ES2410593T3 - Ácidos nucleicos y polipéptidos de lisavirus quiméricos - Google Patents

Abstract

Composición inmunógena que comprende un polipéptido quimérico codificado por una molécula portadora quecontiene una secuencia polinucleotídica, en la que dicha secuencia polinucleotídica comprende: - una secuencia que codifica una parte de una glicoproteína de lisavirus que contiene por lo menos el sitio IIIde la glicoproteína, y - una secuencia que codifica por lo menos una secuencia antigénica diferente al sitio III o sitio II de laglicoproteína de lisavirus seleccionada de entre el grupo constituido por secuencias de proteína antigénica, osu parte antigénica, a partir de otro virus de la rabia o virus relacionado con la rabia.

Description

Ácidos nucleicos y polipéptidos de lisavirus quiméricos.

La presente divulgación se refiere a ácidos nucleicos de lisavirus quiméricos, y polipéptidos y proteínas quiméricos codificados por estos ácidos nucleicos. Más particularmente, la divulgación se refiere a ácidos nucleicos y proteínas de lisavirus quiméricos que pueden ser utilizados en composiciones inmunógenas, tales como vacunas. Por lo tanto, la invención se refiere asimismo a moléculas portadoras para expresar los ácidos nucleicos de lisavirus quiméricos, procedimientos para producir proteínas y polipéptidos de lisavirus quiméricos,y procedimientos para tratar individuos para mejorar, curar o proteger contra la infección por lisavirus.

La rabia es una enfermedad encefalopática provocada por elementos del género Lyssavirus dentro de la familia Rhabdoviridae. La rabia infecta a todos los animales de sangre caliente e invariablemente es casi mortal en seres humanos si no son tratados. Con base a las comparaciones de secuencias nucleotídicas y análisis filogenéticos, el género de Lyssavirus se ha dividido en 7 genotipos (GT). GT1 incluye las cepas clásicas de vacuna y virus de rabia, mientras que GT2 a GT7 corresponden a virus relacionados con rabia que incluyen virus de murciélago de Lagos (GT2); virus de Mokola (GT3); virus de Duvenhage (GT4); lisavirus de murciélago europeo 1 (EBL-1: GT5); lisavirus de murciélago europeo 2 (EBL-2: GT6); y lisavirus de murciélago australiano (GT7).

En base en la antigenicidad, el género Lyssavirus se dividió primero en cuatro serotipos. Más recientemente, este género se dividió en dos grupos principales de acuerdo con la reactividad cruzada del anticuerpo neutralizante del virus (VNAb): El grupo 1 consiste en GT1, GT4, GT5, GT6, y GT7, mientras que el grupo 2 consiste en GT2 y GT3. Los virus del grupo 2 no son patógenos cuando se inyectan periféricamente en ratones. La virulencia de los lisavirus depende, al lo menos en parte, de la glicoproteína presente en el recubrimiento viral. De manera interesante, las glicoproteínas de los virus del grupo 2 muestran un alto grado de identidad, en la región que contiene aminoácidos que empeñan un papel importante en la patogenicidad, con la secuencia correspondiente de virus GT1 no virulentos (véase, por ejemplo Coulon et al., 1998, “An avirulent mutant of rabies virus is unable to infect motoneurons in vivo and in vitro”, J. Virol. 72:273-278).

La glicoproteína del virus de rabia (G) está compuesta de un dominio citoplásmico, un dominio transmembranario y un ectodominio. La glicoproteína es un trímero, con los ectodominios expuestos en la superficie del virus. El ectodominio está involucrado en la inducción de tanto la protección como la producción de VNAb después de la vacunación, tanto antes como después de la exposición al virus. Por lo tanto, se ha dado mucha atención a G en el desarrollo de vacunas de subunidad de rabia. De manera estructural, G contiene tres regiones, la región terminal del extremo amino (N-terminal), una región de “bisagra” o “enlazadora”, y la región terminal del extremo carboxílico (Cterminal). (Véase figura 1).

