WO2022163902A1 - 인체 감염 사스코로나 바이러스 예방 및 감염 증상 완화용 백신 조성물 - Google Patents

인체 감염 사스코로나 바이러스 예방 및 감염 증상 완화용 백신 조성물 Download PDF

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WO2022163902A1
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disease virus
sars
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장현
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안용희
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리벤텍 주식회사
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    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof

Definitions

  • the present invention relates to a vaccine composition for preventing human infection of SARS coronavirus (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2; COVID-19) and alleviating symptoms of infection.
  • SARS coronavirus severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2; COVID-19
  • Acute Respiratory Syndrome is an infectious disease caused by Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection.
  • SARS-CoV-2 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2
  • SARS-CoV-2 virus is a beta-coronavirus that infects humans, belongs to the coronaviridae, has a single-stranded RNA genome, and has a total genome size of 30,473 bp, which is not small All genes are ORF1a to ORF10 up to 10 genes. Viral genes are divided into non-structural genes and archaic genes, and the S gene is known as a spike glycoprotein that binds to the ACE2 receptor in the human respiratory system. The SARS-CoV-2 virus was first detected as a type A virus, but it was later found to be prevalent in North America and Europe. In the case of type B, it is mainly detected in East Asia. is being detected.
  • SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus
  • SARS-CoV-2 a beta-coronavirus belonging to the same family as SARS-CoV (Severe acute respiratory syndrome coronavirus). It was found to have an RNA genome.
  • the genome of SARS-CoV-2 consists of 10 genes, and 2/3 of the entire genome is ORF1ab, which is a non-structural protein (NSP) gene.
  • the remaining 3' end gene has four structural protein genes: spike (S), envelope (E), matrix (M) and nucleocapsid (N) protein genes.
  • S spike
  • E envelope
  • M matrix
  • N nucleocapsid
  • the spike protein on the virus surface and the ACE2 (angiotensin converting enzyme2) receptor on the host cell surface bind, and then the TMPRSS2 protein is additionally bound to cut the middle part of the spike protein and cause the fusion of the cell membrane and the virus membrane.
  • ACE2 angiotensin converting enzyme2
  • SARS-CoV-2 (COVID-19) is an important time when civilization is put to the test whether it is possible to control the disease through a vaccine.
  • Viral vector vaccines induce an immune response by expressing a protein that transfers antigenic genes to viruses that are not pathogenic to the human body, or express an antigenic protein on the surface of the virus and use it as a vaccine in a live form. It is sometimes used as a vaccine. Although it takes time to genetically engineer a virus and create a recombinant virus, it is easy to express different antigens in a successful viral vector, which will be a very important technique for preventing new infectious diseases that may occur in the future.
  • This study aims to develop a recombinant virus as a vaccine by inserting it into NDV cDNA using some domain genes of the surface-expressed protein of NDV virus that do not infect mammals and the receptor binding domain (RBD) gene of SARS-CoV-2. It is a study and relates to the development of a platform that can express various antigens in these cDNAs.
  • An object of the present invention is to provide an LVP-K1 vector for inserting a foreign gene comprising Newcastle Disease Virus cDNA and a transgene cassette.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant Newcastle disease virus comprising the LVP-K1 vector for insertion of the foreign gene and the receptor binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 virus spike protein.
  • Another object of the present invention is to provide a vaccine composition for preventing or treating SARS-CoV-2 virus comprising the recombinant Newcastle disease virus or an antigen purified therefrom.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating SARS-CoV-2 virus infection.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a recombinant Newcastle disease virus.
  • Another object of the present invention is to provide a method for evaluating an immune response in an animal.
  • the present invention includes a Newcastle Disease Virus cDNA and a transgene cassette comprising genes encoding NP, P, M, F, HN and L proteins, and ,
  • the transgene cassette is an IGS sequence (Gene end (GE), Intergenic sequence (IG), Gene start (GS)) and MCS (multicloning site) LVP-K1 vector for inserting a foreign gene, which will consist of provides
  • the present invention provides a recombinant Newcastle disease virus comprising the gene encoding the receptor binding domain (RBD) of the LVP-K1 vector for insertion of the foreign gene and the SARS-CoV-2 virus spike protein.
  • RBD receptor binding domain
  • the present invention provides a vaccine composition for preventing or treating SARS-CoV-2 virus comprising the recombinant Newcastle disease virus or antigen purified therefrom.
  • the present invention provides a method of preventing or treating a SARS-CoV-2 virus infection comprising administering the vaccine composition to an individual.
  • the present invention comprises the steps of inoculating the recombinant Newcastle disease virus into a host cell line; culturing the host cell line; and obtaining a recombinant Newcastle disease virus from the culture of the host cell line.
  • the present invention provides a method for evaluating an immune response in an animal, comprising administering the recombinant Newcastle disease virus to the animal.
  • a vaccine composition comprising a recombinant Newcastle disease virus or antigen purified therefrom expressing the SARS-CoV-2 RBD protein of the present invention on the surface induces an immune response that can fight SARS-CoV-2 (COVID-19) infection Therefore, it can be usefully used as a vaccine for the prevention and treatment of SARS-CoV-2 virus infection.
  • FIG. 1 is a diagram showing a gene schematic diagram, vector map and PCR product of the LVP-K1 vector of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a schematic diagram of the gene of LVP-K1-RBD19 of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of RBD protein surface expression analysis of LVP-K1-RBD19 of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of time-dependent virus titer analysis after inactivation of LVP-K1-RBD19 of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of the RBD protein-specific antibody production analysis of LVP-K1-RBD19 of the present invention.
  • FIG. 6 is a view showing the stability evaluation results of LVP-K1-RBD19 of the present invention.
  • the present invention includes a Newcastle Disease Virus cDNA and a transgene cassette comprising genes encoding NP, P, M, F, HN and L proteins.
  • An LVP-K1 vector for inserting a foreign gene is provided.
  • the transgene cassette may include an IGS sequence (Gene end (GE), Intergenic sequence (IG), Gene start (GS)) and a multicloning site (MCS).
  • IGS sequence Gene end (GE), Intergenic sequence (IG), Gene start (GS)
  • MCS multicloning site
  • NDV Newcastlele Disease Virus
  • the term “Newcastle Disease Virus (NDV)” used in the present invention belongs to a paramyxovirus having a (-)sense RNA genome of about 15 kb and is known as a safe virus for mammals without infecting humans.
  • NDV genomic RNA has an extragenic leader sequence of about 30 bases and a tail sequence of about 50 bases. Two sequences at both ends are known to regulate the transcription and replication of viral genes and the encapsidation of newly synthesized RNA genomes into viral particles.
  • the NDV gene composition consists of six genes including NP, P, M, F, HN and L between both terminal leader and tail genes, and each gene is composed of nucleoprotein (NP), phosphoprotein (P), matrix protein ( M), fusion protein (F), hemagglutinin-neuraminidase protein (HN), and large protein (L) are encoded.
  • NP nucleoprotein
  • P phosphoprotein
  • M matrix protein
  • F fusion protein
  • HN hemagglutinin-neuraminidase protein
  • L large protein
  • IGS Gene end (GE), Intergenic sequence (IG), Gene start (GS) sequences exist between each gene, and each gene undergoes a transcriptional process in the initial stage of host cell infection to the endoplasmic reticulum of the host cell. (endoplasmic reticulum, ER) to synthesize transport proteins. Afterwards, when the amount of M protein synthesis rises above a certain level, a (+)sense RNA genome is synthesized and a (-)sense RNA genome is synthesized using this as a template. The finished virus particles are expelled out of the cell.
  • GE Gene end
  • IG Intergenic sequence
  • GS Gene start
  • the newcastle disease virus has a foreign gene introduction capacity of up to 6 kb, and the foreign gene introduction has been mainly made between the P and M genes and between the HN and L genes.
  • the foreign gene introduction has been mainly made between the P and M genes and between the HN and L genes.
  • all of the foreign genes can be introduced between the six genes, but it is known that each position has an effect on mRNA expression, protein expression, and, in severe cases, virus proliferation. is the state There is a GE-IG-GS gene between each gene.
  • IG gene there are 1 or 2 nucleotides between NP-P, P-M, and M-F, 35 between F-HN and 47 between HN-L. It is made up of nucleotides.
  • the (-)sense RNA genome synthesizes the mRNA of each protein at the initial stage of infection by the NP, L, and P proteins possessed by NDV, and the synthesized mRNA moves to the endoplasmic reticulum of the host cell to synthesize the protein of each gene. .
  • the (+)sense RNA genome is synthesized by the interaction of NP, L, P and M proteins, and many copies of the (-)sense RNA genome are synthesized using this as a template and released out of the host cell.
  • the NDV (-) sense RNA genome is made into multiple pieces of double-stranded DNA through the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method, and then each piece is religated to create a cDNA clone of the entire NDV. This is being used In cDNA preparation using this method, point mutation is highly likely due to the nature of reverse transcriptase, so after writing cDNA, the 15kb gene sequence is confirmed through sequencing. should be repeated.
  • Recombinant NDV is constructed by inserting the cDNA fragment into the pBR322 vector.
  • transgene cassette was created and inserted so that a foreign gene can be easily introduced into a position where the foreign gene can be inserted so that the antigen protein can be expressed or operated through the recombinant Newcastle disease virus.
  • the transgene cassette is composed of a GE-IG-GS sequence and a multi cloning site (MCS) in front of the N-terminus of the foreign gene insertion site, and NP in accordance with the rule of six along with various restriction enzyme sequences and between P genes, between P and M genes, and between HN and L genes.
  • MCS multi cloning site
  • NP multi cloning site
  • it may be inserted between the NP and P genes, between the P and M genes, and more preferably, it may be inserted between the NP and P genes.
  • the LVP-K1 vector for exogenous gene insertion is obtained by putting the transgene cassette between each gene in a perfectly made recombinant NDV and dividing it into 4 pieces of DNA for each NDV fragment gene. was ligated to pBR322 plasmid DNA, transformed into TOP10 E. coli , produced and stored into four recombinant strains, and when new genes were introduced, genes were isolated from each recombinant E. coli strain and After obtaining a fragment using PCR, it may be to prepare a recombinant NDV virus through overlap cloning method, but is not limited thereto.
  • the vector prepared by the above method prevents point mutation that occurs during the process of making recombinant Newcastle disease virus each time, and has a feature that a foreign gene can be easily inserted into the NDV cDNA through a multi-cloning site (MCS).
  • MCS multi-cloning site
  • the LVP-K1 vector for inserting the foreign gene may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and includes a material functionally equivalent thereto.
  • the "functionally equivalent substance” refers to a sequence having at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more sequence homology with the gene sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a result of nucleotide substitution deletion. It refers to a gene or gene combination that exhibits substantially the same physiological activity as the gene having the gene sequence represented by No. 2 .
  • the present invention provides a recombinant Newcastle disease virus comprising the gene encoding the receptor binding domain (RBD) of the LVP-K1 vector for insertion of the foreign gene and the SARS-CoV-2 virus spike protein.
  • RBD receptor binding domain
  • the gene encoding the SARS-CoV-2 virus spike protein is a gene of the SARS-CoV-2 virus having ACE2 binding ability, and the 2020 Korean SARS-CoV-2 virus gene information (GeneBank accession No. It is a gene established based on MT039890.1 SNU01, Severe Acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate BetaCoV/Korea/SNU01/2020).
