CN113061585A - 一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒以及制备方法 - Google Patents

一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒以及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于CRISPR‑Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒以及制备方法，本发明的原理和最核心的关键技术是选择合适插入位点以及sgRNA。插入RFP后进行病毒的纯化，获得可以稳定扩增的重组禽腺病毒。利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入外源基因RFP，成功获得了表达RFP的重组FAdV‑4病毒，由此可见，RFP的插入位置可以作为插入其他病原的保护性抗原插入位点，为构建FAdV‑4重组多价苗提供了夯实的理论基础。

Description

一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒以及制备 方法
技术领域
本发明涉及一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒以及制备方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)是dsDNA病毒，属于腺病毒科禽腺病毒属。根据限制性内切酶图谱分析以及基因测序将其分为5个种(A-E)，又依据血清交叉中和试验分为12个血清型(1-8a,8b-11)。自1987年在巴基斯坦安卡纳地区大规模爆发后，陆续在世界多个国家和地区流行。据报道，FAdV感染一般引起亚临床症状，而急性感染主要出现包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等症状。2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多，但并未出现爆发情况。然而在2015年，我国江苏、山东、河南、江西等多个地区3-4周龄肉鸡爆发以心包膜内积聚大量淡黄色液体以及肝脏出现明显肿胀和黄色坏死灶为主要特征的临床症状。经病毒分离培养鉴定，发现该病主要是由FAdV-4引起的肝炎-心包水综合征(Hydropericardium syndrome，HPS)。该病发病迅速且死亡率高，给国内畜禽养殖行业造成了严重的经济损失，然目前尚无针对FAdV-4的疫苗。而大量文献曾报道以腺病毒为载体开发多价苗，故本发明利用血清4型禽腺病毒作为载体插入外源基因RFP，成功获得可表达RFP的重组FAdV-4病毒，为构建FAdV-4重组多价苗提供了夯实的理论基础。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒以及制备方法，以及可供插入其他病原保护性抗原的位点。本发明的原理和最核心的关键技术是选择合适插入位点以及sgRNA。插入RFP后进行病毒的纯化，获得可以稳定扩增的重组禽腺病毒。。
本发明的目的是这样实现的，一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，其载体为野生型血清4型禽腺病毒SD株。
所述重组血清4型禽腺病毒的外源基因为红色荧光蛋白RFP，在激发光的照射下可以发出红色荧光，可以作为插入位点的荧光标签分子，其序列如SEQ ID NO.1所示；
SEQ ID NO.1为：
AGCGAGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGTACATGGAGGGCACCGTGAACAACCACCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCATGAAGATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGACATCCTGGCTACCAGCTTCATGTACGGCAGCAAAGCCTTCATCAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTTAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGAATCACCACATACGAAGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACACCAGCTTCCAGAACGGCTGCATCATCTACAACGTCAAGATCAACGGGGTGAACTTCCCATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACGCGGCTGGGAGGCCAACACCGAGATGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGAGAGGCCACAGCCAGATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGGGCTACCTGCACTGCTCCTTCAAGACCACATACAGATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCCGGCTTCCACTTCGTGGACCACAGACTGGAAAGAATCAAGGAGGCCGACAAAGAGACCTACGTCGAGCAGCACGAGATGGCTGTGGCCAAGTACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAG。
