CN112877303A - 一种EGFP与Fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法 - Google Patents

一种EGFP与Fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种EGFP与Fiber‑2融合表达的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，本发明的原理和最核心的关键技术是选择合适插入位点以及sgRNA。插入RFP后进行病毒的纯化，获得可以稳定扩增的重组禽腺病毒。利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入外源基因RFP，成功获得了表达RFP的重组FAdV‑4病毒，由此可见，RFP的插入位置可以作为插入其他病原的保护性抗原插入位点，为构建FAdV‑4重组多价苗提供了夯实的理论基础。

Description

一种EGFP与Fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒及其制 备方法
技术领域
本发明涉及一种EGFP与Fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型。虽然在世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV 感染在国内多个省份鸡群爆发。目前FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给国内养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，目前高致病性4型FAdV在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无FAdV-4的疫苗。腺病毒作为开发多价苗的病毒载体在许多文献中也有报道，因此，本发明利用血清4型禽腺病毒作为载体插入外源基因EGFP，成功获得了表达EGFP的重组FAdV4病毒，在体内及体外实验结果均显示，FAdV4-EGFP重组病毒毒力显著降低，由此可见，EGFP的插入位置可以作为插入其他病原的保护性抗原插入位点，从而构建多价苗。本发明为构建FAdV-4重组多价苗提供了坚实的理论基础。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种EGFP与Fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，可供插入其他病原保护性抗原的位点。本发明的原理和最核心的关键技术是选择合适插入位点以及sgRNA。插入RFP 后进行病毒的纯化，获得可以稳定扩增的重组禽腺病毒。。
本发明的目的是这样实现的，一种EGFP与Fiber-2融合表达的重组血清 4型禽腺病毒，其特征在于，其载体为野生型血清4型禽腺病毒SD株；重组血清4型禽腺病毒的外源基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP，在激发光的照射下可以发出绿色荧光，可以作为插入位点的荧光标签分子，其序列如SEQ ID NO.1 所示；
SEQ ID NO.1为：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCG ACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACC CTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTA CGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGC CCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGG CAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGC AGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCC GACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAG CACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGA CCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA；
所述重组血清4型禽腺病毒，其中EGFP插入的位置落在Fiber 2基因的前面，最终使得EGFP与F2蛋白融合表达，Fiber 2的序列如SEQ ID NO.2所示；
SEQ ID NO.2为：
ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACATTCCGAAAACGGGAAGCCCGAGACCGAAGCGGGACCTT CCCCGGCTCCAATCAAGCGCGCCAAACGCATGGTGAGAGCATCCCAGCTTGACCTGGTTTATCCTTTC GATTACGTGGCCGACCCCGTCGGAGGGCTCAACCCGCCTTTTTTGGGAGGCTCAGGACCCCTAGTGGA CCAGGGCGGACAGCTTACGCTCAACGTCACCGATCCCATCATCATCAAGAACAGATCGGTGGACTTGG CCCACGACCCCAGTCTCGATGTCAACGCCCAAGGTCAACTGGCGGTGGCCGTTGACCCCGAAGGGGCC CTGGACATCACCCCCGATGGACTGGACGTCAAGGTCGACGGAGTGACCGTAATGGTCAACGATGACTG GGAACTGGCCGTAAAAGTCGACCCGTCCGGCGGATTGGATtCCACCGCGGGTGGACTGGGGGTCAGCG TGGACGACACCTTGCTCGTGGATCAGGGAGAACTGGGCGTACACCTCAACCAACAAGGACCCATCACT GCCGATAGCAGTGGTATCGACCTCGAGATCAATCCTAACATGTTCACGGTCAACACCTCGACCGGAAG CGGAGTGCTGGAACTCAACCTAAAAGCGCAGGGAGGCATCCAAGCCGACAGTTCGGGAGTGGGCGTTT CCGTGGATGAAAGCCTACAGATTGTCAACAACACTCTGGAAGTGAAACCGGATCCCAGCGGACCGCTT ACGGTCTCCGCCAATGGCCTAGGGCTGAAGTACGACACTAATACCCTAGCGGTGACCGCGGGCGCTTT AACCGTGGTCGGAGGGGGGAGCGTCTCCACACCCATCGCTACTTTTGTCTCGGGAAGTCCCAGCCTCA ACACCTACAATGCCACGACCGTCAATTCCAGCGCGAACGCCTTCTCTTGCGCCTACTACCTTCAACAG TGGAACATACAGGGGCTCCTTGTTACCTCCCTCTACTTGAAATTGGACAGCGCCACCATGGGGAATCG CCCTGGGGACCTCAACTCCGCCAATGCCAAATGGTTCACCTTTTGGGTGTCCGCCTATCTCCAGCAAT GCAACCCCTCCGGGATTCAAGCGGGAACGGTCAGCCCCTCCACCGCCACCCTCACGGACTTTGAACCC ATGGCCAATAGGAGCGTGACCAGCCCATGGACGTACTCGGCCAATGGATACTATGAACCATCCATCGG GGAATTCCAAGTGTTCAGCCCGGTGGTAACAGGTGCCTGGAACCCGGGAAACATAGGGATCCGCGTCC TCCCCGTGCCGGTTTCGGCCTCCGGAGAGCGATACACCCTTCTATGCTATAGTCTGCAGTGCACGAAC GCGAGCATTTTTAATCCAAACAACAGCGGAACCATGATCGTGGGACCCGTGCTCTACAGCTGTCCAGC GGCCTCCCTCCCGTAA。
一种EGFP与Fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒的制备方法，制备方法包括如下步骤：
(1)利用sgRNA在线设计网站设计针对Fiber 2基因上下游位置的sgRNA，选择分数较高排名靠前的sgRNA，其序列如表1所示；
(2)通过overlap-PCR构建带有标签分子EGFP的Fiber2供体质粒， overlap-PCR使用的引物序列如表2所示；
(3)在转染的前一天铺LMH细胞，次日转染两条sgRNA和供体质粒各2ug，转染6h后换成10％生长液；
(4)转染48h后感染FAdV4，2h后换成1％维持液；
(5)感染FAdV4后每天观察荧光，挑取荧光斑，利用空斑实验和有限稀释法，通过筛选绿色荧光的方法进行纯化，获得表达EGFP的FAdV4重组病毒。
所述LMH细胞系为鸡肝癌细胞。
通过本发明，本发明所述的一种EGFP与Fiber-2融合表达的重组血清4 型禽腺病毒及其制备方法，利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入外源基因EGFP，成功获得了表达EGFP的重组FAdV4病毒，在体内及体外实验结果均显示，FAdV4-EGFP重组病毒毒力显著降低，由此可见，EGFP的插入位置可以作为插入其他病原的保护性抗原插入位点，为构建FAdV-4重组多价苗提供了坚实的理论依据。
附图说明
图1为本发明的构建流程图。
图2为PCR扩增EGFP基因和同源臂的电泳图；
泳道M：super DNA marker；泳道1：右同源臂和F2；泳道2：左同源臂；泳道3：EGFP基因。
图3为Overlap PCR构建供体质粒的电泳图。
图4为拯救重组病毒P0代荧光图。
图5为纯化后的重组FAdV4-EGFP病毒感染LMH细胞的荧光图。
图6为PCR鉴定纯化前后的重组FAdV4-EGFP病毒；
泳道M：super DNA marker；泳道1：未纯化的重组FAdV4-EGFP病毒；泳道2：纯化后重组FAdV4-EGFP病毒；泳道3：野生型FAdV-4病毒基因组。
图7为FAdV4-EGFP重组病毒生长曲线图。
图8为SPF鸡群感染FAdV4-EGFP重组病毒和FAdV-4病毒后的生存曲线图。
图9为SPF鸡群感染病毒后的排毒情况。
图10为存活的鸡群攻毒FAdV-4后的生存曲线图。
具体实施方式
实施例：
