30a-3D的BamH1和Hind III双酶切产物；泳道M：2kb DNA分子质量标准。

图2为DHV-1C 3D表达蛋白的SDS-PAGE(A)和Western blotting(B)鉴定图，其中泳道M是蛋白质Marker，泳道2-5分别是BL21(DE3)/pET30a-3D在1、2、3和4小时诱导表达的菌体，泳道1是BL21(DE3)/pET-30a载体诱导表达菌体；图(B)泳道2和1分别是BL21(DE3)/pET30a-3D和BL21(DE3)/pET-30a诱导表达菌体在鸭抗DHV-1CN株阳性血清下的Western blotting结果。

图3为3D蛋白单克隆抗体2D9的Western blotting鉴定图，图中泳道1是3D蛋白，泳道2是大肠杆菌菌体蛋白，泳道M是蛋白质Marker。

图4为抗3D蛋白单克隆抗体2D9的IFA鉴定图，图中A和B分别是单克隆抗体2D9与N株感染的鸭胚成纤维细胞及正常鸭胚成纤维细胞的反应结果，其中A图表示单克隆抗体2D9可以检测出N株病毒感染的鸭胚成纤维细胞的3D蛋白，显示绿色荧光；B图表示未感染病毒的鸭胚成纤维细胞没有荧光。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1.DHV-1C 3D重组蛋白的制备

根据DHV-1C序列设计引物，PCR扩增DHV-1C 3D基因，将其克隆于原核表达载体PET-30a，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达DHV-1C3D蛋白；收集表达菌体，冻融3次后，离心分离包涵体，用pH 8.0的尿素裂解沉淀，经镍亲和层析纯化，获得DHV-1C 3D重组蛋白，最后该蛋白经6M尿素进行梯度透析复性。

1).3D重组表达质粒的构建

根据DHV-1C 3D核苷酸序列(SEQ ID NO：1)设计合成特异性引物，上游引物3DF：5’TCGGGATCCGCTATTGTTGAGAAAAAGTATTCAG3’(SEQ ID NO：2下划线为BamH1位点)，下游引物3DR：5’CAGAAGCTTTTATATAATCATGCAGGCAGTATATG 3’(SEQ ID NO：3，下划线为Hind III位点)。以PCR从DHV-1CN株(哈尔滨兽医研究所)按常规方法反转录的cDNA中扩增3D基因(PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃3min，32个循环；72℃延伸10min，4℃保存)。扩增片段大小为1359bp(见图1A)。pET30a(购自Novagen公司)经BamH1/Hind III双酶切消化后，将扩增的3D基因连接到原核表达载体pET-30a的BamH1/Hind III位点间，转化大肠杆菌Top10，提取转化细菌的质粒，以上述PCR反应和BamH1/Hind III酶切鉴定重组表达质粒(PCR反应结果参见图1A，酶切结果参见图1B)，经序列测定验证，获得3D重组表达质粒pET30a-3D。阳性重组表达质粒pET30a-3D转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Invitrogen公司)，SDS-PAGE和Western blotting表明(图2)，表达的65.8kDa重组3D蛋白(泳道2)可被DHV-1C病毒阳性血清所识别，空载体pET30a诱导蛋白(泳道1)不能被DHV-1C病毒阳性血清所识别。其中DHV-1C病毒阳性血清是利用由哈尔滨兽医研究所的DHV-1C病毒N株免疫番鸭制备，即将纯化的100μgDHV-1C N株与弗氏佐剂等比例混合，充分乳化，制备免疫抗原，免疫4周龄鸭。免疫3次，每次100μg/每只(0.2mL)；第一次以弗氏完全佐剂免疫抗原，肌肉注射；间隔14天，用弗氏不完全佐剂免疫抗原进行第二次免疫；间隔14天，用不加佐剂的免疫抗原进行三免，肌肉注射；免疫10天后，采血，分离DHV-1C病毒阳性血清。

