ES2424847T3

ES2424847T3 - Genes del virus de la fiebre aftosa que expresan avipox recombinantes

Info

Publication number: ES2424847T3
Application number: ES05856627T
Authority: ES
Inventors: Robert Nordgren; Sheena May Loosmore; Jean-Christophe Francis Audonnett; Marvin J. Grubman
Original assignee: Merial Ltd
Current assignee: Merial Ltd
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2005-04-20
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2025-04-20
Also published as: CA2571560A1; BRPI0512421B1; US20090253185A1; US7527960B2; EP1773387A2; EP1773387A4; EP1773387B1; BRPI0512421B8; PL1773387T3; WO2006073431A2; ECSP077196A; BRPI0512421A; CA2571560C; WO2006073431A9; US20050287672A1; WO2006073431A3; DK1773387T3

Abstract

Un vector de avipox recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico quecodifica uno o más antígeno(s) del virus de la fiebre aftosa (FMDV); en el que el avipox es el poxvirus del canario o el poxvirus aviar; en el que la molécula de ácido nucleico se inserta en un único sitio de inserción; y en el que la molécula de ácidonucleico que codifica uno o más antígeno(s) de FMDV está unido operativamente a una secuencia promotora endonde la secuencia promotora se ha seleccionado del grupo que consiste en el promotor I3L de vaccinia, el promotor42K del poxvirus, y el promotor H6 de vaccinia en el que el promotor H6 de vaccinia se ha mutado de forma tal quelos niveles de expresión del antígeno o antígenos de FMDV se han disminuido en comparación con los niveles deexpresión del antígeno o antígenos de FMDV incluidos en un promotor H6 de vaccinia de tipo natural; en el que, cuando el avipox es el poxvirus del canario, el vector de avipox es ALVAC, comprende un locus deinserción C6 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción C6 y el promotor está enorientación opuesta a las secuencias de flanqueo; y en el que, cuando el vector de avipox es un poxvirus aviar, el vector del poxvirus aviar comprende un locus deinserción F8 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción F8

Description

Genes del virus de la fiebre aftosa que expresan avipox recombinantes

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

[0001] Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos con Nº de serie 60/536.786 presentada el 20 de abril de 2004

[0002] Esta solicitud hace referencia a la solicitud de los Estados Unidos con Nº de serie 10/327.481, presentada el 20 de diciembre de 2002, que es una continuación de la solicitud internacional Nº PCT/FR01/02042, presentada el 27 de junio de 2001, publicada el 3 de enero de 2002 como documento WO 02/00251, y que reivindica la prioridad de la solicitud francesa Nº 00/08437, presentada el 29 de junio de 2000.

Campo

[0003] La presente descripción se refiere a vectores, tales como virus, por ejemplo, virus modificados tales como poxvirus, y a los procedimientos para fabricarlos y utilizarlos. En particular, la invención se refiere a los vectores y virus avipox recombinantes que expresan antígenos del virus de la fiebre aftosa (FMDV), y a los procedimientos para prepararlos y utilizarlos. La descripción se refiere además a los procedimientos para estimular la respuesta inmune a FMDV en un sujeto.

Antecedentes de la invención

[0004] La fiebre aftosa (FMD) es una de las enfermedades más virulentas y contagiosas que afectan a losanimales de granja. Esta enfermedad es endémica en numerosos países en el mundo, especialmente en África, Asia y Sudamérica. Además, pueden producirse periódicamente brotes epidémicos. La presencia de esta enfermedad en un país puede tener consecuencias económicas muy graves resultantes de la pérdida de productividad, la pérdida de peso y producción de leche en las manadas afectadas, y de los embargos comerciales impuestos a estos países. Las medidas que se toman frente a esta enfermedad consisten en la estricta aplicación de restricciones a la importación, higiene, controles y cuarentena, sacrificio de animales enfermos y programas de vacunación que utilizan vacunas inactivadas, tanto como medida preventiva a nivel nacional o regional como de forma periódica cuando se produce un brote epidémico.

[0005] La FMD se caracteriza por su periodo de corta incubación, su naturaleza muy contagiosa, la formación de úlceras en la boca y en los pies y, algunas veces, la muerte de animales jóvenes. La FMD afecta a numerosas especies animales, en particular ganado, cerdos, ovejas y cabras. El agente responsable de esta enfermedad es un virus de ácido ribonucleico (ARN) que pertenece al género Apthovirus de la familia Picornaviridae (Cooper y col., Intervirology, 1978, 10, 165-180). Hasta el momento se conocen al menos siete tipos de virus de la fiebre aftosa (FMDV); los tipos europeos (A, O y C), los tipos africanos (SAT1, SAT2 y SAT3) y un tipo asiático (Asia 1). Se han distinguido también numerosos subtipos (Kleid y col. Science (1981), 214, 1125-1129).

[0006] El FMDV es un virus icosahédrico puro de 25 nm de diámetro que contiene una molécula de ARN monocatenario que consiste en aproximadamente 8500 nucleótidos, con una polaridad positiva. Esta molécula de ARN comprende un único marco de lectura abierto (ORF), que codifica una única poliproteína que contiene, entre otros, el precursor de la cápsida conocido también como proteína P1 o P88. La proteína P1 está miristilada en su extremo amino. Durante el proceso de maduración, la proteína P1 se escinde mediante la proteasa 3C en tres proteínas conocidas como VP0, VP1 y VP3 (o 1AB, 1D y 1C respectivamente; Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261). En el virión, la proteína V0 se escinde a continuación en dos proteínas, VP4 y VP2 (o 1A y 1B respectivamente). No se conoce el mecanismo para la conversión de las proteínas VP0 en VP1 y VP3, y para la formación de viriones maduros. Las proteínas VP1, VP2 y VP3 tienen un peso molecular de aproximadamente 26.000 Da, mientras que la proteína VP4 es más pequeñas a aproximadamente 8.000 Da.

[0007] La mera combinación de las proteínas de la cápsida forma el protómero o molécula 5S, que es el constituyente elemental de la cápsida de FMVD. Este promotor se compleja a continuación en un pentámero para formar la molécula 12S. El virión es el resultado de la encapsidación de una molécula de ARN genómico mediante el ensamblaje de 12 pentámeros 12S, constituyendo de esta manera las partículas 146S. La cápsida vírica puede formarse también sin la presencia de una molécula de ARN en el interior (denominada a partir de ahora en el presente documento “cápsida vacía”). La cápsida vacía se diseña también como una partícula 70S. La formación de las cápsidas vacías puede producirse naturalmente durante la replicación vírica o puede producirse de forma artificial mediante tratamiento químico.

[0008] Se han desarrollado muchas hipótesis, rutas de investigación, y propuestas, con la intención de diseñar vacunas eficaces contra la FMD. Actualmente, las únicas vacunas en el mercado comprenden virus inactivados. Existen riesgos acerca de la seguridad de la vacuna de la FMD, dado que brotes de FMD en Europa se han asociado con defectos en la fabricación de la vacuna (King, A.M.Q. y col, (1981) Nature 293: 479-480). Las vacunas inactivadas no confieren inmunidad a largo plazo, requiriendo de esta manera inyecciones de refuerzo proporcionadas cada año, o con mayor frecuencia en el caso de brotes epidémicos. Además, existen riesgos relacionados con la inactivación incompleta y/o el escape del virus durante la producción de vacunas inactivadas (King, A.M.Q., ibíd). Una meta en la técnica ha sido construir conformacionalmente inmunógenos correctos que carezcan del genoma de FMDV ineficaz para preparar vacunas eficaces y seguras.

[0009] Se ha utilizado satisfactoriamente el virus vaccinia para inmunizar contra el virus de la viruela, lo que culminó en la erradicación a nivel mundial del virus de la viruela en 1980. De esta manera, ha aparecido un nuevo papel importante para los poxvirus, el de un vector genomanipulado para la expresión de genes extraños (Panicali y Paoletti, 1982; Paoletti y col., 1984). Se han expresado genes en vaccinia que codifican antígenos heterólogos, dando como resultado a menudo una inmunidad protectora frente al estímulo debido al patógeno correspondiente (revisado en Tartaglia y col., 1990). Se ha utilizado también una cepa muy atenuada de vacunas, designada como MVA, para vacunas basadas en poxvirus. El uso de MVA se ha descrito en la patente de los Estados Unidos Nº

5.185.146.

[0010] Los sistemas de vectores de vacunas adicionales implican el uso de virus avipox que son poxvirus restringidos de forma natural a un hospedador. El virus de la viruela aviar (FPC; Taylor y col. 1988a, b) y el virus de la viruela del canario (CPV; Taylor y col., 1991 y 1992) se han genomanipulado para expresar productos génicos extraños. El virus de la viruela aviar (FPV) es el virus prototípico del género Avipox de la familia Poxvirus. El virus produce una enfermedad económicamente importante de las aves de corral que se ha controlado bien desde los años 20 del siglo XX mediante el uso de vacunas atenuadas vivas. La replicación de los virus avipox está limitada a especies de aves (Matthews, 1982), y no existen informes en la bibliografía de un virus avipox que produzca una infección productiva en cualquier especie no de ave, incluyendo el hombre. Esta restricción del hospedador proporciona una barrera de seguridad inherente frente a la trasmisión del virus a otras especies y hace que el uso del virus avipox basado en vectores de vacuna en aplicaciones veterinarias y humanas una proposición atractiva.

[0011] Se han preparado otros vectores de poxvirus atenuados mediante modificaciones genéticas de cepas naturales de virus. El vector NYVAC, derivado por deleción de virulencia específica y los genes de la gama de hospedadores de la cepa Copenhagen de vaccinia (Tartaglia y col., 1992) han demostrado ser útiles como un vector recombinante en la estimulación de una respuesta inmunoprotectora frente a un antígeno extraño expresado. Otro vector de poxvirus genomanipulado es ALVAC, derivado del virus de la viruela del canario (véase la patente de los Estados Unidos Nº 5.756.103). ALVAC no se replica de forma productiva en hospedadores no de ave, una característica que se piensa que mejora su perfil de seguridad (Taylor y col., 1991 y 1992). ALVAC se ha depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection con el número de acceso VR2547. Otro vector más de poxvirus genomanipulado es TROVAC, derivado del virus de la viruela aviar (véase la Patente de los Estados Unidos Nº 5.766.599).

[0012] Se pueden construir poxvirus recombinantes en dos etapas conocidas en la técnica y análogas a los procedimientos para la creación de recombinantes sintéticos de poxvirus tales como el virus vaccinia y el virus avipox descritos en las patentes de los Estados Unidos Nos 4.769.330; 4.722.848; 4.603.112; 5.110.557; 5.174.993; 5.494.807, y 5.505.941.

[0013] Puede apreciarse de esta manera que la condición de un poxvirus recombinante de FMDV, y de las composiciones y productos del anterior, particularmente, recombinantes de FMDV basados en ALVAC o TROVAC y composiciones y productos de los anteriores, especialmente los mencionados recombinantes que contienen los genes P1 y/o el gen de la proteasa C3 de FMDV, y las composiciones y productos del anterior, serían un avance muy deseable sobre el estado actual de la tecnología.

Resumen de la invención

[0014] La presente invención proporciona un vector de avipox recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) del virus de la fiebre aftosa (FMDV):

en el que el avipox es un virus de la viruela del canario o de la viruela aviar:

en el que la molécula de ácido nucleico se inserta en un único sitio de inserción; y en el que la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) de FMDV se une de manera operable a una secuencia promotora en la que la secuencia promotora se selecciona entre el grupo que consiste en el promotor I3L de vaccinia, el promotor 42K poxvírico, y el promotor H6 de vaccinia, en el que el promotor H6 de vaccinia está mutado de tal manera que los niveles de expresión del(de los) antígeno(s) están disminuidos en comparación con los niveles de expresión del(de los) antígeno(s) de FMDV con un promotor H6 de vaccinia natural;

en el que, cuando el vector de avipox es un virus de la viruela del canario, el vector de avipox que es ALVAC, comprende un locus de inserción C6 y la molécula de ácido nucleico se inserta en el locus de inserción C6 y el promotor en la orientación opuesta a las secuencias de flanqueo;

y en el que, cuando el vector de avipox es el virus de la viruela aviar, el vector de la viruela aviar comprende un locus de inserción F8 y la molécula de ácido nucleico se inserta en el locus de inserción F8.