Como se ilustra en la figura 1, generalmente se piensa que el ectodominio de la glicoproteína (G) tiene dos sitios principales antigénicos, el sitio II y el sitio III, los cuales son reconocidos por aproximadamente 72,5% (sitio II) y 24% (sitio III) de anticuerpos monoclonales neutralizantes (MAb), respectivamente. El sitio II está localizado en la mitad terminal del extremo N de la proteína, y el sitio III está localizado en la mitad terminal del extremo C de la proteína. Las dos mitades están separadas mediante una bisagra flexible alrededor de la región lineal (aminoácido 253 a 257).

El ectodominio de G contiene además un sitio menor (sitio a), y varios epítopos reconocidos por MAbs individuales

(I: resto 231 de aminoácidos; V: resto 294, y VI: resto 264) (5, 10, 18, 21 ref. 2). El sitio II es conformacional y discontinuo (restos 34 a 42 de aminoácidos y restos 198 a 200 de aminoácidos, los cuales están asociados mediante puentes de disulfuro), mientras que el sitio III es conformacional y continuo (restos 330 a 338). La lisina 330 y arginina 333 en el sitio III juegan un papel importante en neurovirulencia, y pueden estar implicadas en el reconocimiento de receptores neuronales (véase, por ejemplo, Coulon et al., supra, y Tuffereau et al., 1998, “Neuronal cell surface molecules mediate specific binding to rabies virus glycoprotein expressed by a recombinant baculovirus on the surfaces of lepidopteran cells”, J. Virol. 72:1085-1091). Los sitios II y III parecen estar próximos entre sí en la estructura tridimensional, y expuestos en la superficie de la proteína (Gaudin, Y., 1997, “Folding of rabies virus glycoprotein: epitope acquisition and interaction with endoplasmic reticulum chaperones”, J. Viro. 71:3742-3750). Sin embargo, a pH bajo, la molécula de G toma una conformación inactiva de fusión en la cual el sitio II no es accesible para MAbs, mientras que los sitios a y III permanecen más o menos expuestos (Gaudin, Y. Et al., 1995, “Biological function of the low-pH, fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein (G): G is transported in a fusion-inactive state-like conformation”, J. Virol. 69:5528-5533; Gaudin, Y., et al., 1991, “Reversible conformational changes and fusion activity of rabies virus glycoprotein”, J. Virol. 65:4853-4859).

Además, varias regiones distribuidas a lo largo del ectodominio están involucradas en la inducción de células auxiliares T (Th) (MacFarlan, R. et al., 1984, “T cell responses to cleaved rabies virus glycoprotein and to synthetic peptides”, J. lmmunol. 133:2748-2752; Wunner, W. et al. 1985, “Localization of immunogenic domains on the rabies virus glycoprotein”, Ann. Inst. Pasteur, 136 E:353-362). Basándose en estas propiedades estructurales e inmunológicas, se ha sugerido que la molécula de G puede contener dos partes inmunológicamente activas, cada una potencialmente capaz de inducir tanto VNAb como células Th (Bahloul, C. et al., 1998, “DNA-based

immunization for exploring the enlargement of immunological cross-reactivity against the lyssaviruses”, Vaccine 16:417-425).

Las vacunas actualmente disponibles consisten o derivan principalmente de virus GT1, contra los cuales dan protección. Muchas cepas de vacunas no son efectivas contra GT4, y ninguna es efectiva contra GT2 o GT3. Sin embargo, la protección producida contra GT4 a 6 depende de la cepa de la vacuna. Por ejemplo, la protección de lisavirus de murciélago europeo (GT5 y GT6), cuyo aislamiento se ha hecho más frecuente en años recientes, mediante la cepa de vacuna de rabia PM (Pitman-Moore) no es muy robusta. La cepa PM induce una protección contra EBL1 (GT5) más débil que la protección que proporciona contra la cepa PV (virus de Pasteur).

