ES2257505T3 - Mutantes de virus de la rabia atenuados y vacunas vivas correspondientes. - Google Patents
Mutantes de virus de la rabia atenuados y vacunas vivas correspondientes.Info
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Abstract
Mutante del virus de la rabia recombinante que tiene una mutación en la proteína G, así como una mutación en la proteína P, donde la mutación en la proteína G es una substitución de aminoácido de la arginina en la posición 333 por otro aminoácido y donde la mutación en la proteína P es una deleción de los aminoácidos 143 a 149 ó 139 a 149.
Description
Mutantes de virus de la rabia atenuados y vacunas
vivas correspondientes.
La presente invención se relaciona con mutantes
del virus de la rabia atenuados consistentes en mutaciones
atenuantes combinadas en su glicoproteína y genes de
fosfoproteínas.
La rabia sigue siendo una de las enfermedades
infecciosas más temibles que afectan a humanos y animales, a pesar
de los significativos avances científicos en su prevención y
control. La rabia se presenta como un problema distinto en
diferentes partes del mundo. En las naciones más industrializadas,
el riesgo para los seres humanos se ha minimizado
significativamente, principalmente debido a los programas
obligatorios de vacunación de perros y otros animales domésticos.
Aunque la rabia salvaje existe aún en los países desarrollados, se
han hecho progresos de lo más impresionantes en el control y la
eliminación de la rabia salvaje usando la inmunización oral de
carnívoros salvajes.
Por el contrario, la rabia sigue siendo una
amenaza mayor para la salud pública y sigue causando numerosas
muertes humanas en las naciones menos industrializadas. La rabia
del perro es aún epizoótica en la mayoría de los países de África,
Asia y Sudamérica y, en estos países, los perros son responsables
de la mayor parte de las muertes humanas debidas a la enfermedad.
Por lo tanto, se necesita introducir nuevas estrategias de control
además de los programas de vacunación parenteral existentes. Debido
al éxito en el control de la rabia salvaje, diversos países en vías
de desarrollo se están ofreciendo como voluntarios actualmente para
hacer uso de la vacunación oral de
perros.
perros.
Con fines de inmunización oral de perros, la
vacuna debe ser altamente segura debido al muy estrecho contacto
entre perros y humanos en comparación con el contacto entre
animales salvajes y humanos. Por lo tanto, existe una necesidad
continua de vacunas vivas atenuadas seguras para la rabia que no
tengan patogenicidad residual o que no presenten el potencial de
revertir a la variante patógena.
El virus de la rabia (RV) es un virus ARN de
hebra negativa no segmentado de la familia Rhabdoviridae. El RV
está compuesto por dos componentes estructurales mayores: una
nucleocápside o ribonucleoproteína (RNP) y una envuelta en forma de
una membrana bicapa que rodea el núcleo RNP. El componente
infeccioso de todos los Rhabdovirus es el núcleo RNP, que consiste
en el genoma de ARN encapsidado por la nucleoproteína (N) en
combinación con otras dos proteínas, es decir, la
ARN-polimerasa ARN-dependiente (L) y
la fosfoproteína (P). La membrana que rodea el núcleo RNP consiste
en dos proteínas: una glicoproteína de transmembrana (G) y una
proteína de matriz (M) localizada en el lado interno de la
membrana.
La proteína G, a la que también se hace
referencia como proteína espiculada, es responsable de la unión
celular y de la fusión de membrana en el RV y adicionalmente es el
blanco principal del sistema inmune del huésped. La región de
aminoácidos en la posición 330 a 340 (a la que se hace referencia
como sitio antigénico III) de la proteína G ha sido identificada
como responsable de la virulencia del virus, en particular el
residuo Arg en la posición 333.
Las vacunas contra la rabia vivas atenuadas
actualmente disponibles se basan en cepas vacunales de RV
atenuadas, incluyendo la cepa SAD Bern o la cepa SAD B19; sin
embargo, estas vacunas aún tienen una patogenicidad residual
indeseada. Se han hecho diversos intentos por obtener cepas de RV
no patógenas para uso en una vacuna viva. La Patente Europea 350398
describe un mutante avirulento de RV SAG1 derivado de la cepa Bern
SAD de RV en donde la glicoproteína posee Ser en lugar de Arg en la
posición 333. El mutante avirulento SAG1 fue obtenido bajo presión
selectiva de anticuerpos monoclonales específicos sobre la cepa SAD
Bern. En ratones adultos, se ha visto que SAG1 es no patogénico.
Sin embargo, se producían revertantes patogénicos del virus
atenuado con una frecuencia de 1 en 10.000 (Lafay y col., Vaccine
12, pp. 317-320, 1994). La inestabilidad genética
de este mutante lo hace inadecuado para una vacunación segura.