[0015] En otro aspecto, la presente invención proporciona un virus avipox recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) del virus de la fiebre aftosa (FMDV);

en el que el virus avipox es un virus de la viruela del canario o de la viruela aviar;

en el que la molécula de ácido nucleico se inserta en un único sitio de inserción; y en el que la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) de FMDV se une de manera operable a una secuencia promotora en la que la secuencia promotora se selecciona entre el grupo que consiste en el promotor I3L de vaccinia, el promotor poxvírico 42K, y el promotor de vaccinia H6 en el que el promotor H6 de vaccinia está mutado de tal manera que los niveles de expresión del(de los) antígeno(s) de FMDV disminuyen en comparación con los niveles de expresión del(de los) antígeno(s) de FMDV con un promotor H6 de vaccinia natural;

en el que, cuando el virus avipox es un virus de la viruela del canario, el virus avipox, que es ALVAC, comprende un locus de inserción C6 y la molécula de ácido nucleico se inserta en el locus de inserción C6 y el promotor está en la orientación opuesta a las secuencias de flanqueo;

y en el que el virus avipox es el virus de la viruela aviar, el virus de la viruela aviar comprende un locus de inserción F8 y la molécula de ácido nucleico se inserta en el locus de inserción F8

[0016] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un vector de acuerdo con la presente invención en la preparación de un medicamento para estimular una respuesta inmune a FMDV en un sujeto.

[0017] La presente invención proporciona, en un aspecto adicional, el uso de un virus de acuerdo con la presente invención en la preparación de un medicamento para estimular una respuesta inmune a DMDV en un sujeto.

[0018] La presente invención proporciona, en otro aspecto, un vector de acuerdo con la presente invención para el uso en la estimulación de una respuesta inmune a FMDV en un sujeto.

[0019] En otro aspecto, la presente invención proporciona un virus de acuerdo con la presente invención para uso en la estimulación de una respuesta inmune a FMDV en un sujeto.

[0020] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un vector de acuerdo con la presente invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de la infección con FMDV; y/o el tratamiento y/o la prevención de la fiebre aftosa.

[0021] La presente invención proporciona, en un aspecto adicional, el uso de un virus de acuerdo con la presente invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de la infección con FMDV; y/o el tratamiento y/o la prevención de la fiebre aftosa.

[0022] La presente invención proporciona, en otro aspecto, un vector de acuerdo con la presente invención para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de la infección con FMDV, y/o el tratamiento y/o la prevención de la fiebre aftosa.

[0023] La presente invención proporciona, en otro aspecto, un virus de acuerdo con la presente invención para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de la infección con FMVD; y/o el tratamiento y/o la prevención de la fiebre aftosa.

[0024] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un vector de avipox recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) del virus de la fiebre aftosa, que comprende las etapas de:

(a): linealizar un plásmido donante con una endonucleasa de restricción, en el que el plásmido donante comprende sitios de escisión de la endonucleasa de restricción o un sitio de clonación múltiple; y

(b): ligar al menos una molécula de ácido nucleico que comprende

(i): una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) de FMDV,

(ii): una secuencia de un promotor vírico, y

(iii) secuencias de inserción que flanquean (i) y (ii) que tienen sitios de escisión de la endonucleasa de restricción complementaria para el plásmido donante en los antígenos de FMDV.

produciendo de este modo el vector de avipox recombinante;

en el que el avipox es un virus de la viruela del canario o un virus de la viruela aviar

en el que la molécula de ácido nucleico se inserta en un único sitio de inserción; y

en el que la molécula de ácido nucleico se une de manera operable a una secuencia promotora, en el que la secuencia promotora se selecciona entre el grupo que consiste en el promotor I3L de vaccinia, el promotor 42k poxvírico, y el promotor H6 de vaccinia, en el que el promotor H6 de vaccinia está mutado de tal manera que los niveles de expresión del(de los) antígenos de FMDV disminuyen en comparación con los niveles de expresión del(de los antígenos) de FMDV con un promotor H6 de vaccinia natural; y

en el que, cuando el virus avipox es un virus de la viruela del canario, el vector de avipox es ALVAC, comprende un locus de inserción C6 y la molécula de ácido nucleico se inserta en el locus de inserción C6 y el promotor está en la orientación opuesta a las secuencias que lo flanquean;

y en el que, cuando el vector de avipox es el virus de la viruela aviar, el vector del virus de la viruela aviar comprende un locus de inserción F8 y la molécula de ácido nucleico se inserta en el locus de inserción F8.

[0025] De acuerdo con esto, un aspecto de la presente descripción proporciona un vector de avipox recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) del virus de la fiebre aftosa (FMDV). En las realizaciones ventajosas, el avipox es ALVAC o TROVAC.

[0026] De forma ventajosa, el(los) antígeno(s) de FMDV pueden ser VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B o 3C. De forma ventajosa, la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) del virus de la fiebre aftosa (FMDV) es un ADNc que codifica la región P1 de FMDV y un ADNc que codifica la proteasa FMDV 3C de FMDV.

[0027] En una realización, los antígenos de FMDV se unen de manera operable a una secuencia promotora, que puede ser el promotor H6 de vaccinia, el promotor I3L de vaccinia, el promotor 42K de vaccinia, el promotor 7,5K de vaccinia, o el promotor Pi de vaccinia. En otra realización, el promotor es el promotor H6 de vaccinia, que está mutado de tal manera que los niveles de expresión de los antígenos de FMDV disminuyen en comparación con los niveles de expresión de los antígenos de FMDV con un promotor H6 de vaccinia natural (es decir, sin mutar).

[0028] En otra realización, el vector de avipox de la presente descripción comprende un locus de inserción C6, en el que las secuencias que flanquean el locus de inserción C6 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción C6. De forma ventajosa, las secuencias de flanqueo comprenden los marcos de lectura abiertos de C6L y C6R del virus de la viruela del canario.

[0029] En una realización adicional, el vector de avipox de la presente descripción comprende un locus de inserción F8 en el que las secuencias que flanquean el locus de inserción F8 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción F8. De forma ventajosa, las secuencias de flanqueo comprenden los marcos de lectura abiertos F8L y FSR del virus de la viruela aviar.

[0030] Un segundo aspecto de la presente invención proporciona un virus avipox recombinante, que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) de FMDV. La presente descripción proporciona también los virus avipox recombinantes vCP2186, vCP2181, vCP2176 y vFP2215.

[0031] Un aspecto adicional de la descripción se refiere a un procedimiento para estimular una respuesta inmune a FMDV en un sujeto, que comprende administrar el vector de avipox o el virus avipox de la presente descripción al sujeto.

[0032] En otro aspecto más de la presente descripción, un procedimiento para producir un vector de avipox recombinante comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) de FMDV, que comprende las etapas de: a) linealizar un plásmido donante con una endonucleasa de restricción, en el que el plásmido donante comprende los sitios de escisión de la endonucleasa de restricción o un sitio de clonación múltiple; y b) unir al menos una molécula de ácido nucleico que comprende (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) de FMDV, (ii) una secuencia promotora vírica, e (iii) secuencias de inserción que flanquean (i) y (ii) que tienen sitios de escisión complementarios a la endonucleasa de restricción para el plásmido donante en los antígenos de FMDV, produciendo por tanto el vector de avipox recombinante.

[0033] El procedimiento puede comprender además las etapas de c) introducir el vector en una célula permisiva para la replicación del vector; y d) aislar el vector a partir de la célula. De forma ventajosa, la célula permisiva para la replicación del vector es un fibroblasto embriónico de pollo.

[0034] En otra realización, el vector comprende además un gen indicador, que se selecciona entre el grupo que consiste en el gen de resistencia a la neomicina, el gen de resistencia a la ampicilina, lacZ (-galactosidasa), luciferasa, y proteína fluorescente verde (GFP)

[0035] Estos y otros objetos de la invención se describirán con más detalle junto con la descripción detallada de la invención.

Breve descripción de los dibujos

[0036] La siguiente Descripción Detallada, proporcionada a modo de ejemplo, puede entenderse junto con los dibujos que la acompañan, incorporados en el presente documento por referencia. Se describirán ahora diversas características y realizaciones de la presente invención por medio de ejemplos no limitantes y con referencia a los dibujos que la acompañan en que:

La Figura 1 muestra el genoma del virus de la fiebre aftosa (FMDV) y los genes insertados en los avipox recombinantes.

La Figura 2 muestra los cebadores de oligonucleótidos utilizados para amplificar mediante la PCR el casete del gen H6p de FMDV (SEQ ID NO: 1-3) y los aminoácidos codificados por los nucleótidos (SEQ ID NO: 4 y 5).

La Figura 3 muestra la construcción del plásmido donante pC5 H6p FMDV P1+3C para generar ALVAC recombinantes, con inserciones en los loci C5.

La Figura 4 (4A-4E) muestra las secuencias del nucleótido (SEQ ID NO: 6) y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) del casete del gen C5 H6p de FMDV del plásmido donante pC5 H6p FMDV P1+3C.

La Figura 5 muestra la construcción de un plásmido donante pF8 H6p FMDV P1+3C para generar virus de la viruela aviar recombinantes, con la inserción en el único locus F8.

La Figura 6 (6A-6F) muestra las secuencias del nucleótido (SEQ ID NO: 8) y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) del casete del gen F8 H6p de FMDV del plásmido donante pF8 H6p FMDV P1+3C.

La Figura 7 muestra los cebadores de oligonucleótidos utilizados para amplificar mediante la PCR el extremo 3’ del casete génico de FDMV (SEQ ID NO: 10-12) y los aminoácidos codificado por los nucleótidos (SEQ ID NO: 13 y 14).

La Figura 8 muestra la construcción de un plásmido de inserción pC6 FMDV P1+3C menos el promotor para la introducción de diferentes promotores.

La Figura 9 muestra la construcción de un plásmido donante pC6 H6p FMDV P1+3C para generar ALVAC recombinantes, con la inserción en el único locus C6.

La Figura 10 (10A-10D) muestra las secuencias del nucleótido (SEQ ID NO: 15) y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 82) del casete del gen C6 H6p de FMDV del plásmido donante pC6 H6p FMDV P1+3C.

La Figura 11 muestra las secuencias del nucleótido del promotor H6 temprano/tardío natural (H6p) (SEQ ID NO: 17) y del promotor H6 temprano mutante (H6p*) (SEQ ID NO: 18).

Las Figuras 12A y 12B muestran los cebadores de oligonucleótidos utilizados para amplificar un fragmento H6p* 5’-FDMV (SEQ ID NO: 19-23) y los aminoácidos codificados por los nucleótidos (SEQ ID NO: 24 y 25).

La Figura 13 muestra la construcción de un plásmido donante pC6 H6p* FM-DV P1+3C para generar ALVAC recombinantes, con la inserción en el único locus C6.

La Figura 14 (14A-14E) muestra las secuencias del nucleótido (SEQ ID NO: 26) y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 27) del casete del gen C6 H6p* de FMDV del plásmido donante pC6 H6p* FDMV P1+3C.

Las Figuras 15A y 15B muestran los cebadores de oligonucleótidos utilizados para amplificar el fragmento I3Lp5’-FMDV (SEQ ID NOS: 28-33), y los aminoácidos codificados por los nucleótidos (SEQ ID NO: 34 y 35).

La Figura 16 muestra la construcción de un plásmido donante pC6 I3Lp FMDV P1+3C para generar ALVAC recombinantes, con la inserción en el único locus C6.

La Figura 17 (17A-17D) muestra las secuencias del nucleótido (SEQ ID N: 36) y secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 37) de los casetes del gen C6 I3Lp FMDV del plásmido donante pC6 I3Lp FMDV P1+3C.

La Figura 18 muestra los cebadores de oligonucleótidos utilizados para amplificar el fragmento 42Kp 5’-FMDV (SEQ ID NO: 38-43) y los aminoácidos codificados por los nucleótidos (SEQ ID NO: 44 y 45).

La Figura 19 muestra la construcción de un plásmido donante pC6 42Kp FMDV P1+3C para generar ALVAC recombinantes, con la inserción en el único locus C6.

La Figura 20 (20A-20D) muestra las secuencias del nucleótido (SEQ ID NO: 46) y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 47) del casete del gen C6 42Kp FMDV del plásmido donante pC6 42Kp FDMV P1+3C.

Las Figuras 21A-21C muestran los cebadores de oligonucleótidos utilizados para amplificar y reparar el fragmento 7.5Kp 5’-FMDV (SEQ ID NO: 48-54), y los aminoácidos codificados por los nucleótidos (SEQ ID NO: 55-57).

La Figura 22 muestra la construcción de un plásmido donante pC6 7.5K FMDV P1+3C para generar ALVAC recombinantes, con la inserción en el único locus C6.