  • the SARS corona (SARS-CoV-2) virus spike protein refers to a protein expressed in the SARS corona SARS-CoV-2 virus, preferably a site binding to the ACE2 receptor as the S1 domain of the spike protein. It may be a gene sequence encoding the Spike protein 331 to 583 amino acid sequence as the RBD domain, which is a site that directly binds to the ACE2 receptor among the S1 domains, and more preferably, the Spike protein 340 to 536 amino acid sequence It may be a coding gene, and most preferably may be the 140-336th amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • a method for securing a gene encoding the receptor binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 virus spike protein is artificially synthesized using a gene synthesizer or complementary binding from the SARS-CoV-2 virus gene.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • the gene encoding the recombinant RBD is SARS-CoV It may exist in the form of various nucleotide sequences including amino acid residues 331 to 583 of the -2 spike protein.
  • the host cell into which the receptor binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 virus spike protein is introduced may be a prokaryotic or eukaryotic cell, and the introduced SARS-CoV-2 virus spike protein Cells with a high expression rate can be used without limitation.
  • RBD receptor binding domain
  • E. coli mammalian cell lines, insect cell lines, fungi, yeast, eukaryotic and prokaryotic hosts such as recombinant viruses, and the like.
  • the expression of the receptor binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 virus spike protein may be expressed as a simple subunit protein or may exist in a form exposed to the outside by binding to the surface of a specific cell line or virus line. have.
  • it is expressed on the surface of a pimp or virus strain, and may be a fusion protein bound to a protein of an existing cell membrane or virus membrane, or may be a protein independently bound to a cell membrane or a virus membrane, preferably a cell membrane or virus membrane. It may be a protein independently expressed on the surface, and most preferably, an RBD protein containing a transmebrane domain in the viral envelope, which is sufficiently exposed to the outside of the virus and may be recognized by the immune system.
  • the enveloped virus may be a poxvirus, a flavivirus, an alphavirus, or a Newcastle disease virus. More preferably, it may be a Newcastle disease virus that is a safe virus that does not infect humans and is capable of producing a high viral titer.
  • An enveloped virus has an envelope so that the virus itself can act as an adjuvant, which can help in the antigen-inducing ability of an antigen.
  • the Newcastle disease virus (NDV) is a legal infectious disease that infects chickens and causes neurological and respiratory symptoms, and is a very lethal virus for chickens. lentogenic), and it can be used for the manufacture of inactivated virus vector vaccines.
  • a weakly pathogenic, non-pathogenic virus can be used.
  • the recombinant Newcastle disease virus may further include an NDV surface expression cassette.
  • the NDV surface expression cassette may be composed of genes encoding the F2 subunit, fusion peptide, transmembrane domain and cytoplasmic domain of Newcastle disease virus fusion protein. Specifically, it may be composed of a C-terminal 56 amino acid sequence including the F2 subunit containing the signal sequence of the fusion protein, the fusion peptide of F1, and the transmembrane domain-cytoplasmic domain.
  • the F2 subunit may further include heptad repeat 4 (HR4).
  • Newcastle disease virus fusion protein used in the present invention is composed of a total of 553 amino acids, synthesized as an F0 precursor protein, and the precusor protein is cleaved into F1 and F2 proteins for virus and host cell fusion activity. do.
  • the transmembrane domain (TM) of the F protein is known to be located at the carboxyl terminus of F1.
  • signal sequence refers to an amino acid sequence that plays another important role in expressing a foreign protein included in the F2 portion of the Newcastle disease virus fusion protein on the virus surface, and the N of the fusion protein proteins located at the ends.
  • the signal sequence may be an amino acid sequence up to number 117 in which the fusion protein cleavage site exists, preferably, it may be an amino acid sequence of more than 40 amino acids from the N-terminus, and more preferably from the N-terminus to number 31 It may contain the amino acid sequence of.
  • the signal sequence may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, and includes all functionally equivalent substances.
  • the "functionally equivalent substance” means at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 as a result of the addition of amino acid substitution deletions. It refers to a protein that exhibits substantially the same physiological activity as the protein having the amino acid sequence represented by number 5.
  • F2 subunit used in the present invention refers to a portion of the Newcastle disease virus fusion protein divided by a cleavage site, includes the signal sequence, and refers to a protein involved in inducing cell membranes of foreign proteins and normal folding of proteins. .
  • the F2 subunit may include the 117th amino acid sequence from the N-terminus of the fusion protein.
  • the F2 subunit may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and includes a substance functionally equivalent thereto.
  • the "functionally equivalent substance” means at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 as a result of the addition of amino acid substitution deletions. It refers to a protein that exhibits substantially the same physiological activity as the protein having the amino acid sequence represented by number 4.
  • fusion peptide used in the present invention refers to a protein belonging to the F1 precursor and plays a role in activating cell membrane fusion upon insertion into the target cell membrane.
  • the fusion peptide may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and includes a substance functionally equivalent thereto.
  • the "functionally equivalent substance” means at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 as a result of the addition of amino acid substitution deletions. It refers to a protein that exhibits substantially the same physiological activity as the protein having the amino acid sequence represented by number 6.
  • transmembrane domain as used in the present invention is a peptide composed of hydrophobic amino acids capable of stable binding to the viral envelope. It refers to a protein that allows foreign proteins to be located in the viral envelope.
  • the transmembrane domain may be used as a transmembrane domain (TM) from amino acid 499 to the carboxyl group terminus of Newcastle disease virus fusion protein, and more preferably, amino acid sequence from amino acid 499 to 540 is transmembrane.
  • domain (TM) more preferably, the amino acid sequence from 499 to 530 may be used as the transmembrane domain (TM), and most preferably, the amino acid sequence from 499 to 529 is the transmembrane domain (TM) ) can be used as
  • the transmembrane domain may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and includes a material functionally equivalent thereto.
  • the "functionally equivalent substance” means at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 as a result of the addition of amino acid substitution deletions. It refers to a protein that exhibits substantially the same physiological activity as the protein having the amino acid sequence represented by number 7.
  • the SARS-CoV-2 virus spike protein RBD receptor binding domain
  • NDV surface RBD protein expression cassette were inserted in the order of F2-Fusion peptide-RBD-TM/CT. It may be inserted between the NP gene and the P gene of the LVP-K1 vector for LVP-K1, preferably SARS represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the LVP-K1 vector for inserting the foreign gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the gene encoding the -CoV-2 RBD protein expression gene combination may be inserted between the NP gene and the P gene.
  • the SARS-CoV-2 RBD protein expression gene combination may be composed of a receptor binding domain (RBD) of SARS-CoV-2 virus spike protein and an NDV surface RBD protein expression cassette.
  • RBD receptor binding domain
  • the recombinant Newcastle disease virus may further include a gene encoding the kozak sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the kozak sequence may be used to increase the expression efficiency of the receptor binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 virus spike protein, which is a foreign gene.
  • the recombinant Newcastle disease virus may be one that expresses a receptor binding domain (RBD) of a SARS-CoV-2 virus spike protein on the surface of the Newcastle Disease Virus.
  • RBD receptor binding domain
  • the recombinant Newcastle disease virus may be LVP-K1-RBD19 (Accession No. KCTC 14422BP) represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and includes a functionally equivalent substance.
  • the "functionally equivalent substance” means at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more sequence homology with the gene sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a result of a nucleotide substitution deletion. It refers to a gene or gene combination that exhibits substantially the same physiological activity as the gene having the gene sequence represented by No. 2 .
  • the present invention provides a vaccine composition for preventing or treating SARS-CoV-2 virus comprising the recombinant Newcastle disease virus or antigen purified therefrom.
  • the vaccine composition of the present invention includes the above-described recombinant Newcastle disease virus, the description of overlapping contents with the recombinant Newcastle disease virus of the present invention is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification due to the overlapping description.
  • the vaccine may be a live venom vaccine or an inactivated vaccine in which the virus has been attenuated.
  • the inactivated vaccine may be an immunoactive product as purified LVP-K1-RBD19 recombinant NDV virus.
  • a vaccine comprising the composition may be prepared by methods known in the art. For example, after obtaining purified viruses, they are treated with formalin, betapropriolactone (BPL), binary ethylenimine (BEI) or gamma rays, or inactivated by other methods known to those skilled in the art.
  • BPL betapropriolactone
  • BEI binary ethylenimine
  • gamma rays or inactivated by other methods known to those skilled in the art.
  • the inactivated virus is then mixed with a pharmaceutically acceptable carrier (eg saline solution) and optional adjuvants. Preferably, it may be inactivated at a final concentration of 0.1% formalin.
  • the vaccine composition may further comprise an immune enhancing material or adjuvant (ajuvant).
  • the immune enhancing material or adjuvant refers to a compound or mixture that enhances the immune response and promotes the rate of absorption after inoculation, and includes any absorption-promoting agent, but is not limited thereto.
  • it may contain auxiliary molecules that are added to vaccines or oils such as aluminum hydroxide, mineral oil or generated by the body after each induction by these additional ingredients.
  • the auxiliary molecule includes interferon, interleukin, growth factor, and the like.
  • vaccine a pharmaceutical composition containing at least one immunologically active ingredient that induces an immunological response in a human.
  • the immunologically active component of the vaccine is the known LVP-K1-RBD19 recombinant NDV virus.
  • one or more additional antigens may be included to enhance the efficacy of the vaccine and the vaccine may include one or more of the elements described above at the same time.
  • the vaccine may be in any form known in the art, for example, in the form of solutions and injections, or in solid form suitable for suspension, but is not limited thereto. Such formulations may also be emulsified or encapsulated in liposomes or soluble glass, or may be prepared in the form of an aerosol or spray. They may also be incorporated into transdermal patches. Liquids or injectables may contain propylene glycol if necessary and sodium chloride in an amount sufficient to prevent hemolysis (eg, about 1%).
  • the vaccine of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • pharmaceutically acceptable means a non-toxic composition that is physiologically acceptable and does not inhibit the action of the active ingredient when administered to humans and does not usually cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, or similar reactions.
  • Suitable carriers for vaccines are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, proteins, sugars, and the like. Such carriers may be aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions.
  • a regular or atypical organic or inorganic polymer may be used as an adjuvant for increasing immunogenicity.
  • Adjuvants are generally known to promote immune responses through chemical and physical binding to antigens.
  • an adjuvant an atypical aluminum gel, an oil emulsion, or a double oil emulsion and an immunosol may be used.
  • the above immune composition can be used as a composition for inducing an optimal immune response by a combination of various adjuvants and immune response promoting additives.
  • a stabilizer, an inactivating agent, an antibiotic, a preservative, and the like may be used as the composition to be added to the vaccine.
  • the vaccine antigen may be mixed with distilled water or a buffer solution.
  • the vaccine may be administered via an oral, intramuscular, subcutaneous, etc. administration route, but is not limited thereto, and may preferably be administered via an intramuscular route.
  • the present invention provides a method of preventing or treating a SARS-CoV-2 virus infection comprising administering the vaccine composition to an individual.
  • the method of the present invention includes the above-described vaccine composition, descriptions of overlapping contents with the above-described vaccine composition of the present invention are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification due to description of overlapping contents.
  • the "subject" of the present invention means a subject in need of a method for preventing, controlling or treating a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat , horses, cattle, and other mammals.
  • Prevention of the present invention means any action that suppresses or delays the onset of SARS-CoV-2 virus infection by administration of the composition according to the present invention.
  • Treatment of the present invention refers to any action in which the symptoms of SARS-CoV-2 virus infection are improved or changed advantageously by administration of the composition according to the present invention.
  • the present invention comprises the steps of inoculating the recombinant Newcastle disease virus into a host cell line; culturing the host cell line; and obtaining a recombinant Newcastle disease virus from the culture of the host cell line.
  • the recombinant virus LVP-K1-RBD19 can be recovered through a conventional virus construction method.
  • a conventional virus construction method After the production of infectious clone cDNA SEQ ID NO: 2 for SARS-CoV-2 RBD protein expression was completed, three types of helper plasmids (NP, P, L) and modified vaccina virus (MVA/T7) were injected into the HEp-2 cell line.