1,禽腺病毒分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后用按1:5 的比例加入PBS制成悬液；5000r/min离心15min，取上清；加入青霉素和链霉素各1000IU/ml，37℃反应30min；经0.45um微孔滤器过滤后，以0.2ml/胚的剂量，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后96-120小时后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为禽腺病毒后，－20℃保存。
2，禽腺病毒基因组的制备：取禽腺病毒分离毒株病毒上清400uL于1.5mL 指形管内，加入400uL细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20mmol/L EDTA pH 8.0，2％SDS和蛋白酶K)，充分混匀后放置56℃水浴锅作用4小时；加入 400uLTris平衡酚，充分混匀后10000r/min离心10分钟，取上清于另一1.5mL 指形管；加入400uL酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后10000r/min离心5分钟，取上清于另一1.5mL指形管；加入800uL无水乙醇，颠倒混匀后放入-20℃孵育 30分钟，12000r/min离心15分钟，弃尽上清；室温自然干燥后向沉淀加入30uL 灭菌超纯水和2uLRNA酶，充分溶解后，即得血清4型禽腺病毒基因组，置-20℃备用。
3，根据Fiber 2的基因，利用sgRNA在线设计网站(http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp和http://crispr.mit.edu)进行 sgRNA序列设计。将设计好的sgRNA分别克隆到lentiCRISPR v2质粒，并通过测序验证构建成功：具体sgRNA序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
表1.针对Fiber 2基因上下游位置的sgRNA序列
Figure BDA0002996722850000051
4,EGFP-Fiber 2供体质粒的构建：以pcDNA3.1-EGFP质粒为模板扩增EGFP 基因(如图1)；以禽腺病毒基因组为模板扩增左端同源臂HR1，Fiber 2和右端同源臂HR2(如图1)，同源臂的长度为1kb。电泳后进行胶回收，通过 overlap-PCR按照HR1-EGFP-F2-HR2的顺序进行组装，最终获得重组病毒的供体质粒(如图2)。构建供体质粒所用的引物序列见表2。
表2.构建供体质粒所用的PCR序列
Figure BDA0002996722850000052
5，重组FAdV4-EGFP病毒的拯救：转染前一天在6孔板中铺LMH细胞，每孔120-150w细胞；次日细胞密度生长至80％左右准备转染，2条sgRNA和供体质粒各2ug，利用2uL转染试剂Mirus与1ug质粒2：1的比例进行室温孵育45min，孵育结束后将转染试剂和质粒混合物滴加到预先用Opti-MEM覆盖的细胞中转染，转染6h后换成10％生长液。转染48h后，弃去生长液，用0.1MOI 的FAdV-4感染LMH细胞，感染2h后弃去病毒，换成1％维持液。感染病毒后，每天用荧光显微镜观察细胞中是否出现荧光斑(如图4)。
6，重组FAdV4-EGFP病毒的纯化及鉴定：将拯救的重组FAdV4-EGFP病毒进行挑取荧光斑，利用空斑纯化技术和有限稀释法进行纯化，最终获得纯化的重组FAdV4-EGFP病毒(如图5)，通过针对插入位点上下游附近的引物进行PCR鉴定(如图6)，PCR所用的引物见表3。
表3.PCR扩增鉴定重组病毒的引物
Figure BDA0002996722850000061
7,重组FAdV4-EGFP病毒体外生长曲线的绘制：在铺有LMH细胞的6孔板中分别接种拯救的重组FAdV4-EGFP和野生型FAdV-4，接种量为0.1MOI，接种后分别在24h、48h、72h、96h和120h时间点收取病毒上清，之后进行TCID50 测定上清中的病毒滴度(如图7)。结果显示重组病毒FAdV4-EGFP与FAdV-4相比，两个病毒的复制曲线相似，但是重组病毒复制速度较慢，且最高滴度明显比FAdV-4低。
8，重组FAdV4-EGFP病毒体内致病性的评估：将120只2周龄的SPF鸡随机分为3组，即FAdV4-EGFP组、FAdV-4组和对照组，之后分别用106TCID50剂量的重组病毒FAdV4-EGFP和FAdV-4接种鸡群，对照组注射相同体积的1％细胞维持液。感染病毒后，每天观察鸡群的生长状况，并记录发病及死亡情况。14d 后绘制成存活曲线(如图8)，每天的观察中发现，感染野生型FAdV-4病毒的鸡群，在感染后第一天便出现嗜睡、精神沉郁、翅膀下垂等症状；感染后的第二天便观察到有少量SPF鸡死亡，鸡群发病死亡主要集中在感染后的第三天，并且在感染后的第四天全部死亡。相比之下，FAdV4-EGFP病毒感染的鸡群和对照鸡群则全部存活。在感染病毒后的第二、三、四天，分别剖杀每组鸡群格3只，解剖发现，感染野生型FAdV-4的鸡群出现典型的肝炎-心包积液综合症；而感染FAdV4-EGFP的鸡群和对照组鸡群则完全没有症状。对解剖的鸡群进行病理学观察，发现感染FAdV-4的鸡群肝脏出现典型的核内包涵体；而感染FAdV4-EGFP 的鸡群和对照组鸡群肝脏则完全正常。对3组鸡群进行扛拭子检测(如图9)，发现感染FAdV-4病毒的鸡群大量排毒，而感染FAdV4-EGFP病毒的鸡群只有在感染后的第二天检测到少量的排毒，其他时间点全部没有检测到排毒。以上结果说明，本发明中构建的重组病毒FAdV4-EGFP毒力相比于野生型FAdV-4被明显致弱。