Debido, en parte, a la importancia de la rabia en la salud mundial, existe una continua necesidad de proporcionar vacunas seguras, efectivas, y de acción rápida, y composiciones inmunógenas para tratar y prevenir esta enfermedad. Muchos enfoques distintos del uso de preparaciones de virus intactos se han propuesto y/o perseguido para proporcionar una composición inmunógena efectiva, y rentable específica para virus de rabia. Por ejemplo, como se discutió anteriormente, se han desarrollado vacunas de subunidad. También, se han propuesto vacunas con cierto valor que podrían generar una respuesta inmune a múltiples serotipos de rabia, así como otros diversos patógenos (Comisión Europea COST/STD-3, 1996 “Advantages of combined vaccines” Vaccine 14:693-700). De hecho, se ha dado a conocer recientemente el uso de una vacuna combinada de difteria, tétanos, tos ferina de células intactas, poliomielitis inactivada, y rabia (Lang J. et al., 1997, “Randomised Feasibility trial of pre-exposure rabies vaccination with DTP-IPV in infants” The Lancet 349:1663-1665). Las vacunas combinadas que incluyen rabia también se han utilizado para inmunización de perros (virus de moquillo, hepatitis, leptospirosis y parvocanino), gatos (virus de panleucopenia, calici- y parvo-felino) y ganado (virus de la glosopeda) (Pastoret, P-P. et al., 1997, “Vaccination against rabies” en Veterinary Vaccinology, Pastoret, P-P. et al., Eds. (Elsevier): 616-628 23).

Además, las vacunas producidas en cultivos de tejidos son costosas de producir a pesar de algunos intentos para reducir sus costes. Por consiguiente, las vacunas de ADN, las cuales son menos costosas de producir y ofrecen muchas ventajas, constituirían una alternativa valiosa. Los informes de vacunaciones de ADN incluyen inoculación en ratones con plásmidos que contienen el gen que codifica la glicoproteína de virus de la rabia (G). Dicha inoculación es muy potente induciendo respuestas inmunes humorales y celulares en asociación con la protección contra una exposición intracerebral (véase, por ejemplo, Lodmell, D. et al., 1998, ”DNA immunization protects nonhuman primates against rabies virus” Science Med. 4:949-952; Xiang, Z. et al.,1994, “Vaccination with a plasmid vector carrying the rabies virus glycoprotein gene induces protective immunity against rabies virus”, Virol. 199:132140 y Lodmell, D. et al., 1998, “Gene gun particle mediated vaccination with plasmid DNA confers protective immunity against rabies virus infection”, Vaccine 16, 115). La inmunización mediante ADN también puede proteger a primates no humanos contra rabia (Lodmell et al., 1998, supra).

Asimismo, Jallet C. et al 1999 (J. Virol., 73(1): 225-233) y Bahloul C. et al, 1998 (Vaccine, 1604) describen vectores plasmídicos que contienen secuencias polinucleotídicas que codifican el sitio III o el sitio II de la glicoproteína del lisavirus y el antígeno del lisavirus distinto de un sitio III o II, y sus usos como vacuna para inducir protección con la exposición a lisavirus.

Debido a que la administración de ADN plasmídico genera respuestas inmunes humorales y celulares, incluyendo producción de linfocitos T citotóxicos (CTL) (para un repaso, véase Donnelly, J. et al., 1997, “DNA Vaccines”, Annu. Rev. immunol. 15:617-648), y se basa en una tecnología versátil, la inmunización con ADN plasmídico puede ofrecer un prospecto satisfactorio para vacunas multivalentes. Sin embargo, se cree que el uso de una mezcla de plásmidos

o un plásmido individual que exprese varios antígenos induce problemas de interferencia tanto en niveles transcripcionales como inmunológicos (Thompson, S. et al., 1998, “Delivery of multiple CD8 cytotoxic cell epitopes by DNA Vaccination”, J. immunol. 160:1717-1723). Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar y producir vacunas a base de ADN multivalentes que sean efectivas contra rabia y otras diversas enfermedades; que sean seguras; y que sean rentables de producir y utilizar.

La presente divulgación proporciona secuencias de ácido nucleico quimérico que codifican polipéptidos quiméricos que inducen respuestas inmunógenas en los individuos. Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser expresados para proporcionar polipéptidos quiméricos que provocan una respuesta inmunitaria contra los virus de la rabia y/o relacionados con la rabia así como otros organismos o polipéptidos patógenos o de otro modo no deseables. Además, los ácidos nucleicos de la invención pueden provocar por sí mismos por lo menos una parte de la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, los ácidos nucleicos quiméricos de la invención pueden ser utilizados para preparar una composición inmunógena, que puede ser utilizada para tratar un individuo.