所述的重组血清4型禽腺病毒，其中RFP插入的位置落在Fiber 1基因的杆部，Fiber 1的序列如SEQ ID NO.2所示；
SEQ ID NO.2为：
ATGTCGGCCCTAATCGCCTCCGCAGCCGATACCGTCTCCGCCAGCGGAAAAAAACGACCCCGCAGGGCCCTATCCGAACCTAGCCGGTACCTTTCGGAGGGCGACGAGCGTCGAAAACCCAAACGCGCGCGACCGGCCACCCGCGCGAATGGTCCCCTCCTCGATCTGGTGTATCCATTTGACTTCAATGCGGGGGGAGGAGGTGGCAGCGGTGGCGGCGGTGGGGGAGGTGGAGGTCAGCAGATCGCGGTCGACCCCGATGGGCCGCTCGAACTCACTGGTGACCTACTGACCCTCAACACCAAAACGCCCATTTACGTCAGCGATCGAGCGGTCAGTCTGCTCATCGATGACAATACTTTGGCCACTAAGCAAGCCAACGGGGCGCTCATGGTCAAAACCGCGGCCCCTCTGAACTCGGGCACTGGTGGAGGCGTCACGCTAGGCTTCGACCCTCGCACCATGGCGCTAGATTCCGTCACCGGGGTGCTCAAAGTGCTCGTCGACTCACAGGGACCTCTACAAGCCGACACGGGAGGCATCACTCTCCAGTTCGACACTCAAGACTTCGTTGTCAACAATGGCGTCTTAGCGCTAGCCTCCTCGGTCGGTCCGACCTATCTGAGCCCCTTTGCGACCTACGAAGTCACGCCCGTCTTGGGAATATCGCAGAGGAACGGCAACGTAAAAAGCAAGGGCTTGCAAAACTGGTCCATAGGCTATTACATCTACATGGTGAGCTCAGCCGGGCTAGTCAACGGACTCATCACTCTGGAGCTAGCCCATGACCTCACAGGCGCGAGCGGAGAAAACAGCCTGACTAGCGGTCTCAACTTTACCTTTGTGCTCAGCCCCATGTACCCGATAGAAACAGAGGTGAATTTGTCCCTCATCGTGCCGCCCACGGTCTCGCCGACCAATCAAAACCACGTGTTTGTGCCCAATAGCAACCAGAGCGACGTGGGCTATCTCGGGCTGCCGCCTCATACCAGGGACAATTGGTACGTGCCCATCGACTCGCCCGGCCTGCGGCTCGTCTCTTTCATGCCCACCGCCACCGGAAACGAGAAATTCGGACAGGGCACGTTGGGATACTGCGCCGCCACCATCCAGAACACGTCCAGCGGAACCACGCCGTCGGATGCGATAGCCTTCACTGTCTCGCTGCCGCAGACCTCCGGCTCCAACTGGTTTGACCAGAACGCGCCCGACACTGTGGTGACGACCGGTCCTATCCCTTTTTCCTATCAGGGTTACGTCTACTCCCCCAACGGGAACAATGCTCCGGGCCCCTAA。
一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒的制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：
(1)利用sgRNA在线设计网站设计针对Fiber 1基因上下游位置的sgRNA，选择分数较高排名靠前的sgRNA，其序列如表1所示；
表1.针对Fiber 1基因上下游位置的sgRNA序列
Figure BDA0002996567150000031
(2)通过overlap-PCR构建带有标签分子RFP的Fiber1供体质粒，overlap-PCR使用的引物序列如表2所示；
表2.构建供体质粒所用的PCR序列
Figure BDA0002996567150000032
Figure BDA0002996567150000041
(3)在转染的前一天铺LMH细胞，次日转染两条sgRNA和供体质粒各2ug，转染6h后换成10％生长液；
(4)转染48h后感染FAdV4，2h后换成1％维持液；
(5)感染FAdV4后每天观察荧光，挑取荧光斑，利用空斑实验和有限稀释法，通过筛选红色荧光的方法进行纯化，获得表达RFP的FAdV4重组病毒。
步骤(3)中，LMH细胞系为鸡肝癌细胞。
本发明公开一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒以及制备方法，利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入外源基因RFP，成功获得了表达RFP的重组FAdV-4病毒，由此可见，RFP的插入位置可以作为插入其他病原的保护性抗原插入位点，为构建FAdV-4重组多价苗提供了夯实的理论基础。
发明内容
图1为本发明的构建流程图；
图2为PCR扩增RFP基因和同源臂的电泳图；
泳道M：super DNA marker；泳道1：左同源臂和F1；泳道2：RFP基因；泳道3：F1和右同源臂；
图3为Overlap PCR构建供体质粒的电泳图；
图4为拯救重组病毒P0代荧光图；
图5为纯化后的重组FAdV4-RFP病毒感染LMH细胞的荧光图；
图6为PCR鉴定纯化前后的重组FAdV4-RFP病毒；
泳道M：super DNA marker；泳道1：野生型FAdV-4病毒；泳道2：未纯化重组FAdV4-RFP病毒；泳道3：纯化后重组FAdV4-RFP病毒；泳道4：阴性对照；
图7为Western Blot鉴定重组FAdV4-RFP病毒的Fiber和RFP的表达泳道1：野生型FAdV-4病毒；泳道2：未纯化重组FAdV4-RFP病毒；泳道3：纯化后重组FAdV4-RFP病毒；泳道4：阴性对照；
图8为PCR鉴定重组FAdV4-RFP病毒的遗传稳定性；
