ES2647073T3 - Vacuna contra la IPN - Google Patents
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Abstract
Un virus avirulento vivo de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) que no revierte en un virus virulento después de al menos 3 pasajes en anfitriones que se sabe que son susceptibles al IPNV, comprendiendo dicho virus un ácido nucleico que codifica una proteína VP2 madura o una proteína VP2 precursora que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 85% con la SEQ ID NO. 1, en la que los residuos aminoácidos en las posiciones 252, 281, 282 y 319 de la proteína son Asn, Ser, Asp y Glu respectivamente.
Description
Descripción de las figuras
Ahora se ilustrarán con más detalle realizaciones preferentes de la presente invención con referencia a las figuras
adjuntas. La Figura 1 ilustra la mortalidad acumulativa de alevines inmunizados/no inmunizados sometidos/no sometidos a una prueba de provocación con una cepa virulenta V-1244.
Eje Y Porcentaje de alevines muertos en cada muestra (mortalidad acumulativa). Eje X
- Grupo
- Preparación de la muestra
- A
- Alevines inmunizados con la cepa avirulenta G700 en el día 4 del experimento; sometidos a una prueba de provocación con la cepa virulenta V-1244 en el día 14 del experimento; muestreo en el día 28 del experimento
- B
- Alevines inmunizados con la cepa avirulenta G700 en el día 4 del experimento; muestreo en el día 28 del experimento
- C
- Alevines inmunizados con la cepa avirulenta G700 en el día 8 del experimento; sometidos a una prueba de provocación con la cepa virulenta V-1244 en el día 14 del experimento; muestreo en el día 28 del experimento
- D
- Alevines inmunizados con la cepa avirulenta G700 en el día 8 del experimento; muestreo en el día 28 del experimento
- E
- Alevines no inmunizados; sometidos a una prueba de provocación con la cepa virulenta V-1244 en el día 14 del experimento; muestreo en el día 28 del experimento
- F
- Alevines no inmunizados; muestreo en el día 28 del experimento
- G
- Alevines inmunizados con la cepa avirulenta G700 en el día 14 del experimento; muestreo en el día 28 del experimento
10 La Figura 2 ilustra la mortalidad acumulativa of alevines inmunizados/no inmunizados sometidos/no sometidos a una prueba de provocación con una cepa virulenta V-1244. Eje Y Porcentaje de alevines muertos en cada muestra (mortalidad acumulativa). Eje X
- Grupo
- Preparación de la muestra
- imagen4
- Alevines inmunizados con la cepa avirulenta G700 en el día 4 del experimento; sometidos a una prueba de provocación con la cepa virulenta V-1244 en el día 14 del experimento; muestreo en el día 28 del experimento
- imagen5
- Alevines inmunizados con la cepa avirulenta G700 en el día 4 del experimento; muestreo en el día 28 del experimento
- imagen6
- Alevines inmunizados con la cepa avirulenta G700 en el día 8 del experimento; sometidos a una prueba de provocación con la cepa virulenta V-1244 en el día 14 del experimento; muestreo en el día 28 del experimento
- Alevines inmunizados con la cepa avirulenta G700 en el día 8 del experimento; muestreo en el día 28 del experimento
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- Alevines no inmunizados; sometidos a una prueba de provocación con la cepa virulenta V-1244 en el día 14 del experimento; muestreo en el día 28 del experimento
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de los peces continuamente desde el desove hasta la recolección mediante muestreos frecuentes y aislamiento del IPNV.
Cuando fue aislado, el IPNV fue sometido a secuenciación para una caracterización detallada a nivel genómico. Los resultados demostraron que ambas categorías de emplazamientos albergaban virus de IPN, pero de genotipos diferentes. El emplazamiento con una historia de problemas recurrentes de IPN tenía una cepa virulenta, mientras que el emplazamiento con pocos problemas de IPN tenía una cepa avirulenta, denominándose a dicha cepa avirulenta del presente documento cepa G700 (depositada como ECACC-Nº 11 041201). Curiosamente, los peces infectados con la cepa G700 parecían estar protegidos de desarrollar IPN cuando se mezclaban con peces que portaban la cepa virulenta. Estos hallazgos revelaron un potencial para esta cepa natural como una vacuna avirulenta viva contra la IPN.
Para caracterizar adicionalmente el virus, se propagaron disoluciones seriadas de la cepa G700 en células CHSE214 con gel de agarosa (SeaPlaque) como soporte sólido (Ejemplo 2). Tres placas fueron identificadas, recolectadas, purificadas y clonadas. Dos de estas fueron sometidas a caracterización adicional secuenciando el gen VP2. Los resultados obtenidos muestran que la secuencia VP2 de ambos clones era un 100% idéntica, tanto a escala de nucleótidos como de aminoácidos y también era idéntico a la cepa G700 original.
En la SEQ ID NO:2 y la SEQ ID NO:3 presentan, respectivamente, las secuencias de ADN y ARN del gen VP2 de G700; y las secuencias de aminoácidos de la precursora G700 y la proteína VP2 madura están representadas, respectivamente, por los residuos aminoácidos 1-508 y 1-442 de la SEQ ID NO:1. Como se verá, ambos clones tenían un Pro217Thr221 en el motivo de virulencia, coherente con los aislados avirulentos.
Para verificar que la cepa G700 es avirulenta y genéticamente estable es estudios biológicos, alevines de salmón atlántico que se sabe que son susceptibles al IPNV fueron expuestos a la cepa G700 en una concentración de 2 × 105 TCID50/ml (Ejemplo 2). El virus fue sometido a pasaje tres veces antes del muestreo. Después del muestreo, algunos alevines fueron sometidos a estrés y luego observados durante 28 días más antes del muestreo final. Las mortalidades fueron registradas a diario. Como puede verse en la Figura 3, no hubo no diferencia significativa entre mortalidades en el grupo sometido a prueba de provocación y el de control y no se observó ninguna diferencia estadística entre los grupos, ni siquiera después de someterlos a estrés. Histológicamente, no se observó ninguna lesión patológica en órganos internos, incluyendo el páncreas, de los alevines antes o después del estrés (datos no mostrados), lo que confirma que la cepa G700 es, de hecho, una cepa avirulenta.
Las secuencias VP2 de los virus reaislados fueron un 100% idénticas a las del aislado original (G700) al inicio y al fin del estudio, lo que indica que esta variante tiene una elevada estabilidad genética, incluso después de pasajes seriados en alevines. En cambio, se ha hallado que las cepas avirulentas Pro217Ala221Ala247 y avirulentas Pro217Thr221Ala247 creadas por genética inversa revierten en variantes virulentas en una sola tanda de infección de alevines de salmón atlántico, haciendo así que las variantes creadas por genética inversa sean inadecuadas para una vacuna avirulenta viva.