9，FAdV4-EGFP重组病毒攻毒保护试验：感染FAdV4-EGFP重组病毒的鸡群和对照组鸡群在21天后仍然全部存活，随即对存活的鸡群进行攻毒保护实验，两组鸡群均攻毒106TCID50剂量的FAdV-4。攻毒后，每天观察鸡群的生长状况，并记录发病及死亡情况。14d后绘制成存活曲线(如图10)，结果显示，对照组鸡群在攻毒FAdV-4后，6d内死亡率达到80％；相比之下，感染FAdV4-EGFP重组病毒的鸡群在攻毒后死亡率为0。说明本发明构建的FAdV4-EGFP重组病毒可以为鸡群提供完全保护，提示插入EGFP的位置可以作为外源基因的插入位点。
SEQ ID NO.1
增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCT GGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGC GAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTG CACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGA CCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCAC GACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCAT CTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCG AGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAG GAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCC ACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAAC TTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCA CTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACA ACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAA GCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCT CGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
SEQ ID NO.2
血清4型禽腺病毒fiber 2基因序列：
ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACATTCCGAAAACGGGAAGCCCGA GACCGAAGCGGGACCTTCCCCGGCTCCAATCAAGCGCGCCAAACGCATGG TGAGAGCATCCCAGCTTGACCTGGTTTATCCTTTCGATTACGTGGCCGACC CCGTCGGAGGGCTCAACCCGCCTTTTTTGGGAGGCTCAGGACCCCTAGTG GACCAGGGCGGACAGCTTACGCTCAACGTCACCGATCCCATCATCATCAA GAACAGATCGGTGGACTTGGCCCACGACCCCAGTCTCGATGTCAACGCCC AAGGTCAACTGGCGGTGGCCGTTGACCCCGAAGGGGCCCTGGACATCACC CCCGATGGACTGGACGTCAAGGTCGACGGAGTGACCGTAATGGTCAACGA TGACTGGGAACTGGCCGTAAAAGTCGACCCGTCCGGCGGATTGGATtCCAC CGCGGGTGGACTGGGGGTCAGCGTGGACGACACCTTGCTCGTGGATCAGG GAGAACTGGGCGTACACCTCAACCAACAAGGACCCATCACTGCCGATAGC AGTGGTATCGACCTCGAGATCAATCCTAACATGTTCACGGTCAACACCTCG ACCGGAAGCGGAGTGCTGGAACTCAACCTAAAAGCGCAGGGAGGCATCC AAGCCGACAGTTCGGGAGTGGGCGTTTCCGTGGATGAAAGCCTACAGATT GTCAACAACACTCTGGAAGTGAAACCGGATCCCAGCGGACCGCTTACGGT CTCCGCCAATGGCCTAGGGCTGAAGTACGACACTAATACCCTAGCGGTGAC CGCGGGCGCTTTAACCGTGGTCGGAGGGGGGAGCGTCTCCACACCCATCG CTACTTTTGTCTCGGGAAGTCCCAGCCTCAACACCTACAATGCCACGACCG TCAATTCCAGCGCGAACGCCTTCTCTTGCGCCTACTACCTTCAACAGTGGA ACATACAGGGGCTCCTTGTTACCTCCCTCTACTTGAAATTGGACAGCGCCA CCATGGGGAATCGCCCTGGGGACCTCAACTCCGCCAATGCCAAATGGTTC ACCTTTTGGGTGTCCGCCTATCTCCAGCAATGCAACCCCTCCGGGATTCAA GCGGGAACGGTCAGCCCCTCCACCGCCACCCTCACGGACTTTGAACCCAT GGCCAATAGGAGCGTGACCAGCCCATGGACGTACTCGGCCAATGGATACTA TGAACCATCCATCGGGGAATTCCAAGTGTTCAGCCCGGTGGTAACAGGTG CCTGGAACCCGGGAAACATAGGGATCCGCGTCCTCCCCGTGCCGGTTTCG GCCTCCGGAGAGCGATACACCCTTCTATGCTATAGTCTGCAGTGCACGAAC GCGAGCATTTTTAATCCAAACAACAGCGGAACCATGATCGTGGGACCCGT GCTCTACAGCTGTCCAGCGGCCTCCCTCCCGTAA
