ES2589057T3 - Proteína quimérica - Google Patents

Proteína quimérica Download PDF

Info

Publication number
ES2589057T3
ES2589057T3 ES10734527.4T ES10734527T ES2589057T3 ES 2589057 T3 ES2589057 T3 ES 2589057T3 ES 10734527 T ES10734527 T ES 10734527T ES 2589057 T3 ES2589057 T3 ES 2589057T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
ibv
chimeric
protein
cell
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10734527.4T
Other languages
English (en)
Inventor
Paul Britton
Erica Bickerton
Maria Armesto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pirbright Institute
Original Assignee
Pirbright Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pirbright Institute filed Critical Pirbright Institute
Application granted granted Critical
Publication of ES2589057T3 publication Critical patent/ES2589057T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Una proteína S de virus de bronquitis infecciosa (IBV) quimérica que se basa en una proteína S de una cepa de IBV con tropismo tisular restringido a infección de células primarias, pero que comprende al menos parte de la subunidad S2 de una cepa de IBV con tropismo tisular extendido que, además de ser capaz de infectar células primarias, es capaz de infectar una o más líneas celulares, de modo que un IBV que comprende la proteína S quimérica es capaz de crecer en una línea celular.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Protelna quimerica Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a una protelna S de IBV quimerica. En particular una protelna S de IBV quimerica que, cuando se usa para producir un virus, provoca que el virus tenga tropismo tisular extendido. La presente invencion tambien se refiere a secuencias de nucleotidos que codifican dicha protelna quimerica; partlculas virales que comprenden dicha protelna quimerica y su uso en una vacuna para prevenir y/o tratar una enfermedad.
Antecedentes de la invencion
Virus de la bronquitis infecciosa (IBV)
El virus de la bronquitis infecciosa aviar (IBV) es un patogeno altamente infeccioso y contagioso de las aves domesticas que se replica principalmente en el tracto respiratorio pero tambien en celulas epiteliales del intestino, rinon y oviducto. El IBV es un miembro de los Coronaviridae y coronavirus geneticamente muy similares provocan enfermedad en pavos y faisanes.
Las senales cllnicas de BI incluyen estornudos, estertores traqueales, descarga nasal y sibilacion. Las aves de tipo carnico tienen aumento de peso reducido, mientras que las aves ponedoras ponen menos huevos. La infeccion respiratoria predispone a los pollos a infecciones bacterianas secundarias que pueden ser letales en polluelos. El virus tambien puede provocar dano permanente en el oviducto, especialmente en polluelos, lo que conduce a una produccion y una calidad de huevos reducidas; y en el rinon, lo que conduce en ocasiones a enfermedad renal que puede ser letal.
Se usan en la actualidad vacunas tanto vivas como atenuadas en la vacunacion de BI. Hasta la fecha, las vacunas mas eficaces son virus atenuados vivos producidos de forma emplrica despues de pases repetidos con ocultacion a traves de huevos embrionados.
Un problema con este enfoque es que, tras el pase en serie, la inmunogenicidad del virus se reduce. Es necesario conseguir un equilibrio entre un grado aceptable de atenuacion para hacer al virus seguro, y una perdida aceptable de inmunogenicidad de modo que la vacuna del virus aun sea eficaz. Este “equilibrado” de la atenuacion es un enfoque de ensayo y error, que hace el resultado del proceso de atenuacion incierto.
Ya que la atenuacion por pase en serie es en la practica un acontecimiento aleatorio, la vacuna resultante esta geneticamente mal definida ya que la base molecular de la atenuacion se desconoce. Cada lote de virus atenuado sera diferente, haciendo diflcil conseguir uniformidad de la vacuna resultante y reproducibilidad del efecto protector/terapeutico in vivo.
Una desventaja adicional es que los huevos embrionados son caros y no pueden usarse como una fuente prolongada de virus.
El cultivo del virus en huevos embrionados es un proceso incomodo ya que cada huevo debe esterilizarse, mirarse al trasluz, inocularse con virus e incubarse antes de recoger volumenes pequenos de llquido alantoideo de cada huevo y agrupar antes de la purificacion. La falta de progresiones fiables de huevos de alta calidad da como resultado limitaciones en la cantidad de vacuna que puede producirse, particularmente en una situacion de emergencia.
Ademas de estos problemas loglsticos y de provisiones, los huevos embrionados tienen otras limitaciones como un sistema hospedador para la produccion de vacuna. Por ejemplo, hay preocupaciones crecientes acerca de la presencia de virus adventicios, particularmente retrovirus en huevos, que comprometerlan la produccion de vacunas virales atenuadas vivas.
Existe por lo tanto la necesidad de vacunas de IBV alternativas y metodos para su produccion que no padezcan las desventajas anteriormente mencionadas.
Coronavirus
Los coronavirus son virus con envoltura que se replican en el citoplasma celular y contienen un genoma de ARN con sentido positivo, monocatenario de 27 a 32 kb.
Todas las envolturas lipldicas de coronavirus contienen al menos tres protelnas de membrana: la glucoprotelna spike (S), protelna integral de membrana (M) y protelna pequena de membrana (E). La protelna S de coronavirus es una glucoprotelna de tipo I que oligomeriza en el retlculo endoplasmico y se ensambla en membranas de viriones mediante interacciones no covalentes con la protelna de membrana. Despues de la incorporacion en partlculas de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
coronavirus, la protelna S es responsable de la union con el receptor de celula diana y fusion de las membranas viral y celular. La glucoprotelna S consiste en cuatro dominios: una secuencia senal que se escinde durante la slntesis; el ectodominio, que esta presente en el exterior de la partlcula del virion; la region transmembrana responsable del anclaje de la protelna S en la bicapa lipldica de la partlcula de virion; y la cola citoplasmatica.
La protelna S de IBV (1.162 aminoacidos) se escinde en dos subunidades, S1 (535 aminoacidos; 90 kDa) que comprende la mitad N terminal de la protelna S, y S2 (627 aminoacidos; 84 kDa) que comprende la mitad C terminal de la protelna S.
La subunidad de protelna S2 se asocia de forma no covalente con la subunidad S1 y contiene los dominios transmembrana y de cola citoplasmatica C terminal.
Se ha indicado ampliamente que la subunidad S1 comprende la actividad de union a receptor de la protelna S.
Por ejemplo, se ha mostrado para el coronavirus de serogrupo I, coronavirus humano HCoV 229E, que de tres variantes que tienen truncamiento en el dominio N terminal de S1, dos eran incapaces de unirse con el receptor, lo que implica que la region entre los aminoacidos 417 y 547 son importantes para la union al receptor (Bonavia et al
(2003) J. Virol 77. 2530-2538).
Los primeros 330 aminoacidos de la subunidad S1 de 769 restos de la protelna S del virus de la hepatitis de raton (MHV) son suficientes para unirse con el receptor de MHV (Kubo et al (1994) J. Virol. 68: 5403-5410). De forma similar, un fragmento de 193 aminoacidos de la protelna S de SARS (restos 318-510) se une con el receptor y bloquea la infeccion mediada por protelna S (Wong et al (2004) J. Biol. chem. 279: 3197-3201).
Tambien se ha indicado que los aminoacidos 1-510 de la glucoprotelna S de SARS-CoV representa un dominio que contiene el sitio de union a receptor (aminoacidos 270-510) analogo de la subunidad S1 de otras glucoprotelnas S de coronavirus (Babcock et al (2004) J. Virol. 4552-4560).
La protelna S es un determinante del tropismo celular del virus (Casias et al (2003) J. Virol. 77: 9084-9089). Se ha mostrado que sustituciones de aminoacidos en la region N terminal de la protelna S1 estan asociadas con el intervalo de hospedador extendido de una variante viral del virus de la hepatitis murina (MHV) (Thackray y Holmes
(2004) Virology 324: 510-524). Ademas, se cree en general que la especificidad de especie de la infeccion se debe a la especificidad de la interaccion de virus-receptor (Compton et al (1992) J. Virol. 7420-7428; Gagneten et al (1995) J. Virol. 69: 889-895).
Hasta la fecha, se ha supuesto ampliamente que el tropismo celular es una propiedad del dominio S1 de la protelna S de coronavirus.
Sumario de la invencion
La invencion en su sentido mas amplio es como se define en las reivindicaciones independientes.