La Figura 23 (23A-23E) muestra las secuencias del nucleótido (SEQ ID NO: 58) y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 59) del casete del gen C6 7.5Kp FMDV del plásmido donante pC6 7.5Kp FMDV P1+3C.

Las Figuras 24A-24E muestran los cebadores de oligonucleótidos utilizados para amplificar y reparar el fragmento Pip 5’-FMDV (SEQ ID NO: 60-77), y los aminoácidos codificados por los nucleótidos (SEQ ID NO: 78-80).

La Figura 25 muestra la construcción de un plásmido donante pC6 Pip FMDV P1+3C para generar ALVAC recombinantes con la inserción en el único locus C6.

La Figura 26 (26A-26D) muestra las secuencias del nucleótido (SEQ ID NO: 81) y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 82) del casete del gen C6 Pip FMDV del plásmido donante pC6 Pip FMDV P1+3C.

La Figura 27 describe los cebadores de oligonucleótidos utilizados para amplificar mediante la PCR un fragmento H6p* 5’-FMDV para la inserción en un plásmido donante pF8 (SEQ ID NO: 83-86).

La Figura 28 ilustra la construcción de un plásmido donante pF8 H6p* FMDV P1+3C para generar virus de la viruela aviar recombinantes.

La Figura 29 representa gráficamente las secuencias del nucleótido (SEQ ID NO: 87) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 88) del casete del gen F8 H6p* FMDV P1+3C del plásmido donante pF8 H6p* FMDV P1+3C.

La Figura 30 muestra el análisis de la expresión de ALVAC recombinantes que contienen el casete del gen P1+3C de FMDV con los promotores I3L o 42K.

Descripción detallada de la invención

[0037] En esta divulgación, “comprende”, “que comprende”, “que contiene” y “que tiene” y similares pueden tener el significado adscrito a los mismos en la legislación en materia de patentes de los Estados Unidos y pueden significar “incluye”, “que incluye”, y similares; “que consiste esencialmente de” o “consiste esencialmente” tienen igualmente el significado adscrito en la legislación en materia de patentes de los Estados Unidos y el término es abierto, permitiendo la presencia de más de lo que se enumera siempre que las características básicas o novedosas de lo que se enumera no cambien debido a la presencia de enumerado de forma adicional, y excluyendo las realizaciones de la técnica anterior.

[0038] Tal como se usa en el presente documento, el término “unido de manera operable” significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera prevista.

[0039] Un “antígeno” es una sustancia que reconoce el sistema inmune e induce una respuesta inmune. Un término similar utilizado en este contexto es “inmunógeno”

[0040] Es por tanto un objeto de esta invención proporcionar composiciones y procedimientos para el tratamiento y la profilaxis de la infección con FMDV. Es también un objeto proporcionar un medio para tratar o evitar la fiebre aftosa.

[0041] En un aspecto, la presente invención se refiere a un vector de avipox recombinante modificado que expresa al menos unas secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más antígeno(s) de FMDV. El vector vírico de acuerdo con la presente descripción es, de forma ventajosa, un virus avipox, tal como un virus de la viruela aviar y un virus de la viruela del canario y, de forma más particular, ALVAC o TROVAC. El vector recombinante modificado comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga, que codifica una proteína antigénica, por ejemplo, derivada de los ORF de FMDV que están codificados por las regiones P1 (que comprenden VP1, VP2, VP3, VP4, y 2A), 2B, y/o 3C.

[0042] En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un virus avipox recombinante modificado que incluye, en una región no esencial del genoma vírico, una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica uno o más antígeno(s)s de FMDV, tal como productos génicos del gen P1 (que comprende VP1, VP2, VP3, VP4, 2A), 2B, y/o 3C.

[0043] En un aspecto más adicional, la presente descripción se refiere a los procedimientos para estimular una respuesta inmune a FMDV en un sujeto, que comprende administrar el vector de avipox recombinante de la presente invención. La presente descripción se refiere también a procedimientos para estimular una respuesta inmune a FMDV en un sujeto, que comprende administrar el virus avipox recombinante de la presente descripción. De forma ventajosa, el virus avipox se selecciona del grupo que consiste en vCP2186, vCP2181, vCP2176, y vFP2215.

[0044] El virus utilizado de acuerdo con la presente descripción es, de forma ventajosa, un poxvirus, particularmente un virus avipox, tal como un virus de la viruela aviar o un virus de la viruela del canario. TROVAC se refiere a un virus de la viruela aviar atenuado que era un aislado clonado en placa derivado de la cepa de la vacuna FP-1 del virus de la viruela aviar que se encuentra autorizada para vacuna en pollos de 1 día de edad. ALVAC es un vector basado en el virus de la viruela del canario atenuado que era un derivado clonado de placa de la vacuna autorizada del virus de la viruela del canario, Kanapox (Tartaglia y col., 1992). Los virus recombinantes basados en ALVAC que expresan inmunógenos extrínsecos se han demostrado también eficaces como vectores de vacunas (Tartaglia y col., 1993 a, b). Este vector de avipox está restringido a especies de aves para replicación productiva. En cultivos de células humanas, la replicación del virus de la viruela del canario se aborta en una etapa temprana en el ciclo de replicación vírica antes de la síntesis del ADN vírico. Sin embargo, cuando se genomanipula para expresar inmunógenos extrínsecos, se observan una expresión y procesamiento auténticos en células de mamíferos in vitro y la inoculación en numerosas especies de mamíferos induce anticuerpos y respuestas inmunes celulares al inmunógeno extrínseco y proporcionan protección frente al estímulo con el patógeno análogo (Taylor y col., 1992; Taylor y col., 1991).

[0045] ALVAC y TROVAC se han reconocido también como los únicos entre los virus avipox a los que los National Institutes of Health (“NIH”; U. S. Public Health Service), Recombinant DNA Advisory Committee, cuyas directrices básicas para el confinamiento físico del material genético, tal como virus y vectores, es decir, las directrices para los procedimientos de seguridad para el uso de dichos virus y vectores, que se basan en la patogenicidad del virus o el vector particular, permiten una reducción en el nivel de contención física; desde BSL2 a BSL1. No hay otro virus avipox que tenga un nivel de contención física BSL1. Incluso la cepa Copenhagen del virus vaccinia -la vacuna habitual de la viruela- tiene un mayor nivel de contención física; concretamente, BSL2. De acuerdo con esto, la técnica ha reconocido que ALVAC y TROVAC tienen una menor patogenicidad que otros virus avipox.

[0046] De forma ventajosa, el vector del virus avipox es un ALVAC o un virus de la viruela del canario (cepa de la vacuna Rentschler) que se ha atenuado a través de 200 o más pases en serie en fibroblastos de embrión de pollo, tras de lo cual, un inóculo maestro del anterior se ha sometido a cuatro purificaciones en placa sucesivas en agar, a partir de las cuales se ha amplificado un clon mediante cinco pases adicionales. El vector del virus avipox puede ser también un virus de la viruela aviar o un virus de la viruela aviar atenuado

[0047] La memoria descriptiva se refiere además al producto de expresión del virus avipox recombinante y a los usos del anterior, tales como para formar composiciones antigénicas, inmunológicas o de vacuna, para el tratamiento, prevención, diagnóstico o ensayo; y, para los ADN procedente del virus avipox recombinante que son útiles en la construcción de sondas de ADN y cebadores de la PCR.

[0048] En un aspecto, la presente descripción se refiere a virus avipox recombinantes que contienen al menos una secuencia de ácido nucleico que expresa uno o más antígeno(s)s de FMDV, de forma ventajosa, en una región no esencial del genoma del virus avipox, el virus avipox puede ser un virus de la viruela aviar, especialmente, un virus de la viruela aviar atenuado, tal como TROVAC, o un virus de la viruela del canario, especialmente un virus de la viruela del canario atenuado, tal como ALVAC

[0049] De acuerdo con la presente invención, el virus avipox recombinante y los vectores víricos de avipox expresan al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) de FMDV. En particular, se pueden aislar cualquiera o todos los genes o marcos de lectura abiertos (ORF) que codifican antígenos de FMDV, caracterizarse e insertarse en ALVAC recombinantes. El virus avipox recombinante resultante se utiliza para infectar un animal. La expresión en el animal de los antígenos de FMDV da como resultado una respuesta inmune en el animal a FMDV. De esta manera, el virus avipox recombinante de la presente invención se puede utilizar en una composición o vacuna inmunológica para proporcionar un medio para inducir una respuesta inmune, que puede, pero no necesita ser, protectora. Sambrook y col (1989) describen las técnicas de biología molecular utilizadas.

[0050] La descripción contempla también antígenos de FMDEV que se pueden derivar como un plásmido o un vector de ADN puro o una vacuna de ADN o las composiciones inmunológicas o inmunógenas que comprenden las moléculas de ácido nucleico que codifican y expresan in vivo un(os) antígeno(s) de FMDV.

[0051] El antígeno de FMDV de interés puede obtenerse a partir de FMDV o puede obtenerse a partir de la expresión recombinante in vitro y/o in vivo de gen(es) de FMDV o de porciones de los mismos. El antígeno de FMDV de interés puede también proporcionarse utilizando secuencias de FMDV sintéticas. El antígeno de FMDV de interés puede ser, pero no limitarse a: Lb, Lab, P1-2A (que comprende VP1, VP2, VP3, VP4, y 2A); P2 (que comprende 2B, y 2C), y P3 (que comprende 3A, 3B, VPg, 3C, y 3D) o porciones de los mismos. En una realización ventajosa, los antígenos de FMDV son P1 y 3C. En una realización particularmente preferida, los antígenos de FMDV son P1-2A o P1-2A, 2B. Se hace referencia en el presente documento a la solicitud de patente de los Estados Unidos cono Nº de serie 10/327.481, que se refiere al aislamiento de las secuencias del genoma de FMDV.

[0052] Se han definido regiones no esenciales en la técnica (Johnson y col., (1993) Virology 196: 381-401) para el virus vaccinia. Estos sitios, denominados también en el presente documento como “loci de inserción”, se describen en las patentes de los Estados Unidos Nos 6.340.462, y 5.756.103 para ALVAC, e incluyen, pero no se limitan a, timidina cinasa (TK), hemaglutinina (HA), M2L, C6, y otros loci. En una realización, en la que se utiliza el virus de la viruela del canario, el locus de inserción es C6. En otra realización, en la que se utiliza el virus de la viruela aviar, el locus de inserción es F8.

[0053] La inserción de las secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos de FMDV puede estar facilitada por la recombinación homóloga, en la que la secuencia de FMDV de interés está flanqueada por secuencias que corresponden a los marcos de lectura abiertos del virus avipox inmediatamente adyacentes al locus de inserción (denominados a partir de ahora en el presente documento como “secuencias de flanqueo” o “secuencias de inserción”. La recombinación homóloga está facilitada por el reconocimiento de las secuencias de flanqueo homólogas, que promueve la integración de las secuencias de FMDV en el locus de inserción de interés. Por medio de ejemplo, la inserción de las secuencias de FMDV en el locus C6 requiere la presencia de los ORF de C6L y C6R en cualquier lado de la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno de FMDV de interés en el vector vírico. De esta manera, de forma ventajosa, los loci de inserción son C6 y las secuencias de flanqueo comprenden C6L y C6R. donde se utiliza el locus de inserción F8, las secuencias de flanqueo comprenden F8L y F8R.

[0054] Los vectores víricos de la invención que expresan los antígenos de FMDV se pueden replicar o producir en células o líneas celulares, o in vivo, en un hospedador o sujeto. Una realización alternativa consiste en la replicación del vector en células permisivas para la replicación del vector.

[0055] Debe señalarse que los virus avipox pueden solo replicarse productivamente en o pasarse a través de especies de aves o líneas celulares de aves tales como, por ejemplo, fibroblastos embriónicos de pollo o QT35. Los virus avipox recombinantes recogidos a partir de células hospedadoras de aves se inoculan en un vertebrado no de ave, tal como un mamífero, de una manera análoga a la inoculación de mamíferos por el virus vaccinia, sin replicación productiva del virus avipox. A pesar del fracaso del virus avipox para replicarse productivamente en dicho vertebrado no de ave inoculado, se produce una expresión suficiente el virus de tal manera que el animal inoculado responde inmunológicamente a los determinantes antigénicos del virus avipox recombinante y también a los determinantes antigénicos codificados en los genes exógenos del anterior. De esta manera, en una realización ventajosa, cuando se utilizan virus o vectores víricos de avipox, se prefieren fibroblastos embriónicos de pollo o QT35 como células permisivas para la replicación del vector vírico.