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种EGFP与Fiber-2融合表达的的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> 维多利亚水母(Aequorea victoria)
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 2
<211> 1440
<212> DNA
<213> 鸡(Chicken)
<400> 2
atgctccggg cccctaaaag aagacattcc gaaaacggga agcccgagac cgaagcggga 60
ccttccccgg ctccaatcaa gcgcgccaaa cgcatggtga gagcatccca gcttgacctg 120
gtttatcctt tcgattacgt ggccgacccc gtcggagggc tcaacccgcc ttttttggga 180
ggctcaggac ccctagtgga ccagggcgga cagcttacgc tcaacgtcac cgatcccatc 240
atcatcaaga acagatcggt ggacttggcc cacgacccca gtctcgatgt caacgcccaa 300
ggtcaactgg cggtggccgt tgaccccgaa ggggccctgg acatcacccc cgatggactg 360
gacgtcaagg tcgacggagt gaccgtaatg gtcaacgatg actgggaact ggccgtaaaa 420
gtcgacccgt ccggcggatt ggattccacc gcgggtggac tgggggtcag cgtggacgac 480
accttgctcg tggatcaggg agaactgggc gtacacctca accaacaagg acccatcact 540
gccgatagca gtggtatcga cctcgagatc aatcctaaca tgttcacggt caacacctcg 600
accggaagcg gagtgctgga actcaaccta aaagcgcagg gaggcatcca agccgacagt 660
tcgggagtgg gcgtttccgt ggatgaaagc ctacagattg tcaacaacac tctggaagtg 720
aaaccggatc ccagcggacc gcttacggtc tccgccaatg gcctagggct gaagtacgac 780
actaataccc tagcggtgac cgcgggcgct ttaaccgtgg tcggaggggg gagcgtctcc 840
acacccatcg ctacttttgt ctcgggaagt cccagcctca acacctacaa tgccacgacc 900
gtcaattcca gcgcgaacgc cttctcttgc gcctactacc ttcaacagtg gaacatacag 960
gggctccttg ttacctccct ctacttgaaa ttggacagcg ccaccatggg gaatcgccct 1020
ggggacctca actccgccaa tgccaaatgg ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag 1080
caatgcaacc cctccgggat tcaagcggga acggtcagcc cctccaccgc caccctcacg 1140
gactttgaac ccatggccaa taggagcgtg accagcccat ggacgtactc ggccaatgga 1200
tactatgaac catccatcgg ggaattccaa gtgttcagcc cggtggtaac aggtgcctgg 1260
aacccgggaa acatagggat ccgcgtcctc cccgtgccgg tttcggcctc cggagagcga 1320
tacacccttc tatgctatag tctgcagtgc acgaacgcga gcatttttaa tccaaacaac 1380
agcggaacca tgatcgtggg acccgtgctc tacagctgtc cagcggcctc cctcccgtaa 1440