  • the procedure for recovering the recombinant virus after culturing was carried out according to a conventional method. Transfection was performed using lipopextamin 3,000 as the injection method into the cell line, and HEp-2 cells were used as the cell line.
  • the recombinant virus After culturing for 3 to 4 days, the recombinant virus is recovered and inoculated into the allantoic cavity of an 8 to 10 day old SPF fertilized egg. After culturing the virus, the allantoic fluid is recovered. Elevation was performed. After purification from allantoic fluid by a conventional purification method, it was cultured in the Vero 76 cell line selected as an appropriate cell line and used for the experiment. The method for confirming the viral surface expression of the SARS-CoV-2 RBD protein of the recombinant virus strain LVP-K1-RBD19 is to confirm the gene stability and mRNA expression of the RBD protein and RBD expression using Western blotting using the reverse transcription PCR method. and virus purification was performed for confirmation.
  • centrifugation After harvesting the recombinant virus culture, centrifugation proceeds with clarification. Clarification can be performed by centrifugation or microfiltration.
  • the centrifugation conditions are 10,000 g, 10 minutes, and 4 °C conditions, so that supernatants can be used for the next purification process.
  • micro filtration a filter with a pore size of 1.0 ⁇ m to 0.2 ⁇ m can be used, and a 0.45 ⁇ m pore size filter can be used preferably.
  • the filtration method either dead end filtration or cross flow filtration can be used, and both methods are applicable.
  • Recombinant virus purification can be accomplished by known methods, including extraction through chromatography or ultrafiltration methods.
  • virus purification is possible through a combination of appropriate resin and buffer through the difference in binding strength such as affinity, ion exchange, size exclusion, and hydrophobicity.
  • the virus is recovered by precipitation or separation, and the recovered virus is resuspended in TNE buffer for use in the next process.
  • the LVP-K-RBD19 recombinant virus was purified using a cation exchange resin chromatography method, and the fraction extracted at a specific concentration was recovered through a sodium chloride concentration gradient after sample loading.
  • the recovered fraction is recovered by precipitating or separating the virus by ultra-high-speed centrifugation using sucrose gradient media, and the recovered virus is resuspended in physiological saline for injection and used in the next process.
  • the present invention provides a method of inducing a protective immune response against SARS-CoV-2 in a human, comprising administering to the human an immune effective amount of the vaccine composition. .
  • the vaccine composition may include a live vaccine composition.
  • the immune response is an antibody, B cells, helper T cells, suppressor T cells, cytotoxic T cells and gamma-delta T cells specifically directed against an antigen or antigens contained in the vaccine composition or vaccine comprising the same.
  • it may be a protective immune response.
  • the protection is evidenced by a reduction or absence of clinical signs normally exhibited by an infected host, a faster recovery time or a lower duration, or a lower viral titer in the tissues or body fluids or feces of the infected host.
  • the immune effective amount refers to an amount of a vaccine capable of inducing an immune response to reduce the frequency or severity of SARS-CoV-2 virus infection in humans, and those skilled in the art can appropriately select it.
  • the purified virus may be 10 5.0 TCID 50 /ml to 10 8.0 TCID 50 /ml. More preferably, it may be 10 6.0 TCID 50 /ml to 10 7.0 TCID 50 /ml or more.
  • the immune response induction method is not limited thereto, but may be inoculating the vaccine composition by oral, transdermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, or subcutaneous routes.
  • the vaccine may be intramuscularly inoculated during the first and second inoculations.
  • the present invention provides a method for evaluating an immune response in an animal comprising administering a recombinant Newcastle disease virus to the animal.
  • the method may be to measure and evaluate an IgG antibody titer from animal serum.
  • the animal is preferably a mammal, and the present invention encompasses immunogenicity evaluation in mice.
  • the inoculation may be performed within two times at a predetermined time interval through the muscle or subcutaneous, oral, or nasal skin of the immunogen animal, and preferably, the inoculation may be performed twice at an interval of 2 weeks through intramuscular inoculation.
  • mouse serum is obtained through tail blood or orbital blood collection, and the effect on immune induction can be confirmed by measuring the IgG antibody titer through the ELISA system, and preferably, it can suppress viral infection.
  • the protective antibody titer can be measured by measuring the virus neutralization antibody titer.
  • the present invention includes a method for measuring neutralizing antibodies to SARS-CoV-2.
  • a method for indirectly measuring the neutralizing antibody titer by measuring the luciferase activity by the virus-neutralizing antibody by producing an HIV-1-based SARS-CoV-2 spike protein-expressing pseudovirus (HIV-2019-nCoV-spikepps-myc-Luc) do.
  • HIV-2019-nCoV-spikepps-myc-Luc HIV-1-based SARS-CoV-2 spike protein-expressing pseudovirus
  • the virus neutralizing antibody titer of the vaccine tested in the present invention may be 12 to 512 fold, preferably 128 to 256 fold, and more preferably 256 fold or more neutralizing antibody titer should be measured.
  • Example 1 Preparation of recombinant NDV virus genome transcription vector using NDV VG/GA-AVINEW strain as a basic backbone
  • NDV VG/GA-AVINEW (Gene bank No. KC906188.1) has about 15 kb negative-sense single-stranded RNA as genetic information and is composed of 6 ORFs. It encodes the M, F, HN and L genes.
  • RNA isolation using a viral RNA extraction kit (Quagen) 4 pairs of gene-specific primers were prepared and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed. Four pairs of primers specific for the gene are shown in Table 1.
  • RT-PCR was performed at 42 °C for 1 hour and at 94 °C for 5 minutes, followed by a total of 30 cycles of 94 °C for 1 minute, 60 °C for 1 minute, and 72 °C for 1 minute, followed by reaction at 72 °C for 7 minutes.
  • a cloning strategy for serially ligating a set of cDNA fragments of a fragment is shown in Figure 1A.
  • the modified pBR322 vector preferably a low-copy-number plasmid, was used for cloning by locating PacI and PmeI restriction enzymes having different recognition sites and cleavage sites.
  • the modified pBR322 vector is preferably under the control of the T7 RNA polymerase promoter, and is positioned so that it is terminated by the hepatitis delta virus (HDV) antigenome ribozyme and T7 terminator gene used to cleave RNA at the end of the NDV genome to facilitate viral encapsidation and packaging. made it possible In addition, the complete genome sequence of the NDV VG/GA-AVINEW strain was included to ensure accurate transcription. Thereafter, as shown in Table 2 below, a cloning strategy was used in which the cDNA fragment set was divided into four pieces and successively ligated (see FIGS. 1B and C).
  • HDV hepatitis delta virus
  • RNA-dependent RNA polymerase initiates transcription in a sequential manner by a stop-start mechanism between genes (GE-IG-GS).
  • GS transcriptional reinitiation is not complete, so the level of transcription of mRNA located at the 3' end is high. Therefore, the higher the 3' end, the higher the mRNA transcription level, and the lower it goes toward the 5' end. Therefore, the new exogenous gene insertion between the NP gene and the P gene is more preferable than between the P gene and the M gene and between the HN gene and the L gene, since higher levels of mRNA transcription and foreign protein translation occur, so the gene insertion between NP-P is more preferable.
  • the four fragments of the cDNA fragment have the same base sequence at the end of 15 bp, and a transgene cassette consisting of an IGS (GE-IG-GS) sequence and an MCS (multicloning site) was combined with the NP gene using the overlap cloning method.
  • LVP-K1 vector for foreign gene insertion was constructed by inserting it between the P genes.
  • Example 2 Construction of recombinant NDV virus cDNA expressing SARS-CoV2 RBD protein on the surface
  • a recombinant Newcastle disease virus expressing the receptor binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 spike protein on the surface of the Newcastle disease virus (NDV) virus was constructed.
  • the RBD protein was encoded in the NDV surface expression cassette for surface expression of Newcastle disease virus (NDV) (genes encoding the F2 subunit (including signal sequence and HR4), fusion peptide, transmembrane domain and cytoplasmic domain of the Newcastle disease virus fusion protein)
  • NDV Newcastle disease virus
  • F2 subunit including signal sequence and HR4
  • fusion peptide transmembrane domain
  • cytoplasmic domain of the Newcastle disease virus fusion protein
  • SEQ ID NO: 3 SARS-CoV-2 RBD protein expression gene combination into which the gene was inserted was constructed (see FIG. 2).
  • the SARS-CoV-2 RBD protein expression gene combination of SEQ ID NO: 3 has an FseI restriction enzyme recognition site and a kozak sequence (SEQ ID NO: 8) at the N-terminus, and an FseI restriction enzyme recognition site at the C-terminus, with the NP gene of Newcastle disease virus and It was designed to be inserted between the P genes and synthesized.
  • the LVP-K1 vector for foreign gene insertion and the SARS-CoV-2 RBD protein expression gene combination (SEQ ID NO: 3) of Example 1 were each treated with FseI restriction enzyme, and then purified using PCR purification and Gel purification kit. After calculating the LVP-K1 vector for foreign gene insertion and the RBD expression cassette in a ratio of 1:3, ligation was performed overnight at 4°C using T4 ligase, and E. coli TOP10 competent cells Transformation was performed using the furnace heat shock method (heat shock).
  • the seeds were determined through colony PCR, and a plasmid expressing the RBD of the SARS-CoV-2 spike protein was secured on the surface of the Newcastle disease virus using plasmid midi preparation, and recombinant Newcastle disease virus LVP-K1-RBD19 (Accession number: KCTC 14422BP) ) was produced.
  • NP, P, L Individual clones (NP, P, L) of the NDV transcriptase complex were cloned into pBR322 vector and used as helper plasmids (pBR322-NP, pBR322-P, pBR322-L). After preparing HEp-2 cells at 5X10 5 cells/well in a 6-well plate the day before, the modified Vaccinia virus (MVA-T7) was infected with 1 MOI (Multiplicity of Infection).
  • Virus confirmation experiment was conducted by ONE-STEP RT-PCR using 5 ul of extracted RNA and 1 ⁇ l of each of Forward and Reverse primers in Table 3 after isolation (isolation) of allantoic fluid using a Viral RNA extraction kit (Quagen). After reacting at 42 °C for 1 hour and at 94 °C for 5 minutes, the reaction was carried out for a total of 35 cycles of 1 minute at 94 °C, 1 minute at 60 °C, and 1 minute at 72 °C, followed by 7 minutes at 72 °C. The results are shown in Figure 3A.
  • the highest titer of the virus supernatant was obtained 2 days after inoculation. Thereafter, the virus supernatant was centrifuged at 5,000 g at 4° C. for 10 minutes to remove suspended matter, and the supernatant was collected.
  • the collected supernatant was ultracentrifuged at 32,000 rpm at 4 °C for 3 hours to concentrate the recombinant virus, and after removing the supernatant, resuspended in TNE buffer (10 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA) did.
  • the concentrated virus was subjected to ultracentrifugation at 32,000 rpm and 4 °C for 2 hours using a 30 ⁇ 60% sucrose gradient method. Recombinant virus was obtained at 40-50%.
  • the obtained recombinant virus was subjected to ultracentrifugation once more at 32,000 rpm at 4° C. for 2 hours to remove sucrose to purify the recombinant Newcastle disease virus LVP-K1-RBD19.
  • Receptor binding domain (RBD) expression of SARS-CoV-2 virus spike protein of recombinant virus was confirmed.
  • 20 ⁇ g of protein was separated through 10% SDS-PAGE and electrophoresed on a PVDF membrane.
  • the membrane was confirmed for protein expression using SARS Coronavirus Spike Protein Polyclonal Antibody (Invitrogen) and NDV HN protein Polyclonal Antibody (Bioss) antibodies.