La presente divulgación proporciona una molécula portadora, tal como un vector de expresión de ADN, que comprende el ácido nucleico de la invención, que codifica un polipéptido quimérico. La molécula portadora de la invención se puede usar como una composición inmunógena, o como una parte de una composición inmunógena, para provocar la respuesta inmune deseada. La respuesta inmunitaria deseada puede ser una respuesta protectora contra los virus de la rabia o virus relacionados de la rabia, así como también contra otros organismos o polipéptidos. De este modo, las moléculas portadoras de la invención se pueden usar para obtener una composición

inmunógena, que se puede usar para tratar a un individuo. La molécula portadora también se puede usar para producir un polipéptido quimérico.

La presente divulgación proporciona así una proteína quimérica (de fusión) que es codificada por el ácido nucleico de la invención, o por una secuencia de ácidos nucleicos presente en la molécula portadora de la invención. La proteína quimérica puede ser utilizada para provocar una respuesta inmunógena en un individuo. La proteína de fusión comprende el determinante antigénico sitio III de una glicoproteína de lisavirus, y puede comprender otros sitios antigénicos de uno o varios otros polipéptidos. De este modo, el polipéptido quimérico de la invención se puede usar para obtener una composición inmunógena, que se puede usar para tratar a un individuo.

La presente divulgación proporciona además composiciones inmunógenas, que comprende vacunas, que provocan una respuesta inmunológica en los individuos a los que son administradas. La presente invención incluye composiciones inmunógenas que comprenden una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido quimérico (o de fusión), o el polipéptido quimérico así codificado, que provoca la respuesta inmunitaria. Las composiciones inmunógenas y vacunas de la presente invención proporcionan un nivel aumentado de la estimulación inmunitaria y la protección mejorada contra los virus de la rabia, y amplían el espectro de protección contra los virus relacionados con la rabia, que el proporcionado por las composiciones inmunógenas conocidas en la técnica. Las composiciones inmunógenas proporcionan asimismo múltiples sitios inmunogénicamente activos para la inducción de una respuesta inmunitaria contra los epítopos que no son de la rabia y los no relacionados con la rabia.

A partir de las formas de realización anteriores de la invención, resulta evidente que la presente invención proporciona asimismo un procedimiento para la producción de una proteína de fusión, y un procedimiento para la preparación de una composición inmunógena, tal como una vacuna. La composición inmunógena así preparada puede ser utilizada para tratar (por ejemplo, inmunizar) los individuos.

Se encuentra incluida en la divulgación la utilización del ácido nucleico, del polipéptido, y/o de la molécula portadora de la invención para provocar una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta inmunitaria protectora. Por lo tanto, la divulgación incluye la utilización de una vacuna que comprende el polinucleótido, el polipéptido, y/o la molécula portadora de la invención para tratar, profiláctica o terapéuticamente, un individuo. Por lo tanto, la invención incluye los procedimientos de tratamiento profiláctico, los procedimientos de tratamiento terapéutico y los procedimientos de tratamiento curativo.

Se han creado secuencias de ácidos nucleicos quiméricas que codifican polipéptidos quiméricos que inducen respuestas inmunógenas en individuos. Como se discutió anteriormente, se sabe en la técnica que el ADN puede producir tanto respuestas inmunes humorales como celulares. Al hacer esto, es posible que los propios ácidos nucleicos puedan inducir al menos parte de la respuesta inmunógena. Por lo tanto, según la exposición, los ácidos nucleicos quiméricos y las moléculas portadoras pueden proporcionar o promover una respuesta inmunógena cuando son utilizados según la invención.