泳道M：super DNA marker；泳道1：p2重组FAdV4-RFP病毒；泳道2：p4重组FAdV4-RFP病毒；泳道3：p6重组FAdV4-RFP病毒；泳道4：p8重组FAdV4-RFP病毒；泳道5：p10重组FAdV4-RFP病毒；泳道6：野生型FAdV-4病毒；泳道7：阴性对照。
具体实施方式
实施例：
1,禽腺病毒分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后用按1:5的比例加入PBS制成悬液；5000r/min离心15min，取上清；加入青霉素和链霉素各1000IU/ml，37℃反应30min；经0.45um微孔滤器过滤后，以0.2ml/胚的剂量，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后96-120小时后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为禽腺病毒后，-20℃保存。
2，禽腺病毒基因组的制备：取禽腺病毒分离毒株病毒上清400uL于1.5mL指形管内，加入0.8uL RNase A涡旋振荡15s，室温静置1min。加入150uL Buffer C-L和ProteinaseK,立即漩涡振荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管置56℃水浴10min。加入350uLBuffer P-D漩涡振荡30s混合均匀，12000×ɡ离心10min。然后将DNA制备管置于2ml离心管中，将离心后的上清转移至制备管中，12000×ɡ离心1min；弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500uL Buffer W1，12000×ɡ离心1min；弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700uL Buffer W2，12000×ɡ离心1min，并以同样的方法，用700uLBuffer W2再洗涤一次；弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，12000×ɡ离心1min，将DNA制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在制管膜中央加30uL去离子水，室温静置1min，12000×ɡ离心1min，洗脱DNA，即血清4型禽腺病毒基因组，置-20℃备用。
3，根据Fiber 1的基因，利用sgRNA在线设计网站(http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp和http://crispr.mit.edu)进行sgRNA序列设计。将设计好的sgRNA分别克隆到lentiCRISPR v2质粒，并通过测序验证构建成功：具体sgRNA序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
表1.针对Fiber 1基因上下游位置的sgRNA序列
Figure BDA0002996567150000061
4,RFP-Fiber 1供体质粒的构建：以pcDNA3.1-RFP质粒为模板扩增RFP基因(如图2)；以禽腺病毒基因组为模板扩增左端同源臂HAL，Fiber 1和右端同源臂HAR(如图2)，同源臂的长度为1kb。电泳后进行胶回收，通过overlap-PCR按照HAL-RFP-F1-HAR的顺序进行组装，最终获得重组病毒的供体质粒(如图3)。构建供体质粒所用的引物序列见表2。
5，重组FAdV4-RFP病毒的拯救：转染前一天在6孔板中铺LMH细胞，每孔120-150w细胞；次日细胞密度生长至80％左右准备转染，2条sgRNA和供体质粒各3ug，利用2uL转染试剂Mirus与1ug质粒2：1的比例进行室温孵育45min，孵育结束后将转染试剂和质粒混合物滴加到预先用Opti-MEM覆盖的细胞中转染，转染6h后换成10％生长液。转染48h后，弃去生长液，用0.1MOI的FAdV-4感染LMH细胞，感染2h后弃去病毒，换成1％维持液。感染病毒后，每天用荧光显微镜观察细胞中是否出现荧光斑(如图4)。
6，重组FAdV4-RFP病毒的纯化及鉴定：将拯救的重组FAdV4-RFP病毒进行挑取荧光斑，利用空斑纯化技术和有限稀释法进行纯化，最终获得纯化的重组FAdV4-RFP病毒(如图5)。通过针对插入位点上下游附近的引物进行PCR鉴定(如图6)，PCR所用的引物见表3。感染鸡肝癌细胞48小时后，收集细胞制备蛋白样品，蛋白电泳后转至NC膜上用Fiber1多克隆抗体作为一抗，然后用HRP标记的二抗检测Fiber1和RFP的表达(如图7)。
表3.PCR扩增鉴定重组病毒的引物
Figure BDA0002996567150000071
7，重组FAdV4-RFP病毒的遗传稳定性评价：将重组FAdV4-RFP在鸡肝癌细胞上连续传代，收获的病毒进行PCR鉴定(如图8)，PCR所用的引物见表3。
SEQ ID NO.1
红色荧光蛋白(RFP)基因序列：
AGCGAGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGTACATGGAGGGCACCGTGAACAACCACCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCATGAAGATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGACATCCTGGCTACCAGCTTCATGTACGGCAGCAAAGCCTTCATCAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTTAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGAATCACCACATACGAAGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACACCAGCTTCCAGAACGGCTGCATCATCTACAACGTCAAGATCAACGGGGTGAACTTCCCATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACGCGGCTGGGAGGCCAACACCGAGATGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGAGAGGCCACAGCCAGATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGGGCTACCTGCACTGCTCCTTCAAGACCACATACAGATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCCGGCTTCCACTTCGTGGACCACAGACTGGAAAGAATCAAGGAGGCCGACAAAGAGACCTACGTCGAGCAGCACGAGATGGCTGTGGCCAAGTACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAG。
SEQ ID NO.2
血清4型禽腺病毒fiber 1基因序列：
ATGTCGGCCCTAATCGCCTCCGCAGCCGATACCGTCTCCGCCAGCGGAAAAAAACGACCCCGCAGGGCCCTATCCGAACCTAGCCGGTACCTTTCGGAGGGCGACGAGCGTCGAAAACCCAAACGCGCGCGACCGGCCACCCGCGCGAATGGTCCCCTCCTCGATCTGGTGTATCCATTTGACTTCAATGCGGGGGGAGGAGGTGGCAGCGGTGGCGGCGGTGGGGGAGGTGGAGGTCAGCAGATCGCGGTCGACCCCGATGGGCCGCTCGAACTCACTGGTGACCTACTGACCCTCAACACCAAAACGCCCATTTACGTCAGCGATCGAGCGGTCAGTCTGCTCATCGATGACAATACTTTGGCCACTAAGCAAGCCAACGGGGCGCTCATGGTCAAAACCGCGGCCCCTCTGAACTCGGGCACTGGTGGAGGCGTCACGCTAGGCTTCGACCCTCGCACCATGGCGCTAGATTCCGTCACCGGGGTGCTCAAAGTGCTCGTCGACTCACAGGGACCTCTACAAGCCGACACGGGAGGCATCACTCTCCAGTTCGACACTCAAGACTTCGTTGTCAACAATGGCGTCTTAGCGCTAGCCTCCTCGGTCGGTCCGACCTATCTGAGCCCCTTTGCGACCTACGAAGTCACGCCCGTCTTGGGAATATCGCAGAGGAACGGCAACGTAAAAAGCAAGGGCTTGCAAAACTGGTCCATAGGCTATTACATCTACATGGTGAGCTCAGCCGGGCTAGTCAACGGACTCATCACTCTGGAGCTAGCCCATGACCTCACAGGCGCGAGCGGAGAAAACAGCCTGACTAGCGGTCTCAACTTTACCTTTGTGCTCAGCCCCATGTACCCGATAGAAACAGAGGTGAATTTGTCCCTCATCGTGCCGCCCACGGTCTCGCCGACCAATCAAAACCACGTGTTTGTGCCCAATAGCAACCAGAGCGACGTGGGCTATCTCGGGCTGCCGCCTCATACCAGGGACAATTGGTACGTGCCCATCGACTCGCCCGGCCTGCGGCTCGTCTCTTTCATGCCCACCGCCACCGGAAACGAGAAATTCGGACAGGGCACGTTGGGATACTGCGCCGCCACCATCCAGAACACGTCCAGCGGAACCACGCCGTCGGATGCGATAGCCTTCACTGTCTCGCTGCCGCAGACCTCCGGCTCCAACTGGTTTGACCAGAACGCGCCCGACACTGTGGTGACGACCGGTCCTATCCCTTTTTCCTATCAGGGTTACGTCTACTCCCCCAACGGGAACAATGCTCCGGGCCCCTAA。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒以及制备方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 690
<212> DNA
<213> 蘑菇珊瑚(Discosoma sp)
<400> 1
agcgagctga ttaaggagaa catgcacatg aagctgtaca tggagggcac cgtgaacaac 60
caccacttca agtgcacatc cgagggcgaa ggcaagccct acgagggcac ccagaccatg 120
aagatcaagg tggtcgaggg cggccctctc cccttcgcct tcgacatcct ggctaccagc 180
ttcatgtacg gcagcaaagc cttcatcaac cacacccagg gcatccccga cttctttaag 240
cagtccttcc ctgagggctt cacatgggag agaatcacca catacgaaga cgggggcgtg 300
ctgaccgcta cccaggacac cagcttccag aacggctgca tcatctacaa cgtcaagatc 360