En función de los hallazgos obtenidos para la cepa G700, se inició un proyecto centrado en identificar los residuos aminoácidos responsables de la estabilidad genética de la cepa avirulenta.
Comparando residuos aminoácidos diferentes del motivo de virulencia (véanse las Figuras 6a-b), se halló con sorpresa que, aunque las cepas avirulentas inestables (que revierten fácilmente en variantes virulentas) tienen todas un residuo Val en la posición 252 de la proteína VP2, la cepa G700 tiene un residuo Asn en esa posición. Además, cada una de las cepas avirulentas inestables, y todas ellas, tienen un residuo Thr en la posición 281 de la proteína VP2 mientras que la cepa G700 tiene un residuo Ser en esta posición. Se halló que, aunque todas las cepas avirulentas inestables tienen un residuo Asn en la posición 282 y un residuo Ala en la posición 319 de la proteína VP2, la cepa G700 tiene un residuo Asp en la posición 282 y un residuo Glu en la posición 319 (véanse los Ejemplos 2 y 3).
En resumen, los anteriores hallazgos demuestran que la cepa G700 es estable y no revierte en virulencia después de 3 pasajes en anfitriones susceptibles. También se ha identificado el motivo de estabilidad del virus IPN y consiste en los residuos 252, 281, 282 y 319, de los cuales Asn252Ser281Asp282Glu319 está asociado con la estabilidad genética (Ejemplo 2), mientras que Val252Thr281Asn282Ala319 está asociado con la inestabilidad (Ejemplo 3).
Se inició un estudio adicional para verificar el efecto protector de la cepa G700 en alevines de salmón atlántico (Salmo salar L.). Además, se examinó la virulencia de la cepa natural monitorizando la mortalidad de los alevines vacunados (expuestos a la cepa G700), pero no sometidos a prueba de provocación en la etapa de su desarrollo en que son más susceptibles a la IPN, para confirmar que no causan brotes clínicos de IPN (Ejemplo 1).
Cuatro días después de la alimentación inicial, un grupo de peces fue inmunizado mediante inmersión con una dosis de 2 × 105 TCID50/ml de la cepa G700. Un segundo grupo fue vacunado con la misma dosis cuatro días después (8 días) tras la alimentación inicial. Ambos grupos vacunados, así como un grupo de control no vacunado, fueron sometidos a una prueba de provocación en el día 14 desde la alimentación inicial, mediante provocación por baño a
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alevines resultaron negativos al virus cuando fueron medidos por inmunohistoquímica, lo que sugiere que el virus está presente en los alevines únicamente a niveles subclínicos.
El término “TCID50” usado en la presente memoria se refiere a la cantidad de virus requerida para producir un efecto citopático en el 50% de las células de cultivos tisulares inoculados. La infección viral en las células es compleja y da como resultado muchos cambios en la célula anfitriona, denominados colectivamente efecto citopático (ECP). Tales cambios incluyen forma alterada, desprendimiento del sustrato, lisis, fusión de membranas, permeabilidad alterada de las membranas, cuerpos de inclusión y apoptosis. El método usado para determinar el valor TCID50 es muy conocido para un experto en la técnica (Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche, Kärber G., vol. 162, 1931).
Aunque el virus estaba presente en los alevines solo a niveles subclínicos, se ha demostrado que el IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención proporcionaba a los alevines protección contra la enfermedad de la IPN, en particular en comparación con los alevines que no han sido expuestos al IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención.
Además, si el IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención es administrado por inmersión con un título de 2 × 105 TCID50/ml a alevines de salmón atlántico mantenidos en agua dulce a una temperatura de 12°C, hace que los alevines no desarrollen ningún signo de la enfermedad de la IPN; en particular, no se ha observado (histológicamente) ninguna lesión patológica en los órganos internos, incluyendo el páncreas de los alevines.
Según se ha dado a conocer anteriormente, normalmente el IPNV tiene dos proteínas estructurales que forman la cápside del IPNV. La proteína viral 2 (VP2) del IPNV es una de estas dos proteínas estructurales, y se ha demostrado que es responsable de la producción de anticuerpos monoclonales específicos al tipo. Anteriormente se ha sugerido que la secuencia de la proteína VP2 decide si el virus es virulento o avirulento, y, en este último caso, ahora se ha demostrado que ciertos aminoácidos de la proteína VP2 son determinantes importantes de si el virus avirulento puede revertir en un virus virulento.
En consecuencia, en una realización según el primer aspecto de la presente invención, el IPNV avirulento vivo comprende un ácido nucleico que codifica una proteína estructural madura (por ejemplo, la VP2 madura), o una precursora de la misma (por ejemplo, la VP2 precursora), haciendo preferentemente dicha proteína estructural que el virus avirulento no revierta en un virus virulento después de al menos 3 pasajes en anfitriones que se sabe que son susceptibles al IPNV.
La expresión “ácido nucleico” usado en la presente memoria se refiere a un ácido ribonucleico (ARN) o un ácido desoxirribonucleico (ADN), preferentemente ARN.
La expresión “proteína estructural”, aplicada a virus, se refiere a una proteína viral que es un componente estructural (normalmente un componente capsídico) del virus maduro.
La expresión “proteína precursora” usada en la presente memoria se refiere a una proteína que es modificada de forma posterior y/o coetánea con la traducción a su forma madura (por ejemplo, VP2 precursora → VP2 madura).
Dicha proteína estructural madura es preferentemente una de las dos proteínas estructurales que forman la cápside del IPNV; más preferentemente la proteína forma la parte más externa de la cápside del IPNV. En una realización preferente, dicha proteína estructural madura es la proteína que es responsable de la producción de anticuerpos monoclonales específicos al tipo en anfitriones que han sido infectados con el virus. En la realización más preferente, dicha proteína estructural es la proteína VP2.
Además, según se ha expuesto con anterioridad, se halló con sorpresa que, aunque todas las cepas avirulentas inestables tienen un residuo Val en la posición 252 de la proteína VP2, la cepa G700 tiene un residuo Asn en esa posición.
En consecuencia, en una realización según el primer aspecto de la presente invención, dicho virus comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VP2, en la que el aminoácido en la posición 252 de la proteína VP2 no es Val.
En otra realización según el primer aspecto de la presente invención, dicho virus comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VP2, seleccionándose el residuo aminoácido en la posición 252 de la proteína VP2 del grupo constituido por Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr y Cys; seleccionándose preferentemente del grupo constituido por Asn y Gln; y siendo lo más preferible que el residuo aminoácido en la posición 252 sea Asn.
Además, cada una de las cepas avirulentas inestables, y todas ellas, tiene un residuo Thr en la posición 281 de la proteína VP2, mientras que la cepa G700 tiene un residuo Ser en esta posición.