  • SARS Coronavirus Spike Protein Polyclonal Antibody Invitrogen
  • NDV HN protein Polyclonal Antibody (Bioss) antibodies The results are shown in Figure 3B.
  • the recombinant SARS-CoV-2 RBD protein of about 42 kDa and about 68 kDa, respectively, was confirmed.
  • LVP-K1 confirmed as the positive control, the target band was not detected in SARS Coronavirus Spike Protein Polyclonal Antibody, and the band was confirmed only in NDV HN protein Polyclonal Antibody, it can be seen that RBD protein was not detected in LVP-K1. .
  • Partial samples of the virus purified in Example 4 were taken and virus titers were measured using Vero 76 cells.
  • the virus titer was measured according to the general TCID 50 measurement method, and the titer was adjusted using PBS according to the virus titer. After diluting the virus titer to 10 8.0 TCID 50 /ml, 0.1% aqueous formalin was added and stored at 4°C for 48 hours. After inactivation, samples were collected for Vero 76 cells. In order to observe CPE caused by virus infection using As a result of the inactivation experiment, it was confirmed that the infective activity of all viruses disappeared within 24 hours. As shown in FIG. 4 , the viral antigen used in the additional experiment was inactivated for 24 hours at a final concentration of 0.1% formalin.
  • Recombinant Newcastle disease virus LVP-K1-RBD19 is an RBD (receptor binding domain) of SARS-CoV-2 virus spike protein expressed on the surface. 7-week-old, female BALB/c mice were vaccinated with LVP-K1-RBD19 as follows.
  • inoculation group for virus culture medium containing 10% FBS negative control group
  • LVP-K1 inactivated virus inoculation group positive control group
  • LVP-K1-RBD19 inactivated virus 10 6.0 TCID 50 /dose
  • Each group was divided into 4 groups with an antigen dose of TCID 50 /dose, and 5 mice in each group were vaccinated, and intramuscular inoculation was performed twice at an interval of 2 weeks at an amount of 100 ⁇ l/animal. From the first inoculation date, antisera were prepared through orbital blood sampling before vaccination, 2 weeks after vaccination (at the time of the second vaccination), and 3 and 4 weeks after vaccination.
  • ELISA antibody measurement was performed.
  • the total IgG antibody titer to RBD protein of the group inoculated with the LVP-K1-RBD19 virus antigen showed a significant difference from the control group, and 10 6.0 TCID than in the group inoculated with the LVP-K antigen.
  • the antibody titer of 50 /dose was significantly higher, and it was confirmed that the antibody titer further increased at the antigen concentration of 10 7.0 TCID 50 /dose.
  • the IgG antibody to SARS-CoV-2 RBD protein was effectively formed through the LVP-K1-RBD19 virus antigen.
  • a neutralizing antibody induction test by the LVP-K1-RBD19 virus antigen obtained in Example 6 was performed.
  • the neutralizing antibody test was performed using a pseudovirus (HIV-2019-nCoV-spike pps-myc-Luc).
  • the serum obtained from Example 7 is diluted in a 96-well plate by binary dilution, and then the same amount of pseudovirus (virus titer: 1 X 10 3.0 TCID 50 /ml) is added and reacted at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, transfer to a pre-prepared 96-well plate with a monolayer-formed Huh7 cell and react for 1 hour.
  • the virus and serum mixed solution is removed, washed once with a cell culture medium that does not contain FBS, and then the cell culture medium is added and incubated in a 37 ° C CO 2 incubator for 18 hours.
  • the fluorescence (Fluc) emitted from the cells was measured using the bright Glo luciferase assay system (Promega).
  • 50 ul of luciferase lysis buffer was added to each well, and frozen at -70°C for 24 hours.
  • luciferase reagent was added to measure the relative light unit (RLU).
  • RLU was measured using a GLOMAX luminometer, and the change to the virus neutralizing antibody titer was calculated according to the formula in Equation 1 below, and the median neutralization dose was calculated by the Reed-Munch method.
  • LVP-K1-RBD19 antigen of 2.0 X 10 7.0 TCID 50 in 50 ⁇ l PBS was inoculated twice at an interval of 2 weeks in the femoral muscle of C57BL/6 mice, followed by weight change and feed for 4 weeks Intake and drinking water were measured.
  • the negative control group was inoculated with the same amount of PBS in the same way.
  • Ten mice per each test group were performed. The results are shown in FIG. 6 .

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Abstract

본 발명은 인체 감염 사스코로나 (SARS-CoV-2; COVID-19) 바이러스 예방 및 감염 증상 완화용 백신 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 SARS-CoV-2 RBD 단백질을 표면에 발현한 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 항원을 포함하는 백신 조성물은 COVID-19 감염에 대항할 수 있는 면역반응을 유도하여 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 감염 예방 및 치료를 위한 백신으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

인체 감염 사스코로나 바이러스 예방 및 감염 증상 완화용 백신 조성물
본 발명은 인체 감염 사스코로나 바이러스 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2; COVID-19) 예방 및 감염 증상 완화용 백신 조성물에 관한 것이다.
급성호흡기증후군은 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 감염에 의해 발병되는 감염병으로 2019년 12월 중국의 우한 (Wuhan)에서 첫 감염자 발생보고가 있었다. 우한시의 훈난 (Hunnan) 해산물 시장에 방문자를 중심으로 폐렴 증상 환자가 발생하였고 우한의 과학자에 의해 환자로부터 바이러스가 분리되고 유전자분석을 통해 기존의 SARS-CoV, MERS-CoV가 아닌 새로운 코로나바이러스임이 밝혀졌다. 2020년 2월 1일 중국에서 11,821명의 환자 발생이 보고되었으며 이때 이미 중국을 비롯한 23개국에서 132명 확진자가 발생하고 있었다. 이후 SARS-CoV-2 로 바이러스가 명명되고 전 세계적으로 급속히 전파되었다. 현재 전 세계적으로 8천만명 이상의 감염자가 발생하였으며 160만명 이상의 감염자가 사망하였다. 국내에서도 44,000명 이상의 감염자가 발생 600명의 사망자가 발생하였으며 연일 천여명의 감염자가 나오고 있는 상황이다. SARS-CoV-2 바이러스 감염의 주된 증상은 발열, 마른 기침, 피로감 그리고 사람에 따라 몸살, 두통, 설사, 인후통, 미각 또는 후각을 상실하는 경우가 있으나 바이러스 감염 이후 특이한 증상이 없는 감염자도 다수 있는 것으로 파악되고 있다. 바이러스 전파 속도는 매우 빠르고 치사율은 국내의 경우 1.36% 이며 전세계 치사율은 2.23%로 초기 치사율에 비해 현저히 감소하고 있는 추세이다. 그럼에도 불구하고 바이러스의 전파 속도는 매우 빠르게 진행되고 있어 1918년 스페인 독감 이후 pandemic 질병으로 인한 최대의 감염자와 사망자가 발생하고 있다. SARS-CoV-2 바이러스는 사람에 감염되는 베타코로나 바이러스로 코로나바이러스과에 속하며 단일 가닥의 RNA 게놈 (genome)을 가지고 있으며 총 게놈의 크기는 30,473 bp로 작지 않은 유전자를 가지고 있다 전체 유전자는 ORF1a부터 ORF10까지 10개의 유전자를 가지고 있다. 바이러스 유전자는 비구조적 유전자와 구족적 유전자로 구분되며 S 유전자가 인체 호흡기의 ACE2 receptor와 결합하는 spike glycoprotein으로 알려져 있다. SARS-CoV-2 바이러스는 최초 A형의 바이러스가 검출되었으나 이후 주로 북미 유럽에서 유행하는 것으로 밝혀졌으며 B형의 경우 주로 동아시아에서 검출이 되고 있고 C형의 경우 유럽과 한국을 비롯한 아시아 몇 개 나라에서 검출이 되고 있다. 바이러스 타입에 따른 혈청형의 차이는 없는 것으로 알려져 있으며 감염이 지속되면서 각국에 따라 다른 유전형의 바이러스가 검출되고 있다. 분리된 SARS-CoV-2의 게놈을 분석한 결과 SARS-CoV (Severe acute respiratory syndrome coronavirus)와 같은 속 (family)에 속하는 베타코로나바이러스로 30 kb 에 크기의 RNA 게놈을 가지고 있어 RNA 바이러스 중 가장 큰 RNA 게놈을 가진 것으로 밝혀졌다. SARS-CoV-2의 게놈은 10개의 유전자로 구성되어 있으며 전체 게놈의 2/3가 ORF1ab로 비구조 유전자 (NSP, Non Structural Protein)이다. 나머지 3’말단의 유전자는 4개의 구조 단백질 유전자를 가지고 있는데 spike (S), envelope (E), matrix (M) 그리고 nucleocapsid (N) 단백질 유전자이다. 이외에도 5개의 보조 단백질 유전자 (accessory protein)를 가지고 있다 (ORF3, 6, 7a, 7b, 8, 10). 유전자 중 아직 기능이 확실히 밝혀지지 않은 유전자는 10 유전자이다.
SARS-CoV-2 바이러스 감염은 바이러스 표면의 spike protein 과 숙주세포 표면의 ACE2 (angiotensin converting enzyme2) receptor 결합이 이루어지고 이후 TMPRSS2 단백질이 추가로 결합하여 spike protein의 중간 부분이 잘리고 세포막과 바이러스막의 융합을 통해 세포안으로 바이러스 게놈이 유입되고 이후 바이러스 증식이 일어나는 것으로 알려져 있다. ACE2 효소가 발현되는 주용 장기는 심장, 폐, 콩팥, 혈관 내피 그리고 소화계통에 발현된다고 알려져 있다.
발생한지 아직 1년도 되지 않은 SARS-CoV-2 (COVID-19)에 대한 백신 개발이 매우 시급히 요구되고 있고 25개 이상의 제약사 등이 다양한 제형의 백신을 개발하고 있으며 이미 공급을 시작한 백신의 mRNA를 이용한 백신이다. 절대적인 시간적 제한으로 인해 신속 승인을 통해 공급된 백신에 대한 광범위한 임상 결과가 백신 접종과 동시에 나오는 상황에서 과연 백신의 효능과 안전성이 얼마나 담보될지는 미지수다. 따라서 고전적인 형태의 백신도 시간이 걸리더라도 개발되어야 하며 지속적인 신종전염병에 대한 대비를 위해서도 신속하게 백신 개발이 가능한 기술개발도 필요한 상황이다. 그리고 전 지구의 사람을 대상으로 하는 백신의 경우 백신 생산과 백신의 경제성은 매우 중요하다. 평등의 실천인 백신이 인류 모두에게 사용될 수 있는 기술의 개발은 무엇보다도 중요하다. 특히 이번 SARS-CoV-2 (COVID-19)은 인류가 백신을 통해 질병 통제가 가능한지 시험대에 오른 중요한 시기이다. 바이러스 벡터 백신은 인체 병원성이 없는 바이러스에 항원 유전자를 전달 단백질을 발현하여 면역반응을 유도하거나 바이러스 표면에 항원단백질을 발현해서 살아있는 형태로 백신으로 사용하는 경우도 있고 항원단백질을 바이러스 표면에 발현하여 불활화 시켜 백신으로 사용하는 경우도 있다. 바이러스를 유전적으로 조작하고 재조합 바이러스를 만들어 내는데 시간이 소요되기는 하나 성공한 바이러스 벡터에 다른 항원을 발현하는 것은 쉬운 일로 앞으로 발생할 수 있는 신종 전염병 예방에 매우 중요한 기술이 될 것이다. 본 연구는 포유류 감염이 되지 않는 NDV 바이러스의 표면발현 단백질의 일부 도메인 유전자와 SARS-CoV-2의 receptor binding domain (RBD) 단백 유전자를 이용하여 NDV cDNA에 삽입하여 재조합 바이러스를 만들어 백신으로서 개발하고자 하는 연구이며 이러한 cDNA에 다양한 항원을 발현할 수 있는 platform 개발에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle Disease Virus) cDNA 및 트랜스진 카세트 (Transgene cassette)를 포함하는 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터 및 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 항원을 포함하는 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 재조합 뉴캐슬병 바이러스 제조 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 동물에서의 면역반응 평가 방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle Disease Virus) cDNA 및 트랜스진 카세트 (Transgene cassette)를 포함하고, 상기 트랜스진 카세트 (Transgene cassette)는 IGS 서열 (Gene end (GE), Intergenic sequence (IG), Gene start (GS)) 및 MCS (multicloning site)로 이루어진 것인, 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터를 제공한다.