La solicitud de patente Europea 583998 describe
otro mutante de RV atenuado, SAG2, en el que la Arg en posición 333
ha sido substituida por Glu en la glicoproteína. SAG2 es no
patogénico para ratones adultos cuando se administra por diversas
vías. Como este mutante tiene también potencial para revertir a la
cepa parental patógena, la vacuna es producida en presencia de
anticuerpos monoclonales específicos para evitar la reversión
(Blancou y Meslin, 1996; En Laboratory techniques in rabies, pp.
324-337). Como estos anticuerpos monoclonales
específicos no están presentes en animales inoculados, la
vacunación con dicho mutante tiene aún el riesgo de que el mutante
revierta a virulencia en el animal inoculado, dando lugar a brotes
de enfermedad en los animales inoculados y a una posible
propagación del patógeno a otros animales.
Más aún, se describieron mutantes de RV atenuados
estables en WO00/32755, que poseen substituciones de la Arg en la
posición 333 de la proteína G con otros aminoácidos que difieren en
los tres nucleótidos del codon de la Arg_{333} en el virus
parental.
Todos los virus vacunales de la rabia vivos antes
descritos que poseen un aminoácido que difiere de Arg en la
posición 333 de la glicoproteína son no patógenos para ratones
adultos inmunocompetentes. Sin embargo, aún son patógenos cuando se
inoculan a ratones lactantes de 1-2 días de edad, lo
que demuestra la existencia de patogenicidad residual y el riesgo
asociado a ella para animales o humanos inmunodeficientes.
La presente invención ha resuelto elegantemente
este problema generando mutantes del virus de la rabia que tienen
una reducida patogenicidad para ratones lactantes.
La presente invención describe mutantes de RV
recombinantes consistentes en una mutación combinada en dos partes
diferentes del genoma vírico, que implica a los genes P y G. Las
mutaciones en el gen P afectan preferiblemente a los residuos 139 a
170, más preferiblemente a los residuos 139 a 149. La mutación puede
ser una substitución o una deleción de uno o más aminoácidos en la
región anterior, así como combinaciones de deleción y
substitución.
Los residuos P del virus de la rabia 138 a 172
han sido mapeados como dominios responsables de la unión a la
cadena ligera de la LC8 dineína (Raux y col., 2000, J. Virol., Vol.
74, pp. 10212-10216; Jacob y col., 2000, Vol. 74,
pp. 10217-10222). Se ha sugerido que la interacción
entre P y LC8 podría ser importante para la patogénesis del virus
de la rabia. Sin embargo, una deleción de hasta 11 aminoácidos
(residuos 139-149) de este dominio no tiene efecto
detectable sobre la patogenicidad de una cepa vacunal de la rabia
convencional.
Sorprendentemente, cuando se introdujeron estas
mutaciones en virus de la rabia que carecían de Arg en la posición
333 de su proteína G, se observó una reducción dramática en la
patogenicidad para ratones lactantes. Este hallazgo inesperado
tiene una profunda ventaja en el desarrollo de vacunas para la rabia
vivas atenuadas más seguras.
Se pueden obtener mutantes preferidos según la
invención suprimiendo los residuos 143 a 149 ó 139 a 149 de la
fosfoproteína (P) del virus de la rabia y substituyendo
simultáneamente la Arg en posición 333 de la glicoproteína en otro
residuo, preferiblemente Asp en lugar de Arg.
La mutación en el gen G puede consistir en una
mutación del codon de Arg_{333} en un codon que difiere en uno,
dos o tres nucleótidos con respecto a dicho codon de ARg_{333}.
Preferiblemente, los mutantes son mutantes de una cepa de RV en la
que se han substituido los tres nucleótidos del codon de
Arg_{333}.
Los mutantes según la invención son
preferiblemente mutantes de la cepa de RV SAD, especialmente cepas
de RV SAD Bern y SAD B19. El mutante de RV preferido según la
invención es un mutante de RV recombinante en el que el codon de
Arg_{333} en el genoma de la cepa de RV SAD B19 ha sido
substituido con un triplete GAC, que codifica para el ácido
aspártico (Asp, D).
Se vio que los mutantes de RV recombinantes que
poseen la mutación combinada en los genes P y G no son patógenos o
son mucho menos patógenos para ratones lactantes de
1-2 días de edad, en oposición a los mutantes
simples que contienen sólo las mutaciones descritas en el gen P o
en el gen G. La introducción de la mutación combinada en el genoma
de RV no afectaba a la tasa de crecimiento del virus en células BSR
y el título final era similar a la cepa parental. Más aún, las
mutaciones combinadas introducidas no afectaban a la inmunogenicidad
de los virus de la rabia recombinantes tras administración oral a
perros. Se midieron niveles similares de títulos de anticuerpos
específicos para la rabia en perros a los que se vacunó oralmente
con virus recombinantes que poseen o bien sólo la mutación de la
proteína G, o bien las mutaciones combinadas en las proteínas P y
G. Esto hace que los mutantes de RV recombinantes según la
invención sean las vacunas anti-rabia vivas más
seguras.