Así, otra realización preferente según la presente invención versa sobre un IPNV avirulento vivo que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VP2 madura y/o una VP2 precursora, haciendo preferentemente dicha 9 10
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proteína que el virus avirulento no revierta en un virus virulento después de al menos 3 pasajes en anfitriones que se sabe que son susceptibles al IPNV; seleccionándose el aminoácido en la posición 281 de la proteína VP2 madura y/o la VP2 precursora del grupo constituido por Ser, Asn, Gln, Tyr y Cys; seleccionándose preferentemente del grupo constituido por Ser y Cys; y siendo lo más preferible que el aminoácido de la posición 281 sea un residuo Ser.
En una realización según el primer aspecto de la presente invención, dicho virus comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VP2, en la que el aminoácido en la posición 281 de la proteína VP2 no es Thr.
También se halló que, aunque todas las cepas avirulentas inestables tienen un residuo Asn en la posición 282 y un residuo Ala en la posición 319 de la proteína VP2, la cepa G700 tiene un residuo Asp en la posición 282 y un residuo Glu en la posición 319.
En consecuencia, otra realización preferente según la presente invención versa sobre un IPNV avirulento vivo que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VP2 madura y/o una VP2 precursora, haciendo preferentemente dicha proteína que el virus avirulento no revierta en un virus virulento después de al menos 3 pasajes en anfitriones que se sabe que son susceptibles al IPNV; seleccionándose el aminoácido en la posición 282 de la proteína VP2 madura y/o la VP2 precursora del grupo constituido por Gln, Asp y Glu; siendo lo más preferible que el aminoácido de la posición 282 de la proteína VP2 madura y/o la VP2 precursora sea un residuo Asp.
En una realización según el primer aspecto de la presente invención, dicho virus comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VP2, en la que el aminoácido en la posición 282 de la proteína VP2 no es Asn.
Otra realización preferente según la presente invención versa sobre un IPNV avirulento vivo que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VP2 madura y/o una VP2 precursora, haciendo preferentemente dicha proteína que el virus avirulento no revierta en un virus virulento después de al menos 3 pasajes en anfitriones que se sabe que son susceptibles al IPNV; seleccionándose el aminoácido en la posición 319 de la proteína VP2 madura y/o la VP2 precursora del grupo constituido por Glu y Asp; siendo lo más preferible que el aminoácido de la posición 319 de la proteína VP2 madura y/o la VP2 precursora sea un residuo Glu.
En una realización según el primer aspecto de la presente invención, dicho virus comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VP2, en la que el aminoácido en la posición 319 de la proteína VP2 no es Ala.
Una realización particularmente preferente versa sobre un IPNV avirulento vivo que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VP2 madura y/o una VP2 precursora, haciendo preferentemente dicha proteína que el virus avirulento no revierta en un virus virulento después de al menos 3 pasajes en anfitriones que se sabe que son susceptibles al IPNV; en la que dicha proteína VP2 madura y/o dicha VP2 precursora tiene un residuo Pro en la posición 217, un residuo Thr en la posición 221, un residuo Asn en la posición 252, un residuo Ser en la posición 281, un residuo Asp en la posición 282 y un residuo Glu en la posición 319.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas VP2 precursora y madura de G700 están representadas, respectivamente, por los residuos aminoácidos 1-508 y 1-442 de la SEQ ID NO:1.
En consecuencia, en una realización particularmente preferente según el primer aspecto de la presente invención, el IPNV avirulento vivo comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VP2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80% con la identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por los residuos 252-282 de la SEQIDNO1;
- –
- preferentemente con la condición de que el residuo 252 se seleccione del grupo constituido por Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr y Cys; más preferentemente Asn o Gln, y siendo Asn lo más preferible; y/o
- –
- preferentemente con la condición de que el residuo 281 se seleccione del grupo constituido por Ser, Asn, Gln, Tyr y Cys; más preferentemente Ser o Cys, y siendo Ser lo más preferible; y/o
- –
- preferentemente con la condición de que el residuo 282 se seleccione del grupo constituido por Gln, Asp y Glu, siendo Asp lo más preferible; y/o
- –
- preferentemente con la condición de que el residuo 217 sea Pro; y/o
- –
- preferentemente con la condición de que el residuo 221 sea Thr;
haciendo preferentemente dicha proteína que el virus avirulento no revierta en un virus virulento después de al menos 3 pasajes en anfitriones que se sabe que son susceptibles al IPNV.
La expresión “identidad de secuencia” indica una medida cuantitativa del grado de homología entre dos secuencias de aminoácidos de igual longitud o entre dos secuencias de nucleótidos de igual longitud. Las dos secuencias que han de compararse deben alinearse con el mejor ajuste posible con los huecos de inserción o, alternativamente, con los truncamientos en los extremos de las secuencias proteínicas. La identidad de secuencia puede calcularse como
- –
- preferentemente con la condición de que el residuo 252 se seleccione del grupo constituido por Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr y Cys; más preferentemente Asn o Gln, y siendo Asn lo más preferible; y/o
- –
- preferentemente con la condición de que el residuo 281 se seleccione del grupo constituido por Ser, Asn, Gln, Tyr y Cys; más preferentemente Ser o Cys, y siendo Ser lo más preferible; y/o
5 – preferentemente con la condición de que el residuo 282 se seleccione del grupo constituido por Gln, Asp y Glu, siendo Asp lo más preferible; y/o
- –
- preferentemente con la condición de que el residuo 319 se seleccione entre Glu y Asp, siendo Glu lo más preferible y/o
- –
- preferentemente con la condición de que el residuo 217 sea Pro; y/o
10 – preferentemente con la condición de que el residuo 221 sea Thr;
haciendo preferentemente dicha proteína que el virus avirulento no revierta en un virus virulento después de al menos 3 pasajes en anfitriones que se sabe que son susceptibles al IPNV.
En una realización particularmente preferente según el primer aspecto de la presente invención, el IPNV avirulento vivo comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VP2 que comprende una secuencia de aminoácidos que 15 tiene una identidad de secuencia del 80% con la identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por los residuos 50-400 de la SEQIDNO1;
– preferentemente con la condición de que el residuo 252 se seleccione del grupo constituido por Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr y Cys; más preferentemente Asn o Gln, y siendo Asn lo más preferible; y/o
– preferentemente con la condición de que el residuo 281 se seleccione del grupo constituido por Ser, Asn, 20 Gln, Tyr y Cys; más preferentemente Ser o Cys, y siendo Ser lo más preferible; y/o
- –
- preferentemente con la condición de que el residuo 282 se seleccione del grupo constituido por Gln, Asp y Glu, siendo Asp lo más preferible; y/o
- –
- preferentemente con la condición de que el residuo 319 se seleccione entre Glu y Asp, siendo Glu lo más preferible; y/o
25 – preferentemente con la condición de que el residuo 217 sea Pro; y/o
– preferentemente con la condición de que el residuo 221 sea Thr;
haciendo preferentemente dicha proteína que el virus avirulento no revierta en un virus virulento después de al menos 3 pasajes en anfitriones que se sabe que son susceptibles al IPNV.