Como se utiliza en la presente memoria, “quimérico” y “fusión” se utilizan de manera intercambiable y con referencia tanto a ácidos nucleicos como a polipéptidos. Estos términos se refieren a ácidos nucleicos y polipéptidos que comprenden secuencias que no se encuentran de manera natural asociadas entre sí en el orden o contexto en el cual son colocados de acuerdo con la invención. Por ejemplo, una glicoproteína quimérica puede comprender una región terminal del extremo C de una rabia GT1 y una región terminal del extremo N de una rabia GT3 o GT5. Además, un ácido nucleico quimérico puede comprender un segmento corto de una porción de un genotipo de rabia enlazado directamente a otro segmento del mismo genotipo, en el que los dos segmentos no son naturalmente adyacentes entre sí. De esta forma, un polipéptido o ácido nucleico quimérico o de fusión no comprende la secuencia natural de un virus de rabia en su totalidad, y puede comprender secuencias heterólogas (de otra cepa de lisavirus, o de otro organismo en conjunto). Las proteínas de fusión/quiméricas tienen los dos (o más) segmentos heterólogos unidos a través de enlaces peptídicos normales, mientras que los ácidos nucleicos de fusión/quiméricos tienen los dos (o más) segmentos heterólogos unidos a través de enlaces fosfodiéster normales.

En un aspecto de la exposición, los ácidos nucleicos quiméricos comprenden a) una secuencia que codifica el sitio III de una glicoproteína, b) una secuencia que codifica el dominio transmembranario (o una porción del mismo que sea funcionalmente equivalente al dominio transmembranario) de una glicoproteína, y c) una secuencia que codifica el dominio citoplásmico de la glicoproteína de un lisavirus. En las formas de realización preferidas de este aspecto de la exposición, los ácidos nucleicos quiméricos comprenden además una secuencia que codifica el sitio II de una glicoproteína de lisavirus. En las formas de realización la secuencia que codifica el dominio transmembranario (o porción del mismo) es una secuencia de una glicoproteína transmembranaria de un lisavirus. En otras formas de realización, la secuencia es de una glicoproteína transmembranaria distinta de una glicoproteína procedente de un lisavirus. Por ejemplo, puede ser de una glicoproteína de otro organismo, o de una proteína transmembranaria que no sea una glicoproteína. En las formas de realización, la secuencia que codifica el dominio transmembranario (o porción del mismo) y la secuencia que codifica el dominio citoplásmico son del mismo lisavirus. En las formas de realización de este aspecto de la invención, la secuencia que codifica el sitio III y el dominio citoplásmico son de la misma proteína, preferentemente una proteína de lisavirus, tal como una glicoproteína de lisavirus.

En una forma de realización preferida de este aspecto de la exposición, el ácido nucleico quimérico incluye secuencias que codifican una secuencia de sitio III de una glicoproteína de lisavirus, una secuencia de sitio II de una glicoproteína de lisavirus, un dominio transmembranario de una proteína transmembranaria , y un dominio citoplásmico de una glicoproteína de lisavirus. El dominio transmembranario puede ser de un lisavirus o de otro organismo. Resulta muy preferido que el ácido nucleico quimérico de la invención comprenda secuencias que codifiquen una proteína antigénica (o porción antigénica de la misma), especialmente entre las secuencias que codifican los sitios II y III.

Las secuencias que codifican el sitio II y sitio III son secuencias que abarcan el sitio II y sitio III de una glicoproteína de un lisavirus, respectivamente. En las formas de realización, la secuencia que codifica el sitio III no es idéntica a ninguna de las secuencias conocidas del sitio III de los lisavirus, pero muestra por lo menos 60% de identidad con una de las secuencias de lisavirus, que se extiende 30 pares de bases a cada lado de la secuencia de sitio III. Los análisis de secuencias y estudios filogenéticos se realizan utilizando diferentes paquetes: GCG (versión 8.1, 1994), CLUSTAL W (Thompson, 1994 #1040), PHYLIP (versión 3.5: Felseustein, 1993, #1042), y GDE (Genetic Data Environment, Versión 2.2: Institute Pasteur Scientific Computer Service - S.I.S).