Los presentes inventores han mostrado sorprendentemente que el tropismo celular de coronavirus se determina por la protelna S2, y que la sustitucion de la protelna S2 con todo o parte de otro coronavirus puede alterar (extender o reducir) el tropismo celular del virus, dependiendo del tropismo celular del virus del que derivo la protelna S2. Esto significa que pueden inducirse vacunas de virus inmunogenicas que son incapaces de crecer en llneas celulares para hacerlo por sustitucion de todas o parte de sus protelnas S2.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invencion proporciona una protelna S de virus de bronquitis infecciosa (IBV) quimerico que se basa en una protelna S de una cepa de IBV con tropismo tisular restringido a infeccion de celulas primarias, pero que comprende al menos parte de la subunidad S2 de una cepa de IBV con tropismo tisular extendido que, ademas de ser capaz de infectar celulas primarias, es capaz de infectar una o mas llneas celulares, de modo que un IBV que comprende la protelna S quimerica es capaz de crecer en una llnea celular.
La protelna S quimerica puede comprender toda o parte de la subunidad S2 de la cepa de IBV con tropismo tisular extendido. Por ejemplo, una protelna S de virus de bronquitis infecciosa (IBV) quimerica puede comprender una parte de la secuencia de S2 que comprende la secuencia XBBXBX en la parte de la protelna S2 correspondiente a entre los restos 686 y 691 de la secuencia proporcionada como SEQ ID No. 1, en la que B es un resto de aminoacido basico y X es cualquier aminoacido.
La secuencia de XBBXBX puede, por ejemplo, ser la secuencia SRRKRS o SRRRRS. La protelna S quimerica puede comprender la secuencia SRRKRSLIE o SRRRRSVIE en la parte de la protelna S2 correspondiente a entre los restos 686 y 694 de la secuencia proporcionada como SEQ ID No. 1.
El coronavirus es virus de bronquitis infecciosa (IBV).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La cepa de IBV con tropismo tisular extendido puede ser IBV Beaudette.
En un segundo aspecto, la presente invencion proporciona una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna S quimerica de acuerdo con el primer aspecto de la invencion.
La invencion tambien proporciona un plasmido que comprende una secuencia de nucleotidos de acuerdo con el segundo aspecto de la invencion.
En un tercer aspecto, la presente invencion proporciona una partlcula viral que comprende una protelna S quimerica de acuerdo con el primer aspecto de la invencion y/o una secuencia de nucleotidos de acuerdo con el segundo aspecto de la invencion.
La partlcula viral puede ser un virus de vaccinia recombinante (rVV) o un IBV.
La partlcula de IBV puede ser capaz de crecer en una llnea celular tal como celulas Vero.
La infeccion de celulas Vero por una partlcula de IBV de acuerdo con el tercer aspecto de la invencion puede bloquearse por heparina soluble.
En un cuarto aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para preparar una partlcula viral de acuerdo con el tercer aspecto de la invencion que comprende las siguientes etapas:
(i) transfectar un plasmido como se ha descrito en la seccion previa en una celula hospedadora;
(ii) infectar la celula hospedadora con un virus recombinante que comprende el genoma de la cepa de IBV con tropismo tisular restringido, que carece de al menos parte de la subunidad S2;
(iii) permitir que se produzca recombinacion homologa entre las secuencias del gen S en el plasmido y las secuencias correspondientes en el genoma de virus recombinante para producir un gen S quimerico; y
(iv) seleccionar virus recombinantes que comprenden el gen S quimerico.
El virus recombinante puede ser virus vaccinia.
Para generar una partlcula de coronavirus recombinante, puede usarse el ADN de virus de la etapa (iv) para generar ARN de coronavirus in situ usando un sistema genetico inverso.
El metodo anterior incluye por lo tanto opcionalmente la etapa:
(v) recuperar IBV recombinante que comprende el gen S quimerico del ADN del virus recombinante de la etapa (iv).
En un quinto aspecto, la presente invencion proporciona una celula que comprende una secuencia de nucleotidos de acuerdo con el segundo aspecto y que es capaz de producir una partlcula viral de acuerdo con el cuarto aspecto de la invencion. La celula puede, por ejemplo, ser una celula, tal como una celula de rinon de polluelo primaria, capaz de producir virus recombinante usando un sistema de genetica inversa, o una celula infectada con una partlcula viral de acuerdo con el cuarto aspecto de la invencion.
La celula infectada con una partlcula viral de acuerdo con el cuarto aspecto de la invencion puede ser derivable de una llnea celular, tal como una celula Vero.
En un sexto aspecto, la presente invencion proporciona una vacuna que comprende una partlcula viral del cuarto aspecto de la invencion.
Aspectos adicionales de la invencion proporcionan:
(i) una vacuna de acuerdo con el sexto aspecto de la invencion para uso en el tratamiento y/o prevencion de una enfermedad en un sujeto;
(ii) un metodo para producir una vacuna de acuerdo con el sexto aspecto de la invencion, que comprende la etapa de infectar celulas Vero con una partlcula viral de acuerdo con el cuarto aspecto de la invencion;
(iii) un metodo para alterar el tropismo celular de un IBV que comprende la etapa de sustitucion de al menos una parte de la protelna S2 con la protelna S2, o parte correspondiente de la misma, de una cepa de IBV diferente; y
(iv) un cultivo celular que comprende una celula o una poblacion de celulas de acuerdo con el quinto aspecto de la invencion.
El tropismo celular extendido conferido al virus por la presencia del gen quimerico significa que puede producirse reserva de virus para produccion de vacuna cultivando en llneas celulares, en lugar de huevos embrionados o celulas primarias.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El uso de ilneas celulares tales como celulas Vero tiene muchas ventajas:
(i) se ha validado previamente para el cultivo de virus y fines de diagnostico;
(ii) las celulas (y por lo tanto virus) pueden cultivarse en suspension, en lugar de lechos planos; y
(iii) es posible conseguir rendimientos uniformes.
Description de las figuras
Figura 1 - diagrama esquematico de la protelna S de IBV. La protelna S funcional esta glucosilada y esta presente como un homotrlmero en la membrana del virion. La forma trimerica de las subunidades S1 constituye el dominio de union a receptor.
Figura 2 - diagrama esquematico que muestra las protelnas S de Beaudette (Beau-R) y M41 y las protelnas S quimericas BeauR M1B2(S), BeauR-B1M2(S), Beau-S-M41-M41 y Hep-S- Beau-Hep. El dominio transmembrana (TM) y el dominio de cola citoplasmatica (cito) de todas las protelnas S quimericas derivan de la protelna S de Beaudette. La position del sitio de union a heparan sulfato en la subunidad de S2 se indica como HSBS.
Figura 3 - generation de plasmidos que contienen genes de glucoprotelna S quimericos. Las subunidades S1 y S2 de Beau-R y M41 se amplificaron a partir de dos plasmidos, pGPT-M41S y pGPT-IBV-Stul-BamHI, por PCR usando cebadores localizados en el gen de replicasa, a traves del punto de union S1/S2 y el gen 3. Se uso PCR solapante para combinar las subunidades, formando los genes S quimericos, que despues se cortaron con Nsil (sitio de restriction localizado en el gen de replicasa) y BspEI (sitio de restriction localizado en el gen 3). El plasmido receptor, pGPT-IBV-StuI-BamHI, tambien se corto con NsiI y BspEI y el gen S de Beaudette se retiro por extraction en gel. Los genes S quimericos se ligaron a la cadena principal de pGPT-IBV-StuI-BamHI restante que contenla el gen de guanina xantina fosforribosiltransferasa (GPT) de E. coli.
Figura 4 - diagramas de pGPT-IBV-StuI-BamHI y pGPT-M41 S.
Los plasmidos pGPT-IBV-StuI-BamHI y pGPT-M41S se usaron para amplificar las subunidades S1 y S2 de Beau-R y M41 por PCR. El gen de replicasa y el gen 3 que rodean a los genes S derivan de Beaudette. El extremo C terminal del gen S de M41 en pGPT-M41S se ha intercambiado por el extremo C del gen S de Beau-R debido a que esta es el area que interacciona con la protelna M. Los extremos C terminales de las protelnas S de M41 y Beau-R son muy diferentes entre si para permitir la interaction de la protelna S quimerica con las otras protelnas estructurales de Beau-R, se decidio mantener el extremo C terminal del gen S de Beau-R. El gen S de Beau-R se retiro de pGPT-IBV-StuI-BamHI y los genes S quimericos se insertaron en su lugar para crear los plasmidos pGPT- S1m41S2b eau y pGPT-S1 BeauS2M41.