En una realización particularmente preferente según el primer aspecto de la presente invención, el IPNV avirulento
30 vivo comprende un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80% con la identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por los residuos 1-442 de la SEQIDNO 1;
– preferentemente con la condición de que el residuo 252 se seleccione del grupo constituido por Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr y Cys; más preferentemente Asn o Gln, y siendo Asn lo más preferible; y/o
35 – preferentemente con la condición de que el residuo 281 se seleccione del grupo constituido por Ser, Asn, Gln, Tyr y Cys; más preferentemente Ser o Cys, y siendo Ser lo más preferible; y/o
– preferentemente con la condición de que el residuo 282 se seleccione del grupo constituido por Gln, Asp y Glu, siendo Asp lo más preferible; y/o
– preferentemente con la condición de que el residuo 319 se seleccione entre Glu y Asp, siendo Glu lo más 40 preferible; y/o
- –
- preferentemente con la condición de que el residuo 217 sea Pro; y/o
- –
- preferentemente con la condición de que el residuo 221 sea Thr;
haciendo preferentemente dicha proteína que el virus avirulento no revierta en un virus virulento después de al menos 3 pasajes en anfitriones que se sabe que son susceptibles al IPNV.
45 En una realización particularmente preferente según el primer aspecto de la presente invención, el IPNV avirulento vivo comprende un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que
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- el residuo 282 se seleccione del grupo constituido por Gln, Asp y Glu; más preferentemente Asp; y/o
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- el residuo 319 se seleccione entre Glu y Asp, siendo Glu lo más preferible; y/o
- –
- el residuo 217 sea Pro; y/o
- –
- el residuo 221 sea Thr;
haciendo preferentemente dicha proteína que el virus avirulento no revierta en un virus virulento después de al menos 3 pasajes en anfitriones que se sabe que son susceptibles al IPNV.
En una realización preferente, dicha identidad de secuencia se selecciona del grupo constituido por una identidad de secuencia de al menos el 85%, una identidad de secuencia de al menos el 90%, una identidad de secuencia de al menos el 95% y una % identidad de secuencia del 100.
En una realización particularmente preferente, dicha proteína VP2 madura y/o dicha proteína VP2 precursora comprenden una secuencia de aminoácidos representada por el residuo 1-442 de la SEQIDNO1.
En otra realización particularmente preferente, dicha proteína VP2 madura consiste en una secuencia de aminoácidos representada por el residuo 1-442 de la SEQIDNO1 y dicha proteína VP2 precursora consiste en una secuencia de aminoácidos representada por el residuo 1-508 de la SEQIDNO1.
La secuencia de aminoácidos de la VP2 precursora y la VP2 madura de la cepa G700 está representada, respectivamente, por los residuos aminoácidos 1-508 y 1-442 de la SEQ ID NO:1; y proporciona una referencia conveniente para la numeración de los aminoácidos usados en la presente memoria. Se cree que los expertos en la técnica identificarán inmediatamente las posiciones correspondientes en otras proteínas VP2 precursoras y VP2 maduras.
Según se ha expuesto anteriormente, el segmento genómico A del IPNV codifica una poliproteína precursora de 106 kDa compuesta de pVP2-VP4-VP3 en ese orden. Cuando se hace referencia a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína, debería entenderse que también se pretende que esté incluida una molécula de ácido nucleico que codifique una poliproteína, siendo dicha proteína parte de la proliproteína.
En caso de que el ácido nucleico codifique la proteína en forma de una poliproteína, se prefiere que el virus también comprenda medios para separar la poliproteína en proteínas separadas. Así, en una realización según la presente invención, el virus IPNV comprende, además, un ácido nucleico que codifica una NS-proteasa; por ejemplo, un ácido nucleico que codifique la proteína VP4. Opcionalmente, en el anfitrión pueden estar presentes los medios para separar la poliproteína en las proteínas separadas.
Además, en caso de que el ácido nucleico codifique una proteína precursora (por ejemplo, pVP2), se prefiere que el virus también comprenda medios para transformar la precursora en su forma madura (por ejemplo, mVP2). Opcionalmente, los medios para transformar la precursora en su forma madura pueden estar presentes en el anfitrión.
Una realización particularmente preferente según el primer aspecto de la presente invención versa sobre la cepa G700 (IPNV-G700) depositada con el nº de acceso ECACC 11 041201, o cepas estrechamente relacionadas de la misma. Con “cepas estrechamente relacionadas” queremos decir cualquier cepa que comparta características genotípicas y/o fenotípicas similares a la cepa depositada. En particular, esta frase abarca formas ligeramente modificadas del virus que retienen sustancialmente las mismas actividades funcionales. Así, por ejemplo, algunas adiciones, deleciones o alteraciones aminoácidos o nucleótidos tienen muy poco efecto, en caso de que lo tengan, en las actividades funcionales del virus.
La realización más preferente según el primer aspecto de la presente invención versa sobre la cepa G700 (IPNV-G700), depositada con el nº de acceso ECACC 11 041201.
Otra realización particularmente preferente versa sobre un IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención que, cuando es administrado por inmersión con un título de 2 × 105 TCID50/ml a alevines de salmón atlántico mantenidos en agua dulce a una temperatura de 12°C,
- –
- hace que los alevines sean positivos al virus, medidos por reaislamiento en las células RTG-2;
- –
- hace que los alevines sean negativos al virus, medidos por inmunohistoquímica;
- –
- proporciona a los alevines protección contra la enfermedad de la IPN, preferiblemente en comparación con alevines no infectados; y
- –
- hace que los alevines no desarrollen ningún signo de la enfermedad de la IPN.
5
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Otra realización particularmente preferente versa sobre un IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención que, cuando es administrado por inmersión con un título de 2 × 105 TCID50/ml a alevines de salmón atlántico mantenidos en agua dulce a una temperatura de 12°C,
- –
- hace que los alevines sean positivos al virus, medidos por reaislamiento en las células RTG-2;
- –
- hace que los alevines sean negativos al virus, medidos por inmunohistoquímica;
- –
- proporciona a los alevines protección contra la enfermedad de la IPN, preferiblemente en comparación con alevines que no han sido expuestos al IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención; y
- –
- hace que los alevines no desarrollen ningún signo de la enfermedad de la IPN.