이어서, 본 발명은 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터 및 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 항원을 포함하는 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
더불어, 본 발명은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 숙주 세포주에 접종하는 단계; 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스 제조 방법을 제공한다.
마지막으로 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 동물에 투여하는 단계를 포함하는 동물에서의 면역반응 평가 방법을 제공한다.
본 발명의 SARS-CoV-2 RBD 단백질을 표면에 발현한 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 항원을 포함하는 백신 조성물은 SARS-CoV-2 (COVID-19) 감염에 대항할 수 있는 면역반응을 유도하여 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 감염 예방 및 치료를 위한 백신으로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 LVP-K1 벡터의 유전자 모식도, 벡터 지도 및 PCR 산물을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 LVP-K1-RBD19의 유전자 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 LVP-K1-RBD19의 RBD 단백 표면 발현 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 LVP-K1-RBD19의 불활화 후 시간별 바이러스 역가 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 LVP-K1-RBD19의 RBD 단백질 특이적인 항체 생산 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 LVP-K1-RBD19의 안정성 평가 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle Disease Virus) cDNA 및 트랜스진 카세트 (Transgene cassette)를 포함하는 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터를 제공한다.
또한, 상기 트랜스진 카세트 (Transgene cassette)는 IGS 서열 (Gene end (GE), Intergenic sequence (IG), Gene start (GS)) 및 MCS (multicloning site)로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle Disease Virus, NDV)”는 약 15kb 정도 (-)sense RNA 게놈을 가지고 있는 paramyxovirus에 속하며 인체감염성 없는 포유류에 안전한 바이러스로 알려져 있다. NDV 게놈 RNA 는 30 base 정도의 extragenic leader 서열을 가지고 있으며 50 base 정도의 tail 서열을 가지고 있다. 양쪽 말단의 두 서열은 바이러스의 유전자의 전사 (transcription)와 복제 (replication) 그리고 새롭게 합성된 RNA 게놈을 바이러스 파티클 안에 봉입 (encapsidation) 과정을 조절하는 것으로 알려져 있다. NDV 유전자 구성은 양쪽 말단 리더와 꼬리 유전자 사이에 NP, P, M, F, HN 및 L을 포함하는 6개의 유전자로 구성되어 있으며 각각의 유전자는 nucleoprotein (NP), phosphoprotein (P), matrix protein (M), fusion protein (F), hemagglutinin-neuraminidase protein (HN), large protein (L)을 암호화하고 있다.
상기 뉴캐슬병 바이러스는 각각의 유전자 사이에 IGS[Gene end (GE), Intergenic sequence (IG), Gene start (GS)] 서열이 존재하고 있으며 숙주세포 감염 초기 각각의 유전자는 전사과정을 거쳐 숙주세포의 소포체 (endoplasmic reticulum, ER)으로 이동 단백질을 합성하게 된다. 이후 M protein 합성량이 일정 수준 이상으로 올라가게 되면 (+)sense RNA 게놈을 합성하고 이를 주형으로 하여 (-)sense RNA 게놈을 합성하게 된다. 완성된 바이러스 파티클은 세포 밖으로 배출되게 된다.
상기 뉴캐슬병 바이러스의 외부 유전자 도입 능력은 최대 6 kb 정도인 것으로 알려져 있으며 외래 유전자 도입은 주로 P과 M 유전자 사이 그리고 HN과 L 유전자 사이에 이루어져 왔다. 다만 6개의 유전자 사이에 외래 유전자 도입이 모두 가능한 것으로 알려져 있으나 각각의 위치에 따라 mRNA 발현, 단백질 발현 그리고 심한 경우 바이러스 증식에도 영향이 있는 것으로 알려져 있으나 각각의 위치에 따라 정량적인 비교 시험은 이루어지지 않은 상태이다. 각각의 유전자 사이에는 GE-IG-GS 유전자가 있으며 특히 IG 유전자의 경우 NP-P, P-M, M-F 사이에는 1개 또는 2개의 뉴클레오티드를 가지고 있으며 F-HN 사이는 35개, HN-L 사이는 47개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 바이러스 감염 후 (-)sense RNA 게놈은 NDV 가 가지고 있는 NP, L 그리고 P 단백질에 의해 감염 초기 각 단백질의 mRNA를 합성하여 합성된 mRNA 가 숙주 세포의 소포체로 이동하여 각 유전자의 단백질을 합성하게 된다. 이후 NP, L, P 그리고 M 단백질의 상호작용에 의해 (+)sense RNA 게놈을 합성하고 이를 주형으로 많은 copy의 (-)sense RNA 게놈을 합성하고 숙주세포 밖으로 방출되게 된다. 최초 감염시 자가 단백질 생산을 위한 mRNA의 합성량은 N말단 에서부터 즉 NP mRNA 가 가장 많이 합성되고 이후 N말단으로부터 멀어질수록 mRNA 합성은 줄어드는 것으로 알려져 있다.
뉴캐슬병 바이러스의 cDNA 구축에는 NDV (-) sense RNA 게놈을 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)법을 통해 여러 조각의 double strand DNA로 만든 이후 각각의 조각을 다시 ligation 하여 전체 NDV의 cDNA clone 만드는 방법이 사용되고 있다. 이 방법을 이용한 cDNA 작성은 reverse transcriptase의 특성상 point mutation이 일어날 가능성이 높아 cDNA 를 다 작성한 이후에 sequencing을 통해 15kb 에 달하는 유전자 서열을 확인하고 하나 이상의 point mutation 이 발생하면 다시 NDV 게놈으로부터 cDNA 를 만드는 과정을 반복해야 한다. cDNA 조각을 pBR322 vector에 삽입하여 recombinant NDV를 구축한다.
또한, 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 통해 항원 단백질이 발현 또는 작동할 수 있도록 외래 유전자 삽입 가능한 위치에 쉽게 외래유전자를 도입할 수 있도록 트랜스진 카세트 (Transgene cassette)를 만들어 삽입하였다. 트랜스진 카세트 (Transgene cassette)는 외래 유전자 삽입위치 N말단 앞쪽에 GE-IG-GS sequence 및 multi cloning site (MCS)로 구성되어 있으며, 다양한 제한효소 (Restriction enzyme) 서열과 함께 rule of six에 맞춰 NP 및 P 유전자 사이, P 및 M 유전자 사이, HN 및 L 유전자 사이에 삽입하여 제작할 수 있다. 바람직하게는 NP 및 P 유전자 사이, P 및 M 유전자 사이에 삽입하는 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 NP 및 P 유전자 사이에 삽입되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터는 완벽하게 만들어진 recombinant NDV에 상기 트랜스진 카세트 (Transgene cassette)를 각 유전자 사이에 넣고 4조각의 DNA로 나누어 각각의 NDV 조각 유전자를 pBR322 plasmid DNA에 라이게이션 (ligation) 후 TOP10 E.coli 에 형질전환 (transformation)하여 4종의 재조합 균주로 제작 보관한 후 새로운 유전자 도입 시 각 재조합 E. coli 균주로부터 유전자를 분리하고 본 유전자를 PCR을 이용하여 fragment를 획득한 후 overlap cloning 방법을 통해 재조합 NDV 바이러스를 제작하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기와 같은 방법으로 제작된 벡터는 매번 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 만드는 과정 중에 발생하는 point mutation을 막아주며 MCS (multi cloning site)를 통해 쉽게 외래 유전자를 NDV cDNA에 삽입할 수 있다는 특징이 있다.
또한, 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것일 수 있으며, 이와 기능적으로 동등한 물질을 포함한다. 상기 “기능적 동등한 물질”이란 뉴클레오티드의 치환 결손의 결과로 상기 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열을 갖는 유전자와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 유전자 또는 유전자 조합을 말한다.
이어서, 본 발명은 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터 및 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제공한다.
또한, 상기 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자는 ACE2 결합 능력이 있는 SARS-CoV-2 바이러스의 유전자로서 2020년 한국형 SARS-CoV-2 바이러스 유전자 정보 (GeneBank accession No. MT039890.1 SNU01, Severe Acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate BetaCoV/Korea/SNU01/2020)를 바탕으로 확립된 유전자이다.
또한, 상기 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질은 사스 코로나 SARS-CoV-2 바이러스에서 발현되는 단백질을 말하며, 바람직하게는 스파이크 단백질 (spike protein)의 S1 도메인으로 ACE2 receptor와 결합하는 부위일 수 있고, 더욱 바람직하게는 S1 도메인 중 ACE2 receptor와 직접 결합하는 부위인 RBD 도메인으로 Spike protein 331 ~ 583 아미노산서열을 코딩하는 유전자 서열일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 Spike protein 340 ~ 536 아미노산서열을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 140 ~ 336 번째 아미노산서열 일 수 있다.
사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)을 코딩하는 유전자 확보를 위한 방법은 유전자 합성기기를 이용하여 인공적으로 합성하거나, SARS-CoV-2 바이러스 유전자로부터 상보적 결합이 가능한 PCR primer를 이용하여 RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) 방법을 이용할 수 있다. 발현 시스템에 따라 코돈 (codon)-최적화로 인하여 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자와 상이함이 있을 수 있어 재조합 RBD (receptor binding domain)을 코딩하는 유전자는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 잔기 331 ~ 583를 포함하는 다양한 염기 서열 형태로 존재할 수 있다.
상기 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)이 도입되는 숙주세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있으며, 도입되는 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 발현율이 높은 세포라면 제한되지 않고 사용될 수 있다. 예를 들어, 대장균, 포유류 세포주, 곤충 세포주, 진균, 효모, 재조합 바이러스와 같은 진핵 및 원핵 숙주 등이 있다.
또한, 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)의 발현은 단순한 subunit 단백질로 발현될 수 있고 또는 특정한 세포주 또는 바이러스주의 표면에 결합하여 외부로 노출되는 형태로 존재할 수 있다. 바람직하게는 포주 또는 바이러스주 표면에 발현되는 경우이며 기존 세포막이나 바이러스막의 단백질과 결합된 fusion 단백질일 수도 있으며 세포막이나 바이러스막에 독립적으로 결합된 형태의 단백질일 수 있고, 바람직하게는 세포막이나 바이러스막의 표면에 독립적으로 발현된 단백질일 수 있으며, 가장 바람직하게는 바이러스 엔벨로프 (envelope)에 transmemebrane domain을 함유하고 있는 RBD 단백질로서 바이러스 외부에 충분히 노출되어 면역체계에 의해 인식될 수 있는 형태인 것일 수 있다.