2).DHV-1C 3D重组蛋白的表达与纯化

以氯化钙法将重组表达质粒pET30a-3D转化大肠杆菌BL21(DE3)，取阳性克隆用LB液体培养基(含50μg/mL Kan)，37℃250r/min振荡培养过夜，次日按1∶100的比例接种于含10mL新鲜LB培养基100mL锥形瓶中，37℃300r/min振荡培养，当OD₆₀₀＝0.6时，加入终浓度为1mM IPTG诱导表达2h，4℃12000r/min离心30sec，收集菌体，冻融三次，4℃12000r/min离心10min，SDS-PAGE分析裂解菌体的上清和沉淀，分析3D蛋白的表达情况。加入5倍体积8M尿素溶解沉淀，振荡至溶液澄清，4℃12000r/min离心10min，弃沉淀，上清转移至镍离子亲和层析柱中(购自Qiagen公司，Valencia，CA)，振荡1h，由pET-30a表达的带有His标签的VP3表达蛋白与镍离子螯合，先后用2倍体积柱床体积pH＝8.0的8M尿素溶液，3倍柱床体积pH＝6.3的8M尿素，3倍柱床体积pH＝5.9的8M尿素和5倍柱床体积pH＝4.5的8M尿素洗脱柱床，收集洗脱液1ml/管；用SDS-PAGE分析洗脱液，经6mol/L尿素进行梯度透析复性，获得高纯度的3D重组蛋白。

实施例2.抗3D蛋白单克隆抗体的制备

用等量弗氏佐剂(Sigma公司)乳化纯化的100ug 3D重组蛋白，免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，15天后用不完全弗氏佐剂(Sigma公司)乳化等体积蛋白进行二次免疫，二次免疫后十天断尾采血用ELISA方法检测小鼠血清效价，此时小鼠血清效价已经明显上升，经第三次免疫后检测小鼠血清效价，阳性值达1.0以上，P/N大于10时取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇(Invitrogen公司)作用下进行细胞融合，用HAT培养基(购自Invitrogen公司)进行选择性培养；以纯化的3D重组蛋白和His蛋白(购自KPL)为检测抗原，用双重ELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行筛选，阳性杂交瘤经连续5次有限稀释法克隆化，获得稳定分泌抗3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9，将其于2011年2月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，保藏号为CGMCC No4580；将杂交瘤细胞注入致敏小鼠腹腔诱生腹水，获得抗N株3D蛋白单克隆抗体2D9。具体如下。

1).小鼠免疫

分别将纯化的DHV-1C 3D重组蛋白与弗氏佐剂等比例混合，充分乳化，制备3D免疫抗原，免疫6周龄BALB/c小鼠8只(购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心)。免疫3次，每次100μg/每只(0.2mL)；第一次以弗氏完全佐剂免疫抗原，背部皮下多点注射；间隔20天，用弗氏不完全佐剂免疫抗原进行第二次免疫，腹腔注射；间隔20天，用不加佐剂的3D免疫抗原进行三免，肌肉注射；免疫15天后，尾静脉采血，以3D重组蛋白为检测抗原，用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清的抗体水平，免疫小鼠抗体滴度达到1∶4000以上，表明小鼠获得良好免疫效果。

2).杂交瘤细胞株的建立

i)细胞融合

细胞融合前3天，以不加佐剂的3D重组蛋白尾静脉注射小鼠，每只100μg(0.1mL)，无菌取脾脏，分离脾细胞，计数后按5∶1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞(2×10⁷)混合，在PEG4000作用下进行细胞融合(《实用免疫学》，杨廷彬主编，长春出版社，1994年12月出版)；用HAT选择培养基(购自Invitrogen公司)重悬，置5％CO₂ 37℃进行选择性培养，5天后半量换液，10天后改为HAT培养基(购自Invitrogen公司)。待细胞克隆长至1/4-1/2培养孔时，取细胞培养上清检测分泌抗体。

ii).杂交瘤细胞筛选

分别用纯化的3D重组蛋白和His蛋白(购自KPL公司)作为检测抗原，对杂交瘤细胞培养上清中的分泌抗体进行双重ELISA检测，筛选阳性杂交瘤细胞。用0.05M碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)稀释纯化的VP3重组蛋白或His蛋白，按100μL 0.045μg/孔加入酶标板中，37℃包被1h后转入4℃过夜；用含0.05％吐温20的PBS缓冲液(PBST)洗涤3次，加5％脱脂奶粉37℃封闭1h，每孔加入杂交瘤细胞培养上清100μL，37℃孵育2h；PBST洗3次，加入1∶5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，37℃孵育1h，PBST洗4次，加入显色底物OPD-H₂O₂(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，避光反应10min后，用2M H₂SO₄终止反应，用酶标仪读取OD₄₉₀值，以与阴性OD₄₉₀值的比值大于2.1判为阳性。3D重组蛋白阳性而His蛋白阴性检测的杂交瘤细胞孔为阳性克隆。