aacggggtga acttcccatc caacggccct gtgatgcaga agaaaacacg cggctgggag 420
gccaacaccg agatgctgta ccccgctgac ggcggcctga gaggccacag ccagatggcc 480
ctgaagctcg tgggcggggg ctacctgcac tgctccttca agaccacata cagatccaag 540
aaacccgcta agaacctcaa gatgcccggc ttccacttcg tggaccacag actggaaaga 600
atcaaggagg ccgacaaaga gacctacgtc gagcagcacg agatggctgt ggccaagtac 660
tgcgacctcc ctagcaaact ggggcacaag 690
<210> 2
<211> 1296
<212> DNA
<213> 鸡(Chicken)
<400> 2
atgtcggccc taatcgcctc cgcagccgat accgtctccg ccagcggaaa aaaacgaccc 60
cgcagggccc tatccgaacc tagccggtac ctttcggagg gcgacgagcg tcgaaaaccc 120
aaacgcgcgc gaccggccac ccgcgcgaat ggtcccctcc tcgatctggt gtatccattt 180
gacttcaatg cggggggagg aggtggcagc ggtggcggcg gtgggggagg tggaggtcag 240
cagatcgcgg tcgaccccga tgggccgctc gaactcactg gtgacctact gaccctcaac 300
accaaaacgc ccatttacgt cagcgatcga gcggtcagtc tgctcatcga tgacaatact 360
ttggccacta agcaagccaa cggggcgctc atggtcaaaa ccgcggcccc tctgaactcg 420
ggcactggtg gaggcgtcac gctaggcttc gaccctcgca ccatggcgct agattccgtc 480
accggggtgc tcaaagtgct cgtcgactca cagggacctc tacaagccga cacgggaggc 540
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tttgtgctca gccccatgta cccgatagaa acagaggtga atttgtccct catcgtgccg 900
cccacggtct cgccgaccaa tcaaaaccac gtgtttgtgc ccaatagcaa ccagagcgac 960
gtgggctatc tcgggctgcc gcctcatacc agggacaatt ggtacgtgcc catcgactcg 1020
cccggcctgc ggctcgtctc tttcatgccc accgccaccg gaaacgagaa attcggacag 1080
ggcacgttgg gatactgcgc cgccaccatc cagaacacgt ccagcggaac cacgccgtcg 1140
gatgcgatag ccttcactgt ctcgctgccg cagacctccg gctccaactg gtttgaccag 1200
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<212> DNA
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacttgggg gagtagacgt aaccc 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgacggtaa tcggtctcgg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctgtgagtcg acgagcactt 20

Claims (5)

1.一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，其载体为野生型血清4型禽腺病毒SD株。
2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，所述重组血清4型禽腺病毒的外源基因为红色荧光蛋白RFP，在激发光的照射下可以发出红色荧光，可以作为插入位点的荧光标签分子，其序列如SEQ ID NO.1所示；
SEQ ID NO.1为：
AGCGAGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGTACATGGAGGGCACCGTGAACAACCACCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCATGAAGATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGACATCCTGGCTACCAGCTTCATGTACGGCAGCAAAGCCTTCATCAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTTAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGAATCACCACATACGAAGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACACCAGCTTCCAGAACGGCTGCATCATCTACAACGTCAAGATCAACGGGGTGAACTTCCCATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACGCGGCTGGGAGGCCAACACCGAGATGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGAGAGGCCACAGCCAGATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGGGCTACCTGCACTGCTCCTTCAAGACCACATACAGATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCCGGCTTCCACTTCGTGGACCACAGACTGGAAAGAATCAAGGAGGCCGACAAAGAGACCTACGTCGAGCAGCACGAGATGGCTGTGGCCAAGTACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAG。
3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，所述的重组血清4型禽腺病毒，其中RFP插入的位置落在Fiber 1基因的杆部，Fiber 1的序列如SEQ ID NO.2所示；
SEQ ID NO.2为：
ATGTCGGCCCTAATCGCCTCCGCAGCCGATACCGTCTCCGCCAGCGGAAAAAAACGACCCCGCAGGGCCCTATCCGAACCTAGCCGGTACCTTTCGGAGGGCGACGAGCGTCGAAAACCCAAACGCGCGCGACCGGCCACCCGCGCGAATGGTCCCCTCCTCGATCTGGTGTATCCATTTGACTTCAATGCGGGGGGAGGAGGTGGCAGCGGTGGCGGCGGTGGGGGAGGTGGAGGTCAGCAGATCGCGGTCGACCCCGATGGGCCGCTCGAACTCACTGGTGACCTACTGACCCTCAACACCAAAACGCCCATTTACGTCAGCGATCGAGCGGTCAGTCTGCTCATCGATGACAATACTTTGGCCACTAAGCAAGCCAACGGGGCGCTCATGGTCAAAACCGCGGCCCCTCTGAACTCGGGCACTGGTGGAGGCGTCACGCTAGGCTTCGACCCTCGCACCATGGCGCTAGATTCCGTCACCGGGGTGCTCAAAGTGCTCGTCGACTCACAGGGACCTCTACAAGCCGACACGGGAGGCATCACTCTCCAGTTCGACACTCAAGACTTCGTTGTCAACAATGGCGTCTTAGCGCTAGCCTCCTCGGTCGGTCCGACCTATCTGAGCCCCTTTGCGACCTACGAAGTCACGCCCGTCTTGGGAATATCGCAGAGGAACGGCAACGTAAAAAGCAAGGGCTTGCAAAACTGGTCCATAGGCTATTACATCTACATGGTGAGCTCAGCCGGGCTAGTCAACGGACTCATCACTCTGGAGCTAGCCCATGACCTCACAGGCGCGAGCGGAGAAAACAGCCTGACTAGCGGTCTCAACTTTACCTTTGTGCTCAGCCCCATGTACCCGATAGAAACAGAGGTGAATTTGTCCCTCATCGTGCCGCCCACGGTCTCGCCGACCAATCAAAACCACGTGTTTGTGCCCAATAGCAACCAGAGCGACGTGGGCTATCTCGGGCTGCCGCCTCATACCAGGGACAATTGGTACGTGCCCATCGACTCGCCCGGCCTGCGGCTCGTCTCTTTCATGCCCACCGCCACCGGAAACGAGAAATTCGGACAGGGCACGTTGGGATACTGCGCCGCCACCATCCAGAACACGTCCAGCGGAACCACGCCGTCGGATGCGATAGCCTTCACTGTCTCGCTGCCGCAGACCTCCGGCTCCAACTGGTTTGACCAGAACGCGCCCGACACTGTGGTGACGACCGGTCCTATCCCTTTTTCCTATCAGGGTTACGTCTACTCCCCCAACGGGAACAATGCTCCGGGCCCCTAA。
4.如权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒的制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：
(1)利用sgRNA在线设计网站设计针对Fiber 1基因上下游位置的sgRNA，选择分数较高排名靠前的sgRNA，其序列如表1所示；
表1.针对Fiber 1基因上下游位置的sgRNA序列
Figure FDA0002996567140000021
Figure FDA0002996567140000031
(2)通过overlap-PCR构建带有标签分子RFP的Fiber1供体质粒，overlap-PCR使用的引物序列如表2所示；
表2.构建供体质粒所用的PCR序列
Figure FDA0002996567140000032
(3)在转染的前一天铺LMH细胞，次日转染两条sgRNA和供体质粒各2ug，转染6h后换成10％生长液；
(4)转染48h后感染FAdV4，2h后换成1％维持液；
(5)感染FAdV4后每天观察荧光，挑取荧光斑，利用空斑实验和有限稀释法，通过筛选红色荧光的方法进行纯化，获得表达RFP的FAdV4重组病毒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，LMH细胞系为鸡肝癌细胞。
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