[0056] Los vectores víricos recombinantes y los virus recombinantes pueden contener promotores que se unen de manera operable a los antígenos de FMDV de la presente descripción. El promotor es, de forma ventajosa de origen poxvírico y de forma ventajosa, promotores tempranos o temprano-tardíos, que pueden ser, en particular, el promotor P11K del virus vaccinia, el promotor poxvírico I3L, el promotor poxvírico 42K, el promotor poxvírico H6, el promotor poxvírico Pi, P28K del virus vaccinia, P160K ATI del virus de la viruela de la vaca. En particular, la secuencia que divide la transcripción temprana de un promotor tardío-temprano se puede usar en vez del promotor de longitud completa (Moss, B. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59: 661-688; Mars, M. y col, (1987) J. Mol. Biol. 198: 619631; Davison, A. y col (1989) J. Mol. Biol. 210: 749-769; Vassef, A. (1987) Nucl. Acid. Res. 15: 1427-1443). El promotor es, de forma ventajosa, un promotor débil. Los términos “promotor fuerte” y “promotor débil son conocidos en la técnica, y se ha definen por la frecuencia relativa del inicio de la transcripción (veces por minuto) en el promotor.

[0057] La descripción proporciona también promotores poxvíricos que están mutados. Los presentes inventores han encontrado que la expresión de determinados antígenos de FMDV no es posible a partir de promotores poxvíricos fuertes. Sin pretender quedar vinculado por teoría alguna, se cree que altos niveles de expresión de antígenos de FMDV potencialmente tóxicos pueden impedir la formación de recombinantes poxvíricos estables. Por tanto, la presente descripción comprende también el uso de un promotor poxvírico mutado , tal como, por ejemplo, un promotor H6 mutado, de tal manera que los niveles de expresión de los antígenos de FMDV disminuyen en comparación con los niveles de expresión de los antígenos de FMDV con un promotor natural (Davison, A. y col (1989) J. Mol. Biol. 210: 749-769). El promotor H6 mutado de la presente descripción puede considerarse como un promotor débil.

[0058] Se piensa que el promotor H6 mutado del presente documento contiene una mutación puntual. La invención puede emplear también promotores diferentes de H6, que contienen mutaciones puntuales que reducen su frecuencia o inicio de la transcripción en comparación con el promotor natural. Además, otros tipos de promotores mutados son adecuados para el uso en la presente invención. Por ejemplo, la solicitud de los Estados Unidos nº 107679.520, describe una forma truncada del promotor H6 (véase también Davison, A. y col (1989) J. Mol. Biol. 210: 749-769; Taylor J. y col., Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. y col. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. y col., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836).

[0059] La presente descripción se refiere también a un procedimiento para producir un vector de avipox recombinante que comprende antígenos de FMDV, que comprende las etapas de linealizar un plásmido donante con una endonucleasa de restricción, en el que el plásmido donante comprende sitios de escisión de la endonucleasas de restricción o un sitio de clonación múltiple, y ligando al menos una secuencia de ácido nucleico que comprende (i) una secuencia de ácido nucleico que comprende (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) de FMDV (ii) una secuencia promotora vírica, y (iii) las secuencias de inserción flanqueantes (i) y(ii) que tienen sitios de escisión complementarios de la endonucleasa de restricción para el plásmido donante en los antígenos de FMDV, produciendo por tanto el vector de avipox recombinante. De forma ventajosa, el procedimiento comprende además las etapas de introducir el vector en una célula permisiva para la replicación del vector, y aislar el vector a partir de la célula.

[0060] Por definición, un vector de expresión de un plásmido donante (o un plásmido donante) comprende una unidad de transcripción del ADN que comprende una secuencia del polinucleótido que contiene el ADNc que se va a expresar y los elementos necesarios para su expresión in vivo. El plásmido donante puede incluir también una señal de terminación temprana poxvírica en el término 3’ del gen extraño (Moss, B. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59: 661688). Se prefiere la forma circular del plásmido superenrrollado o no enrrollado. La forma lineal procede también en el alcance de esta descripción.

[0061] Los procedimientos para preparar y/o usar vectores (o recombinantes) para la expresión y usos de los productos de expresión y productos de los anteriores (tales como anticuerpos) pueden ser los procedimientos dados a conocer o bien análogos de los procedimientos dados a conocer en los documentos citados en el presente documento y los documentos referenciados o citados en los documentos citados en el presente documento. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. Molecular Cloning (1999). La descripción incluye también el uso de los vectores avipox que expresan antígenos de FMDV en el escenario de investigación. Los vectores de avipox recombinantes y los virus avipox recombinantes se pueden usar para transfectar o infectar células o líneas celulares de interés para el estudio, por ejemplo, respuestas celulares a los antígenos de FMDV, o rutas de transducción de la señal mediadas por antígenos de FMDV.

[0062] En el escenario de investigación es a menudo ventajoso diseñar vectores o virus recombinantes que comprendan genes indicadores que se puedan detectar fácilmente mediante ensayos y técnicas de laboratorio. Los genes indicadores son bien conocidos en la técnica y pueden comprender genes de resistencia a los antibióticos tales como, pero sin limitarse a, ampicilina, neomicina, zeocina, kanamicina, bleomicina, higromicina, cloranfenicol, entre otros. Los genes indicadores pueden comprender también proteína fluorescente verde, el gen lacZ (que codifica -galactosidasa), luciferasa, y -glucuronidasa.

[0063] La descripción se refiere también a un procedimiento para estimular una respuesta inmune frente a la fiebre aftosa en un sujeto, que comprende administrar los vectores de avipox recombinantes o los virus avipox recombinantes de acuerdo con la presente invención al sujeto. El sujeto puede ser cualquier animal que pueden llegar a infectarse con FMDV, en particular, especies bovinas, ovinas, porcinas o caprinas. En el presente documento se definen los procedimientos de administración y las dosis.

[0064] Los vectores y virus avipox recombinantes que expresan antígenos de FMDV o un producto de expresión de los mismos, composiciones inmunológicas, antigénicas o de vacuna o composiciones terapéuticas, se pueden administrar mediante una ruta parenteral (intradérmica, intramuscular o subcutánea) Dicha administración permite una respuesta inmune sistémica o respuestas humorales o mediadas por células.

[0065] Tal como se usa en el presente documento, los términos “composición inmunógena” y “composición inmunológica” cubren cualquier composición que estimula una respuesta inmune dirigida contra el antígeno de FMDV. Los términos “composición vaccinal” y “vacuna” y “composición de vacuna” cubren cualquier composición que induzca una respuesta inmune protectora frente al antígeno de FMDV o que proteja eficazmente contra el antígeno tras la administración o la inyección en el animal. La descripción comprende además vectores víricos de avipox recombinantes administrados como un vector o vacuna de ADN plásmido.

[0066] De forma más general, los vectores víricos de avipox recombinante de la invención y los vectores de avipox recombinante que expresan antígenos de FMDV, composiciones de FMDV antigénicas, inmunógenas, inmunológicas de virus avipox de vacuna, se pueden preparar de acuerdo con las técnicas normalizadas bien conocidas por los expertos en las técnicas farmacéuticas o veterinarias. Dichas composiciones pueden administrarse en dosificaciones y mediante técnicas bien conocidas por los expertos en las técnicas médicas o veterinarias, teniendo en consideración los mencionados factores tales como la edad, sexo, peso, especie y dolencia del paciente concreto, y la ruta de administración.

[0067] Las composiciones se pueden administrar solas, o se pueden administrar simultáneamente o administrar de forma secuencial con las composiciones, por ejemplo, con “otra” composición inmunológica, antigénica o de vacuna o composiciones terapéuticas que proporcionan de este modo una composición multivalente o “cóctel” o combinación de la descripción y procedimientos para emplearlos. De nuevo, los ingredientes y la manera (secuencial

o en administración simultánea) de administración, así como las dosificaciones, se pueden determinar teniendo en consideración los mencionados factores tales como la edad, sexo peso, especie y dolencia del sujeto concreto, y la ruta de administración. A este respecto, se hace referencia a la patente de los estados Unidos Nº 5.843.456, dirigida a composiciones para la rabia y a una combinación de composiciones y los usos de las mismas.

[0068] Los ejemplos de composiciones de la descripción incluyen preparaciones líquidos para orificios, o mucosales, por ejemplo, orales, nasales, anales, vaginales, perorales, intragástricas, etc, administraciones tales como suspensiones, disoluciones, pulverizaciones, jarabes o elíxires, y preparaciones para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo, administración de inyectables) tales como suspensiones o emulsiones estériles. En dichas composiciones, el virus avipox recombinante o los vectores víricos de avipox recombinante pueden estar en premezcla con un vehículo, diluyente, o excipiente adecuados, tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similares. Las composiciones pueden también liofilizarse. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes tamponantes del pH, adyuvantes, gelificantes o aditivos potenciadores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colores, y similares, dependiendo de la ruta de administración y la preparación deseadas. Se pueden consultar textos normalizados tales como "REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17ª edición, 1985, para preparar preparaciones adecuadas, sin excesiva experimentación.

[0069] Las composiciones en formas para las diversas rutas de administración quedan abarcadas por la descripción. Y, de nuevo, la dosificación eficaz y la ruta de administración se determinan mediante factores conocidos, tales como la edad, sexo, peso, dolencia y naturaleza del animal, así como la DL50 y otros procedimientos de cribado que son conocidos y no requieren excesiva experimentación. Las dosificaciones de cada agente activo pueden ser como en los documentos citados en el presente documento (o los documentos a los que se hace referencia o se cita en los documentos citados en el presente documento) y/o pueden variar de uno a unos pocos a unos pocos cientos o miles de microgramos, por ejemplo, 1 μg a 1 mg, para una composición inmunógena, inmunológica o de vacuna, y, 104 a 1010 de la CTDI50) de forma ventajosa 106 a 108 de la CTDI50 para una composición inmunógena, inmunológica o de vacuna.

[0070] Se pueden administrar recombinantes o vectores en una cantidad adecuada para obtener la expresión in vivo que corresponde a las dosificaciones descritas en el presente documento y/o, en los documentos citados en el presente documento. Por ejemplo, se pueden determinar de manera empírica los intervalos adecuados para las suspensiones víricas. El vector o recombinante vírico en la invención se puede administrar a un animal o infectarse o transfectarse en células en una cantidad de aproximadamente al menos 103 ufp; de forma más ventajosa 104 ufp a aproximadamente 1010 ufp, por ejemplo, aproximadamente 105 ufp a aproximadamente 109 ufp, por ejemplo, aproximadamente 106 ufp a aproximadamente 108 ufp, con dosis que varían generalmente desde aproximadamente 106 a aproximadamente 1010, de forma ventajosa, aproximadamente 108 ufp/dosis, y , de forma ventajosa, aproximadamente 107 ufp por dosis de 2 ml, Y, si se expresa más de un producto por más de un recombinante, se puede administrar cada recombinante en estas cantidades; o, cada recombinante se puede administrar de tal manera que exista, en combinación, una suma de recombinantes que comprenda estas cantidades.

[0071] En las composiciones de vector o plásmido empleadas en la descripción, las dosificaciones pueden ser como se ha descrito en los documentos citados en el presente documento o como se describen en el presente documento o como en los documentos a los que se hace referencia o se cita en los documentos citados en el presente documento. De forma ventajosa, la dosificación debe ser una cantidad suficiente de plásmido para estimular una respuesta análoga a las composiciones en las que el(los) antígeno(s) de FMDV están directamente presentes; o tienen una expresión análoga a la expresión obtenida in vivo por las composiciones recombinantes. Por ejemplo, cuando se administran vacunas de ADN, las cantidades adecuadas de cada ADN plásmido en las composiciones de plásmidos pueden ser de 1 μg a 2 mg, de forma ventajosa de 50 μg a 1 mg. El técnico experto puede consultar los documentos citados en el presente documento (o los documentos citados o a los que se hace referencia en los documentos citados en el presente documento) con respecto a los vectores del plásmido de ADN para dilucidar otras dosificaciones adecuadas para las composiciones del vector del plásmido de ADN de la descripción, sin excesiva experimentación.

[0072] Sin embargo, la dosificación de la(s) composición(ones), la concentración de los componentes en el anterior y el calendario de administración de la(s) composición(ones), que estimula(n) una respuesta inmunológica adecuada, se puede determinar mediante procedimientos tales como titulaciones de anticuerpos de suero, por ejemplo, mediante análisis ELISA y/o análisis de ensayos de seroneutralización. Dichas determinaciones no requieren excesiva experimentación considerando el conocimiento del técnico experto, esta divulgación, y los documentos citados en el presente documento. E, igualmente, puede dilucidarse el tiempo para las administraciones secuenciales con procedimientos dilucidables a partir de esta divulgación, y el conocimiento de la técnica, sin excesiva experimentación.