Según se ha expuesto con anterioridad, los peces infectados con la cepa G700 parecían estar protegidos de desarrollar la enfermedad de la IPN cuando se mezclan con peces que portan una cepa virulenta. Estos hallazgos revelaron un potencial para esta cepa natural como vacuna avirulenta viva contra la IPN.
Así, un segundo aspecto de la presente invención versa sobre una vacuna que comprende el IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención.
Un tercer aspecto de la presente invención versa sobre el IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención para ser usado como vacuna.
En una realización preferente según el tercer aspecto de la presente invención, el IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención es para ser usado como vacuna contra la enfermedad de la IPN en alevines y/o esguines y/o peces; más preferentemente, para ser usado como vacuna contra la enfermedad de la IPN en alevines.
En una realización particularmente preferente según el tercer aspecto de la presente invención, el IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención es para la vacunación de alevines contra la enfermedad de la IPN.
En una realización preferente según el tercer aspecto de la presente invención, la vacuna es distribuida por inmersión o administración oral; más preferentemente, distribuida a los alevines por inmersión o administración oral.
En otra realización preferente según el tercer aspecto de la presente invención, dichos alevines son mantenidos en un entorno que está libre del IPNV virulento durante al menos 10 días después de la vacunación con dicho IPNV avirulento.
En otra realización preferente según el tercer aspecto de la presente invención, dicho virus o vacuna es distribuido no después del día 4 después de la alimentación inicial de los alevines. En otra realización preferente según el tercer aspecto de la presente invención, la distribución es por inmersión usando una dosificación del virus en el intervalo de 1 × 104 TCID50/ml a 1 × 106 TCID50/ml; más preferentemente 5 × 104 TCID50/ml a 5 × 105 TCID50/ml; aún más preferentemente 1 × 105 TCID50/ml a 5 × 105 TCID50/ml; y lo más preferible es que sea de aproximadamente 2 × 105 TCID50/ml.
La presente invención también versa sobre un IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención, o sobre una vacuna según el segundo aspecto de la presente invención, para la profilaxis o tratamiento de la enfermedad de la IPN.
La presente invención también versa sobre un IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención, o sobre una vacuna según el segundo aspecto de la presente invención, para la profilaxis o tratamiento de la IPN, siendo la distribución por inyección, inmersión o como aditivo alimenticio, preferentemente inmersión o como aditivo alimenticio, siendo lo más preferible por inmersión.
La presente invención también versa sobre un IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención, o sobre una vacuna según el segundo aspecto de la presente invención, para la profilaxis o tratamiento de la enfermedad de la IPN en peces y/o alevines, preferiblemente alevines.
La presente invención también versa sobre un IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención, o sobre una vacuna según el segundo aspecto de la presente invención, para la profilaxis o tratamiento de la enfermedad de la IPN en alevines, manteniéndose dichos alevines en un entorno que está libre del IPNV virulento durante al menos 10 días después de la vacunación con dicho IPNV avirulento.
La presente invención también versa sobre un IPNV avirulento vivo según el primer aspecto de la presente invención, o sobre una vacuna según el segundo aspecto de la presente invención, para la profilaxis o tratamiento de la enfermedad de la IPN en alevines, administrándose dicho virus o vacuna no después del día 4 desde la alimentación inicial de los alevines.
- Tarea
- Actividad Día exp.
- Grupo de inmunización 2
- Los peces de cuatro tanques paralelos (2A-D) fueron inmunizados interrumpiendo el flujo de agua y añadiendo al agua 2 × 105 TCID50/ml de la cepa G700. El caudal normal se reanudó después de tres horas. 8
- Muestreo
- Seis peces fueron recogidos de todos los paralelos en los grupos 1, 2 y 3, y congelados a -20°C. Seis peces de todos los paralelos en los grupos 1, 2 y 3 fueron sometidos a muestreo mediante inmersión en formol para un examen histopatológico. 14
- Provocación
- Los peces en el grupo de inmunización 1A-C, en el grupo de inmunización 2A-C y en el grupo no inmunizado 3A-C fueron sometidos a una prueba de provocación interrumpiendo el flujo de agua y añadiendo al agua 2 × 105 TCID50/ml de la cepa V-1244. El flujo de agua también fue interrumpido en los tanques de control (1D, 2D y 3D-E), y el caudal normal se reanudó después de tres horas. 14
- Muestreo
- Seis peces fueron recogidos de todos los paralelos en los grupos 1, 2 y 3, y congelados a -20°C. Seis peces de todos los paralelos en los grupos 1, 2 y 3 fueron sometidos a muestreo mediante inmersión en formol para un examen histopatológico. 28
- Muestreo
- Seis peces fueron recogidos de todos los paralelos en los grupos 1, 2 y 3, y congelados a -20°C. Seis peces de todos los paralelos en los grupos 1, 2 y 3 fueron sometidos a muestreo mediante inmersión en formol para un examen histopatológico. 42
- Fin del experimento
- Cualquier pez remanente fue muerto y congelado a -70°C. 43
Resultados, reaislamiento del virus mediante cultivo celular y RT-PCR
Los grupos de inmunización 1A-D y 2A-D, así como los grupos no inmunizados (3A-E) fueron sometidos a muestreo antes de su sometimiento a la prueba de provocación en el día 14 del experimento. Los grupos inmunizados resultaron positivos al IPNV después del reaislamiento en células RTG-2. Esto se confirmó con resultados positivos
5 de RT-PCR. Los grupos no inmunizados fueron negativos tanto en el cultivo celular como en RT-PCR (Tabla 1).
El muestreo se repitió después de la prueba de provocación en el día 28 del experimento. Los resultados demuestran que todos los grupos que fueron inmunizados y/o sometidos a la prueba de provocación (grupos 1A-D, 2A-D y 3A-C) fueron positivos al virus. Los grupos no inmunizados ni sometidos a la prueba de provocación (3D-E) fueron negativos según cultivo celular. Sin embargo, 2 de 12 muestras resultaron positivas según PCR (Tabla 1).
10 El último muestreo, en el día 42 del experimento, presenta resultados positivos en los grupos 1 y 2 de inmunización (1A-C y 2A-C), pero se encontró que 7 de las muestras del grupo 2 eran positivas según PCR. Asimismo, se halló 4 de 18 muestras en los grupos no inmunizados ni sometidos a la prueba de provocación (3A-C) también eran positivos según PCR, aunque no según el reaislamiento del virus. Los controles negativos (3D-E) fueron todos negativos según el cultivo celular y RT-PCR (Tabla 1).
15 Tabla 1
- Grupo
- Tanque Previo a la provocacióndía 14 del exp. Posterior a la provocacióndía 28 del exp. Posterior a la provocacióndía 42 del exp.