Dichos virus de vacunas contra la rabia vivas
altamente seguras pueden ser usados no sólo para inmunizar frente a
la rabia, sino también como vectores vacunales para proteger a
humanos y/o animales de otros agentes infecciosos. Además de las
otras cinco proteínas víricas, el virus de la rabia ha mostrado
expresar un gen extraño de un modo estable durante más de 25 pases
seriados (Mebatsion y col., 1996, PNAS, Vol. 93, pp.
7310-7314). El potencial de los vectores basados en
virus de la rabia como vacunas frente a otras enfermedades víricas,
tales como HIV-1, quedó también demostrado
recientemente (Schnell y col., 2000, PNAS, Vol. 97, pp.
3544-3549). La introducción de las mutaciones
combinadas de las proteínas G y P antes descritas en vectores del
virus de la rabia aumentará sin lugar a dudas la seguridad de
cualquier vector basado en el virus de la rabia.
Los mutantes de RV recombinantes según la
invención pueden ser obtenidos usando tecnología del ADN
recombinante y mutagénesis específica de sitio para introducir las
mutaciones deseadas. La manipulación genética dirigida del RV puede
ser llevada a cabo usando el sistema genético inverso descrito en
Schnell y col., 1994, EMBO J., Vol. 13, Nº 18, pp.
4195-4203, y en la solicitud de patente Europea
0.702.085. Se puede llevar a cabo la mutagénesis específica de
sitio usando kits comerciales.
Se usó un clon de ADNc de longitud total
infeccioso (pSAD-L16) de la cepa vacunal SAD B19
descrita en Schnell y col., 1994, como base para introducir
mutaciones simples o combinadas en el gen P y/o G. Se pueden obtener
mutantes de RV según la invención a) introduciendo la mutación
deseada en el clon de ADNc de longitud total de RV, b) expresando
simultáneamente un ARN de RV antigenómico de longitud total a
partir del ADNc modificado y de proteínas N, P y L de RV
procedentes de plásmidos transfectados en células que expresan la
ARN-polimerasa T7 y c) aislando los virus mutantes
de RV producidos por dichas células. Los mutantes de RV
recombinantes según la invención pueden ser cultivados en un
cultivo celular derivado, por ejemplo, de células BHK o de células
diploides humanas. Los virus así cultivados pueden ser recogidos
cosechando los fluidos y/o las células del cultivo celular.
La vacuna según la invención puede ser preparada
usando técnicas estándar disponibles en este campo. En general, la
vacuna es preparada mezclando el mutante de RV recombinante
atenuado según la invención con un soporte o diluyente farmacéutico
aceptable.
Los soportes o diluyentes farmacéuticos
aceptables que pueden ser usados para formular una vacuna según la
invención son estériles y fisiológicamente compatibles, tales como,
por ejemplo, agua estéril, solución salina, tampones acuosos, tales
como fosfatos de metales alcalinos (v.g., PBS), alcoholes, polioles
y similares. Además, la vacuna según la invención puede incluir
otros aditivos, tales como adyuvantes, estabilizadores,
antioxidantes, conservantes y similares.
Como adyuvantes adecuados, se incluyen, aunque
sin limitación, sales o geles de aluminio, carbómeros, copolímeros
de bloques no iónicos, tocoferoles, monofosferil lípido A,
dipéptido de muramilo, emulsiones oleosas (ag/ac o ac/ag),
citokinas y saponinas, tales como Quil A. La cantidad de adyuvante
añadida depende de la naturaleza del propio adyuvante.
Son estabilizadores adecuados para uso en una
vacuna según la invención, por ejemplo, carbohidratos, incluyendo
sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrina y glucosa;
proteínas, tales como albúmina o caseína, y tampones, tales como
fosfatos alcalinos. Como conservantes adecuados, se incluyen, entre
otros, timerosal, mertiolato y gentamicina.
La vacuna anti-rabia viva
atenuada según la invención puede ser administrada a mamíferos de
sangre caliente, incluidos humanos, perros, zorros, mapaches y
mofetas por inyección (intramuscular, intradérmica o
subcutáneamente), spray o aerosol (intranasalmente), o por vía
oral. Preferiblemente, la vacuna es administrada a los sujetos por
vía oral, especialmente en el caso de animales de vida salvaje o de
perros callejeros. Para la administración oral, se mezcla la vacuna
con un soporte adecuado, tal como, por ejemplo, proteínas o aceites
de origen vegetal o animal. Para la administración oral, la
formulación vacunal puede ser además encapsulada con cebos
preparados a partir de substancias metabolizables de origen animal
o vegetal.
La dosificación útil que se ha de administrar
variará dependiendo del tipo de mamíferos de sangre caliente que se
han de vacunar, de la edad, del peso y del modo de administración.
En general, una dosificación adecuada variará entre 10^{2} y
10^{8} TCID_{50}/mamífero.