Figura 5 - el sistema de genetica inversa de IBV.
Se construye un vector plasmldico que contiene gpt del gen S quimerico y partes de los genes adyacentes en el genoma de IBV. El plasmido se transfecta en celulas Vero infectadas con rVV que contiene el genoma de IBV menos el gen S. Se llevan a cabo tres ciclos de purification en placas en presencia de componentes de selection de gpt y tres ciclos en ausencia para seleccionar rVV que contiene el gen S quimerico. Se preparan grandes reservas de virus en celulas BHK-21 de las que se purifica virus y se extrae ADN. Se transfecta AdNc de IBV recombinante dentro del genoma de VV y un plasmido que expresa la protelna N de IBV a celulas CK infectadas con rFPV-T7. El sobrenadante se filtra y se usa para pase en celulas CK y rIBV con el gen S quimerico se recupera.
Figura 6 - celulas Vero infectadas 48 horas despues de la infection con diversos IBV.
Figura 7 - microscopla confocal de crecimiento de rIBV en celulas Vero. Las celulas Vero se infectaron con rIBV y se fijaron 24 horas despues de la infeccion y se inmunomarcaron con anti ARNbc de raton, anticuerpo secundario AlexaFluor 488 de cabra anti raton (verde, Invitrogen) para detectar celulas infectadas por IBV. Los nucleos de todas las celulas se marcaron con DAPI (azul).
Figura 8 - cinetica de crecimiento de rIBV en celulas Vero. Las celulas Vero se infectaron con Beau-R, M41-CK, BeauR-M41 (S), BeauR-M1B2 (S), BeauR-B1M2 (S), Beau-S-M41-Hep y M41-S-Beau-Hep a una multiplicidad de infeccion de 0,1. El sobrenadante se recogio a 1, 12, 24, 48 y 72 horas despues de la infeccion y se valoro en celulas CK. Se realizaron tres repeticiones y se tomaron los promedios. Las barras de error indican el error tlpico de la media.
Figura 9 - ensayo de reduction de placas en celulas Vero de IBV pretratado con cantidades crecientes de heparina soluble.
Figura 10 - grafico de barras que compara el efecto de la heparina soluble en el porcentaje de celulas Vero infectadas por IBV. Las cepas de IBV Beau-R y BeauR-M1B2 (S) se incubaron con PBS (-) o heparina soluble, 15 mg/ml (+) durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de infectar celulas Vero. Las celulas se fijaron 24 horas despues de la infeccion, despues se inmunomarcaron con a-ARNbc de raton, anticuerpo secundario de cabra a-IgG
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de raton (verde, Invitrogen) y se tineron nucleos en azul con DAPI. Se analizaron diez campos de vision por muestra mediante microscopia confocal a aumento 40x y se calculo el porcentaje de celulas infectadas.
Figura 11 - alineamiento entre Beaudette (Beau-R), M41, teniendo Beaudette el sitio de union a heparan sulfato modificado para la secuencia de M41 correspondiente (BEAUS-M41-Hep) y teniendo M41 el sitio de union a heparan sulfato de Beaudette (M41-S-Beau-Hep).
Figura 12 - comparacion de a) secuencias de proteinas S y b) region de S2 de Beaudette y M41.
Figura 13 - diferencias de aminoacidos entre proteinas S de M41 y Beaudette.
Figura 14 - diferencias de aminoacidos entre regiones S2 de M41 y Beaudette.
Description detallada
La invention en su sentido mas amplio es como se define en las reivindicaciones independientes.
Coronavirus
El coronavirus es un genero de virus animal que pertenece a la familia Coronaviridae. Los coronavirus son virus con envoltura con un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo y una simetria helicoidal. El tamano genomico de coronavirus varia de aproximadamente 27 a 32 kilobases, que es el tamano mas largo para cualquier virus de ARN conocido.
Los coronavirus infectan principalmente el tracto respiratorio superior y gastrointestinal de mamiferos y aves. De cuatro a cinco diferentes cepas actualmente conocidas de coronavirus infectan a seres humanos. El coronavirus humano mas publicitado, SARS-CoV, que provoca SDRA, tiene una patogenesis unica porque provoca infecciones tanto del tracto respiratorio superior como inferior y tambien puede provocar gastroenteritis. Se cree que los coronavirus provocan un porcentaje significativo de todos los resfriados comunes en adultos humanos. Los coronavirus tambien provocan una serie de enfermedades en animales de granja y mascotas domesticadas, algunas de las cuales pueden ser graves y son un peligro para la industria agraria. Los coronavirus economicamente significativos de animales de granja incluyen virus de la bronquitis infecciosa (IBV), que provoca principalmente enfermedad respiratoria en pollos y afecta gravemente a la industria de las aves de corral en todo el mundo; coronavirus porcino (gastroenteritis transmisible, TGE) y coronavirus bovino, que dan como resultado ambos diarrea en animales jovenes. El coronavirus felino tiene dos formas, el coronavirus enterico felino es un patogeno de importancia clinica menor, pero la mutation espontanea de este virus puede dar como resultado peritonitis infecciosa felina (FIP), una enfermedad asociada con una alta mortalidad. Tambien hay dos tipos de coronavirus canino (CCoV), uno que provoca enfermedad gastrointestinal leve y uno que se ha descubierto que provoca enfermedad respiratoria. El virus de la hepatitis de raton (MHV) es un coronavirus que provoca una enfermedad murina epidemica con una alta mortalidad, especialmente entre colonias de ratones de laboratorio.
Los coronavirus se dividen en tres grupos, como se muestra a continuation:
Grupo 1
• Coronavirus canino (CCoV)
• Coronavirus felino (FeCoV)
• Coronavirus humano 229E (HCoV-229E)
• Virus de la diarrea epidemica porcina (PEDV)
• Virus de gastroenteritis transmisible (TGEV)
• Coronavirus humano NL63 (NL o New Haven)
Grupo 2
• Coronavirus bovino (BCoV)
• Coronavirus respiratorio canino (CRCoV) - Comun en el sureste de Asia y Micronesia
• Coronavirus humano OC43 (HCoV-OC43)
• Virus de la hepatitis de raton (MHV)
• Virus de la encefalomielitis hemaglutinante porcina (HEV)
• Coronavirus de rata (VN). El coronavirus de rata es bastante prevalente en este de Australia donde, hasta marzo/abril de 2008, se ha descubierto entre colonias de roedores nativas y silvestres.
• Coronavirus de pavo (TCoV)
• (Sin ningun nombre comun aun) (HCoV-HKU1)
• Coronavirus de sindrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Grupo 3
• Virus de la bronquitis infecciosa (IBV)
• Coronavirus de pavo (virus de enfermedad de Bluecomb)
El virus de la presente invention es un IBV.
IBV
La bronquitis infecciosa (IB) aviar es una enfermedad respiratoria aguda y altamente contagiosa de pollos que provoca perdidas economicas significativas. La enfermedad se caracteriza por senales respiratorias incluyendo jadeos, tos, estornudos, estertores traqueales y descarga nasal. En pollos jovenes, puede producirse dificultad respiratoria grave. En ponedoras, son comunes dificultad respiratoria, nefritis, reduction de la production de huevo y perdida de calidad interna de huevo y calidad de cascara de huevo.
En pollos de engorde, son senales cllnicas comunes la tos y crepitation, que se propagan rapidamente en todas las aves de la instalacion. La morbilidad es 100 % en bandadas no vacunadas. La mortalidad varla dependiendo de la edad, la cepa del virus y las infecciones secundarias pero puede ser de hasta el 60 % en bandadas no vacunadas.
El primer serotipo de IBV identificado fue Massachusetts, pero en los Estados Unidos estan en circulation en la actualidad varios serotipos, incluyendo Arkansas y Delaware, ademas del tipo Massachusetts identificado originalmente.
La cepa de IBV Beaudette se derivo despues de al menos 150 pases en embriones de polluelos. IBV Beaudette ya no es patogeno para aves adultas, pero mata rapidamente los embriones.