상기 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)의 발현을 위한 바이러스로서는 렌티바이러스 (Lentivirus), 레트로바이러스 (Retrovirus), 벡시니아 바이러스 (Vaccinia virus), 아데노바이러스 (Adenovirus), 아데노 관련 바이러스 (Adeno associated virus), 거대세포바이러스 (Cytomegalovirus), 센다이 바이러스 (Sendai virus), 폭스바이러스 (Poxvirus), 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle disease virus), 알파바이러스 (Alphavirus)와 같이 외래 유전자 도입을 통해 항원을 발현 또는 전달할 수 있고, 높은 안정성, 높은 항원발현 능력 및 높은 바이러스 역가 생산이 가능한 바이러스이면 제한되지 않고 사용할 수 있다. 바람직하게는 피막 바이러스 (enveloped virus)로서 폭스바이러스 (Poxvirus), 플라비바이러스 (Flavivirus), 알파바이러스 (alphavirus), 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle disease virus)가 될 수 있다. 더욱 바람직하게는 인체 감염성이 없는 안전한 바이러스이며 높은 바이러스 역가 생산이 가능한 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle disease virus)일 수 있다. 피막 바이러스 (enveloped virus)는 엔벨로프 (envelope)를 가져 바이러스 자체가 아쥬반트 (adjuvant) 역할을 할 수 있어 항원의 항체 유도 능력에 도움이 될 수 있다. 상기 뉴캐슬병 바이러스 (Newcsatle disease virus, NDV)는 닭에게 감염되어 신경증상 및 호흡기 증상 등을 일으키는 법정 전염병으로 닭에게는 매우 치명적인 바이러스로 이러한 병원성에 따라 강병원성 (velogenic), 약병원성 (mesogenic), 비병원성 (lentogenic)으로 나뉘며, 불활화 바이러스 벡터 백신 제조에 모두 사용이 가능하다. 바람직하게는 약병원성, 비병원성 바이러스가 사용될 수 있다.
또한, 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 NDV 표면 발현 카세트 (NDV surface expression cassette)를 더 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 NDV 표면 발현 카세트 (NDV surface expression cassette)는 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (Fusion protein)의 F2 subunit, fusion peptide, transmembrane domain 및 cytoplasmic domain을 코딩하는 유전자로 이루어진 것일 수 있다. 구체적으로는 융합 단백질의 signal sequence를 포함하는 F2 subunit, F1의 fusion peptide 및 transmembrane domain-cytoplasmic doamain을 포함하는 C 말단 56개의 아미노산서열로 구성되는 것일 수 있다. 또한, 상기 F2 subunit은 heptad repeat 4 (HR4)을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (Fusion protein)”은 총 553개의 아미노산으로 구성되어 있으며, F0 전구 단백질로 합성되어 precusor 단백질이 바이러스와 숙주세포의 fusion 활동을 위해 F1과 F2 단백질로 절단된다. F 단백질의 transmembrane domain (TM) 은 F1의 카복실기 말단에 위치하는 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “signal sequence (SS)”는 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질의 F2 부분에 포함된 외래 단백질을 바이러스 표면에 발현하기 위해서 또 하나의 중요한 역할을 하는 아미노산서열을 의미하고, 융합 단백질의 N 말단에 위치하는 단백질을 말한다.
본 발명에서 signal sequence는 융합 단백질 cleavage site가 존재하는 117번까지의 아미노산서열이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 N 말단에서 40번 이상의 아미노산서열이 될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 N 말단에서 31번까지의 아미노산서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 signal sequence는 서열번호 5의 염기서열로 구성된 것일 수 있으며, 이와 기능적으로 동등한 물질을 모두 포함한다. 상기 “기능적 동등한 물질”이란 아미노산 치환 결손 부가의 결과로 상기 서열번호 5으로 표시되는 아미노산서열과 적어도 70 %이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 서열번호 5로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “F2 subunit”은 뉴캐슬병 바이러스 융합단백질이 cleavage site에 의해 나뉜 일부분을 의미하고, 상기 signal sequence를 포함하고 있으며, 외래 단백질의 세포막 유도와 단백질의 정상적인 folding에 관여하는 단백질을 말한다.
본 발명에서 F2 subunit은 융합 단백질의 N 말단에서 117번째 아미노산서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 F2 subunit은 서열번호 4의 아미노산서열로 구성된 것일 수 있으며, 이와 기능적으로 동등한 물질을 포함한다. 상기 “기능적 동등한 물질”이란 아미노산 치환 결손 부가의 결과로 상기 서열번호 4로 표시되는 아미노산서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 서열번호 4로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “fusion peptide”는 F1 전구체에 속하여 표적 세포막으로 삽입시 세포막 융합을 활성화 시키는 역할을 하는 단백질을 말한다.
본 발명에서 fusion peptide는 서열번호 6의 아미노산서열로 구성된 것일 수 있으며, 이와 기능적으로 동등한 물질을 포함한다. 상기 “기능적 동등한 물질”이란 아미노산 치환 결손 부가의 결과로 상기 서열번호 6로 표시되는 아미노산서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 서열번호 6로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “Transmembrane domain (TM)”은 바이러스 엔벨로프 (envelope)에 안정적인 결합이 가능한 소수성 아미노산 (hydrophobic amino acid)으로 구성된 펩타이드로, 외래 단백질의 세포막에 발현시킬 때 바이러스 envelope와 비공유결합을 통해 외래 단백질이 바이러스 외막에 위치할 수 있도록 하는 단백질을 말한다.
본 발명에서 Transmembrane domain은 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (Fusion protein)의 499번째 아미노산으로부터 카복실기 말단까지가 transmembrane domain (TM)으로 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 499번 아미노산으로부터 540번까지의 아미노산서열이 transmembrane domain (TM)으로 사용될 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 499번부터 530번까지의 아미노산서열이 transmembrane domain (TM)으로 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 499번에서 529까지의 아미노산서열이 transmembrane domain (TM)으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 Transmembrane domain은 서열번호 7의 염기서열로 구성된 것일 수 있으며, 이와 기능적으로 동등한 물질을 포함한다. 상기 “기능적 동등한 물질”이란 아미노산 치환 결손 부가의 결과로 상기 서열번호 7로 표시되는 아미노산서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 서열번호 7로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
또한, 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain) 및 NDV 표면 RBD 단백 발현 카세트가 F2-Fusion peptide-RBD-TM/CT의 순서로 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터의 NP 유전자 및 P 유전자 사이에 삽입된 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터에 서열번호 3의 아미노산서열로 표시되는 SARS-CoV-2 RBD 단백 발현 유전자 조합을 코딩하는 유전자가 NP 유전자 및 P 유전자 사이에 삽입된 것일 수 있다.
또한, 상기 SARS-CoV-2 RBD 단백 발현 유전자 조합은 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain) 및 NDV 표면 RBD 단백 발현 카세트로 구성된 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 서열번호 8의 아미노산서열로 표시되는 kozak sequence를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 kozak sequence는 외래유전자인 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)을 발현 효율을 높이기 위해 사용되는 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle Disease Virus) 표면에 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)을 발현하는 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는LVP-K1-RBD19 (수탁번호 KCTC 14422BP)일 수 있으며, 기능적으로 동등한 물질을 포함한다. 상기 “기능적 동등한 물질”이란 뉴클레오티드의 치환 결손의 결과로 상기 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열을 갖는 유전자와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 유전자 또는 유전자 조합을 말한다.
아울러, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 항원을 포함하는 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물은 상술한 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 재조합 뉴캐슬병 바이러스와 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
또한, 상기 백신은 바이러스가 약독화된 생독 백신 또는 불활화 백신일 수 있다.
또한, 상기 불활화 백신은 정제된 LVP-K1-RBD19 재조합 NDV 바이러스로서 면역 활성물일 수 있다. 상기 조성물을 포함하는 백신은 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 정제된 바이러스를 수득한 후 이들을 포르말린, 베타프로프리오락톤 (BPL), 이성분 에틸렌이민 (BEI) 또는 감마선으로 처리하거나, 당업자에게 공지된 기타 방법에 의해 비활성화 시킨다. 이어서 비활성화된 바이러스를 제약상 허용 가능한 캐리어 (예컨대 염수 용액) 및 임의의 보조제와 함께 혼합한다. 바람직하게는 최종농도 0.1% 포르말린에서 불활화한 것일 수 있다.
또한, 백신 조성물은 면역증강물질 또는 아쥬반트 (ajuvant)를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 면역증강물질 또는 아쥬반트는 면역반응의 향상 및 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 수산화알루미늄, 광유와 같은 오일 또는 백신에 첨가되거나 이러한 추가의 성분에 의해 각각의 유도 후 신체에 의해 발생되는 보조 분자를 포함할 수 있다. 상기 보조 분자는 인터페론, 인터류킨, 성장인자 등이 있다.
본 백신은 사람에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분을 함유하는 약학적 조성물을 의미한다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 공지된 LVP-K1-RBD19 재조합 NDV 바이러스이다. 또한 백신의 효능 증대를 위해 하나 이상의 추가적인 항원이 포함될 수 있으며 백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 동시에 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 백신은 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 리포좀이나 가용 유리 내로 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피 (transdermal) 팻치에 함유시킬 수도 있다. 액체 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양 (예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.
본 발명의 백신은 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용 가능한" 이란 생리학적으로 허용되고 사람에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며 단백질, 당 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액, 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 면역원성을 증가시키기 위한 면역보조제로서 정형 또는 비정형 유기 또는 무기 고분자등이 사용될 수 있다. 면역보조제는 일반적으로 항원에 대한 화학적 물리적 결합을 통해 면역반응을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 면역보조제로서는 비정형 알루미늄 겔, 오일 에멀젼, 또는 이중 오일 에멀젼 그리고 이뮤노졸 등이 사용될 수 있다. 또한 면역반응의 촉진을 위해 다양한 식물 유래 사포닌, 레바미솔, CpG 다이뉴클레오티드, RNA, DNA, LPS, 다양한 종류의 싸이토카인 등이 사용될 수 있다. 위와 같은 면역 조성물은 다양한 보조제와 면역반응 촉진 첨가물의 조합에 의해 최적의 면역반응 유도를 위한 조성으로 사용될 수 있다. 또한 백신에 추가될 있는 조성물로는 안정제, 불활화제, 항생제, 보존제, 등이 사용될 수 있다. 백신의 투여 경로에 따라 백신 항원은 증류수, 완충용액 등과도 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 백신은 경구, 근육, 피하, 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 근육 투여경로를 통해 투여될 수 있다.
더불어, 본 발명은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 상술한 백신 조성물을 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 백신 조성물과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 "개체"는 질병의 예방, 조절 또는 치료방법을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 감염증에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
나아가, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 숙주 세포주에 접종하는 단계; 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 바이러스 LVP-K1-RBD19는 통상의 바이러스 작출 방법을 통해 회수할 수 있다. SARS-CoV-2 RBD 단백질 발현을 위한 감염성 클론 cDNA 서열번호 2를 제작 완료한 후 3종의 helper plasmid (NP, P, L), modified vaccina virus (MVA/T7)를 HEp-2 세포주에 주입하여 배양한 후 재조합 바이러스를 회수하는 절차는 통상적인 방법에 따라 실시하였다. 세포주에 주입방법은 lipopextamin 3,000을 이용한 transfection을 실시하였으며 세포주는 HEp-2 cell을 이용하였다. 3~4일 배양 후 재조합 바이러스를 회수하여 8에서 10일령 SPF 유정란 allantoic cavity에 접종하여 바이러스를 배양한 후 allantoic fluid를 회수하여 다시 같은 방법으로 유정란에 blind passage를 최소 2대 이상 배양하여 바이러스 역가를 높이는 작업을 수행하였다. 이후 allantoic fluid로부터 통상의 정제 방법을 통해 정제한 후 적절한 세포주로 선정된 Vero 76 cell line에서 배양하여 실험에 사용하였다. 재조합 바이러스주 LVP-K1-RBD19의 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 바이러스 표면 발현을 확인하기 위한 방법은 Reverse transcription PCR 방법을 이용하여 RBD 단백질의 유전자 안정성과 mRNA 발현 및 Western blotting을 이용한 RBD 발현을 확인하였으며 확인을 위해 바이러스 정제를 수행하였다.