- Total
- + – Total + – Total + –
- 1
- A,B,C 18 18 0 18 18 0 18 18 0
- 2
- A,B,C 18 18 0 18 18 0 18 15 (3)
- 3
- A,B,C 18 0 18 18 18 0 18 14 (4)
- 1
- D 6 6 0 6 6 0 6 6 0
- 2
- D 6 6 0 6 6 0 6 2 (4)
- 3
- D,E 12 0 12 12 2 10 12 0 12
Resultados del reaislamiento del virus en los alevines sometidos a muestreo en diferentes momentos. Los homogenatos fueron sometidos a ensayo mediante inoculación en cultivo celular (RTG-2) y observación del ECP
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seguido por verificación mediante RT-PCR. Los números entre paréntesis representan resultados positivos únicamente según RT-PCR (la PCR tiene una sensibilidad más elevada que el cultivo celular).
Resultados, mortalidad
La mortalidad fue registrada diariamente y los peces muertos (si los había) eran retirados de los tanques diariamente. Los resultados están representados en la Figura 1 y la Figura 2.
Ejemplo 2
“Avirulencia y estabilidad genética”
La purificación de placas de las placas de IPNV de la cepa de la vacuna se obtuvo propagando disoluciones seriadas de la cepa G700 en células CHSE-214, con gel de agarosa (SeaPlaque) como soporte sólido. Tres placas fueron identificadas, recolectadas, purificadas y clonadas. Dos de estas fueron sometidas a caracterización adicional secuenciando el gen VP2.
Los resultados obtenidos muestran que la secuencia VP2 de ambos clones era un 100% idéntica, tanto a escala de nucleótidos como de aminoácidos y también era idéntico a la cepa G700 original. Los clones tenían Pro217Thr221 en el motivo de virulencia, coherente con los aislados de baja virulencia. Sin embargo, solo se usó uno de los dos clones en los experimentos subsiguientes de provocación.
La secuencia de nucleótidos del gen VP2 de G700 está presentada en la SEQ ID NO:2, y la secuencia de aminoácidos de la proteína VP2 madura de G700 está representada por el residuo aminoácido 1-442 de la SEQ ID NO:1.
Avirulencia y estabilidad genética
La prueba de provocación de los alevines se efectuó en Veso-Vikan, acreditada instalación experimental que satisface los requisitos de las normativas existentes (basadas en monografías de la Farmacopea General Europea para la documentación de vacunas de virus vivos). Se usaron alevines de salmón atlántico de la variedad AquaGen, que se sabe que son susceptibles al IPNV. Los alevines fueron expuestos (provocados) a la solución de virus en el momento de la alimentación inicial. Aunque el objetivo inicial era someter al virus a 6 pasajes en alevines, solo fue posible acometer 3 pasajes, debido a la estacionalidad en la disponibilidad de alevines. El estudio se realizó como bloques experimentales discontinuos, uno detrás de otro, con trabajo de laboratorio (reaislamiento y propagación de virus para su uso en el experimento siguiente) entre medias. Cada experimento comprendió tres paralelos, con 100 alevines en cada cubo. También se incluyó un cuarto cubo que contenía 100 alevines como control contra la mortalidad incidental. La dosificación del virus fue de aproximadamente 2 × 105 TCID50/ml y fue administrado mediante baño aproximadamente 6 días después de la alimentación inicial. El primer muestreo se realizó el día 21 tras la exposición al virus. Después del muestreo, los alevines fueron sometidos a estrés (disminuyendo el contenido de agua en los cubos combinado con movimiento de un salabre en los cubos durante un periodo de 10 min; este procedimiento se repitió diariamente durante 1 semana) en los bloques experimentales 1º y 3º. Estos alevines fueron observados durante 28 días más antes del muestreo final. Las mortalidades se registraron a diario.
La Figura 3 muestra las mortalidades totales al final de cada bloque experimental. En el primer experimento, hubo ligeramente más mortalidad incidental en los grupos tanto de control como inmunizado tanto antes como después del estrés. Después del estrés, no obstante, morían 5 alevines más de promedia en el grupo sometido a la prueba de provocación con respecto al control, aunque, en último término, sobrevivió aproximadamente el 90% de los alevines y no hubo ninguna diferencia significativa (p=0,05) entre el grupo sometido a la prueba de provocación y el de control. En los experimentos segundo y tercero, muy pocos peces murieron en cualquiera de los dos grupos, sin que se observara diferencia estadística entre los grupos, ni siquiera después de someterlos a estrés (3er experimento).
Histológicamente, no se observó ninguna lesión patológica en órganos internos, incluyendo el páncreas de los alevines antes o después del estrés. Además, no se detectó mediante inmunohistoquímica ningún virus de IPN en ninguno de los alevines inmunizados, aunque el virus fuera reaislado de ellos. Esto sugiere que el virus estaba presente en los alevines únicamente en niveles subclínicos. Las secuencias de VP2 de los virus reaislados fueron idénticas en un 100% al aislado original (G700) al comienzo y al fin del estudio. Sin embargo, en los pasajes 2º y 3º anteriores al estrés se observó una mutación de leucina a fenilalanina en la posición 336. Esta es una mutación conservada y no tiene ninguna influencia en la virulencia del virus, dado que cae fuera de los motivos críticos. Esto está apoyado por las bajas mortalidades asociadas con los aislados. También es digno de mención que la mutación revirtió tras el estrés de los alevines en el 3er experimento.
Ejemplo 3
“Avirulencia e inestabilidad genética”
Células y virus
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55
Se mantuvieron embriones de salmón Chinock (células CHSE-214; ATCC CCL-1681) a 20°C en medio L-15 (Sigma-Aldrich) complementado con suero fetal bovino al 5% (FBS, Medprobe), 2 mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich) y 50 μg ml-1 de gentamicina (Sigma-Aldrich). Se cultivaron células de gónadas (RTG-2; ATCC CCL-55) de trucha arcoíris a 20°C en medio L-15 complementado con suero fetal bovino al 10%, 2 mM de L-glutamina y 50 μg ml-1 de gentamicina.
Los aislados virales fueron propagados en células RTG-2 mediante inoculación de 100μl de solución viral madre (almacenada a -20°C en glicerol al 30%, título ~ 107 TCID50/ml) en matraces de cultivo celular confluentes en T de 162 cm2 al 70%. Los sobrenadantes fueron recolectados cuando era visible de forma generalizada el efecto citopático, 5-7 días después de la infección. Los sobrenadantes del cultivo celular fueron obtenidos después de una centrifugación a 2500 × g durante 10 minutos, y de filtrado estéril (0,22μl). El título infeccioso se determinó mediante disolución límite en células CHSE-214, y la TCID50 fue estimada mediante el método de Kärber (1931. Beitrage zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. Arch. Exp. Pathol. Pharmakol 162:480-483).