La Figura 12 y la Tabla 1 muestran las diferencias de aminoacidos entre IBV Beaudette y M41.
H120 es una cepa de vacuna de serotipo Massachusetts de IBV viva comercial, atenuada por aproximadamente 120 pases en huevos de pollos embrionados. H52 es otra cepa de Massachusetts, y representa un virus de pase anterior y ligeramente mas patogenico (pase 52) durante el desarrollo de H120. Se usan habitualmente vacunas basadas en H120 y H52.
Protelna S
La protelna S de coronavirus comprende un ectodominio muy glucosilado, grande, que puede escindirse durante la bioslntesis en dos subunidades (S1 y S2) por una enzima de tipo furina en el aparato de Golgi. No todos los coronavirus se escinden, pero incluso sin escision la estructura basica de subunidad de la protelna S se conserva. S1 comprende el dominio de union al receptor (Li et al (2005), Science 309: 1864-1868) y S2 comprende el dominio de fusion. La protelna S de IBV se escinde completamente en el llmite S1/S2, especialmente en sistemas de embrion de pollo.
El dominio S2 contiene cinco dominios o regiones funcionales, como se muestra en la Figura 1: dos dominios, HR1 y HR2, forman estructuras helicoidales que dan como resultado la estructura de tallo de la protelna; un dominio transmembrana responsable de anclar la protelna en la membrana de virion; un dominio citoplasmatico rico en cistelna responsable de interaccionar con otras protelnas estructurales de virus y un quinto dominio, el peptido de fusion, responsable de fusion virus-celula o fusion entre celulas.
Las diferencias de aminoacidos entre las protelnas S de M41 y Beaudette y las regiones S2 se muestran en las Figuras 13 y 14, respectivamente.
Tropismo tisular
Los coronavirus muestran fuerte tropismo de especie y tisular. De forma similar, los aislados cllnicos de IBV muestran tropismo definido tanto in vivo como en cultivo celular.
La cepa M41 se ha adaptado para crecimiento en celulas de rinon de polluelo primarias (CK) y se restringe a infection de celulas de pollo primarias, y por lo tanto es necesario cultivarla en huevos embrionados o celulas CK.
Se sabe que la cepa Beaudette, por otro lado, es capaz de infectar una serie de celulas en cultivo, incluyendo celulas Vero y celulas de rinon de crla de hamster (BHK).
Un coronavirus con tropismo tisular restringido es capaz de infectar un numero menor de tipos celulares que un coronavirus con tropismo tisular extendido.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Un coronavirus con tropismo tisular restringido puede, por ejemplo, restringirse a infeccion de celulas primarias, mientras que un coronavirus con tropismo tisular extendido puede (ademas de ser capaz de infectar celulas primarias) ser capaz de infectar una o mas llneas celulares.
Un coronavirus con tropismo tisular extendido puede, por ejemplo, tener la capacidad de infectar celulas Vero.
El linaje celular Vero se aislo en 1962 de celulas epiteliales de rinon extraldas de un mono verde africano (Cercopithecus aethiops). Las celulas Vero se usan para muchos fines experimentales y cllnicos, incluyendo su accion como celulas hospedadoras para cultivar virus.
El linaje celular Vero es continuo porque puede replicarse a traves de muchos ciclos de division y no se convierte en senescente.
El linaje celular Vero se ha autorizado para su uso en la fabricacion de vacunas y se usa actualmente para la produccion de vacunas de la polio y rabia.
La cepa con tropismo tisular restringido puede ser inmunogenica y capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora o terapeutica in vivo. La cepa con tropismo tisular restringido puede, por ejemplo, ser una cepa usada en la actualidad para produccion de vacunas. Para IBV, esto incluye cepas tales como: H52, H120, Ma5, 4/91, D41, D274 y W93. La cepa con tropismo tisular restringido puede ser o derivar de un aislado “del campo” tal como BJ1, BJ2 o BJ3 (Li y Yang (2001) Avian Pathol 30: 535-541).
Para IBV, la cepa con tropismo tisular extendido puede, por ejemplo, ser IBV Beaudette, de modo que la protelna quimerica de la invencion comprende toda o parte de la protelna S2 de IBV Beaudette.
Puede establecerse tropismo celular experimentalmente simplemente exponiendo un tipo celular dado a infeccion por un virus. Despues puede analizarse el efecto citopatico (cpe) y el grado de formacion de sincitios tras un cierto numero de pases, como se describe en los Ejemplos. El cambio de morfologla de las celulas infectadas puede analizarse usando microscopla.
Protelna quimerica
La presente invencion se refiere a una protelna S de virus de bronquitis infecciosa (IBV) quimerica que se basa en una protelna S de una cepa de IBV con tropismo tisular restringido a infeccion de celulas primarias, pero que comprende al menos parte de la subunidad S2 de una cepa de IBV con tropismo tisular extendido que, ademas de poder infectar celulas primarias, es capaz de infectar una o mas llneas celulares, de modo que un IBV que comprende la protelna S quimerica es capaz de crecer en una llnea celular.
La expresion “basado en” indica que al menos el dominio S1 deriva o puede derivar de la cepa con tropismo tisular restringido. La protelna quimerica tambien puede comprender una parte del dominio S2 de la cepa con tropismo tisular restringido. Por ejemplo, los dominios transmembrana y/o citoplasmatico pueden derivar o ser derivables de la cepa con tropismo tisular restringido.
La protelna quimerica puede comprender toda o una parte de la subunidad S2 de la cepa de coronavirus con tropismo tisular extendido.
La protelna quimerica puede comprender el sitio de union a heparan sulfato localizado dentro de la subunidad S2 de, por ejemplo, IBV Beaudette.
Una protelna S de virus de bronquitis infecciosa (IBV) quimerico puede comprender, por ejemplo, las secuencias XB- BXBX en la parte de la protelna S2 correspondiente a entre los restos 686 y 691 de la secuencia proporcionada como SEQ ID No. 1 (secuencia BEAU-CK de la Figura 12A), en la que B es un resto de aminoacido basico y X es cualquier aminoacido.
Por ejemplo, la protelna puede comprender la secuencia SRRKRS o SRRRRS en la parte de la protelna S2 correspondiente a entre los restos 686 y 691 de la secuencia proporcionada como SEQ ID No. 1.
Por ejemplo, la protelna puede comprender la secuencia SRRKRSLIE o SRRRRSVIE en la parte de la protelna S2 correspondiente a entre los restos 686 y 694 de la secuencia proporcionada como SEQ ID No.1.
La protelna quimerica puede comprender sustancialmente toda la parte de secuencia de S2 que esta en sentido N terminal del dominio HR1 de la cepa con tropismo tisular extendido. La protelna quimerica puede comprender la parte de secuencia de S2 que esta en sentido N terminal del dominio HR1, junto con el dominio HR1 de la cepa con tropismo tisular extendido. La protelna quimerica puede comprender la parte de secuencia de S2 que esta en sentido N terminal del dominio HR1, el dominio HR1 y la parte de secuencia entre los dominios HR1 y HR2 de la cepa con tropismo tisular extendido. La protelna quimerica puede comprender la parte de secuencia de S2 que esta
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
en sentido N terminal del dominio HR1, el dominio HR1, la parte de secuencia entre los dominios HR1 y HR2 y el dominio HR2 de la cepa con tropismo tisular extendido.
La protelna quimerica puede comprender sustancialmente toda la subunidad S2 de la cepa de coronavirus con tropismo tisular extendido.
La protelna quimerica puede comprender uno o mas de los diecinueve cambios de aminoacidos de la region S2 mostrada en la Tabla 1 y la Figura 14. En particular la protelna quimerica puede comprender un resto de arginina en la posicion 687, y un resto de lisina en la posicion 689. La protelna quimerica tambien puede comprender un resto de leucina en la posicion 692.
La expresion “sustancialmente todo” significa que la protelna quimerica comprende al menos 95 % de la parte correspondiente de la secuencia de tipo silvestre. Los aminoacidos ausentes pueden situarse en cualquier parte dentro de la secuencia y pueden agruparse entre si (de modo que falte una seccion pequena de secuencia) o separarse.