Los siguientes ejemplos ilustrarán la invención
sin limitar la invención a los mismos.
Para introducir las mutaciones deseadas en el
genoma del virus de la rabia, se clonó primeramente un fragmento
BstB1 de 2,2 kb consistente en los nucleótidos
1497-3738 de la cepa del virus de la rabia SAD B19
(la numeración de nucleótidos es según Conzelmann y col., 1990,
Virology, Vol. 175, pp. 485-499; Nº de acceso
EMBL/GenBank M31046) en el vector pSK. Se realizó una mutagénesis
dirigida a sitio usando el "QuikChange
Site-Directed Mutagenesis Kit" según las
instrucciones del fabricante. Se usaron pares de cebadores #142 y
#143 (Tabla 1) para eliminar los nucleótidos en la posición 1940 a
1960, correspondientes a los aminoácidos 143 a 149 de la proteína P
del virus de la rabia. Se introdujo también una deleción mayor que
abarcaba los nucleótidos 1928 a 1960, que corresponde a los
aminoácidos 139 a 149 de la proteína P del virus de la rabia,
usando los oligonucleótidos #144 y 145 (Tabla 1). Se confirmó la
precisión de la deleción introducida secuenciando la región
modificada. Se digirieron los clones que contenían las deleciones
deseadas (7 ó 11 aminoácidos) con NcoI y SnaBI y se usaron los
fragmentos respectivos de \sim0,8 kb para substituir los
correspondientes fragmentos de clones de ADNc de RV de longitud
total. La manipulación en pSAD-L16 (Schnell y col.,
1994, EMBO J., Vol. 13, pp. 4195-4203), que
representaba la secuencia SAD-B19, dio lugar a
pL16-\Delta97 o a
pL16-\DeltaP11 (Fig. 1), que poseen deleciones de
7 ó 11 residuos, respectivamente. Después de un intercambio similar
de fragmentos de ADN modificados de \sim0,8 kb en
pSAD-D29, se obtuvieron un clon de longitud total
que poseía Asp (D) en lugar de Arg (R) en la posición 333 de la
glicoproteína y dos clones de longitud total -
pD29-\Delta97 y pD29-\DeltaP11
(Fig. 1). Estos clones tienen las deleciones respectivas en la
proteína P y la substitución de R a D en la proteína G.
Se transfectaron aproximadamente 1,5x10^{6}
células BSR T7 (Buchholz y col., 1999, J. Virol., Vol. 73, pp.
251-259) con una mezcla de plásmidos que contenía 5
\mug de pt7T-N, 2,5 \mug de
pT7T-P y 2,5 \mug de pT7T-L y con
10 \mug de uno de los plásmidos de longitud total usando el kit
de transfección en mamíferos Stratgene (protocolo de CaPO_{4}).
Se hizo un pase de los sobrenadantes de células transfectadas y se
monitorizó la infección de las células por inmunofluorescencia
directa con un conjugado de nucleoproteína anti-RV
(Centocor). Se volvieron a hacer pases de los virus recombinantes de
2 a 3 veces y se titularon los stocks de virus resultantes por
diluciones a punto final.
\newpage
Replicación de virus recombinantes in
vitro : Para comparar la eficiencia de la producción de virus
bajo múltiples ciclos de infección, se infectaron células BSR T7
con una multiplicidad de infección ("m.o.i.") de 0,02. Se
recogieron los sobrenadantes dos días después de la infección y se
titularon por diluciones a punto final. Para el análisis de la
curva de crecimiento en una etapa, se cultivaron 10^{6} células
BSR-T7/5 en placas de 3,2 cm de diámetro durante la
noche y se infectaron por duplicado con una multiplicidad de
infección (m.o.i.) de 10 con los diversos virus recombinantes. Tras
2 h de incubación a 37ºC, se retiró el inóculo y se lavaron las
células tres veces con PBS. Se suministraron a las células 2,5 ml de
medio fresco y se volvieron a incubar a 37ºC. A las 4, 18, 24 y 48
h después de la infección, se retiraron 100 \mul de los
sobrenadantes del cultivo y se titularon por duplicado en células
BSR-T7/5.
Para determinar si los virus recombinantes
mantienen las deleciones introducidas, se aisló el ARN total de
células BSR infectadas con un pase de nivel cuatro de los
respectivos virus stock. Se llevó a cabo una RT-PCR
sobre 1 \mug de ARN total aislado de células infectadas. Se
analizaron los productos de la PCR en geles de agarosa al 1% y se
usaron directamente para la secuenciación.