[0073] Las composiciones inmunógenas o inmunológicas contempladas por la memoria descriptiva pueden contener también un adyuvante. Los adyuvantes particularmente adecuados para uso en la práctica de la presente descripción son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, polímeros derivados de anhídrido maleico y alquenilo,

(2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades CpG no metiladas (Klinman D. M. y col., Proc. Nad. Acad. Sci., USA, 1996, 93, 2879-2883; WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en la p 147 de "Vaccine

5 Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la p 183 del mismo trabajo. (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, (5) citosinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio o (7) otros adyuvantes descritos en cualquier documento citado en la presente solicitud, u (8) cualquier combinación o mezcla de los mismos. Las vacunas de ADN o composiciones inmunógenas o inmunológicas abarcadas por la descripción se pueden formular con un liposoma, en presencia o ausencia de un adyuvante tal como se ha descrito anteriormente.

[0074] Otros adyuvantes adecuados incluyen fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; patente de los Estados Unidos Nº 6.017.537) y/o polímero de ácido acrílico o ácido metacrílico y/o un copolímero de anhídrido maleico y de un derivado de alquilo. Los polímeros de ácido acrílico o ácido metacrílico pueden ser reticulados, por ejemplo, con 15 éteres de polialquenilo de azúcares o de polialcoholes. Estos compuestos son conocidos bajo el término “carbómero” (Pharmaeuropa, Vol. 8, Nº 2, junio de 1996). Una persona experta en la técnica puede también referirse a la patente de los Estados Unidos Nº 2.909.462, que describe dichos polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que contiene al menos 3 grupos hidroxilo; en una realización, un compuesto polihidroxilado contiene no más de 8 grupos hidroxilo; en otra realización, los átomos de hidrógeno de al menos 3 hidroxilos están sustituidos con radicales alifáticos insaturados que contienen al menos 2 átomos de carbono; en otras realizaciones, los radicales contienen entre aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden por sí mismos contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos adquiridos bajo el nombre Carbopol® (Noveon Inc., Ohio, EE.UU.) son particularmente adecuados para el uso como un adyuvante. Están reticulados con una alil

25 sacarosa o con un alfapentaeritritol, entre los que se pueden mencionar los productos Carbopol® 974P, 934P, y 971P.

[0075] Análogamente a los copolímeros de anhídrido maleico y un derivado de alquenilo, se pueden mencionar los productos EMA® (Monsanto), que son copolímeros de anhídrido maleico y de etileno, que pueden ser lineales o reticulados con divinil éter. También se puede hacer referencia a J. Fields y col., Nature 186: 778-780, 1960.

[0076] Con respecto a la estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y EMA están formados de forma ventajosa por unidades básicas que tienen la siguiente fórmula:

en la que:

-: R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan H o CH3

-: x = 0 o 1, de forma ventajosa x = 1

-: y = 1 o 2, con x + y = 2.

[0077] Para EMA, x =0 e y = 2 y para los carbómeros x = y = 1.

45 [0078] Estos polímeros son solubles en agua o solución salina fisiológica (20 g/l de NaCl) y el pH puede ajustarse a 7,3 a 7,4, por ejemplo, mediante sosa (NaOH), para proporcionar la disolución de adyuvante en que se puede(n) incorporar el(los) vector(es) de expresión. La concentración de polímero en la composición final de vacuna puede variar entre 0,01 y 1,5% en p/v, de forma ventajosa 0,05 a 1% en p/v y ventajosamente 0,1 a 0,4% en p/v.

[0079] Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario que son de forma ventajosa pero no exclusivamente adecuados para plásmidos, son de manera ventajosa aquellos que tienen la siguiente fórmula:

en la que R1 es un radical alifático de cadena lineal, saturado o insaturado que tiene 12 a 18 átomos de carbono, R2

es otro radical alifático que contiene 2 o 3 átomos de carbono y X es una amina o un grupo hidroxilo.

[0080] Entre estos lípidos catiónicos, se da preferencia a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis (tertradeciloxi)-1-propano amonio; documento WO96/34109), asociado de forma ventajosa con un lípido neutro, de manera ventajosa DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanol amina; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389) para formar DMRIE-DOPE.

[0081] De forma ventajosa, la mezcla del plásmido con el adyuvante se forma de manera extemporánea o contemporánea con la administración de la preparación, por ejemplo, poco antes o antes de la administración, se forma la mezcla de plásmido-adyuvante, de forma ventajosa de tal manera que se proporciona suficientemente antes de la administración de la mezcla para formar un complejo, por ejemplo, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 minutos antes de la administración, tal como aproximadamente 30 minutos antes de la administración.

[0082] Cuando está presente DOPE, la relación molar DMRIE:DOPE es, ventajosamente, de aproximadamente 95, aproximadamente 5 a aproximadamente 5:aproximadamente 5: aproximadamente 95, de forma más ventajosa aproximadamente 1: aproximadamente 1, por ejemplo, 1:1.

[0083] La relación en peso de DMRIE o de adyuvante:plásmido DMRIE-DOPE puede estar entre aproximadamente 50: aproximadamente 1 y aproximadamente 1. Aproximadamente 10, tal como aproximadamente 10; aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 5; y, de forma ventajosa, aproximadamente 1: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 2, por ejemplo 1:1 y 1:2 . [0084] Una vacuna recombinante o composición inmunógena o inmunológica se puede formular también en forma de una emulsión de aceite en agua. La emulsión de aceite en agua puede estar basada, por ejemplo, en aceite de parafina líquida ligero (de tipo Farmacopea Europea); aceite de isoprenoide tal como escualeno, escualeno, EICOSANETM o tetratetracontano; aceite resultante de la oligomerización de alqueno(s), por ejemplo, isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, tales como aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol di(caprilato/caprato), gliceril tri(caprilato/caprato) o dioleato de propilenglicol, ésteres de ácidos grasos o alcoholes blanqueados, por ejemplo, ésteres de ácido isoesteárico. El aceite se utiliza de forma ventajosa en combinación con emulsificantes para formar la emulsión. Los emulsificantes pueden ser tensioactivos no iónicos, tales como ésteres de sorbitán, mannide (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), glicerol, poliglicerol, propilenglicol, y ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico, o hidroxiesteárico, que opcionalmente se etoxilan, y copolímeros en bloque de polioxipropileno-polioxietileno, tales como productos de Pluronic®, por ejemplo, L121. El adyuvante puede ser una mezcla de emulsificante(s), un agente formador de micelas tal como el que se encuentra disponible con el nombre Provax® (IDEC Pharmaceuticals, San Diego (CA).

[0085] El término de “inducción-refuerzo” se refiere a sucesivas administraciones de dos tipos de vacunas o composiciones inmunógenas o inmunológicas diferentes que tienen al menos un antígeno en común. La administración por inducción (inducción) es la administración de una primera vacuna o tipo de composición inmunógena o inmunológica y puede comprender una, dos o más administraciones. La administración del refuerzo es la administración de una segunda vacuna o tipo de composición inmunógena o inmunológica y puede comprender una, dos o más administraciones, y, por ejemplo, puede comprender o consistir esencialmente de administraciones anuales.

[0086] De esta manera, la descripción abarca la inmunización de inducción-refuerzo o procedimiento de vacunación de un animal frente a al menos un antígeno de FMDV, que comprende administrar al animal una vacuna de ADN de inducción o una composición inmunológica o inmunógena que comprende una(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica y expresa in vivo un(os) antígeno(s) de FMDV, y administrar posteriormente una composición de refuerzo que comprende al antígeno de FMDV expresado por la vacuna de ADN o la composición inmunógena o inmunológica, o un vector recombinante o modificado, por ejemplo, un virus, tal como un virus avipox (tal como ALVAC, el virus de la viruela del canario, TROVAC, o el virus de la viruela aviar) que contiene y expresa en una célula hospedadora animal una secuencia de nucleótido que codifica el antígeno de FMDV expresado por la vacuna de ADN o la composición inmunógena o inmunológica. La vacuna de refuerzo o composición inmunógena o inmunológica puede ser igual o diferente que la vacuna de inducción o la composición inmunógena o inmunológica.

[0087] Por ejemplo, la vacuna de refuerzo o composición inmunógena o inmunológica puede ser, de forma ventajosa, el antígeno de FMDV expresado por la vacuna de ADN (o la composición inmunógena o inmunológica) y/o el vector de avipox recombinante o modificado, por ejemplo, virus, vacuna o composición inmunógena o inmunológica. Un vector recombinante o modificado es, de forma ventajosa, un vector de expresión in vivo, tal como una bacteria, levadura, virus, por ejemplo, virus avipox, modificado o recombinante, que comprende una(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica y expresa in vivo el(los) antígeno(s) de FMDV, expresados por la vacuna de ADN o la composición inmunógena o inmunológica. El refuerzo se lleva a cabo de forma ventajosa con una vacuna inactivada o composición inmunógena o inmunológica que comprende un vector de un virus vivo recombinante, tal como un virus avipox recombinante, que comprende una(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica y expresa in vivo el(los) antígeno(s) procedente(s) del antígeno de FMDV expresado por la vacuna de ADN o la composición inmunógena o inmunológica. De esta manera, resulta ventajoso que el refuerzo comprenda tanto el antígeno expresado por la vacuna de ADN o la composición inmunógena o inmunológica o que exprese in vivo el mismo antígeno de FMDV expresado por la vacuna de ADN o la composición inmunógena o inmunológica. De forma ventajosa, el refuerzo comprende el virus avipox recombinante que expresa los antígenos de FMDV descritos en el presente documento.

[0088] De forma alternativa, la inmunización de inducción-refuerzo o procedimiento de vacunación puede comprender administrar al animal una vacuna de cebado que comprende los virus avipox recombinantes de la presente invención, y el refuerzo posteriormente con la vacuna de ADN

[0089] El ADN plásmido, o el vector de avipox recombinante que expresa una o más secuencias de ácido nucleico que codifican al menos un antígeno de FMDV, por ejemplo, un vector de acuerdo con esta divulgación, puede preservarse y/o conservarse y almacenarse tanto en forma líquida, a aproximadamente 5º C, o en forma liofilizada o criocongelada, en presencia de un estabilizante. La criocongelación puede ser de acuerdo con procedimientos de criocongelación normalizado bien conocidos. Los estabilizantes farmacéuticamente aceptables pueden ser SPGA (sacarosa fosfato glutamato albúmina; Bovarnik y col., J. Bacteriology 59: 509, 1950), hidratos de carbono (por ejemplo, sorbitol, manitol, lactosa, sacarosa, glucosa, dextrano, trehalosa), glutamato de sodio (Tsvetkov T y col., Cryobiology 20(3): 318-23, 1983; Israeli E y col., Cryobiology 30(5): 519-23, 1993), proteínas tales como peptona, albúmina o caseína, agentes que contienen proteínas tales como leche desnatada (Mills CK y col., Cryobiology 25(2): 148-52, 1988; Wolff E y col., Cryobiology 27(5): 569-75, 1990), y tampones (por ejemplo, tampón fosfato, tampón fosfato de metales alcalinos) Se puede utilizar un adyuvante y/o un vehículo o excipiente para hacer solubles las preparaciones criocongeladas.

[0090] Se describirá ahora la invención por medio de los siguientes Ejemplos no limitantes, proporcionados a modo de ilustración

Ejemplos

Ejemplo 1. Construcción de un plásmido donante pC5 H6p FMDV P1+3C para la introducción de genes de FMDVG en los loci C5 de ALVAC

[0091] Se utilizó el plásmido pAd5-A24 como el plásmido donante para generar el adenovirus Ad5A24 recombinante. Este es un plásmido de ~ 39 kb que contiene los genes de la cepa A24 P1 y la proteasa de la cepa A12 3C. Se realizaron algunas deleciones del genoma de FMDV por motivos de seguridad que se indican en la Figura 1.

[0092] Se digirió el plásmido pAd5-A24 con EcoRI y XbaI y el fragmento de ~ 3,4 kb que contenía los genes de FMDV se insertó en PUC8:2 con los sitios BgIII y XbaI añadidos al sitio de clonación múltiple). El plásmido pUC de FMDV de 6 kb resultante (designado pHM-1119-1) se utilizó como fuente de los genes de FMDV en todas las construcciones posteriores.