Cuando una parte de la protelna quimerica puede derivar de una protelna S para una cepa dada, esa parte puede tener la misma secuencia de aminoacidos que la parte correspondiente de la secuencia de tipo silvestre, o puede tener una o mas sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacidos en comparacion con la secuencia de tipo silvestre siempre que la funcion original de esa parte de la secuencia se conserve.
La expresion “tipo silvestre” se usa para indicar un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos primaria que es identica a la protelna nativa (es decir, la protelna viral).
Una secuencia mutante tambien puede surgir de forma natural o puede crearse artificialmente (por ejemplo por mutagenesis dirigida). El mutante puede tener al menos 70, 80, 90 o 95 % de identidad de secuencia con la parte correspondiente de la secuencia de tipo silvestre. El mutante puede tener menos de 20, 10 o 5 mutaciones sobre la parte correspondiente de la secuencia de tipo silvestre.
Pueden realizarse comparaciones de identidad a la vista, o mas habitualmente, con la ayuda de programas de comparacion de secuencias disponibles facilmente. Estos programas informaticos disponibles en el mercado pueden calcular el % de identidad entre dos o mas secuencias. Un programa informatico adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, Estados Unidos; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Los ejemplos de otros software que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero sin limitacion, el paquete BLAST (vease Ausubel et al., 1999 misma referencia - Capltulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y el conjunto GENEWORKS de herramientas de comparacion. Tanto BLAST como FASTA estan disponibles para busqueda fuera de llnea y en llnea (vease Ausubel et al., 1999 misma referencia, paginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa GCG Bestfit. Tambien esta disponible una nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences para comparar secuencia proteica y de nucleotidos (vease FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y
tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).
La secuencia puede tener una o mas supresiones, inserciones o sustituciones de restos de aminoacidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una molecula funcionalmente equivalente. Pueden realizarse sustituciones de aminoacidos deliberadas basandose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilia y/o la naturaleza anfipatica de los restos siempre que la actividad se conserve. Por ejemplo, los aminoacidos con carga negativa incluyen acido aspartico y acido glutamico; los aminoacidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoacidos de grupos de cabeza polar sin carga que tienen valores de hidrofilia similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.
Pueden realizarse sustituciones conservativas, por ejemplo de acuerdo con la Tabla posterior. Los aminoacidos en el mismo bloque de la segunda columna y preferentemente en la misma llnea de la tercera columna pueden sustituirse entre si:
alifAticos
No polares G A P
I L V
Polares sin carga
C S T M
N Q
Polares con carga
D E
K R
aromAticos
H F W Y
La presente invencion tambien proporciona un metodo para alterar el tropismo celular de un coronavirus que comprende la etapa de sustitucion de al menos parte de la protelna S2 con la protelna S2 o parte correspondiente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de la misma de una cepa diferente. Pueden intercambiarse partes de secuencia por metodos conocidos en la tecnica, tales como por escision y ligamiento.
Por “parte correspondiente” se entiende, cuando la secuencia de la protelna S de la cepa con tropismo tisular restringido se alinea con la secuencia de la protelna S con tropismo tisular extendido (como se muestra, por ejemplo, en la Figura 12A y 12B) la parte de una secuencia que se alinea con la otra.
Un alineamiento entre protelnas S de diferentes cepas es sencillo porque los coronavirus comparten una estructura de dominio comun y, entre cepas, deberlan tener un nivel de identidad de secuencia relativamente alto. Puede usarse software de alineamiento tal como el paquete BLAST™ descrito anteriormente.
Secuencia de nucleotidos
La presente invencion tambien proporciona una secuencia de nucleotidos que codifica la protelna quimerica del primer aspecto de la invencion.
La secuencia de nucleotidos puede ser natural, sintetica o recombinante. Puede ser mono o bicatenaria, puede ser de ADN o ARN o combinaciones de los mismos. Puede ser, por ejemplo, ADNc, producto de PCR, secuencia genomica o ARNm.
La secuencia de nucleotidos puede optimizarse con respecto a codones para la produccion en el hospedador/la celula hospedadora elegido.
Puede estar aislada o como parte de un plasmido, virus o celula hospedadora.
Plasmido
Un plasmido es una molecula de ADN extracromosomica separada del ADN cromosomico que es capaz de replicar independientemente del ADN cromosomico. Son habitualmente circulares y bicatenarios.
Los plasmidos, o vectores (como se conocen en ocasiones), pueden usarse para expresar una protelna en una celula hospedadora. Por ejemplo, una celula hospedadora bacteriana puede transfectarse con un plasmido capaz de codificar una protelna particular, para expresar esa protelna. El termino tambien incluye cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de bacterias que son capaces de acomodar partes mas largas de ADN.
El plasmido de la presente invencion comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el gen S quimerico. Tambien puede comprender una o mas secuencias de nucleotidos de coronavirus adicionales o secuencias de nucleotidos capaces de codificar una o mas protelnas de coronavirus tales como el gen de replicasa y/o gen 3. El plasmido tambien puede comprender un marcador de resistencia, tal como el gen de guanina xantina fosforribosiltransferasa (gpt) de Escherichia coli, que confiere resistencia a acido micofenolico (MPA) en presencia de xantina e hipoxantina y se controla por el promotor temprano/tardlo de virus vaccinia P7.5.
Partlcula viral
La presente invencion tambien se refiere a una partlcula viral que comprende una protelna S quimerica de acuerdo con el primer aspecto de la invencion y/o una secuencia de nucleotidos de acuerdo con el segundo aspecto de la invencion.
La partlcula viral puede ser un virus vaccinia recombinante (rVV) o un coronavirus.
La partlcula viral puede ser recombinante.
La partlcula viral puede prepararse usando un sistema de genetica inversa, tal como un sistema de genetica inversa basado en virus vaccinia.
A este respecto, la presente invencion tambien proporciona un metodo para preparar una partlcula viral de acuerdo con el cuarto aspecto de la invencion:
(i) transfectando un plasmido como se ha descrito en la seccion anterior a una celula hospedadora;
(ii) infectando la celula hospedadora con un virus recombinante que comprende el genoma de la cepa de coronavirus con tropismo tisular restringido, que carece de al menos parte de la subunidad de S2;
(iii) permitiendo que se produzca recombinacion homologa entre las secuencias del gen S en el plasmido y las secuencias correspondientes en el genoma de virus recombinante para producir un gen S quimerico;
(iv) seleccionando virus recombinantes que comprenden el gen S quimerico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El genoma de la cepa de IBV con tropismo tisular restringido puede carecer de la parte de la protelna S2 correspondiente a la parte proporcionada por el plasmido, de un modo que se forme una protelna quimerica.
El virus recombinante es uno adecuado para permitir la recombinacion homologa entre su genoma y el plasmido. El virus vaccinia es particularmente adecuado ya que se usa habitualmente recombinacion homologa para insertar y suprimir secuencias para el genoma de virus vaccinia.
El metodo anterior incluye opcionalmente las etapas:
(v) recuperacion de IBV recombinante que comprende el gen S quimerico del ADN del virus recombinante de la etapa (iv).
Se conocen en la tecnica metodos para recuperar IBV recombinante (vease Britton et al (2005) vease pagina 24).
Por ejemplo, el ADN del virus recombinante de la etapa (iv) puede insertarse en un plasmido y usarse para transfectar celulas que expresan ARN polimerasa T7 citoplasmatica. (Las celulas pueden, por ejemplo, preinfectarse con un virus de la viruela aviar que expresa ARN polimerasa T7). El IBV recombinante puede despues aislarse, por ejemplo, del medio de cultivo.
Cuando el plasmido se inserta en el genoma de virus vaccinia, se forma un intermedio inestable. Pueden seleccionarse recombinantes que comprenden el plasmido por ejemplo usando un marcador de resistencia en el plasmido.
Despues puede verificarse que los recombinantes positivos contienen el gen S quimerico, por ejemplo, mediante PCR y secuenciacion.
Pueden cultivarse grandes reservas del virus de recombinacion incluyendo el gen S quimerico (por ejemplo virus vaccinia recombinante, rVV) y extraerse el ADN para llevar a cabo la etapa (v).
Se conocen en la tecnica sistemas de genetica inversa adecuados (Casais et al (2001) J. Virol 75: 12359-12369; Casais et al (2003) J. Virol. 77: 9084-9089; Britton et al (2005) J. Virological Methods 123: 203-211; Armesto et al (2008) Methods in Molecular Biology 454: 255-273).