iii).有限稀释法克隆化获得杂交瘤细胞系和保藏

用HT培养基将杂交瘤细胞稀释至20个/ml，每孔0.1ml接入96孔培养板，细胞含量分别为2个/孔和1个/孔，置5％CO₂ 37℃培养，5-7天观察细胞克隆生长情况，选取单克隆生长孔细胞上清，以ELISA检测分泌抗体；对阳性克隆进行连续5次克隆，获得稳定分泌抗VP3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9，使其抗体分泌阳性率达95％以上。杂交瘤细胞株2D9扩大培养，500转/分钟离心5分钟，收集细胞培养上清，将细胞沉淀用37℃提前预热的DMEM冻存液(含7份DMEM+2份血清+1份二甲亚砜)重悬，每管2ml分装，-70℃冻存细胞。该杂交瘤细胞株于2011年2月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC-4580。

3).抗3D蛋白单克隆抗体2D9的制备。

成年雌性BALB/c小鼠经0.2ml/只降植烷腹腔注射，致敏1周后，腹腔注射杂交瘤细胞2D9悬液5×10⁶-1×10⁷，7-10天后采集腹水，12000g离心5min，收集上清。上清加入等量PH7.2巴比妥缓冲盐水(VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg²⁺，0.3mmol/L Ca²⁺)稀释；每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅(Sigma公司)，混匀，悬液在室温孵育30分钟，摇动；2000g离心20分钟，即得到澄清的单克隆抗体2D9腹水，-70℃冻存。

4).抗3D蛋白单克隆抗体2D9的腹水效价的测定。

首先抗3D蛋白单克隆抗体2D9腹水用PBS缓冲液1000倍稀释，然后倍比稀释，3D重组蛋白(2μg/ml)100μL/孔包被的酶标板(购自Corning公司)，37℃孵育2h；加入倍比稀释(1∶2000)的抗3D蛋白单克隆抗体2D9腹水100μl，37℃孵育1h，PBST洗涤3次后加入1∶5000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育1h，PSBT洗涤后，加入显色底物OPD-H₂O₂(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，避光反应10min，用2M H₂SO₄终止反应，用酶标仪读取OD₄₉₀值，以与阴性OD₄₉₀值比值大于2.1判为阳性，以阳性孔的最大稀释度为抗3D蛋白单克隆抗体2D9腹水效价。结果测得单克隆抗体2D9腹水的ELISA效价分别为：6.4×10^-6。

实施例3.抗3D蛋白单克隆抗体2D9的特性鉴定

以纯化3D重组蛋白为检测抗原用间接ELISA方法测定抗3D蛋白单克隆抗体2D9的腹水效价；以间接免疫荧光鉴定抗3D蛋白单克隆抗体2D9与DHV-1C病毒蛋白的反应性和特异性；用Zymed Laboratories，Inc公司亚型测定试剂盒鉴定抗3D蛋白单克隆抗体2D9重链和轻链的Ig亚型。

i).抗3D蛋白单克隆抗体2D9与DHV-1C的反应性和特异性鉴定

以间接免疫荧光测定抗3D蛋白单克隆抗体与DHV-1C病毒蛋白的反应性和特异性。鸡胚成纤维细胞DF1经DHV-1C病毒(哈尔滨兽医研究所)感染24h，PBS洗两次；100μl/孔加入甲醇固定，1h后弃固定液，分别加入单克隆抗体2D9的细胞培养上清，100μl/孔，37℃孵育1h；PSB洗涤3次，加入1∶100稀释的FITC标记羊抗鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，37℃孵育30min；PBS洗涤后，加入PBS 100μl，荧光显微镜观察并照相。结果单克隆抗体2D9株均特异识别DHV-1CC病毒3D蛋白(图4A)，而阴性对照则没有荧光(图4B)。

ii).抗3D蛋白单克隆抗体的Ig亚型测定。

利用Zymed Laboratories，Inc.公司亚型测定试剂盒测定抗3D蛋白单克隆抗体Ig亚型。结果显示，单克隆抗体2D9的重链为IgG1，轻链均为κ。

Claims (6)

1.分泌抗新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏号为CGMCC No.4580。

2.针对新I型鸭肝炎病毒3D蛋白的单克隆抗体，其由保藏号为CGMCC No.4580的杂交瘤细胞系分泌。

3.用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的药物组合物，其包含权利要求2所述的单克隆抗体。

4.用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的试剂盒，其包含权利要求2所述的单克隆抗体。

5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的药物中的应用。

6.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测新I型鸭肝炎病毒的药物中的应用。 

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