[0093] El promotor H6 (H6p) es un promotor temprano/tardío derivado del gen H6 de vaccinia (Perkus, M.E. y col, (1989) J. Virol. 63: 3829-3836), que se ha designado como el gen H5 en la cepa Copenhagen de vaccinia. El H6p es un fuerte promotor que se ha utilizado de forma extensa en avipox recombinantes para la expresión de genes extraños.

[0094] Se utilizó el plásmido pHM-1119-1 como un molde para la amplificación de la PCR con los cebadores 11277.SL y 11282.SL. estos cebadores introdujeron el extremo 3’ del promotor H6 de vaccinia, así como las señales de detención de la traducción y la transcripción, y los sitios de restricción XbaI o BamHI para la clonación. En la Figura 2 se muestran las secuencias del cebador. Se clonó el producto de la PCR de 3,4 kb en pCR2.1 para generar el plásmido pHM-1151-4, pCR2.1 H6p de FMDV

[0095] El plásmido pCXL-148-2 es un plásmido de inserción ALVAC para los loci C5, que contiene el promotor H6 del virus vaccinia. El fragmento NruI-XbaI de 3,4 kb procedente de pHM-1151-4 se insertó en pcXL-148-2, para generar pC5 H6p FMDV P1+3C (pHM-1175-1). En la Figura 3, se ilustra la construcción de pHM-1175-1 y en la Figura 4 se muestra la secuencia del casete del gen C5 H6p de FMDV.

[0096] A pesar de múltiples intentos, no se han generado ALVAC recombinantes a partir de pC5 H6p FMDV P1+3C, pHM-1175-1.

Ejemplo 2: Construcción de un plásmido donante pF8 H6p FMDV P1+3C para la introducción de genes de FMDV en el locus F8 del virus de la viruela aviar

[0097] El plásmido pSL-6427-2-1 (pF8 H6p) es un plásmido de inserción de la viruela aviar, que contiene el promotor H6 del virus vaccinia. El fragmento NruI-BamHI de 3,4 kb procedente de pHM-1151-4 (pCR2.1 H6p de FMDV; véase el Ejemplo 1), se insertó en pSL-6427-2-1 generando el vector pHM-1180-11 (pF8 H6p FMDV P1+3C).

La construcción de pHM-1180-11 se ilustra en la Figura 5 y en la Figura 6 se muestra la secuencia del casete del gen F8 H6p de FMDV.

[0098] A pesar de múltiples intentos, no se pueden generar virus de la viruela aviar recombinantes a partir de pF8 H6p FMDV P1+3C, pHM-1180-1.

Ejemplo 3: Construcción del plásmido de inserción pC6 FMDV P1+3C menos el promotor.

[0099] El fracaso en generar avipox recombinantes que expresaban los genes de FMDV podría deberse al uso de un promotor H6 fuerte de virus vaccinia en los plásmidos pC5 H6p FMDV P1+3C y pF8 H6p FMDV P1+3C descritos en los Ejemplos 1 y 2. Además, el plásmido donante ALVAC da como resultado la inserción de casetes génicos en los dos loci C5. Para ALVAC, se han utilizado diferentes promotores víricos y el único locus de inserción C6.

[0100] Se utilizó el plásmido pHM-1119-1 (pUC de FMDV, véase el Ejemplo 1) como el molde para la amplificación de la PCR de un fragmento 3’ de FMDV, con los cebadores 11280 SL y 11352 CXL. El fragmento de la PCR de ~ 900 pb contiene el extremo 3’ de FMDV procedente del sitio XhoI e introduce detenciones de la traducción y de la transcripción y un sitio de clonación PstI. En la Figura 7 se ilustran los cebadores. El fragmento de la PCR se clonó en pCR2.1, generando el plásmido pHM-1240, pCR2. 3’-FMDV

[0101] El plásmido pC6L es un plásmido de inserción ALVAC para el único sitio C6 de ALVAC. El fragmento EcoRI-XhoI 5’-FMDV de ~ 2,6 kb procedente de pHM-1119-1 se insertó en pC6L, generando el plásmido pCXL1008-1, pC6 5’-FMDV. El fragmento XhoI-Pstl de ~ 900 pb procedente de pHM-1240-2 se insertó en pCXL-1008-1, generando pCXL-1013-2, pC6 de FDMV. En la Figura 8, se ilustra la construcción de pC6 de FMDV.

Ejemplo 4: Construcción de un plásmido donante pC6 H6p FMDV P1+3C para inserción en el casete del gen FMDV en el locus único C6 de ALVAC

[0102] El plásmido pSL-6407-7 es un plásmido de inserción pC6 H6p para el locus ALVAC C6, que contiene el promotor H6 del virus vaccinia. El promotor H6 está en la orientación opuesta a los brazos de C6. El fragmento NruI-XhoI 5’-FMDV de ~ 2,6 kb procedente de pHM-1151-4 (pCR2.1 de FDMV, véase el Ejemplo 1) se insertó en pSL6407-7, generando pC6 H6p 5’-FMDV, pCXL-1008-3. El fragmento XhoI-Pstl 3’-FMDV procedente de pHM-1240-2 (pCR2.1 3’-FDMV, véase el Ejemplo 3) se insertó en pCXL-1008-3, generando pC6 H6p FDMV P1+3C, pCXL-1013

4. La construcción de pC6 H6p FMDV P1+3C se ilustra en la Figura 9 y en la Figura 10, se muestra la secuencia del casete del gen C6 H6p de FMDV.

[0103] A pesar de múltiples intentos, no se pueden generar ALVAC recombinantes utilizando el plásmido donante pC6 H6p FMDV P1+3C, sugiriendo que la inserción en un único sitio con un promotor fuerte no ha sido factible.

Ejemplo 5: Construcción de un plásmido donante pC6 H6p* FMDV P1+3C para la inserción de un casete génico de FMDV en el único locus C6 de ALVAC

[0104] Basándose en los estudios con el promotor temprano de 7,5 K del virus vaccinia (Davison, A.J. y Moss, B. (1989) J. Mol. Biol. 210: 749-769), se introdujo una mutación puntual en la región del promotor temprano H6 del virus vaccinia, generando un promotor H6 mutante, H6p*. En la Figura 11 se muestran las secuencias H6p temprana/tardía natural y H6p* mutante

[0105] Se utilizó el plásmido pHM-1119-1 (pUC de FMDV, véase el Ejemplo 1) como el molde para amplificar mediante la PCR el fragmento H6p* 5’-FMDV, con los cebadores 11353.CXL y 11358.CXL. El fragmento de ~ 1,2 kb contenía los genes H6p* y el 5’-FMDV en un único sitio NdeI. El fragmento se clonó en pCR2.1, generando el plásmido pHM-1249-1-3. Este clon había perdido un nucleótido en VP4, de esta manera, se llevó a cabo la mutagénesis dirigida al emplazamiento con los cebadores 11410.HM y 11411.HM para reparar el error de la PCR. El clon pHM-1260-2, pCR2-1 H6p* 5’-FMDV, se confirmó mediante el análisis de la secuencia. La Figura 12A describe los cebadores de amplificación de la PCR y la Figura 12B describe los cebadores de la mutagénesis.

[0106] El fragmento EcoRI-NdeI H6p* 5’-FMDV procedente de pHM-1260-2 se insertó en pCXL-1013-2 (pC6 FMDV P1+3C, véase el Ejemplo 3), generando el plásmido pHM-1273-1, pC6 H6p* FMDV P1+3C. En la Figura 13 se ilustra la construcción de pC6 H6p* FMDV P1+3C y en la Figura 14 se muestra el casete del gen C6 H6p* de FMDV.

[0107] Para generar un ALVAC recombinante, se transfectaron fibroblastos primarios embriónicos de pollo (CEF) con el plásmido donante pHM-1273-1 linealizado con SapI, en presencia del reactivo FuGENE-6® (Roche). Las células transfectadas se infectaron posteriormente con ALVAC como virus auxiliar a una MOI de 10 y después de 24 horas, se cosecharon las células transfectadas-infectadas, se sonicaron, y se usaron para el cribado del virus recombinante. Las placas recombinantes se cribaron basándose en el método de hibridación con elevación de placa utilizando una sonda específica de FMDV de 1,7 kb marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amersham). Se generaron ALVAC recombinantes y se designaron como vCP2176.

Ejemplo 6: Construcción de un plásmido donante pC6 I3Lp FMDV P1+3C para la introducción de los genes FMDV en el único locus C6 de ALVAC

[0108] El promotor I3L temprano/intermedio (I3Lp) procedente del virus vaccinia (Schmitt, J.F. y Stunnenberg, H.G. (1988) J. Virol. 62: 1889-1897) se ha utilizado anteriormente en avipox recombinantes.

[0109] El plásmido pCXL-1-4 es pC5 H6p EHV-1 gB (-TM)/42Kp EHV-1gD (-TM)/I3Lp EHV-1 gC (-TM), un plásmido donante utilizado para introducir los genes gB, gC, y gD de EHV-1 en ALVAC (descrito en la Patente de los Estados Unidos Nº. 5.756.103). Cada gen utiliza un promotor vírico diferente, de esta manera, se utilizó pCXL-1-4 como el molde para amplificar mediante la PCR el promotor 13L. Se utilizaron los cebadores 11407.CXL y 11423. CXL para amplificar un fragmento de 75 pb que contenía el promotor I3L y el extremo 5’ de los genes de FMDV. En la Figura 15A se describen los cebadores de la PCR.

[0110] Se amplificó un fragmento de la PCR de 648 pb, que contenía un solapamiento de 20 pb con el fragmento I3Lp de 75 pb, utilizando los cebadores 11425.CXL y 11407.CXL, como pHM-1119-1 (pUC de FMDV, véase el Ejemplo 1) como molde. Este fragmento contenía los genes de 5’-FMDV en el único sitio KpnI. En la Figura 15B se describen los cebadores de la PCR.

[0111] Se mezclaron los dos fragmentos de la PCR a una relación molar 1:1 y se amplificó la PCR utilizando los cebadores 11423.CXL y 11407.CXL. El fragmento de 703 pb resultante se clonó en pCR2.1, generando pCXL-10681 (PCR2.1 I3Lp 5’-FMDV).

[0112] El fragmento EcoRI-KpnI I3Lp 5’-FMDV de ~ 700 pb procedente pCXL-1068-1 se insertó en pHM1119-1, generando pCXL-1072-2 (pUC I3Lp FMDV P1+3C).

[0113] El fragmento EcoRI-NdeI I3Lp 5’-FMDV procedente de pCXL-1072-2 se insertó en pCXL-1013-2 (pC6 FMDV P1+3C). En la Figura 16 se ilustra la construcción de pC6 I3Lp FMDV P1+3C y en la Figura 17 se muestra la secuencia del casete del gen C6 I3Lp de FMDV.

[0114] Para generar un ALVAC recombinante, se transfectaron CEF primarios con 20 μg del plásmido donante pCXL-1079-1 linealizado con Sapl utilizando el reactivo FuGENE® (Roche). Las células transfectadas se infectaron posteriormente con ALVAC como virus auxiliar a una MOI de 10 y después de 24 horas, se cosecharon las células transfectadas-infectadas, se sonicaron, y se utilizaron para el cribado del virus recombinante. Las placas recombinantes se cribaron basándose en el método de hibridación con elevación de placa utilizando una sonda específica de FMDV de 1,7 kb marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amersham). Tras cuatro ciclos secuenciales de purificación en placas, se generaron recombinantes designados como vCP2181.4.1.1.1 y vCP2181.5.1.1.1 y se confirmaron por hibridación como 100% positivos para la inserción de FMDV y 100% negativos para el ORF de C6.

[0115] Se seleccionaron placas individuales desde el 4º ciclo de purificación en placas y se expandieron para obtener disoluciones madre P1 (1 X matraz T25 por hermana), P2 (1 X matraz T25 por hermana) y P3 (4 x frascos cilíndricos) amplificadas de los vCP2181 recombinantes. Las células infectadas procedentes de los frascos cilíndricos se cosecharon y concentraron para producir disoluciones madre de virus. Se volvió a confirmar el concentrado vírico por hibridación mediante elevación de placa con las sondas de FMDV y C6 específicas. Se preparó ADN vírico y se confirmó la inserción correcta del casete génico de FMDV en el locus C6 de ALVAC mediante los análisis de transferencia Southern y el análisis de la secuencia. Se llevaron a cabo los análisis de inmunotransferencia e inmunoplacas utilizando anticuerpos específicos tal como se describe en el Ejemplo 7 (véase la Figura 30)

Ejemplo 7: Construcción de un plásmido donante pC6 42kDp FMDV P1+3C para la introducción de los genes de FMDV en el único locus C6 de ALVAC

[0116] Se ha utilizado previamente un promotor 42K (42Kp) derivado del gen AMV091 (homólogo A23R del virus vaccinia) del poxvirus del insecto Amsacta moorei (Bawden, A.L. y col, (2000) Virology 274: 120-139) en avipox recombinantes (Patente de los Estados Unidos Nº 5.756.103).