Celula
La partlcula viral puede usarse para infectar una celula.
Ya que la partlcula viral que comprende el gen S quimerico tiene tropismo tisular extendido, la celula puede ser derivable de o una parte de una llnea celular.
La celula puede ser, por ejemplo, una celula de rinon de crla de hamster (por ejemplo BHK-21) o una celula Vero.
La celula puede usarse para producir la partlcula viral.
Por lo tanto la presente invencion tambien proporciona un metodo para producir una partlcula viral que comprende las siguientes etapas:
(i) infeccion de una celula con una partlcula viral de acuerdo con el sexto aspecto de la invencion;
(ii) permitir que el virus se replique en la celula; y
(iii) recoger el virus descendiente.
La celula puede ser de o parte de una llnea celular, tal como una celula Vero. Las partlculas virales pueden recogerse, por ejemplo del sobrenadante por metodos conocidos en la tecnica, y opcionalmente purificarse.
La presente invencion tambien proporciona una celula capaz de producir una partlcula viral recombinante de acuerdo con el cuarto aspecto de la invencion usando un sistema de genetica inversa. Por ejemplo, la celula puede comprender un genoma de virus recombinante que comprende una secuencia de nucleotidos capaz de codificar el gen S quimerico.
La celula puede ser capaz de producir virus de recombinacion recombinantes (por ejemplo virus vaccinia) que contiene el gen S quimerico. La celula puede ser una celula Vero.
Como alternativa la celula puede ser capaz de producir coronavirus recombinante por un sistema de genetica inversa. La celula puede expresar o inducirse para expresar polimerasa T7 para rescatar la partlcula viral recombinante. La celula puede ser una celula CK.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Vacuna
La partlcuia viral puede usarse para producir una vacuna.
La vacuna puede ser una forma atenuada viva de la partlcula viral.
La presente invencion tambien se refiere a un metodo para producir dicha vacuna que comprende la etapa de infectar celulas, por ejemplo celulas Vero, con una partlcula viral que comprende una protelna quimerica de acuerdo con el primer aspecto de la invencion.
Metodo de vacunacion
La partlcula viral de la presente invencion puede usarse para tratar y/o prevenir una enfermedad.
“Tratar” significa administrar la vacuna a un sujeto que tiene una enfermedad existente para disminuir, reducir o mejorar al menos un slntoma asociado con la enfermedad y/o para ralentizar, reducir o bloquear la progresion de la enfermedad.
“Prevenir” significa administrar la vacuna a un sujeto que aun no ha contraldo la enfermedad y/o que no muestra ningun slntoma de la enfermedad para evitar o alterar la causa de la enfermedad (por ejemplo infeccion) o para reducir o prevenir el desarrollo de al menos un slntoma asociado con la enfermedad.
La enfermedad puede ser bronquitis infecciosa (IB).
La vacuna puede administrarse a polluelos eclosionados o pollos, por ejemplo por colirio o administracion intranasal. Aunque son precisos, estos metodos pueden ser caros por ejemplo para bandadas de pollos de engorde grandes. Las alternativas incluyen inoculacion por pulverizacion o administracion al agua para beber pero puede ser diflcil asegurar la aplicacion de vacuna uniforme usando dichos metodos.
La vacuna puede proporcionarse en una forma adecuada para su administracion, tal como un colirio para uso intraocular.
La vacuna puede administrarse por la inoculacion en el huevo, por ejemplo mediante inyeccion de huevos embrionados. La vacunacion en el huevo tiene la ventaja de que proporciona una resistencia de estadio temprano a la enfermedad. Tambien facilita la administracion de una dosis uniforme por sujeto, a diferencia de la inoculacion por pulverizacion y administracion mediante agua para beber.
La vacuna puede administrarse a cualquier compartimento adecuado del huevo, incluyendo fluido alantoideo, saco vitelino, amnios, celda de aire o embrion. Puede administrarse debajo de la membrana de la cascara (celda de aire) y membrana corioalantoidea.
Habitualmente la vacuna se inyecta a huevos embrionados durante los estadios tardlos del desarrollo embrionario, generalmente durante el ultimo trimestre del periodo de incubacion, tal como 3-4 dlas antes de eclosionar. En los pollos, la vacuna puede administrarse entre el dla 15 y el 19 del periodo de incubacion de 21 dlas, por ejemplo al dla 17 o 18.
El proceso puede automatizarse usando un proceso de inyeccion robotico, tal como el descrito en el documento WO 2004/078203.
La vacuna puede administrarse junto con una o mas vacunas distintas, por ejemplo, vacunas para otras enfermedades, tales como virus de enfermedad de Newcastle (NDV). La presente invencion tambien proporciona una composicion de vacuna que comprende una vacuna de acuerdo con la invencion junto con uno o mas vacunas adicionales. La presente invencion tambien proporciona un kit que comprende una vacuna de acuerdo con la invencion junto con una o mas vacunas distintas para administracion separada, secuencial o simultanea.
La vacuna o composicion de vacuna de la invencion pueden usarse para tratar un sujeto aviar. Por ejemplo, el sujeto puede ser un polluelo o pollo.
Tlpicamente, un medico o veterinario determinara la dosis real que sera mas adecuada para un sujeto individual o grupo de sujetos y variara con la edad, el peso y la respuesta del sujeto o los sujetos particulares.
La composicion puede comprender opcionalmente un vehlculo, diluyente, excipiente o adyuvante farmaceuticamente aceptable. La eleccion de vehlculo farmaceutico, excipiente o diluyente puede seleccionarse con respecto a la via pretendida de administracion y la practica farmaceutica convencional. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender como (o ademas de) el vehlculo, excipiente o diluyente, cualquier aglutinante, lubricante, agente de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
suspension, agente de recubrimiento, agente de solubilizacion y otros agentes vehlcuios adecuados que pueden ayudar o aumentar el suministro o la inmunogenicidad del virus.
La invention se describira ahora por medio de ejemplos, que se pretende que sirvan para ayudar a un experto habitual en la materia a llevar a cabo la invencion y no se pretende de ninguna manera que limiten el alcance de la invencion, que se define mas bien por las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Production de genes S quimericos compuestos de (i) la subunidad S1 de IBV de M41 y la subunidad S2 de Beaudette (M1B2): y (ii) la subunidad S1 de Beaudette y la subunidad S2 de M41 (B1 M2)
Se uso una estrategia de reaction en cadena de la polimerasa (PCR) solapante para crear dos genes S quimericos, uno con la subunidad S1 de M41 y la subunidad S2 de Beaudette (M1B2), y el otro con la subunidad S1 de Beaudette y la subunidad S2 de M41 (B1M2; vease Figuras 2 y 3). Los genes S de Beau-R (un clon molecular de Beaudette) y M41 estan contenidos dentro de los plasmidos pGPT-IBV-Stul-BamHI y pGPT-M41S respectivamente (vease Figura 4). Los cebadores dentro del gen de replicasa y gen 3 se disenaron cercanos a sitios de restriction ya contenidos dentro del genoma de IBV para hacer mas facil recuperar los genes S quimericos de los plasmidos pGPT-S1 M41S2[3eau (M1B2) y pGPT-S1[3eauS2M41 (B1M2). La secuencia del gen S es identica entre Beau-R y M41 en el sitio de escision S1/S2 de modo que tambien se disenaron cebadores a traves de esta localization. Alrededor de 500 nucleotidos se dejaron a uno de los lados del gen S para permitir la facil manipulation.
Los genes S quimericos se clonaron en plasmidos que contenlan el gen de guanina xantina fosforribosiltransferasa (gpt) de Escherichia coli, que confiere resistencia a acido micofenolico (MPA) en presencia de xantina e hipoxantina y esta controlado por el promotor temprano/tardlo de virus vaccinia P7.5.
Ejemplo 2 - Rescate de rIBV que expresan la proteina S quimerica B1M2 o M1B2 y que establece si pueden crecer en celulas Vero.