재조합 바이러스 배양액을 harvest 한 후 원심분리하여 clarification을 진행한다. Clarification은 원심분리나 micro filtration 방법을 사용할 수 있다. 원심분리 조건은 10,000 g, 10 분, 4 ℃ 조건에서 실행하여 supernatant를 다음 정제 과정에 사용할 수 있다. Micro filtration의 경우 filter의 pore size는 1.0 ㎛ 에서 0.2 ㎛ 사이의 filter를 사용할 수 있으며 바람직하게는 0.45 ㎛ pore size filter를 사용할 수 있다. Filtration 방법은 dead end filtration 이나 cross flow filtration 방법을 사용할 수 있으며 두 방법 모두 적용 가능하다. 재조합 바이러스 정제는 크로마토그래피나 ultrafiltration 방법을 통해 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해 정제 가능하다. 크로마토그래피를 이용한 정제 방법은 친화성, 이온 교환, 크기별 배제 그리고 소수성 등의 결합력 차이를 통해 적절한 resin과 buffer의 조합을 통해 바이러스 정제가 가능하다 통상적으로 바이러스 정제는 sucrose gradient media를 이용한 초고속 원심분리를 하여 바이러스를 침전 또는 분리하여 회수하고 회수된 바이러스는 TNE buffer에 재부유하여 다음 공정에 사용한다. LVP-K-RBD19 재조합 바이러스는 양이온 교환수지 크로마토그래피 방법을 이용하여 정제하였으며 샘플 loading 후 sodium chloride 농도 구배를 통해 특정 농도에서 추출되는 fraction을 회수하였다. 회수된 fraction은 sucrose gradient media를 이용한 초고속 원심분리를 하여 바이러스를 침전 또는 분리하여 회수하고 회수된 바이러스는 주사용 생리식염수에 재부유하여 다음 공정에 사용한다.
또한, 본 발명은 사람에서 SARS-CoV-2에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 백신조성물의 면역 유효량을 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 보호성 면역 반응의 유도법을 제공한다.
또한, 상기 백신 조성물은 생백신 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 면역 반응은 백신 조성물 또는 이를 포함하는 백신 중에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지시된 항체, B 세포, 도움 T 세포, 억제 T 세포, 세포독성 T 세포 및 감마-델타 T 세포의 생산 또는 활성화, 숙주에서 치료학적 또는 보호 면역학적 반응을 나타내어 새로운 감염에 대한 내성이 증진되거나 질환의 임상적 중증도가 감소되는 효과 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 보호 면역 반응일 수 있다.
또한, 상기 보호는 감염된 숙주가 통상적으로 나타내는 임상적 징후의 감소 또는 부재, 보다 신속한 회복 시간 또는 보다 낮아진 지속시간 또는 감염된 숙주의 조직 또는 체액 또는 배설물에서 보다 낮은 바이러스 역가에 의해 입증된다.
또한, 상기 면역 유효량은 면역 반응을 유도하여 사람에서 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 감염의 빈도수 또는 이의 중증도를 감소시킬 수 있는 백신의 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 면역 유효량은 상기 백신 조성물을 포함하는 백신일 경우 정제된 바이러스의 양은 105.0 TCID50/ml 에서108.0 TCID50/ml 일수 있다. 더 바람직하게는 106.0 TCID50/ml 에서 107.0 TCID50/ml 이상일 수 있다.
상기 면역 반응 유도법은 이것에 한정되는 것은 아니지만, 경구, 경피, 근육내, 복막 내, 정맥 내, 피하 내 경로로 상기 백신 조성물을 접종하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 1차 및 2차 접종 시 백신을 근육 내 접종하는 것일 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 동물에 투여하는 단계를 포함하는 동물에서의 면역반응 평가 방법을 제공한다.
또한, 상기 방법은 동물의 혈청으로부터 IgG 항체가를 측정하여 평가하는 것일 수 있다.
상기 동물은 바람직하게는 포유류이며, 본 발명에서는 마우스에서의 면역원성 평가를 포함한다. 상기 피면역원 동물의 근육 또는 피하 또는 경구, 비강 피부를 통해 일정 시간 간격으로 2회 이내 접종을 수행할 수 있으며 바람직하게는 근육 접종을 통해 2주 간격으로 2회 접종을 할 수 있다. 피면역 동물을 면역 시킨 2주 후 꼬리 채혈 또는 안와 채혈을 통해 마우스 혈청을 확보하며, ELISA 시스템을 통해 IgG 항체가를 측정하여 면역 유도에 대한 효과를 확인할 수 있으며 바람직하게는 바이러스 감염을 억제할 수 있는 Virus neutralization antibody titer를 측정하는 것으로 방어항체가를 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 SARS-CoV-2에 대한 중화항체가 측정을 위해 방법을 포함한다. HIV-1 기반 SARS-CoV-2 spike protein 발현 pseudovirus (HIV-2019-nCoV-spikepps-myc-Luc)를 제작하여 바이러스 중화항체에 의한 luciferase 활성을 측정하여 중화항체가를 간접적으로 측정하는 방법을 제공한다. 위 방법을 통해 본 발명에서 시험한 백신의 바이러스 중화항체가는 12배에서 512배 일 수 있으며 바람직하게는 128배에서 256배 일 수 있으며 더 바람직하게는 256배 이상의 중화항체가가 측정되어야 한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> NDV VG/GA-AVINEW주를 기본 backbone으로 한 재조합 NDV 바이러스 게놈 전사 벡터 제조
NDV VG/GA-AVINEW (Gene bank No. KC906188.1)는 약 15 kb 정도의 negative-sense 단일 가닥 RNA를 유전정보로 가지며 6개의 ORFs로 구성되어 있으며 바이러스의 구조를 이루는 단백질은 NP, P, M, F, HN 및 L 유전자를 코딩한다. viral RNA 추출 키트 (Quagen)를 이용하여 RNA를 분리 (isolation) 후, 유전자에 특이적인 4 쌍의 프라이머를 제작하여 Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)을 수행하였다. 상기 유전자에 특이적인 4 쌍의 프라이머는 표 1에 나타내었다. RT-PCR은 42 ℃ 1시간, 94 ℃에서 5분간 반응한 후, 94 ℃ 1분, 60 ℃ 1분, 72 ℃ 1분의 반응을 총 30 사이클 실시한 후, 72 ℃에서 7분간 반응하였으며, 네 조각의 cDNA 절편 세트를 연속적으로 연결시키는 클로닝 전략은 도 1A에 나타내었다. 벡터의 재구성 효율을 높이기 위해 바람직하게는 low-copy-number plasmid인 modified pBR322 벡터로 인식부위와 절단부위가 상이한 PacⅠ과 PmeⅠ제한효소를 위치시켜 클로닝을 수행하였다. Modified pBR322 벡터는 바람직하게는 T7 RNA polymerase promoter의 통제 하에 있으며, NDV 게놈 말단에서 RNA를 분할하는데 사용되는 hepatitis delta virus (HDV) antigenome ribozyme과 T7 terminator 유전자에 의해 종결되도록 위치시켜 바이러스의 encapsidation 및 packaging을 가능하게 하였다. 또한, NDV VG/GA-AVINEW strain의 완전한 게놈 서열을 포함시켜 정확하게 전사되도록 하였다. 이후, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 네 조각으로 나뉘어 cDNA 절편 세트를 연속적으로 연결시키는 클로닝 전략을 이용하였다 (도 1B, C 참조).
RNA-dependent RNA polymerase는 유전자 사이의 stop-start 메커니즘(GE-IG-GS)에 의해 순차적인 방식으로 전사를 시작한다. GS에서 전사의 재개시가 완전하지 않으므로 3' 말단에 위치한 mRNA의 전사 수준이 높다. 따라서 3' 말단 일수록 높은 mRNA 전사 수준을 보이며 5' 말단으로 갈수록 그 수준이 낮아진다. 그러므로 NP 유전자와 P 유전자 사이의 새로운 외부 유전자 삽입은 P 유전자와 M 유전자 및 HN 유전자와 L 유전자 사이에 비해 더 높은 수준의 mRNA 전사와 외부 단백 번역이 일어나므로 NP-P 사이의 유전자 삽입이 더 바람직하다고 할 수 있다.
상기 네 조각의 cDNA 절편은 말단 15 bp의 염기서열이 동일하며, IGS (GE-IG-GS) 서열 및 MCS (multicloning site)로 이루어진 트랜스진 카세트 (transgene cassette)를 overlap cloning법을 이용해 NP 유전자와 P 유전자 사이에 삽입하여 외래 유전자 삽입용 LVP-K1 vector를 구축하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2021003046-appb-I000001
[표 2]
Figure PCTKR2021003046-appb-I000002
<실시예 2> SARS-CoV2 RBD 단백질을 표면에 발현하는 재조합 NDV 바이러스 cDNA 제작
뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 바이러스 표면에 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)을 발현하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제작하였다.
먼저, 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 표면 발현을 위한 NDV 표면 발현 카세트 (뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질의 F2 subunit (signal sequence 및 HR4 포함), fusion peptide, transmembrane domain 및 cytoplasmic domain을 코딩하는 유전자)에 상기 RBD 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 SARS-CoV-2 RBD 단백 발현 유전자 조합 (서열번호 3)을 구성하였다 (도 2 참조). 서열번호 3의 SARS-CoV-2 RBD 단백 발현 유전자 조합은 N 말단에는 FseⅠ 제한효소 인식부위 및 kozak sequence (서열번호 8)를 가지고, C 말단에는 FseⅠ 제한효소 인식부위를 가지고 뉴캐슬병 바이러스의 NP 유전자와 P 유전자 사이에 삽입되도록 디자인하여 합성하였다.
이어서, 실시예 1의 외래 유전자 삽입용 LVP-K1 벡터와 SARS-CoV-2 RBD 단백 발현 유전자 조합 (서열번호 3)을 각각 FseⅠ 제한효소를 처리 후 PCR purification 및 Gel purification kit를 이용하여 정제하였다. 외래 유전자 삽입용 LVP-K1 벡터와 RBD 발현 cassette를 1:3의 비율로 계산 후, T4 ligase를 이용하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 (overnight) 라이게이션 (ligation)을 진행하였으며, E. coli TOP10 competent cell로 열 충격법 (heat shock)을 이용하여 형질전환 (transformation)을 수행하였다. 이후, colony PCR을 통해 seed를 결정 하였으며, plasmid midi preparation을 이용해 뉴캐슬병 바이러스 표면에 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD를 발현하는 플라스미드를 확보하여 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-RBD19 (수탁번호: KCTC 14422BP)를 제작하였다.
<실시예 3> 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-RBD19의 작출
NDV 전사효소 복합체의 개별적인 클론 (NP, P, L)을 pBR322 벡터로 클로닝 하여 helper plasmid로 이용하였다 (pBR322-NP, pBR322-P, pBR322-L). 전날 6-well 플레이트에 5X105 cells/well로 HEp-2 세포를 준비 후 변형된 벡시니아 바이러스 (MVA-T7)를 1 MOI (Multiplicity of infection) 감염시켰다. 상기 세포주에 T7 promoter에 의해 단백질이 발현되는 pBR322-NP, pBR322-P, pBR322-L Helper plasmid와 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD를 표면에 발현하는 플라스미드인 LVP-K1-RBD19를 각각 2.5 μg, 1.5 μg, 0.5 μg, 5 μg을 Lipofectamine 3000 (Invitrogen)과 적정비율로 혼합하여 transfection하였다. 이후 3 내지 4일간 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양 후 HEp-2 세포 상층액을 수확하였다. 이 후 9~11일령의 SPF 발육란의 allantoic cavity로 접종하였으며, 접종 4일 후 요막강액을 채취하였다. (생략 필요: 바이러스 확인 실험을 실시하였다.) 백시니아 바이러스 제거를 위해 PBS를 이용하여 10-3으로 희석된 요막강액을 각각 9~11일령의 SPF 발육란의 allantoic cavity로 접종 뒤 4일 후 요막강액을 채취하여 바이러스 확인 실험을 실시하였다. 바이러스 확인 실험은 요막강액을 Viral RNA extraction kit (Quagen)을 이용하여 분리 (isolation) 후, 추출한 RNA 5 ul와 하기 표 3의 프라이머를 Forward 및 Reverse 각각 1 μl를 이용하여 ONE-STEP RT-PCR로 42 ℃에서 1시간, 94 ℃에서 5분간 반응한 후, 94 ℃에서 1분, 60 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분의 반응을 총 35 사이클 실시한 후, 72 ℃에서 7분간 수행하였으며 그 결과는 도 3A에 나타내었다.