Composición proteica de los virus
mutantes: Para analizar la composición proteica de los virus
recombinantes, se infectaron \sim10^{7} células
BSR-T7/5 con una m.o.i. de 0,02 y se incubaron
durante 2 días. Se purificaron entonces los viriones del
sobrenadante y se concentraron por centrifugación a través de un
cojín de sacarosa al 20% en un rotor Beckman SW28 a 25.000 rpm
durante 90 min. Se resuspendieron las pellas y se mezclaron con
tampón de muestra de proteínas para romper los viriones. Se
redisolvieron entonces las proteínas víricas de los viriones
purificados por electroforesis en dodecilsulfato de
sodio-gel de poliacrilamida
("SDS-PAGE") y se transfirieron a membranas
PVDF (Millipore). Después de incubar con una solución bloqueante,
se incubaron las membranas con suero de conejo producido frente a
la ribonucleoproteína de RV S50 (Mebatsion y col., Cell 84, pp.
941-951, 1996) o con un anticuerpo
anti-LC8 policlonal de conejo, R4058 (Kinig, S.M. y
R.S. Patel-King, J. Biol. Chem., 270, PP.
11445-11452, 1995). Se incubaron entonces las
membranas con inmunoglobulina-G de cabra
anti-conejo conjugada con peroxidasa. Se
visualizaron las proteínas tras incubación con substrato de
peroxidasa (Vector).
Se inocularon grupos de seis ratones Balb/c
lactantes de 1-2 días de edad cada uno
intramuscular (i.m.) o intracranealmente (i.c.) con un volumen de
0,03 ml de suspensiones víricas a diversas concentraciones. Los
ratones fueron observados en cuanto a síntomas de rabia durante un
total de 21 días. Se preparó una suspensión de cerebro al 20% de
los ratones muertos y se hizo el aislamiento del virus en cultivo
celular. Se calculó la dosis letal que mata al 50% de los animales
(DL_{50}) usando el método de Reed y Muench.
\vskip1.000000\baselineskip
| Pares de | Secuencia en orientación 5'-3' | Posición de los nucleótidos | |||||||||
| cebadores | o aminoácidos suprimidos | ||||||||||
| #142 | GGA | AAG | TCT | TCA | GAG | GGC | CGA | GAG | CTC | AAG | 1940 a 1960 (aminoácidos |
| #143 | CTT | GAG | CTC | TCG | GCC | CTC | TGA | AGA | CTT | TCC | 143 a 149 de la proteína P) |
| #144 | CCC | AAC | CCT | CCA | GGA | GGC | CGA | GAG | CTC | AAG | 1928 a 1960 (aminoácidos |
| #145 | CTT | GAG | CTC | TCG | GCC | TCC | TGG | AGG | GTT | GGG | 139 a 149 de la proteína P) |
La seguridad de las vacunas vivas orales contra
la rabia es una cuestión primaria de salud pública. Los mutantes
del virus de la rabia que tienen modificación en la posición de la
Arg 333 de la glicoproteína son las cepas más atenuadas actualmente
disponibles. Sin embargo, estas cepas son aún patógenas para
ratones lactantes de 1-2 días de edad, lo que
demuestra el peligro potencial de dichas vacunas vivas para
animales o humanos inmunocomprometidos. Por lo tanto, hay una gran
necesidad de una vacuna más segura para inmunización contra la
rabia usando vacunas vivas.
La fosfoproteína (P) del virus de la rabia mostró
interaccionar con una cadena ligera de dineína LC8 citoplasmática.
El dominio de unión a LC8 fue mapeado en la parte central de P
(residuos 138 a 172). Se sugiere que la interacción entre P y LC8
podría estar implicada en la patogénesis del virus de la rabia. Se
construyeron mutantes del virus de la rabia que contenían deleciones
de 7 (aminoácidos 143 a 149) ó 11 residuos (aminoácidos 139 a 149)
en el dominio de unión a LC8 de la proteína P. Todos los mutantes
fueron recuperados con éxito en cultivos celulares. Se obtuvieron
títulos idénticos al del virus parental para todos los virus
mutantes (Fig. 2) y todos los mutantes se propagaron en cultivo
celular tan eficientemente como las cepas parentales a diferentes
puntos temporales (Fig. 3).
Para determinar el nivel de expresión de las
proteínas P mutantes y para elucidar la asociación entre proteína P
y LC8, se analizaron proteínas de los virus purificados por
inmunoblotting Western. Se incubaron los blots con un suero de
conejo anti-RNP RV (S50) o un anticuerpo policlonal
anti-LC8 (R4058). Las cantidades de proteínas P o
las razones entre proteínas P y N de los virus mutantes eran
indistinguibles de las de los virus parentales, lo que indica que
las deleciones de 7 ó 11 aminoácidos del sitio de unión a LC8 no
tienen influencia sobre la expresión de proteínas P mutadas.
Contrariamente a los respectivos virus parentales, no se pudo
detectar ninguna proteína correspondiente a LC8 en los virus
mutantes con deleción en el sitio de unión a LC8 (Fig. 4). Este
resultado demuestra que la incorporación de LC8 a la membrana de
los viriones es dirigida por una interacción específica entre P y
LC8 y que las deleciones introducidas eran suficientes para
bloquear por completo la asociación entre la proteína P y LC8.