Se utilizo un sistema de genetica inversa basado en virus vaccinia para crear IBV recombinante (rIBV) con un gen S quimerico (vease Figura 5). Los plasmidos pGPT-S1M41S2eeau (M1B2) y pGPT-S1eeauS2M41 (B1M2) se transfectaron en celulas Vero infectadas con un virus vaccinia recombinante (rVV) que contiene el genoma de ADNc de IBV de longitud completa menos el gen S. El plasmido se inserto en el genoma de virus vaccinia creando un intermedio inestable. Tres ciclos de purification de placas en presencia de acido micofenolico, xantina e hipoxantina seleccionaron recombinantes positivos para gpt. Despues se seleccionaron los recombinantes de GPT negativo por purificacion en placas tres veces en ausencia de medio de selection de gpt.
Se exploraron recombinantes BeauR-M1B2(S) y BeauR-B1M2(S) mediante PCR y secuenciacion para determinar que la secuencia del gen S quimerico se habla insertado con exito en el genoma de rVV. Se cultivaron grandes reservas del rVV que contenla genoma de IBV con el gen S quimerico en celulas de rinon de crla de hamster (BHK- 21) hasta que se observo el efecto citopatico (cpe). El virus vaccinia se purifico y se extrajo el ADN.
Se recuperaron dos aislados de rIBV BeauR-M1B2(S) y BeauR-B1M2(S), con el fondo genomico de Beau-R y la subunidad S1 o S2 de M41. Se transfectaron celulas CK infectadas con virus de la viruela aviar recombinante que expresaba ARN polimerasa T7 (rFPV-T7), con el ADN rW y se incubaron a 37 °C. Una vez que se hubo observado cpe de ~60 %, el medio de cultivo se retiro y se filtro para retirar cualquier rFPV-T7. El medio de cultivo que contenla el rIBV se paso tres veces sobre celulas CK. El ARN celular total se aislo y se analizo con respecto a la presencia de ARN de IBV por RT-PCR. Se secuencio el gen S.
Despues de tres pases en celulas CK, se pasaron rIBV BeauR-M1B2(S) y BeauR-B1M2(S) tres veces en celulas Vero. Se han tomado fotograflas de celulas Vero infectadas por rIBV BeauR-M1B2(S) y BeauR-B1M2(S) mediante microscopla de campo claro (Figura 6) y mediante microscopla confocal con inmunofluorescencia (Figura 7). Los virus recombinantes se valoraron en celulas CK y se investigo la cinetica de crecimiento en celulas Vero (Figura 8).
BeauR-B1M2(S) no formo CPE en celulas Vero y se observaron muy pocas celulas Vero infectadas por microscopla confocal con inmunofluorescencia indirecta. La curva de crecimiento indica que BeauR-B1M2(S) es incapaz de replicar en celulas Vero. BeauR-M1B2(S) provoco cpe extensiva en celulas Vero despues de un pase y se paso adicionalmente en celulas Vero hasta el pase 7, formando sincitios de pase 5. La curva de crecimiento indica que BeauR-M1B2(S) es capaz de replicar en celulas Vero.
Como se muestra en las Figuras 6 - 8, las celulas Vero no apoyan el crecimiento de M41, BeauR-M41(S), el rIBV derivado de Beaudette pero que expresa la proteina S de M41 o BeauR-B1M2(S), la morfologla de las celulas infectadas con estas cepas de IBV es similar a celulas infectadas con simulation. Sin embargo, las celulas Vero infectadas con BeauR-M1B2(S) mostraron la misma morfologla que las infectadas con Beaudette (Beau-R). Estos resultados indican que la subunidad S2 esta implicada en la infecciosidad de celulas Vero.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ejemplo 3 - La heparina soluble es capaz de bloquear la infeccion de celulas Vero usando rIBV Beau-R y BeauR- M1B2(S)
Se llevaron a cabo ensayos de reduccion de placas en los que se han incubado aislados de Beau-R y los dos BeauR-M41(S1) en presencia de sal sodico de heparina soluble a diversas concentraciones 0-20 mg/ml antes de llevar a cabo ensayos de placas en celulas Vero. El numero de placas producido se ha analizado para descubrir si la presencia de heparina tiene algun efecto en la capacidad de los virus para crecer en celulas Vero (Figura 9).
Se han incubado aislados de Beau-R y los dos de BeauR-M1B2(S) en presencia de sal sodica de heparina a 15 mg/ml y en ausencia antes de infectar celulas Vero. Se uso microscopla confocal e inmunofluorescencia indirecta para observar el efecto de la heparina en el numero de celulas infectadas presentes (Figura 10). Se analizaron diez campos de vision por muestra por microscopla confocal a aumento x40 y se calculo el porcentaje de celulas infectadas.
La Figura 9 muestra un ensayo de reduccion de placas en celulas Vero de IBV pretratado con cantidades crecientes de heparina soluble. La llnea verde representa Beaudette y las llneas azul y roja representan los dos rIBV que expresan la protelna S de M1B2 quimerica. La Figura 10 muestra un diagrama de barras que compara el efecto de heparina soluble en el porcentaje de celulas Vero infectadas por IBV, medido por microscopla confocal con inmunofluorescencia indirecta. Estos resultados indican que la heparina soluble tiene el mismo efecto, el bloqueo de la infeccion, en los rIBV que en Beaudette.
Ejemplo 4 - Introduction del sitio de union a heparan sulfato en la subunidad S2 del gen S de M41 en BeauR-M41(S) y reemplazo del sitio de union a heparan sulfato en la proteina S de Beau-R con la region correspondiente de la proteina S de M41.
Se han disenado dos plasmidos, uno con una section del gen Beau-R S con el sitio de union a heparan sulfato localizado con la subunidad S2 intercambiada por la secuencia correspondiente de M41 (Beau-S-M41-Hep), y el otro con una seccion del gen S de M41 con el sitio de union a heparan sulfato de Beau-R (M41-S-Beau-Hep). Ambos plasmidos contienen el gen de gpt para selection.
Los sistemas de genetica inversa como se ha descrito en el ejemplo 2 y en la Figura 5 se han usado para crear dos rIBV quimericos, Beau-S-M41-M41 y Hep-S-Beau-Hep (Figuras 2 y 11). Se pasaron dos recombinantes adecuados de cada uno tres veces en celulas CK, despues se analizaron sus caracteristicas de crecimiento en celulas Vero por microscopla de campo claro para evaluar si los rIBV provocan cpe (Figura 6), microscopla confocal de celulas infectadas (Figura 7) y cinetica de crecimiento (Figura 8).
Como se muestra en las Figuras 6-8, las celulas Vero no apoyan el crecimiento de M41, M41-BeauR(S), BeauR- B1M2(S) o Beau-S-M41-Hep. La morfologia de las celulas infectadas con estas cepas de IBV es similar a las celulas infectadas con simulation y se observaron muy pocas celulas infectadas por microscopla confocal con inmunofluorescencia indirecta. Sin embargo, las celulas Vero infectadas con M41-S-Beau-Hep muestran la misma morfologia que las infectadas con Beaudette (Beau-R) y BeauR-M1B2(S). Las curvas de crecimiento en celulas Vero mostraron que la retirada del sitio de union a heparan sulfato de Beau-R elimino su capacidad para crecer en celulas Vero y la introduccion del sitio de union a heparan sulfato en la proteina S de BeauR-M41(S) permitio el crecimiento en celulas Vero. Estos resultados indican que el sitio de union a heparan sulfato dentro de la subunidad S2 de Beaudette esta implicado en la infecciosidad de celulas Vero.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, a no ser que el contexto requiera otra cosa, deberia entenderse que la palabra “comprender” o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, implica la inclusion de un elemento o numero entero indicado o grupo de elementos o numeros enteros pero no la exclusion de cualquier otro elemento o numero entero o grupos de elementos o numeros enteros. Aunque la invention se ha descrito en relation con realizaciones especificas preferidas, deberia entenderse que la invencion como se reivindica no deberia estar limitada indebidamente a dichas realizaciones especificas.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Una protelna S de virus de bronquitis infecciosa (IBV) quimerica que se basa en una protelna S de una cepa de IBV con tropismo tisular restringido a infeccion de celulas primarias, pero que comprende al menos parte de la subunidad S2 de una cepa de IBV con tropismo tisular extendido que, ademas de ser capaz de infectar celulas primarias, es capaz de infectar una o mas llneas celulares, de modo que un IBV que comprende la protelna S quimerica es capaz de crecer en una llnea celular.