도 3A에 나타낸 바와 같이, 백시니아 바이러스가 제거되고, 뉴캐슬병 바이러스 및 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-RBD19 (서열번호 2)만 남아 있는 것을 확인하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2021003046-appb-I000003
<실시예 4> 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-RBD19 배양 및 정제
Vero 76 세포를 3 X 105 cells/mL로 배양 후 다음날 재조합바이러스 0.05 MOI (Multiplicity of infection)를 접종 2일 후 가장 높은 역가의 바이러스 상층액을 얻었다. 이후, 바이러스 상층액은 부유물을 제거하기 위해 5,000 g, 4 ℃에서 10분간 원심분리하고 상층액을 수거하였다. 수거된 상층액은 재조합 바이러스 농축을 위해 32,000 rpm 4 ℃에서 3 시간동안 초원심분리를 진행하였으며, 상층액을 제거 후 TNE buffer (10 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA)로 재부유하였다. 농축된 바이러스는 30 ~ 60 % sucrose gradient 법을 이용해 32,000 rpm 4 ℃에서 2시간 동안 초원심분리를 진행하였다. 40 ~ 50 %에서 재조합 바이러스를 수득하였다. 마지막으로 수득한 재조합 바이러스를 32,000 rpm 4 ℃에서 2시간 초원심분리를 한번 더 진행하여 수크로스 (Sucrose)를 제거하여 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-RBD19를 정제하였다.
<실시예 5> RBD 발현 표면 발현 확인
실시예 4에서 정제된 재조합 바이러스의 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain) 발현을 확인하였다. 먼저, BCA 단백질 분석을 이용하여 단백질 농도 측정 후, 20 μg의 단백질을 10% SDS-PAGE를 통해 분리하였으며 PVDF 막으로 전기이동 (transfer)하였다. 상기 멤브레인은 SARS Coronavirus Spike Protein Polyclonal Antibody (Invitrogen) 및 NDV HN protein Polyclonal Antibody (Bioss) 항체를 이용해 단백질 발현 확인을 수행하였다. 그 결과는 도 3B에 나타내었다. 도 3B에 나타낸 바와 같이, 각각 약 42 kDa과 약 68 kDa의 재조합 SARS-CoV-2 RBD 단백을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 양성대조군으로 확인한 LVP-K1에서는 SARS Coronavirus Spike Protein Polyclonal Antibody에서는 타겟 밴드가 검출되지 않았으며 NDV HN protein Polyclonal Antibody에서만 밴드가 확인되었으므로, LVP-K1에서는 RBD 단백질이 검출되지 않은 것을 알 수 있다.
<실시예 6> 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-RBD19의 불활화
실시예 4에서 정제된 바이러스의 일부 샘플을 채취하여 Vero 76 세포를 이용하여 바이러스 역가를 측정하였다. 일반적인 TCID50 측정 방법에 따라 바이러스 역가를 측정하였고 바이러스 역가에 따라 PBS 를 이용하여 역가를 조정하였다. 바이러스 역가를 108.0 TCID50/ml로 희석한 다음 수용액 formalin을 0.1 % 되게 첨가하여 4℃에서 48시간 동안 보관하였으며, 불활화 이후 6, 12, 24, 36, 48시간 샘플을 채취하여 Vero 76 세포를 이용한 바이러스 감염으로 인한 CPE를 관찰하기 위해 5일동안 TCID50법을 이용하여 역가를 관찰해 불활화 여부를 확인하였다. 불활화 실험 결과 24시간 이내에 모든 바이러스의 감염 활성이 없어지는 것을 확인하였으며 추가 실험에 사용되는 바이러스 항원은 도 4에 나타낸 바와 같이 최종 농도 0.1 % formalin에서 24시간 불활화한 바이러스 항원을 사용하였다.
<실시예 7> 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-RBD19의 면역원성 확인
재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-RBD19는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)가 표면에 발현되는 것으로, RBD의 항원으로써 RBD에 대한 항체 생성 효과를 확인하기 위해 실시예 4에서 정제된 LVP-K1-RBD19를 7주령, 암컷인 BALB/c 마우스에 다음과 같이 백신 접종을 실시하였다. 구체적으로, FBS 10 % 를 함유하는 바이러스 배양용 배지 접종 그룹 (음성대조군), LVP-K1 불활화 바이러스 접종 그룹 (양성대조군), LVP-K1-RBD19 불활화 바이러스 106.0 TCID50/dose, 107.0 TCID50/dose의 항원량으로 총 4 그룹으로 나누어 각 그룹당 5 마리씩 백신 접종을 진행하였으며, 100 μl/마리의 양으로 2주 간격으로 2회 근육 접종을 진행하였다. 최초의 접종일로부터 백신 접종 전, 백신 접종 2주 후 (2차 접종 시)와 접종 후 3, 4 주차에 안와 채혈을 통해 항혈청을 준비하였다. 이어서, 항혈청과 RBD 단백질과의 항체 반응을 확인하기 위하여 ELISA 항체 측정을 실시하였다. LVP-K1-RBD19 항원에 의한 SARS-CoV-2 RBD 단백질에 대한 항체가를 측정하기 위해 재조합 CHO cell을 이용하여 발현한 재조합 RBD 단백질을 2.5 ug/mL을 각 well에 100 μl씩 ELISA 측정용 96 well plate에 coating 하였으며, PBS로 100배 희석한 혈청을 이용하여 일반적인 ELISA 측정 방법에 따라 항체가를 측정하였다. 그 결과는 도 5A에 나타내었다.
도 5A에 나타낸 바와 같이, LVP-K1-RBD19 바이러스 항원을 접종한 그룹의 RBD 단백질에 대한 total IgG 항체가가 대조군과 유의한 차이를 나타내는 것을 확인하였으며, LVP-K 항원 접종 그룹에서보다 106.0 TCID50/dose의 항체가가 상당히 높았고 107.0 TCID50/dose 항원 농도에서의 항체가가 더욱 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 LVP-K1-RBD19 바이러스 항원을 통해 SARS-CoV-2 RBD 단백질에 대한 IgG 항체 형성이 효과적으로 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 8> 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-RBD19의 RBD 단백질에 대한 중화항체가 평가
실시예 6을 통해 확보한 LVP-K1-RBD19 바이러스 항원에 의한 중화항체 유도시험을 실시하였다. 중화항체가 시험은 pseudovirus (HIV-2019-nCoV-spike pps-myc-Luc)를 이용하여 실시하였다. 구체적으로, 실시예 7로부터 얻어진 혈청을 96 well plate에 2진 희석법으로 희석한 뒤 동량의 pseudovirus (virus titer: 1 X 103.0 TCID50/ml)를 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시킨다. 반응이 끝난 후 미리 준비된 96 well plate에 monolayer가 형성된 Huh7 세포로 이송하여 1시간 동안 반응시킨다. 반응이 끝나면 바이러스와 혈청 혼합 용액을 제거한 뒤, FBS가 포함되지 않은 세포배양용 배지로 1회 세척한 후 세포 배양용 배지를 넣어 37 ℃ CO2incubator에서 18시간 배양한다. Luciferase assay는 bright Glo luciferase assay system (Promega)를 이용하여 세포에서 발광되는 형광 (Fluc)을 측정하였다. 배지를 버리고 luciferase lysis buffer를 각 well 당 50 ul씩 넣어준 뒤 -70 ℃에서 24시간 냉동 보관한 뒤 luciferase reagent를 첨가하여 Relative light unit (RLU)를 측정하였다. RLU 측정은 GLOMAX luminometer를 이용하여 측정하였으며 바이러스 중화항체가로 변화는 하기 수학식 1의 산출식에 따라 계산하였으며, 중화항체 중위값 (median neutralization dose)는 Reed-Munch 방법으로 계산하였다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2021003046-appb-I000004
<실시예 9> 항원의 독성 및 안전성 평가
항원의 독성 및 안전성 평가를 위해 50 μl 의 PBS에 2.0 X 107.0 TCID50의 LVP-K1-RBD19 항원을 C57BL/6 마우스의 대퇴 근육에 2주 간격으로 2회 접종 한 후 4주간 체중 변화와 사료섭취량, 음수량을 측정하였다. 음성 대조군은 동량의 PBS 를 같은 방법으로 접종하였다. 각각의 시험 그룹당 마우스는 10마리로 수행하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, PBS 접종군과 항원 접종군 사이에 체중 변화, 사료섭취량 및 음수량에서 큰 차이가 없음을 확인하였다. 이러한 결과는 LVP-K1-RBD19 바이러스 항원은 독성이 없고 안전성이 우수하여 SARS-CoV-2 바이러스 예방 및 치료용 백신으로 사용하기에 적합하다는 것을 의미한다.
[미생물기탁증]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)
수탁번호 : KCTC 14422BP
수탁일자 : 20201229
Figure PCTKR2021003046-appb-I000005

Claims (15)

  1. NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle Disease Virus) cDNA 및 트랜스진 카세트 (Transgene cassette)를 포함하고,
    상기 트랜스진 카세트 (Transgene cassette)는 IGS 서열 (Gene end (GE), Intergenic sequence (IG), Gene start (GS)) 및 MCS (multicloning site)로 이루어진 것인, 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 벡터는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 트랜스진 카세트 (Transgene cassette)는 뉴캐슬병 바이러스의 NP 유전자와 P 유전자 사이에 삽입되는 것을 특징으로 하는, 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터.
  4. 제1항의 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터 및 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)을 코딩하는 유전자를 포함하는, 재조합 뉴캐슬병 바이러스.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 NDV 표면 발현 카세트 (NDV surface expression cassette)를 더 포함하는 것을 특징으로 하고,
    상기 NDV 표면 발현 카세트는 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (Fusion protein)의 F2 subunit, fusion peptide, transmembrane domain 및 cytoplasmic domain을 코딩하는 유전자로 이루어진 것이며,
    상기 F2 subunit은 signal sequence를 포함하는 것인, 재조합 뉴캐슬병 바이러스.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 서열번호 8의 아미노서열로 표시되는 kozak sequence 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 뉴캐슬병 바이러스.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle Disease Virus) 표면에 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)을 발현하는 것을 특징으로 하는, 재조합 뉴캐슬병 바이러스.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 LVP-K1-RBD19 (수탁번호 KCTC 14422BP)인 것인, 재조합 뉴캐슬병 바이러스.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 항원을 포함하는, 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 백신은 바이러스가 약독화된 생독 백신 또는 불활화 백신인 것인, 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 면역증강물질 또는 아쥬반트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  12. 제9항의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 사스코로나 (SARS-CoV-2) 바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법.
  13. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 숙주 세포주에 접종하는 단계;
    상기 숙주 세포주를 배양하는 단계; 및
    상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는, 재조합 뉴캐슬병 바이러스 제조 방법.
  14. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서의 면역반응 평가 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 방법은 동물의 혈청으로부터 IgG 항체가를 측정하여 평가하는 것인, 동물에서의 면역반응 평가 방법.
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