Para comparar la patogenicidad de los mutantes
derivados de SAD-L16, se inocularon ratones
lactantes de 1-2 días de edad intramuscularmente con
el virus parental o con uno de los mutantes de deleción
(L16-\DeltaP7 o L16-\DeltaP11)
a una dosis de 100 ó 100.000 ffu/ratón. Como se muestra en la Fig.
5, todos los ratones lactantes inoculados con 100.000 ffu/ratón
murieron de rabia en los 7 días desde la inoculación. Los ratones
de todos los grupos inoculados con 100 ffu/ratón murieron de rabia
en los 10 días desde la inoculación (Fig. 5), lo que indica que la
deleción de 7 ó 11 residuos del sitio de unión a LC8 de la proteína
P no reducía significativamente la patogenicidad del virus de la
rabia para ratones lactantes.
Se generaron mutantes que contienen una deleción
idéntica de 7 ó 11 aminoácidos en su proteína P, así como una
substitución de Arg (R) a Asp (D) en la posición 333 de su proteína
G (Fig. 1). Estos mutantes (D29-\DeltaP7 y
D29-\DeltaP11) crecían en cultivo celular hasta
un título similar al de SAD-D29, que contiene sólo
la substitución de R a D (Fig. 2 y 3). Para comparar la
patogenicidad de los mutantes combinados con la del mutante simple,
se inocularon ratones lactantes de 1-2 días de edad
intramuscularmente a una dosis de 100 ó 100.000 ffu/ratón. En los
10 días posteriores a la inoculación, todos los ratones inoculados
con ambas dosis de SAD-D29 murieron de rabia. Por el
contrario, sólo el 83% o el 50% de los ratones que habían recibido
una dosis de 100.000 ffu/ratón de D29-DP7 o
D29-DP11, respectivamente, murieron de rabia 10 días
después de la infección. A los 15 días de la infección, la
mortalidad alcanzó el 100% y el 83%, respectivamente, y permaneció
igual hasta el final del período de observación de 21 días (Fig.
6).
Sorprendentemente, no se produjo mortalidad en
los grupos de ratones inoculados con D29-\DeltaP7
o D29-\DeltaP11 a una dosis de 100 ffu/ratón hacia
el final de los 10 días después de la infección. Hasta el final del
período de observación de 21 días, no se produjo mortalidad en el
grupo de ratones inoculados con D29-\DeltaP11,
mientras que, en el grupo de ratones inoculados con
D29-DP7, hubo menos de un 17% (uno de seis) de
mortalidad (Fig. 6). Estos resultados inesperados demuestran que la
combinación de la mutación en el sitio de unión a LC8 y el cambio
de aminoácido en la Arg333 de la proteína G atenúa
considerablemente la virulencia del virus de la rabia para ratones
lactantes.
A continuación, se analizó el grado de atenuación
del D29-\DeltaP11 recombinante administrando
dosis graduadas a ratones lactantes de 1 a 2 días de edad por las
vías i.m. o i.c. Como se muestra en la Fig. 7, la dosis de
D29-\DeltaP11 necesaria para matar al 50%
(DL_{50} por 30 \mul) de los ratones lactantes de 2 días de
edad inoculados i.m. era de 556 ffu, mientras que la DL_{50} del
virus SAD-D29 parental era sólo de 18 ffu. Esto
demuestra que D29-\DeltaP11 está atenuado hasta
30 veces cuando se administra por vía i.m. Es interesante el hecho
de que se obtuvo una DL_{50} muy similar, de 10 y 14 ffu, para
SAD-D29 y D29-\DeltaP11,
respectivamente, cuando las cepas fueron administradas por vía i.c.
(Fig. 7). Esta notable atenuación tras administración i.m., pero no
i.c., muestra que D29-\DeltaP11 se propaga
insuficientemente de un sitio periférico de infección al SNC, en
comparación con el virus parental. Estos resultados demuestran que
la eliminación del ligando LC8 y la substitución simultánea de R333
atenúa considerablemente la patogenicidad del RV tras inoculación
periférica y que pueden ser útiles en el diseño y desarrollo de
vacunas basadas en RV vivas altamente seguras.
Para determinar la seguridad y la eficacia de los
virus recombinantes tras administración oral, se dividieron perros
seronegativos a la rabia de tres a cuatro meses de edad en tres
grupos de 4 perros cada uno. El Grupo 1 y el 2 recibieron una dosis
de 10^{8} unidades formadoras de focos ("ffu") en un volumen
de 2 ml de SAD-D29 o de
D29-\DeltaP11, respectivamente, por instilación
oral. El Grupo 3 sirvió como control. Se tomaron muestras de saliva
con torunda los días 1, 3 y 7 tras la vacunación para estudiar la
excreción del virus vacunal por inoculación en cultivos celulares.