En las formas de realización preferidas de este aspecto de la exposición, se describe que la secuencia de sitio III es la de la cepa PV del virus de la rabia, o muestra por lo menos 60% de identidad con esa secuencia de sitio III. Se obtienen resultados muy satisfactorios con los siguientes constructos, representados en la figura 1: PV-PV o PV III o EBL1-PV o MOK-PV. El módulo base debe de contener por lo menos una secuencia de PV III.

Se ha encontrado que la presencia del sitio III de las glicoproteínas del lisavirus mejora la inmunogenicidad de composiciones que comprenden la glicoproteína, o porciones de la misma. Por lo tanto, la presente divulgación incluye ácidos nucleicos quiméricos que comprenden una secuencia que codifica el sitio III de una glicoproteína de lisavirus que está enlazada funcional, operativa y físicamente a una secuencia homóloga o heteróloga que codifica un dominio transmembranario de secuencia natural o sintética que codifica una proteína transmembranaria (o una porción de la misma que sea funcionalmente equivalente al dominio transmembranario), y una secuencia que codifica un dominio citoplásmico (o una porción del mismo que sea suficiente para existir citoplásmicamente de manera estable) procedente de glicoproteína. Preferentemente, la glicoproteína es la de un virus, y particularmente la de un lisavirus. Las secuencias de ácidos nucleicos quiméricos pueden proceder todas del mismo lisavirus, se pueden seleccionar de diversos lisavirus, o pueden ser tanto de lisavirus como de otros virus y organismos. En las formas de realización preferidas, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el sitio III y el dominio citoplásmico son del mismo lisavirus.

Además, el ácido nucleico quimérico de la divulgación comprende una secuencia que codifica un polipéptido antigénico, o una porción antigénica del mismo, de otro virus u organismo (una secuencia heteróloga). Por ejemplo, el ácido nucleico quimérico puede comprender, además de los elementos antes expuestos, una secuencia que codifica un epítopo de leishmania, difteria, tétanos, poliomielitis, virus de la glosopeda, virus del herpes, virus de moquillo en caninos, parvovirus y virus de inmunodeficiencia felina. Alternativamente, o además, el ácido nucleico quimérico puede comprender una secuencia que codifica un antígeno tumoral. La secuencia que codifica el polipéptido heterólogo (o porción antigénica del mismo) se fusiona (en marco) con la secuencia codificante arriba detallada, en cualquier sitio que dé cómo resultado un producto funcional. De esta forma, el ácido nucleico quimérico de la invención proporciona la secuencia codificante para múltiples determinantes antigénicos, incluyendo, pero sin limitarse a, epítopos del virus de rabia.

Los ácidos nucleicos quiméricos de la divulgación se puede usar para obtener una composición inmunógena. La composición inmunógena puede constar esencialmente del ácido nucleico quimérico, o puede comprender el ácido nucleico quimérico además de otros componentes, incluyendo, pero sin limitarse a, adyuvantes, excipientes, estabilizadores, vectores supramoleculares como se describen en la patente europea nº 696.191 (Samain et al.), y antígenos. Los componentes normalmente incluidos en composiciones inmunógenas son bien conocidos por el experto en la materia, ya que son las técnicas para preparar composiciones inmunógenas , tales como vacunas. Por lo tanto, el experto en la materia puede conseguir la preparación de la composición inmunógena utilizando técnicas bien conocidas, sin indebida o excesiva experimentación.

En otro aspecto de la exposición, el ácido nucleico quimérico de la invención se encuentra presente como parte de una molécula portadora. El núcleo de la molécula portadora puede ser cualquier molécula que se sepa que es útil para mantener, y preferentemente expresar, un ácido nucleico que codifique un polipéptido heterólogo. El núcleo de la molécula portadora puede ser, por ejemplo, un plásmido, un fago, un fagómido, un cósmido, un virus o un cromosoma artificial de levadura (YAC). Dichas moléculas portadoras de núcleo también se denominan habitualmente como vectores o vectores de expresión, y son bien conocidas por el experto en la materia y están ampliamente disponibles al público. La molécula portadora de la divulgación se puede proporcionar como un ácido nucleico desnudo, o empaquetado, tal como en cubierta o caparazón viral. La molécula portadora se puede proporcionar como ADN o ARN. Las formas modificadas de estos dos ácidos nucleicos se incluyen dentro del alcance de la exposición. Preferentemente, la molécula portadora comprende secuencias que permiten la transcripción de los ácidos nucleicos quiméricos de la exposición. Estas secuencias están operablemente enlazadas con los ácidos nucleicos quiméricos de la invención (es decir, su operación/función afecta directamente a la