[0117] El plásmido pCXL-1-4 es pC5 H6p EHV-1 gB (-TM)/42Kp EHV-1 gD (-TM)/I3Lp EHV-1 gC (-TM), un plásmido donante utilizado para introducir los genes gB, gC, y gD de EHV-1 en ALVAC (véase el Ejemplo 6). Cada gen utiliza un promotor vírico diferente, de esta manera, se utilizó pCXL-1-4 como el molde para amplificar mediante la PCR el promotor 42K. Se utilizaron los cebadores 11426.CXL y 11427.CXL para amplificar un fragmento de 48 pb que contenía el promotor 42K y el extremo 5’ de los genes de FMDV. En la Figura 18A se describen los cebadores de la PCR.

[0118] Un fragmento de la PCR de 647 pb, que contiene un solapamiento de 20 pb con el fragmento 42Kp de 48 pb, se amplificó utilizando los cebadores 11428. CXL y 11407.CXL, con pHM-1119-1 (pUC de FMDV, véase el Ejemplo 1) como un molde. Este fragmento contiene los genes 5’-FMDV en el único sitio de unión KpnI. En la Figura 18B se describen los cebadores de la PCR.

[0119] Los dos fragmentos de la PCR se mezclaron a una relación molar 1:1 y se amplificaron mediante la PCR utilizando los cebadores 11426.CXL y 11407.CXL. El fragmento de 676 pb resultante se clonó en pCR2.1, generando pCXL-1080-2-2 (pCR2.1 42Kp 5’-FMDV).

[0120] El fragmento EcoRI -KpnI 42Kp 5’-FMDV de 676 pb procedente de pCXL-1080-2-2 se insertó en pHM1119-1, generando pCXL-1089-1 (pUC 42Kp FMDV P1+3C).

[0121] El fragmento EcoRI - NdeI 42Kp 5’-FMDV de Ң 1.2 kb procedente de pCXL-1089-1 se insertó en pCXL1013-2 (pC6 FMDV P1+3C, véase el Ejemplo 3), generando pCXL-1095-1 (pC6 42Kp FMDV P1+3C). En la Figura 19 se ilustra la construcción de pC6 42Kp FMDV P1+3C y en la Figura 20 se muestra la secuencia del casete del gen C6 42Kp de FMDV.

[0122] Para generar un ALVAC recombinante, se transfectaron CEF primarios con 20 μg del plásmido donante pCXL-1095-1 linealizado con Sapl, utilizando el reactivo FuGENE-6® (Roche). Las células transfectadas se infectaron posteriormente con ALVAC como virus auxiliar a una MOI de 10 y después de 29 horas, se cosecharon las células transfectadas-infectadas, se sonicaron, y se utilizaron para el cribado del virus recombinante. Se cribaron las placas recombinantes besándose en el método de hibridación con elevación de placa utilizando la sonda específica de FMDV de 1,7 kb marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amersham). Tras cuatro ciclos secuenciales de purificación en placas, se generó el recombinante designado como vCP2186.6.2.1.1 y se confirmó por hibridación como 100% positivos para la inserción de FMDV y 100% negativos para el ORF de C6.

[0123] Se seleccionaron placas individuales a partir del 4º ciclo de purificación en placas, y se expandieron para obtener las disoluciones madre P1 (1 x matraz T25), P2 (1 x matraz T75) y P3 (8 x frascos cilíndricos) amplificadas. Las células infectadas procedentes de los frascos cilíndricos se cosecharon y se concentraron para producir disoluciones madre de virus. El concentrado vírico se caracterizó llevando a cabo la hibridación mediante las elevaciones de placas con las sondas específicas de FMDV y C6 para confirmar una pureza genética del 100%. Se extrajo el ADN vírico y los análisis de la transferencia Southern y el análisis de la secuencia confirmaron la correcta inserción del casete de FMDV.

[0124] Para el análisis de la expresión, se infectaron CEF a una MOI de 10 con vCP2181 (ALVAC C6 I3Lp FMDV P1+3C; véase el Ejemplo 6) o vCP2186 (ALVAC C6 42Kp FMDV P1+3C) y se hicieron crecer a 37º C, en presencia de CO2 al 5%, durante 24 horas. Se cosechó el sobrenadante y se clarificó y se volvió a suspender la monocapa de células en PBS, y a continuación se aglomeraron. Los aglomerados se volvieron a suspender en agua, y a continuación se añadió SDS PAGE a los sobrenadantes. Las muestras de proteína se separaron en un gel de SDS PAGE al 10%, a continuación se electrotransfirieron a una membrana de nylon. La membrana se bloqueó, y a continuación se sondó con antisueros VP1, VP2, y VP3 dirigidos contra FMDV. El análisis de anticuerpos secundarios y colorimétrico desveló que ambos recombinantes expresaron proteínas específicas de tamaños consistentes con VP0, VP1 y VP3 en los aglomerados y sobrenadantes. En la Figura 30 se ilustran estos datos.

Ejemplo 8: Construcción de un plásmido donante pC6 7.5Kp FMDV P1+3C para la introducción de genes de FMDV en el único locus C6 de ALVAC

[0125] Se ha utilizado el promotor 7.5K temprano (7.5Kp) del virus vaccinia (Davison, A.J. y Moss, B. (1989) J. Mol. Biol. 210: 749-769) en avipox recombinantes.

[0126] Se utilizó el plásmido pHM-1119-1 (pUC FMDV, véase el Ejemplo 1) como el molde para la amplificación mediante la PCR del promotor 7.5K y los genes de FMDV, en el único sitio NdeI. Se utilizaron los cebadores 11357.CXL y 11358.CXL para amplificar un fragmento 7.5Kp 5’-FMDV de 1214 pb, que se clonó en pCR2.1, generando pHM-1249-5-3. En la Figura 21A se describen los cebadores de amplificación de la PCR.

[0127] El análisis de la secuencia desveló deleciones en tres pares de bases en pHM-1249-5-3. Se designaron los cebadores de oligonucleótidos 11429.HM y 11430.HM para volver a introducir los nucleótidos desaparecidos mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento. En la Figura 21B se describen los cebadores de la mutagénesis. Los clones resultantes contenían 2 de los 3 nucleótidos reintroducidos, de tal manera que el clon pHM-1267-4 se sometió a un ciclo adicional de mutagénesis dirigida al emplazamiento con los cebadores 11445.HM y 11446.HM. En la Figura 21C se describen los cebadores de la mutagénesis. Se confirmó que el clon pHM-1299-2 8pCR2.1 7.5Kp 5’-FMDV) era correcto mediante el análisis de la secuencia.

[0128] El fragmento EcoRI - NdeI de Ң 1.2 kb procedente de pHM-1299-2 se insertó en pCXL-1013-2 (pC6 FMDV, véase el Ejemplo 3), generando el plásmido pHM-1310-4 (pC6 7.5Kp FMDV P1+3C). En la Figura 22 se ilustra la construcción de pHM-1310-4 y en la Figura 23 se muestra la secuencia del casete del gen C6 7.5Kp de FMDV.

[0129] Se obtuvo el ALVAC recombinante vCP2189 tras dos ciclos de cribado, pero no se pudo purificar/amplificar y se perdió, sugiriendo que era inestable y/o tóxico.

Ejemplo 9: Construcción de un plásmido donante pC6 Pip FMDV P1+3C para la inserción de los genes de FMDV en el locus C6 único de ALVAC

[0130] El promotor Pi temprano (Pip) del virus vaccinia (Wachsman, M. y col, (1987) J. Infect. Dis. 155: 11881197) se ha utilizado anteriormente en avipox recombinantes. Tiene una longitud de 81 nucleótidos y se cree que es un promotor relativamente débil.

[0131] El plásmido pHM-1119-1 (pUC FMDV, véase el Ejemplo 1) se utilizó como molde para amplificar mediante la PCR el fragmento Pip 5’-FMDV, con los cebadores 11356.CXL y 11358.CXL (Figura 24A). El fragmento amplificado se clonó en pCR2.1 y se cribaron varios clones mediante análisis de secuencia. Al clon con el menor número de errores PCR (pHM-1249-4-4, pCR2.1 Pip* 5’-FMDV) le faltaban 28 nucleótidos aleatoriamente en la región del promotor Pi incluyendo el sitio de clonación EcoRI.

[0132] Los oligonucleótidos 11395.CXL y 11399.CXL (Figura 24B) se utilizaron para ensamblar el promotor correcto Pi. El Pip se amplificó mediante la PCR con los cebadores 11400.CXL y 11401.CXL (Figura 24C) y se clonaron en pCR2.1 para generar pHM-1263-1 (pCR2.1 Pip). El plásmido pHM-1263-1 se utilizó como molde para amplificar mediante la PCR un fragmento Pip 5’-FMDV de 97 pb, usando los cebadores 11402.CXL y 1140.CXL (Figura 24D). Este fragmento contiene el sitio de clonación EcoRI, el Pip de longitud completo y 10 pb of FMDV.

[0133] Usando pHM-1249-4-4 como molde, se amplificó un fragmento de 648 pb mediante PCR mediante los cebadores 11406.CXL y 11407.CXL (Figura 24E). Este fragmento contiene 10 pb del extremo 3’ de Pip y los genes 5’-FMDV hasta un único sitio KpnI.

[0134] Cantidades equimoleculares de los fragmentos de Pip 5’-FMDV de 97 pb y de 3’-Pip 5’-FMDV de 648 pb obtenidos mediante PCR se mezclaron y amplificaron mediante los cebadores 11402.CXL y 11407.CXL. El fragmento resultante de Pip 5’-FMDV (EcoRI -KpnI) de 745 pb se clonó en pCR2.1 para generar pHM-1268-1 (pCR2.1 Pip 5’-FMDV, EcoRI -KpnI). El fragmento EcoRI -KpnI procedente de pHM-1268-1 se insertó en pHM1119-1, generando pHM-1277-6 (pUC Pip de FMDV).

[0135] El fragmento EcoRI - NdeI Pip 5’-FMDV de 1252 pb procedente de pHM-1277-6 se insertó en el plásmido pCXL-1013-2 (pC6 FMDV P1+3C, véase el Ejemplo 3), generando el plásmido pHM-1284-25 (pC6 Pip FMDV P1+3C). La construcción de pC6 Pip FMDV P1+3C se ilustra en la Figura 25 y la secuencia del casete del gen C6 Pip de FMDV se muestra en la Figura 26.

[0136] El ALVAC recombinante vCP2184 se obtuvo tras dos rondas de purificación, pero se perdió en la tercera ronda de cribado/amplificación, lo que sugiere que era tóxico y/o inestable.

Ejemplo 10: Construcción de un plásmido donante pF8 H6p* FMDV P1+3C para la inserción en el casete del gen FMDV en el locus único F8 del poxvirus aviar

[0137] El plásmido pHM-1260-2 (pCR2.1 H6p* 5’-FMDV (Nde); véase el Ejemplo 5) se utilizó como molde para amplificar mediante la PCR un fragmento H6p* 5’-FMDV, con los cebadores 11506.HM y 11279.SL. El cebador 11506.HM fue diseñado para introducir un sitio Hind III frente a H6p* y el cebador 11279.SL fue diseñado para amplificar los genes de FMDV hasta un único sitio KpnI en el gen VP2. El fragmento de Ң 700 pb se clonó en el pCR2.1, generando pHM-1341-7 (pCR2.1 H6p* 5’-FMDV KpnI), que se confirmó era correcto mediante análisis de secuencia. La Figura 27 describe los cebadores de la PCR.

[0138] El plásmido pHM-1180-11 es pF8 H6p FMDV P1+3C, que contiene el promotor H6 de tipo natural (véase el Ejemplo 2 y la Figura 5). El plásmido pSL-6427-1-1 (pF8 MCS) es un plásmido con defecto de promotor, que se utiliza para inserción en el sitio F8 del poxvirus aviar. El fragmento HindIII-KpnI H6p* 5’-FMDV de 0,7 kb procedente de pHM-1341-7 y el fragmento KpnI BamH I 3’- FMDV de 2,7 kb procedente de pHM-1180-11 se ligaron en el plásmido pSL-6427-1-1 que se había digerido con HindIII y BamHI, generando pHM-1354-1 (pF8 H6p* FMDV P1+3C). La construcción de pHM-1354-1 se ilustra en la Figura 28 y la secuencia del casete del gen F8 H6p* FMDV P1+3C se muestra en la Figura 29.