Se tomaron muestras de sangre de todos los animales antes de la
vacunación y 2 y 8 semanas después de la primera inmunización. Los
Grupos 1 y 2 fueron reforzados con dosis similares de las vacunas
respectivas a las 8 semanas de la primera inmunización. Se
volvieron a tomar muestras de sangre 2 semanas después de la
inmunización de refuerzo. Se inactivaron las muestras de suero por
calor durante 30 minutos a +56ºC y se guardaron a -20ºC hasta su
uso. Se determinó la ausencia/presencia de anticuerpos frente a la
rabia por la prueba rápida de inhibición de focos fluorescentes
("RFFIT") según se describe en "WHO Laboratory Techniques in
Rabies" (1996). A lo largo de todo el experimento, los perros
fueron observados diariamente en cuanto a las condiciones generales
de salud.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Todos los perros permanecieron clínicamente sanos
a lo largo del período de observación de 3 meses. Todas las
muestras de saliva recogidas en diferentes puntos temporales
resultaron negativas para la presencia de los virus vacunales, lo
que indica la ausencia de excreción del virus en los tiempos
indicados. Para determinar el efecto de la deleción de 11
aminoácidos en la proteína P sobre la inmunogenicidad del virus,
los perros fueron inmunizados con SAD-D29 o
D29-\DeltaP11 por instilación oral. Dos semanas
después de la primera inmunización, los títulos específicos de
rabia en ambos grupos de animales no diferían significativamente
(Fig. 8). Como la administración de vacunas de rabia por vía oral
es menos efectiva que la administración parenteral, se dio una
dosis de refuerzo a las 8 semanas de la primera inmunización. Como
se ve en la Fig. 8, hubo un dramático aumento comparable en los
títulos de anticuerpos específicos de rabia en ambos grupos de
animales inmunizados con SAD-D29 o
D29-\DeltaP11. Estos resultados demuestran que la
deleción de hasta 11 aminoácidos del sitio de unión a LC8 de la
proteína P del virus de la rabia no afectaba a la inmunogenicidad
del virus cuando se administra por vía oral a perros.
Fig. 1. Una representación esquemática del orden
génico del virus de la rabia en el ARN genómico de hebra negativa.
(A) Orden génico de SAD-L16, un virus de la rabia
recombinante que posee la auténtica secuencia de
SAD-B19 (Conzelmann y col., 1990, Virology, Vol.
175, pp. 485-499). (B) Orden génico de
SAD-D29, un virus de la rabia recombinante que
posee una substitución de Arg (R) a Asp (D) en la posición 333 de
la proteína G de SAD-B19. Se muestra la secuencia de
aminoácidos (posiciones 138 a 150) alrededor del sitio de unión a
la cadena ligera de la LC8 dineína de la fosfoproteína (proteína
P). \DeltaP7 o \DeltaP11 son mutantes con las deleciones
indicadas de 7 ó 11 aminoácidos en el sitio de unión a LC8 de la
proteína P.
Fig. 2. Títulos infecciosos de mutantes del virus
de la rabia recombinantes. Se infectaron células BSR a una m.o.i.
de 0,02 y se incubaron durante 2 días. Se recogieron los
sobrenadantes y se titularon por dilución a punto final. Los
títulos fueron expresados en unidades formadoras de focos (ffu)
log_{10}/ml. -d7 y -d11 representan -\DeltaP7 y -\DeltaP11,
respectivamente.
Fig. 3. Curvas de crecimiento en una etapa de RV
recombinantes. Se infectaron células BSR-T7/5 con
los RV recombinantes SAD-L16 (L16),
L16-\DeltaP7 (L7),
L16-\DeltaP11 (L11),
SAD-\Delta29 (D29), D29-\DeltaP7
(D7) y D29-\DeltaP11 (D11) a una m.o.i. de 10. Se
recogieron alícuotas de sobrenadantes de cultivo celular en los
puntos temporales indicados y se determinaron los títulos víricos
por duplicado por diluciones seriadas. Los títulos fueron
expresados en unidades formadoras de focos (ffu) log_{10}/ml.
Fig. 4. Composición proteica de RV recombinantes.
Se infectaron aproximadamente 10^{7} células
BSR-T7/5 con los RV recombinantes
SAD-L16 (L16), L16-\DeltaP7
(L\Delta7), L16-\DeltaP11 (L\Delta11),
SAD-D29 (D29), D29-\DeltaP7
(D\Delta7) y D29-\DeltaP11 (D\Delta11) a una
m.o.i. de 0,02. A los dos días de la infección, se purificaron los
viriones de los sobrenadantes sobre un cojín de sacarosa al 20% y
se analizaron las pellas víricas por Western blotting. Utilizando
un marcador proteico como indicador, se cortó el mismo blot en dos
pares en aproximadamente la posición \sim20 kD. Se incubó la parte
superior del blot con suero anti-RNP RV (A) y se
incubó la parte inferior del blot con un anticuerpo LC8 policlonal
de conejo (B). Se pudo detectar la incorporación de LC8 sólo en los
virus parentales SAD-L16 y SAD-D29,
pero no en los virus recombinantes que poseen deleciones en el
sitio de unión a LC8.