Construcción de clones de ADNc de longitud máxima
La generación de clones de ADNc de longitud máxima de todas las regiones codificantes y no codificantes de los segmentos A y B de ARN de NVI-015 se llevó a cabo según procedimientos descritos por Yao y Vakharia (1998. Generation of infectious pancreatic necrosis virus from cloned cDNA. J Virol. 72:8913-8920). El aislado recombinante rNVI-15PA (también denominado rNVI15VP2) de IPNV Sp fue generado según ha sido descrito anteriormente por Song y colaboradores (2005. Molecular determinants of infectious pancreatic necrosis virus virulence and cell culture adaptation. Journal of Virology 79: 10289-10299). Este aislado recombinante se origina a partir de rNVI-15TA (también denominado rNVI15) y el terminal 5′ de Sp103. Esto dio como resultado la recuperación de la progenie viral con un motivo de virulencia similar Pro217Ala221Ala247 al del aislado progenitor Sp103 (2005. Molecular determinants of infectious pancreatic necrosis virus virulence and cell culture adaptation. Journal of Virology 79:10289-10299). La Sp103 es un aislado del IPNV obtenido de un brote natural de IPN, y provoca tasas de mortalidad de moderadas a bajas (2005. Infectious pancreatic necrosis virus induces apoptosis in vitro and in vivo independent of VP5 expression. Virology 342:13-25; 2004. Identification of putative motifs involved in the virulence of infectious pancreatic necrosis virus. Virology 322:31-40). El virus recombinante rNVI-15PA fue sometido a dos tandas de purificación de placas en células CHSE-214 antes de su propagación de células RTG-2 para obtener una reserva. El ácido nucleico del virus fue secuenciado completamente para garantizar que no se produjera ninguna mutación adversa debido a la adaptación celular.
Las cepas de virus creadas por ingeniería genética se propagaron en monocapas de RTG-2. Los sobrenadantes fueron recolectados tras una centrifugación a 2500 × g durante 10 minutos, y de filtrado estéril (0,22μl). La extracción de ARN usando el mini kit viral QIAamp (Qiagen) se llevó a cabo según la recomendación del fabricante. Para garantizar que los clones generados tenían los residuos correctos, los genomas de los segmentos A y B fueron secuenciados según describen Yao y Vakharia (1998. Generation of infectious pancreatic necrosis virus from cloned cDNA. J Virol. 72:8913-8920) y los cromatogramas fueron analizados.
Ensayo de purificación en placas
Para generar el virus mutante final en el residuo 221 de VP2, los inventores efectuaron 10 veces (pasajes) el pasaje del virus recombinante ProAlaAla obtenido en células CHSE-214 (2005. Molecular determinants of infectious pancreatic necrosis virus virulence and cell culture adaptation. Journal of Virology 79:10289-10299). A continuación, el aislado fue purificado en placas inoculando monocapas de RTG-2 en placas de seis pocillos con una disolución en potencias de diez (10-3 a 10-8) de sobrenadantes del cultivo celular. Después de 1 hora de adsorción a temperatura ambiente, se retiró el inóculo y las células fueron cubiertas con agarosa SeaPlaque al 0,8% (BioWhittaker) en medio 2×L-15 (Sigma) que contenía un 5% de FBS y un 1% de L-glutamina. Las células fueron incubadas a 15°C durante 4 días, y las placas formadas por el efecto citopático (ECP) fueron cogidas mediante la inserción de unas pinzas de biopsia de 3 mm (Miltex), llegando a la placa atravesando el agar. Posteriormente, las placas fueron inoculadas sobre monocapas de RTG-2 e incubadas a 15°C hasta que se observó un ECP completo. Después el sobrenadante fue recogido tras una centrifugación a 2500 × g durante 10 minutos y filtrado estéril (0,22μl). Se extrajo ARN usando el mini kit de ARN viral QIAamp según las recomendaciones del fabricante. Se determinaron secuencias completas de nucleótidos de los segmentos A y B de cada virus según se ha descrito antes. Los cromatógrafos fueron revisados para garantizar que en el estudio se usaba un codón ATT “limpio” que codificaba Thr221. No se encontró ninguna otra mutación en todo el genoma del virus en comparación con rNVI-15PA. Antes del sometimiento a la prueba de provocación, los aislados fueron propagados por un pasaje en células RTG-2.
Establecimiento de una población de alevines de salmón atlántico infectados persistentemente
La prueba de provocación se realizó en el centro de investigación de VESO Vikan, Namsos, Noruega. Esto formó parte de un estudio mayor que incluía en total 1020 alevines de salmón atlántico (Salmo salar L.) de la variedad AquaGen eclosionados en el criadero VESO Vikan incluidos en el experimento. Los alevines habían comenzado recientemente a alimentarse (Micro 015, Ewos) y tenían un peso medio de 0,2 gramos (n=20). Los peces fueron divididos en 4 cubos, cada uno de 250 alevines. Después de un periodo de aclimatación de una semana, los alevines pasaron hambre un día antes de ser sometidos a la prueba de provocación.
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Los peces fueron sometidos a la prueba de provocación mediante inmersión con rNVI-15PT a una dosis de 5 × 104 TCID50/ml en un volumen total de 4 litros (Tanque 1). Un tanque de control fue infectado de forma simulada añadiendo medio de cultivo celular (Tanque 2). El agua fue removida durante la prueba de provocación para su aireación. Después de un periodo de 3 horas, el volumen de agua fue reducido a 2 litros y se reanudó el caudal normal. Se registró la mortalidad y los peces muertos fueron recogidos y congelados diariamente a -70°C. Se llevó a cabo un muestreo de diez peces de cada tanque diez días después de la prueba de provocación y, después de este primer muestreo, diez peces fueron objeto de muestreo de cada tanque una vez al mes, hasta seis meses después de la prueba de provocación.
Reaislamiento del virus a partir de peces persistentemente infectados
A las muestras de alevines almacenados a -70°C sin conservantes se añadió suero fisiológico con tampón de fosfato (PBS) (1:5, peso/volumen) y fueron homogeneizadas usando un homogeneizador peristáltico. Se transfirieron 100μl de este homogenato a 600μl de tampón de RLT que contenía 2-mercaptoetanol (mini kit RNeasy, Qiagen) y fueron almacenados a -70°C. El resto del homogenato fue diluido 1:2 en medio L-15 complementado con 2 mM de Lglutamina y 50μg ml-1 de gentamicina. Después de una breve centrifugación a 2500 × g durante 10 minutos, el sobrenadante fue inoculado en células RTG-2 cultivadas en placas de 24 pocillos en disoluciones finales del 1% y el 0,1%, e incubado durante una semana a 15°C. El medio de cultivo celular del primer pasaje fue usado para infectar nuevas monocapas. Las muestras fueron consideradas negativas cuando no se observaba ningún ECP después de una incubación de 1 semana del segundo pasaje. Se aisló ARN del homogenato de peces para todas las muestras negativas en el cultivo celular usando el mini kit RNeasy (Qiagen) según el protocolo del proveedor, y se efectuó una RT-PCR para amplificar un fragmento de ADN específico al IPNV, de 224 bp, según describen Santi et al. (2004. Identification of putative motifs involved in the virulence of infectious pancreatic necrosis virus. Virology 322:31-40) con modificaciones menores. Los productos de PCR fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa y visualizados mediante tincionado con tinción de gel de ADN SYBR® Safe (Invitrogen).