  2. 2. Una protelna S quimerica de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende sustancialmente toda la subunidad S2 de la cepa de IBV con tropismo tisular extendido.
  3. 3. Una protelna S quimerica de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, que comprende las secuencias de XBBXBX en la parte de la protelna S2 correspondiente a entre los restos 686 y 691 de la secuencia proporcionada como Beau- CK en la Figura 12A, en la que B es un resto de aminoacido basico y X es cualquier aminoacido.
  4. 4. Una protelna S quimerica de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en la que la cepa de IBV con tropismo tisular extendido es IBV Beaudette.
  5. 5. Una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna S quimerica de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente.
  6. 6. Un plasmido que comprende una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 5.
  7. 7. Una partlcula viral que comprende una protelna S quimerica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y/o una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 5.
  8. 8. Una partlcula viral de acuerdo con la reivindicacion 7, que es capaz de crecer en celulas Vero.
  9. 9. Un metodo para preparar una partlcula viral de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8, que comprende las siguientes
    etapas:
    (i) transfectar un plasmido de acuerdo con la reivindicacion 6 a una celula hospedadora;
    (ii) infectar la celula hospedadora con un virus recombinante que comprende el genoma de la cepa de IBV con tropismo tisular restringido, que carece de al menos parte de la subunidad S2;
    (iii) permitir que se produzca recombinacion homologa entre las secuencias del gen S en el plasmido y las secuencias correspondientes en el genoma de virus recombinante para producir un gen S quimerico; y
    (iv) seleccionar virus recombinantes que comprenden el gen S quimerico.
  10. 10. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 9, que tambien incluye la etapa:
    (v) recuperar IBV recombinante que comprende el gen S quimerico del ADN del virus recombinante de la etapa (iv).
  11. 11. Una celula que comprende una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 5 y que es capaz de producir una partlcula viral de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8.
  12. 12. Una celula Vero de acuerdo con la reivindicacion 11.
  13. 13. Una vacuna que comprende una partlcula viral de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8.
  14. 14. Una vacuna de acuerdo con la reivindicacion 13 para uso en el tratamiento y/o la prevencion en un sujeto.
  15. 15. Un metodo para producir una vacuna de acuerdo con la reivindicacion 13, que comprende celulas Vero con una partlcula viral de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8.
    de una enfermedad la etapa de infectar
ES10734527.4T 2009-07-07 2010-07-05 Proteína quimérica Active ES2589057T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0911794 2009-07-07
GBGB0911794.6A GB0911794D0 (en) 2009-07-07 2009-07-07 Chimaeric protein
PCT/GB2010/001293 WO2011004146A1 (en) 2009-07-07 2010-07-05 Chimaeric protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2589057T3 true ES2589057T3 (es) 2016-11-08

Family

ID=41022290

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10734527.4T Active ES2589057T3 (es) 2009-07-07 2010-07-05 Proteína quimérica

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8828407B2 (es)
EP (1) EP2451827B1 (es)
CN (1) CN102574897B (es)
BR (1) BR112012000281A8 (es)
ES (1) ES2589057T3 (es)
GB (1) GB0911794D0 (es)
HU (1) HUE029073T2 (es)
PL (1) PL2451827T3 (es)
WO (1) WO2011004146A1 (es)
ZA (1) ZA201200200B (es)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060325B (zh) * 2013-01-14 2015-01-07 韩健宝 抗猪流行性腹泻病毒pedv的反义核酸及肽核酸pna
CN104072592B (zh) * 2013-03-26 2016-12-28 复旦大学 对新型冠状病毒HCoV-EMC 2012感染具有抑制作用的多肽及其应用
GB201308057D0 (en) 2013-05-03 2013-06-12 Pirbright Inst The Protein
GB201310031D0 (en) * 2013-06-05 2013-07-17 Pirbright Inst The Cell
CN103394097A (zh) * 2013-06-09 2013-11-20 东北农业大学 猪传染性胃肠炎和流行性腹泻两联疫苗的引物及制备方法
GB201413020D0 (en) * 2014-07-23 2014-09-03 Pribright The Inst Coronavirus
CN104262488B (zh) * 2014-09-24 2017-07-28 普莱柯生物工程股份有限公司 一种融合蛋白及其疫苗组合物的制备与应用
GB201601498D0 (en) 2016-01-27 2016-03-09 Pirbright Inst The Coronavirus
EA202191147A1 (ru) * 2018-10-31 2021-08-23 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх Вакцина виб h52 с гетерологичным шиповидным белком
JP7206383B2 (ja) * 2018-10-31 2023-01-17 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハー 異種スパイクタンパク質を有する４／９１ ｉｂｖワクチン
CN109943536B (zh) * 2019-03-26 2021-09-14 昆明理工大学 一种戊型肝炎病毒的培养方法及其灭活疫苗的制备方法
WO2020229248A1 (en) * 2019-05-10 2020-11-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Modified s1 subunit of the coronavirus spike protein
MX2021013728A (es) * 2019-05-10 2021-12-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Ibv atenuado con tropismo de cultivo celular y tisular extendido.
US20220213148A1 (en) 2019-05-10 2022-07-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Modified s2 subunit of the coronavirus spike protein
CN110894217B (zh) * 2019-12-16 2021-07-13 中国农业大学 一种牛冠状病毒嵌合抗原以及检测牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡
US10975126B1 (en) 2020-04-23 2021-04-13 King Faisal University MERS-CoV inhibitor peptides
CN111607003B (zh) * 2020-05-21 2022-08-23 上海百英生物科技有限公司 一种SARS-CoV-2 N/S1(RBD)重组蛋白及制备方法和应用
WO2022005214A1 (ko) * 2020-06-30 2022-01-06 포항공과대학교 산학협력단 코로나-19 바이러스의 스파이크 단백질의 에스터가수분해효소 활성을 이용한 코로나 바이러스 감염증 치료제 스크리닝 키트 및 상기 키트를 이용하여 스크리닝된 물질의 코로나 바이러스 감염증의 예방, 개선 또는 치료 용도

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL1610817T3 (pl) 2003-03-03 2010-05-31 Intervet Int Bv Wirus zakaźnego zapalenia oskrzeli ze zmienionym genem wypustek
CN100374460C (zh) * 2004-07-05 2008-03-12 华中农业大学 含有与鸡传染性支气管炎病毒特异性结合短肽的噬菌体及应用
CN1763085A (zh) * 2005-11-02 2006-04-26 浙江大学 鸡传染性支气管炎病毒s1重组蛋白抗原、制备方法及用途
CN101240289A (zh) * 2008-03-11 2008-08-13 四川大学 一种禽传染性支气管炎病毒S1基因与禽IL-2基因共表达DNA疫苗pIRES-S1/IL2

Also Published As

Publication number Publication date
CN102574897B (zh) 2015-03-11
PL2451827T3 (pl) 2016-12-30
BR112012000281A2 (pt) 2016-08-09
US20120177675A1 (en) 2012-07-12
GB0911794D0 (en) 2009-08-19
BR112012000281A8 (pt) 2016-09-06
EP2451827A1 (en) 2012-05-16
WO2011004146A1 (en) 2011-01-13
ZA201200200B (en) 2013-03-27
HUE029073T2 (en) 2017-02-28
US8828407B2 (en) 2014-09-09
EP2451827B1 (en) 2016-06-15
CN102574897A (zh) 2012-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2589057T3 (es) Proteína quimérica
ES2764275T3 (es) Coronavirus
US8173136B2 (en) Attenuated recombinant newcastle disease virus and vaccine containing the same
AU2017211507B2 (en) Attenuated infectious bronchitis virus
ES2714689T3 (es) Proteína de espina mutante que extiende el tropismo tisular del virus de bronquitis infecciosa (IBV)
ES2647073T3 (es) Vacuna contra la IPN
CN113430178B (zh) 一种表达ii型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用
WO2006035082A1 (es) Genes g mutantes del virus de la septicemia hemorrágica de la trucha (vhsv) y aplicaciones
US20230321215A1 (en) Avian influenza vaccines and methods of making same
TWI324160B (es)
WO2001066569A1 (en) Viral antigen and vaccine against isav (infectious salmon anaemia virus)
Gebreeziabher Development of Dual Vaccines for the Control of Peste des Petits Ruminants and Capripox Infections of Small Ruminants