[0139] Para generar un poxvirus aviar recombinante, los CEF primarios se transfectaron con pHM-1354-1 linealizado con NotI en presencia de un reactivo Fugene-6® (Roche). Las células transfectadas se infectaron posteriormente con el poxvirus aviar como virus auxiliar en MOI de 10 y después de 51 horas, las células transfectadas-infectadas se recogieron, se sonicaron y se utilizaron para cribar el virus recombinante. Las placas recombinantes se cribaron en función del método de hibridación con elevación de placa mediante una sonda específica de FMDV de 1,7 kb marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amersham nº de catálogo RPN3001). Tras cinco rondas de secuenciación de purificación de placa, se generó un poxvirus aviar recombinante designado como vFP2215.1.3.1.1., que se conformó mediante hibridación como 100% positivo para la inserción de FMDV y 100% negativo para el F8 ORF.

[0140] Placas individuales se seleccionaron de la 5ª ronda de purificación de placa, y se expandieron para obtener disoluciones madre de P1 (1 x frasco T25), P2 (2 x frasco T75) y P3 (10 x frascos cilíndricos) para amplificar vFP2215. Las células infectadas procedentes de los frascos cilíndricos se recogieron y se concentraron para producir una disolución madre de virus. El concentrado del virus se volvió a confirmar por hibridación mediante elevación de placa con sondas específicas de FMDV y F8. El ADN vírico se preparó, y se confirmó la inserción correcta del casete del gen de FMDV en el locus F8 de la viruela aviar mediante transferencia Southern y análisis de secuencia.

Ejemplo 11: Preparación y purificación de plásmidos

[0141] Para la preparación de los plásmidos previstos para la vacunación de animales, se puede utilizar cualquier técnica que posibilite obtener una suspensión de plásmidos purificados predominantemente en una forma superenrollada. Estas técnicas son bien conocidas de los expertos en la técnica. Se pueden mencionar en particular la técnica de lisis alcalina seguida por dos ultracentrifugaciones sucesivas con un gradiente de cloruro de cesio en presencia de bromuro de etidio, tal como se ha descrito en J. Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). También se puede hacer Referencia a las solicitudes de patente PCT WO 95/21350 y PCT WO 96/02658, que describen procedimientos para producir, a escala industrial, plásmidos que se pueden usar para vacunación. Para los fines de la fabricación de vacunas (véase el Ejemplo 11), los plásmidos purificados se resuspenden de forma que se puedan obtener disoluciones de una concentración elevada (> 2 mg/ml), que sean compatibles con el almacenamiento. Para hacerlo, los plásmidos se resuspenden bien en agua ultrapura o en tampón TE (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0).

Ejemplo 12: Fabricación de la vacuna asociada

[0142] Los diferentes plásmidos necesarios para la fabricación de una vacuna asociada se mezclaron a partir de sus disoluciones concentradas (Ejemplo 10). Las mezclas se prepararon de forma tal que la concentración final de cada plásmido corresponde a la dosis eficaz de cada plásmido. Las disoluciones que se pueden utilizar para ajustar la concentración final de la vacuna pueden ser bien una disolución de NaCl 0,9M, o bien tampón PBS buffer.

[0143] También se pueden utilizar formulaciones específicas como liposomas o lípidos catiónicos para la fabricación de vacunas.

Ejemplo 13: Vacunación de animales

[0144] Los animales se vacunaron con dosis de 100 pg, 250 !g o 500 !g por plásmido. Las inyecciones se realizaron con una aguja por vía intramuscular bien a la altura del músculo glúteo o bien a la altura de los músculos del cuello. La dosis de vacuna se administraron el volúmenes de entre 1 y 5 ml.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector de avipox recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) del virus de la fiebre aftosa (FMDV);

en el que el avipox es el poxvirus del canario o el poxvirus aviar;

en el que la molécula de ácido nucleico se inserta en un único sitio de inserción; y en el que la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) de FMDV está unido operativamente a una secuencia promotora en donde la secuencia promotora se ha seleccionado del grupo que consiste en el promotor I3L de vaccinia, el promotor 42K del poxvirus, y el promotor H6 de vaccinia en el que el promotor H6 de vaccinia se ha mutado de forma tal que los niveles de expresión del antígeno o antígenos de FMDV se han disminuido en comparación con los niveles de expresión del antígeno o antígenos de FMDV incluidos en un promotor H6 de vaccinia de tipo natural;

en el que, cuando el avipox es el poxvirus del canario, el vector de avipox es ALVAC, comprende un locus de inserción C6 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción C6 y el promotor está en orientación opuesta a las secuencias de flanqueo;

y en el que, cuando el vector de avipox es un poxvirus aviar, el vector del poxvirus aviar comprende un locus de inserción F8 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción F8
2.

El vector de avipox de la reivindicación 1, en el que el antígeno se ha seleccionado del grupo que consiste en VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, y 3C de FMDV.
3.

El vector de avipox de la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) del virus de la fiebre aftosa (FMDV) es un ADNc que codifica una región P1 de FMDV y un ADNc que codifica una proteasa 3C de FMDV.
4.

El vector de avipox de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que dicho promotor H6 de vaccinia mutado comprende la secuencia mostrada en la Figura 11.
5.

El vector de avipox de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que cuando el vector de avipox es ALVAC que comprende un locus de inserción C6, las secuencias de flanqueo del locus de inserción C6 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción C6.
6.

El vector de avipox de la reivindicación 5, en el que las secuencias de flanqueo comprenden las regiones de marco de lectura abierto C6L y C6R de avipox.
7.

El vector de avipox de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que cuando el vector de avipox es un poxvirus aviar vector que comprende un locus de inserción F8, las secuencias de flanqueo del locus de inserción F8 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción F8.
8.

El vector de avipox de la reivindicación 7, en el que las secuencias de flanqueo comprenden las regiones de marco de lectura abierto F8L y F8R de avipox.
9.

Un vector de avipox recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s)s del virus de la fiebre aftosa (FMDV);

en el que el avipox es el poxvirus del canario o el poxvirus aviar;

en el que la molécula de ácido nucleico se inserta en un único sitio de inserción; y en el que la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s) de FMDV está unido operativamente a una secuencia promotora en donde la secuencia promotora se ha seleccionado del grupo que consiste en el promotor I3L de vaccinia, el promotor 42K del poxvirus, y el promotor H6 de vaccinia en el que el promotor H6 de vaccinia se ha mutado de forma tal que los niveles de expresión del antígeno o antígenos de FMDV se han disminuido en comparación con los niveles de expresión del antígeno o antígenos de FMDV incluidos en un promotor H6 de vaccinia de tipo natural;

en el que, cuando el avipox es el poxvirus del canario, el vector de avipox es ALVAC, comprende un locus de inserción C6 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción C6 y el promotor está en orientación opuesta a las secuencias de flanqueo;

y en el que, cuando el vector de avipox es un poxvirus aviar, el vector del poxvirus aviar comprende un locus de inserción F8 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción F8
10.

El virus avipox de la reivindicación 9, en el que el antígeno se ha seleccionado del grupo que consiste en VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, y 3C de FMDV.
11.

El virus avipox de la reivindicación 9 o 10, en el que la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s)s del virus de la fiebre aftosa (FMDV) es un ADNc que codifica una región P1 de FMDV y un ADNc que codifica una proteasa 3C de FMDV.
12.

El virus avipox de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 en el que dicho promotor H6 de vaccinia mutado comprende la secuencia mostrada en la Figura 11.
13.

El virus avipox de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que cuando el vector de avipox es ALVAC que comprende un locus de inserción C6, las secuencias de flanqueo del locus de inserción C6 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción C6.
14.

El vector de avipox de la reivindicación 13, en el que las secuencias de flanqueo comprenden las regiones de marco de lectura abierto C6L y C6R de avipox.
15.

El virus avipox de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el vector de avipox es un poxvirus aviar que comprende un locus de inserción F8, las secuencias de flanqueo del locus de inserción F8 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción F8.
16.

El vector de avipox de la reivindicación 15, en el que las secuencias de flanqueo comprenden las regiones de marco de lectura abierto F8L y F8R de avipox.
17.

Uso de un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la preparación de un medicamento para desencadenar una respuesta inmune frente a FMDV en un sujeto.
18.

Uso de un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 en la preparación de un medicamento para desencadenar una respuesta inmune frente a FMDV en un sujeto.
19.

Un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 a usar para desencadenar una respuesta inmune frente a FMDV en un sujeto.
20.

A virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 para desencadenar una respuesta inmune frente a FMDV en un sujeto.
21.

Uso de un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de una infección por FMDV; y/o tratar y/o prevenir la fiebre aftosa.
22.

Uso de un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de una infección por FMDV; y/o tratar y/o prevenir la fiebre aftosa.
23.

Un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 a utilizar en el tratamiento y/o profilaxis de una infección por FMDV; y/o tratar y/o prevenir la fiebre aftosa.
24.

Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 a utilizar en el tratamiento y/o profilaxis de una infección por FMDV; y/o tratar y/o prevenir la fiebre aftosa.
25.

Un procedimiento para producir un vector de avipox recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno(s)s del virus de la fiebre aftosa (FMDV), que comprende las etapas de:

(a)

linealizar un plásmido donante con una endonucleasa de restricción, en el que el plásmido donante comprende sitios de escisión de la endonucleasa de restricción o un sitio de clonación múltiple; y

(b)

unir al menos una molécula de ácido nucleico que comprende

(i)

una secuencia de ácido nucleico codifica uno o más antígeno(s) de FMDV,

(ii)

una secuencia de un promotor vírico, y

(iii) secuencias de inserción que flanquean (i) y (ii) que tienen sitios de escisión de la endonucleasa de restricción complementarios del plásmido donante en los antígenos de FMDV,

produciendo de esta forma el vector de avipox recombinante; en el que el avipox es poxvirus del canario o poxvirus aviar;

en el que la molécula de ácido nucleico está insertada en un único sitio de inserción; y en el que la molécula de ácido nucleico está unida operativamente a una secuencia promotora en donde la secuencia promotora se ha seleccionado del grupo que consiste en el promotor I3L de vaccinia, el promotor 42K poxviral y el promotor H6 de vaccínica en el que el promotor H6 de vaccinia se ha mutado de forma tal que los niveles de expresión del antígeno

o antígenos de FMDV se han disminuido en comparación con los niveles de expresión del antígeno o antígenos de FMDV incluidos en un promotor H6 de vaccinia de tipo natural;

y

en el que, cuando el avipox es el poxvirus del canario, el vector de avipox es ALVAC, comprende un locus de inserción C6 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción C6 y el promotor está en orientación opuesta a las secuencias de flanqueo;

y en el que, cuando el vector de avipox es un poxvirus aviar, el vector del poxvirus aviar comprende un locus de inserción F8 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción F8.
26. El procedimiento de la reivindicación 25, que comprende además las etapas de:

(c)

introducir el vector en una célula que permita la replicación del vector; y

(d)

aislar el vector de la célula.
27.

El procedimiento de la reivindicación 25 o 26, en el que el antígeno comprende al menos uno de VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, y 3C de FMDV.
28.

El procedimiento de la reivindicación 25 o 26, en el que la molécula de ácido nucleico que codifica uno

o más antígeno(s)s del virus de la fiebre aftosa (FMDV) es un ADNc que codifica una región P1 de FMDV y un ADNc que codifica una proteasa 3C de FMDV.
29.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en el que cuando el vector de avipox es ALVAC que comprende un locus de inserción C6, las secuencias de flanqueo del locus de inserción C6 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción C6.
30.

El procedimiento de la reivindicación 29, en el que las secuencias de flanqueo comprenden las regiones de marco de lectura abierto C6L y C6R de avipox.
31.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en el que cuando el vector de avipox es un poxvirus aviar vector que comprende un locus de inserción F8, las secuencias de flanqueo del locus de inserción F8 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción F8..
32.

El procedimiento de la reivindicación 31, en el que las secuencias de flanqueo comprenden las regiones de marco de lectura abierto F8L y F8R de avipox.
33.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, en el que el vector comprende además un gen indicador.
34.

El procedimiento de la reivindicación 33, en el que el gen indicador se ha seleccionado del grupo que consiste en gen de resistencia a la neomicina, gen de resistencia a la ampicilina, lacZ ( -galactosidasa), luciferasa, y proteína de fluorescencia verde (GFP).
35.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 32, en el que la célula que permite el crecimiento del vector es un fibroblasto embriónico de pollo.