Secuenciación
Se aisló ARN a partir del homogenato almacenado en tampón de RLT que contenía 2-mercaptoetanol (mini kit RNeasy, Qiagen) almacenado a-70°C después de la homogenización. Se llevó a cabo RT-PCR para amplificar un fragmento de ADN específico al IPNV, de 400 bp, usando el kit de RT-PCR OneStep de Qiagen según las instrucciones del fabricante, con 0,5 μg de ARN y 15 pmol de cada uno de los cebadores A-Sp500F y A-Sp1689R (2004. Identification of putative motifs involved in the virulence of infectious pancreatic necrosis virus. Virology 322:31-40) en un volumen total de reacción de 25 μl. Las condiciones de ciclado fueron 50°C durante 30 min., 95°C durante 15 min., seguido por 40 ciclos a 94°C durante 45 s, 57°C durante 45s, 72°C durante 2 min. 15s, y, por último, 72°C durante 10 min. Los productos de PCR fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa y analizados mediante tincionado con tinción de gel de ADN SYBR® Safe (Invitrogen).
Para purificar los fragmentos de ADN del gel de agarosa, se usó la columna de centrifugación de extracción de gel de ADN Quantum Prep Freeze N’ Squeeze (BIO-RAD) según las instrucciones del fabricante. El ADN recuperado fue secuenciado por un servicio comercial de secuenciación (operón de Eurofins MWG) usando el cebador A-Sp500F (2004. Identification of putative motifs involved in the virulence of infectious pancreatic necrosis virus. Virology 322:31-40). Los datos de la secuencia fueron analizados usando el soporte lógico VectorNTI (Invitrogen).
Clonación y secuenciación de nucleótidos
Se tomaron cuatro muestras con diferentes mezclas de bases en las posiciones 217 y 221 para su clonación y secuenciación. Los productos de PCR amplificados por polimerasa Taq derivados de la etapa de secuenciación fueron clonados en un Vector TOPO® usando TOPO TA Cloning® según las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Las células One Shot® de E. coli químicamente competentes fueron transformadas según el protocolo y se distribuyeron 50 μl sobre placas de agar precalentadas que contenían 50 μg/ml de ampicilina y fueron preincubadas durante 30 min a 37°C con 40 μl 40 mg/ml X-gal (Invitrogen) en dimetilformamida para la selección blanca/azul. Se cogieron 80-96 colonias blancas de cada placa de Petri y se puso una en cada pocillo de una placa de agar de 96 pocillos con 150 mg de ampicilina (GATC Biotech). Los plásmidos fueron aislados y secuenciados por una empresa comercial de secuenciación, GATC Biotech. Los datos de secuencia fueron analizados usando el soporte lógico VectorNTI.
Resultados
Construcción de virus de la cepa IPNV Sp de baja virulencia
El aislado usado para la prueba de provocación tenía las siguientes combinaciones de aminoácidos en las posiciones 217, 221 y 247: ProThrAla. Los aminoácidos en las posiciones 252, 281, 282 y 319 fueron ValThrAsnAla.
En detalle, los constructores que incluían combinaciones de los constructos originales pUC19NVI15VP2 y pUC19NVI15B dieron como resultado la recuperación de NVI-15PA (2005. Molecular determinants of infectious pancreatic necrosis virus virulence and cell culture adaptation. Journal of Virology 79:10289-10299), que
subsiguientemente fue sometido a pasaje 10 veces, resultando en una mutación en la posición 221 en VP2 (Ala221 Thr), y, después de la purificación de la placa, se recuperó el aislado rNVI-15PT con la combinación de aminoácidos ProThrAla.
Los ARN genómicos de los virus recuperados fueron analizados después de su amplificación mediante RT-PCR, y el
5 análisis de secuencias de los productos de RT-PCR confirmó las mutaciones previstas en las regiones VP2 y VP1. Además, se determinaron las secuencias completas de nucleótidos del segmento A de ambos virus, que no presentaba ninguna otra sustitución no deseada de nucleótidos.
Infección persistente de los alevines
La dosis de la prueba de provocación usada en este estudio fue menor que la acostumbrada en estudios estándar
10 de provocación (2004. Identification of putative motifs involved in the virulence of infectious pancreatic necrosis virus. Virology 322:31-40), pensados para establecer una infección persistente en alevines y para retener un gran número de peces supervivientes (>95%). De todos los peces muestreados durante el experimento, el 94% estaba persistentemente infectado.
Reaislamiento y caracterización del IPNV a partir de los alevines infectados
15 Para documentar que los peces estaban infectados y permanecían permanentemente infectados, los inventores recogieron alevines una vez cada 30 días en los meses 1-6 después de la infección. En cada punto temporal, fueron examinados 10 peces usando cultivo celular y RT-PCR. En general, los IPNV fueron reaislados por cultivo o detectados mediante RT-PCR en un 94% de los tres grupos. Ya fuera por reaislamiento del virus o RT-PCR, todos los peces eran positivos a los 6 meses posteriores a la prueba de provocación.
20 El avance de infección aguda a persistencia ha sido asociado con el aumento en la complejidad genómica de regiones hipervariables de los virus, documentada en particular para el VHC (2000. The outcome of acute hepatitis C predicted by the evolution of the viral quasispecies. Science 288:339-344. doi:8445 [pii]) y da como resultado de cuasiespecies. Con el fin de determinar la complejidad de los genomas virales de la región hipervariable de la proteína VP2 (posiciones de aminoácidos 180-360) y de cualquier mutación en peces individuales durante el periodo
25 de persistencia, el ARN aislado de cada uno de 5 peces de cada grupo en todos los puntos de muestreo fue amplificado mediante RT-PCR, y los productos de PCR fueron purificados mediante electroforesis en gel y enviados para su secuenciación. Esto demostró que la cepa con ProThrAla tenía mutaciones en el genoma que producían una combinación de ProThrAla (aislado de la prueba de provocación) y a nueva variante ThrAlaThr, que representa una cepa revertida muy virulenta del IPNV (Figura 5).
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