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccgggttt atcctttcga ttacg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaccgtaat cgaaaggata aaccc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccgtccta tccctttttc ctatc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacgatagg aaaaagggat aggac 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccggctta cgggagggag gccgc 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaacgcggcc tccctcccgt aagcc 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caccgcgtgc tctacagctg tccag 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaacctggac agctgtagag cacgc 25
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtctactccc ccaacgggaa caatggtgag caagggcgag gagctgttc 49
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cttcttttag gggcccggag cttgtacagc tcgtccatg 39
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggtgacctac tgaccctcaa cacc 24
<210> 14
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaacagctcc tcgcccttgc tcaccattgt tcccgttggg ggagtagac 49
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
catggacgag ctgtacaagc tccgggcccc taaaagaag 39
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctactttacc tgcatttcgt cag 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctccaactgg tttgaccaga acg 23
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gacggggtcg gccacgtaat cgaaagg 27

Claims (3)

1.一种EGFP与Fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，其载体为野生型血清4型禽腺病毒SD株；重组血清4型禽腺病毒的外源基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP，在激发光的照射下可以发出绿色荧光，可以作为插入位点的荧光标签分子，其序列如SEQID NO.1所示：
SEQ ID NO.1为：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA；
所述重组血清4型禽腺病毒，其中EGFP插入的位置落在Fiber2基因的前面，最终使得EGFP与F2蛋白融合表达，Fiber2的序列如SEQ ID NO.2所示；
SEQ ID NO.2为：
ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACATTCCGAAAACGGGAAGCCCGAGACCGAAGCGGGACCTTCCCCGGCTCCAATCAAGCGCGCCAAACGCATGGTGAGAGCATCCCAGCTTGACCTGGTTTATCCTTTCGATTACGTGGCCGACCCCGTCGGAGGGCTCAACCCGCCTTTTTTGGGAGGCTCAGGACCCCTAGTGGACCAGGGCGGACAGCTTACGCTCAACGTCACCGATCCCATCATCATCAAGAACAGATCGGTGGACTTGGCCCACGACCCCAGTCTCGATGTCAACGCCCAAGGTCAACTGGCGGTGGCCGTTGACCCCGAAGGGGCCCTGGACATCACCCCCGATGGACTGGACGTCAAGGTCGACGGAGTGACCGTAATGGTCAACGATGACTGGGAACTGGCCGTAAAAGTCGACCCGTCCGGCGGATTGGATtCCACCGCGGGTGGACTGGGGGTCAGCGTGGACGACACCTTGCTCGTGGATCAGGGAGAACTGGGCGTACACCTCAACCAACAAGGACCCATCACTGCCGATAGCAGTGGTATCGACCTCGAGATCAATCCTAACATGTTCACGGTCAACACCTCGACCGGAAGCGGAGTGCTGGAACTCAACCTAAAAGCGCAGGGAGGCATCCAAGCCGACAGTTCGGGAGTGGGCGTTTCCGTGGATGAAAGCCTACAGATTGTCAACAACACTCTGGAAGTGAAACCGGATCCCAGCGGACCGCTT