Fig. 5. Patogenicidad de mutantes del virus de la
rabia, cepa SAD-L16, L16-\DeltaP7
(L16-d7) y L16-\DeltaP11
(L16-d11), para ratones lactantes de días de edad.
Se inocularon los ratones lactantes con dosis de 100 ffu/ratón o de
100.000 ffu/ratón intramuscularmente y se observaron a diario
durante un total de 21 días. Se presentaron los resultados
registrados al final de 7 y 10 días. Todos los animales de los tres
grupos murieron de rabia en los 10 días tras la inoculación.
Fig. 6. Patogenicidad de mutantes del virus de la
rabia, cepa SAD-D29, D29-\DeltaP7
(D29-d7) y D29-\DeltaP11
(D29-d11), para ratones lactantes de días de edad.
Se inocularon los ratones lactantes con dosis de 100 ffu/ratón o de
100.000 ffu/ratón intramuscularmente y se observaron a diario
durante un total de 21 días. Se presentaron los resultados
registrados al final de 7, 10, 15 y 21 días. No se produjo
mortalidad en el grupo de ratones inoculados con 100 ffu/ratón de
D29-\DeltaP11 (D29-d11).
Fig. 7. Comparación del grado de patogenicidad de
RV recombinantes después de inoculaciones intracraneales (i.c.) o
intramusculares (i.m.). Se inocularon ratones lactantes de dos días
de edad con SAD-D29 (D29) o
D29-\DeltaP11 (D11) por vía i.c. o i.m. a las
dosis indicadas. Después de la inoculación i.c., la DL_{50} de
SAD-D29 y D29-\DeltaP11 era de 10
y 14 ffu/30 \mul, respectivamente. Mientras que, tras inoculación
i.m., la DL_{50} de D29-\DeltaP11 era de 556
ffu, en oposición a sólo 18 ffu para SAD-D29, lo que
indica que D29-\DeltaP11 está atenuado en hasta
30 veces.
Fig. 8. Inmunogenicidad de vacunas de virus de la
rabia recombinantes tras administración oral. Se dividieron perros
seronegativos de tres a cuatro meses de edad en tres grupos de 4
perros cada uno. El Grupo 1 (D29) y el 2 (D11) recibieron una dosis
de 10^{8} unidades formadoras de focos (ffu) en un volumen de 2
ml de SAD-D29 o de D29-\DeltaP11,
respectivamente, por instilación oral. El Grupo 3 sirvió como
control. Los Grupos 1 y 2 fueron reforzados con dosis similares de
las respectivas vacunas 8 semanas después de la primera
inmunización. Se determinaron los títulos de anticuerpos específicos
de la rabia por la prueba rápida de inhibición de focos
fluorescentes (RFFIT) en los puntos temporales indicados.
\global\parskip0.990000\baselineskip
Claims (12)
1. Mutante del virus de la rabia recombinante que
tiene una mutación en la proteína G, así como una mutación en la
proteína P, donde la mutación en la proteína G es una substitución
de aminoácido de la arginina en la posición 333 por otro aminoácido
y donde la mutación en la proteína P es una deleción de los
aminoácidos 143 a 149 ó 139 a 149.
2. Un mutante del virus de la rabia recombinante
según la reivindicación 1, donde el codon que codifica para la
Arg_{333} está substituido por un codon que difiere en los tres
nucleótidos del codon de la Arg_{333} del virus parental.
3. Un mutante del virus de la rabia recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la
Arg_{333} está substituida con Asp.
4. Un mutante del virus de la rabia recombinante
según la reivindicación 3, donde el codon de la Arg_{333} está
substituido con GAC.
5. Un mutante del virus de la rabia recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el
codon de la Arg_{333} está substituido con GAC y donde la
mutación en el gen P es una deleción de los aminoácidos 139 a
149.
6. Un mutante del virus de la rabia recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho
mutantes es un mutante de la cepa de RV SAD Bern o SAD B19.
7. Un mutante del virus de la rabia recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que adicionalmente
expresa un ácido nucleico codificante de un antígeno
heterólogo.
8. Un mutante del virus de la rabia recombinante
según la reivindicación 7, donde dicho antígeno deriva de un
patógeno humano o animal.
9. Un mutante del virus de la rabia recombinante
según la reivindicación 7 ó 8, que adicionalmente expresa un gen
codificante de una proteína inmunoestimulante.
10. Un mutante del virus de la rabia recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en
una vacuna.
11. Vacuna viva atenuada
anti-rabia consistente en un mutante del virus de la
rabia recombinante según cualquiera de las reivindicaciones
1-9 y un soporte farmacéuticamente aceptable.
12. Vacuna según la reivindicación 11,
caracterizada por ser formulada para uso oral.
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