ACGGTCTCCGCCAATGGCCTAGGGCTGAAGTACGACACTAATACCCTAGCGGTGACCGCGGGCGCTTTAACCGTGGTCGGAGGGGGGAGCGTCTCCACACCCATCGCTACTTTTGTCTCGGGAAGTCCCAGCCTCAACACCTACAATGCCACGACCGTCAATTCCAGCGCGAACGCCTTCTCTTGCGCCTACTACCTTCAACAGTGGAACATACAGGGGCTCCTTGTTACCTCCCTCTACTTGAAATTGGACAGCGCCACCATGGGGAATCGCCCTGGGGACCTCAACTCCGCCAATGCCAAATGGTTCACCTTTTGGGTGTCCGCCTATCTCCAGCAATGCAACCCCTCCGGGATTCAAGCGGGAACGGTCAGCCCCTCCACCGCCACCCTCACGGACTTTGAACCCATGGCCAATAGGAGCGTGACCAGCCCATGGACGTACTCGGCCAATGGATACTATGAACCATCCATCGGGGAATTCCAAGTGTTCAGCCCGGTGGTAACAGGTGCCTGGAACCCGGGAAACATAGGGATCCGCGTCCTCCCCGTGCCGGTTTCGGCCTCCGGAGAGCGATACACCCTTCTATGCTATAGTCTGCAGTGCACGAACGCGAGCATTTTTAATCCAAACAACAGCGGAACCATGATCGTGGGACCCGTGCTCTACAGCTGTCCAGCGGCCTCCCTCCCGTAA。
2.如权利要求1所述的一种EGFP与Fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒的制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：
(1)利用sgRNA在线设计网站设计针对Fiber 2基因上下游位置的sgRNA，选择分数较高排名靠前的sgRNA，其序列如表1所示；
表1.针对Fiber 2基因上下游位置的sgRNA序列
Figure FDA0002996722840000021
(2)通过overlap-PCR构建带有标签分子EGFP的Fiber2供体质粒，overlap-PCR使用的引物序列如表2所示；
表2.构建供体质粒所用的PCR序列
Figure FDA0002996722840000022
Figure FDA0002996722840000031
(3)在转染的前一天铺LMH细胞，次日转染两条sgRNA和供体质粒各2ug，转染6h后换成10％生长液；
(4)转染48h后感染FAdV4，2h后换成1％维持液；
(5)感染FAdV4后每天观察荧光，挑取荧光斑，利用空斑实验和有限稀释法，通过筛选绿色荧光的方法进行纯化，获得表达EGFP的FAdV4重组病毒。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述LMH细胞系为鸡肝癌细胞。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113917139A (zh) * 2021-10-18 2022-01-11 扬州大学 基于重组荧光病毒的血清4型禽腺病毒中和抗体的检测方法
CN116286926A (zh) * 2023-02-28 2023-06-23 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种双荧光报告质粒的构建及其在检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QUAN XIE等: "《A novel fiber-2-edited live attenuated vaccine candidate against the highly pathogenic serotype 4 fowl adenovirus》", 《VETERINARY RESEARCH》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113917139A (zh) * 2021-10-18 2022-01-11 扬州大学 基于重组荧光病毒的血清4型禽腺病毒中和抗体的检测方法
CN116286926A (zh) * 2023-02-28 2023-06-23 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种双荧光报告质粒的构建及其在检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平中的应用
CN116286926B (zh) * 2023-02-28 2023-12-29 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种双荧光报告质粒的构建及其在检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平中的应用

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