expresión del ácido nucleico quimérico). En las formas de realización, estas secuencias incluyen elementos reguladores que permiten la expresión controlada de los ácidos nucleicos quiméricos, de modo que la expresión de los ácidos nucleicos quiméricos se pueda regular, por ejemplo, retardando la expresión hasta que se desee, o expresando los ácidos nucleicos quiméricos en ciertos tejidos o tipos de células solamente. Dichos elementos de control son conocidos por el experto en la materia, y se pueden insertar o extraer de manera habitual de las moléculas portadoras según se desee o sea necesario, utilizando reactivos y técnicas de biología molecular bien conocidos.

En una forma de realización de la exposición, una molécula portadora según la invención comprende unos ácidos nucleicos que codifican a) el sitio III de la glicoproteína de un lisavirus, b) un dominio transmembranario de una glicoproteína (o una parte del mismo que es funcionalmente equivalente al dominio transmembranario), y c) una secuencia que codifica el dominio citoplásmico de la glicoproteína de un lisavirus. En las formas de realización preferidas de este aspecto de la exposición, la molécula portadora comprende además una secuencia que codifica el sitio II de una glicoproteína de lisavirus. En las formas de realización, la secuencia que codifica el dominio transmembranario (o una parte del mismo) es una secuencia de la glicoproteína de un lisavirus. En otras formas de realización, la secuencia es de una glicoproteína transmembranaria diferente a una glicoproteína de un lisavirus. En las formas de realización, la secuencia que codifica el dominio transmembranario (o una parte del mismo) y la secuencia que codifica el dominio citoplásmico son del mismo lisavirus. En las formas de realización, la secuencia que codifica el sitio III y el dominio citoplásmico es del mismo lisavirus. En una forma de realización preferida, la molécula portadora comprende además por lo menos una secuencia antigénica diferente al sitio III o al sitio II de un lisavirus. La(s) secuencia(s) antigénica(s) adicional(es) puede(n) ser de cualquier organismo e incluye(n), de manera no limitativa, las secuencias antigénicas de parásitos (por ejemplo leishmania), bacterias, virus, y células tumorales. La molécula portadora de la presente invención, proporcionando la región de la glicoproteína de lisavirus requerida para la inmunogenicidad mejorada (sitio III), permite la producción de una respuesta inmunitaria de nivel elevado a no únicamente los antígenos de lisavirus (sitios III y II), sino también al(a los) antígeno(s) fusionado(s) a las secuencias de lisavirus. La molécula portadora puede ser por lo tanto utilizada para provocar una respuesta inmunitaria a los múltiples antígenos de diferentes organismos.

La molécula portadora de la divulgación comprende preferentemente una secuencia quimérica que codifica un polipéptido quimérico que comprende por lo menos un determinante antigénico, que es el sitio III de un lisavirus. Más preferentemente, la molécula portadora comprende una secuencia quimérica que codifica un polipéptido quimérico que comprende el sitio III de un lisavirus y por lo menos un determinante antigénico diferente seleccionado de entre el grupo constituido por un antígeno del mismo lisavirus del que el sitio III es obtenido y un antígeno heterólogo. Los otros determinantes antigénicos incluyen, de manera no limitativa, los de parásitos, virus y bacterias patógenos, y los de las células tumorales. Las moléculas portadoras de la divulgación pueden ser utilizados para preparar una composición inmunógena. La composición inmunógena puede estar constituida esencialmente por la molécula portadora o puede comprender la molécula portadora además de otros componentes, que comprenden de manera no limitativa adyuvantes, excipientes, estabilizantes, vectores supramoleculares (documento EP 696.191, Samain et al.), y antígenos. Los componentes incluidos típicamente en las composiciones inmunógenas son bien conocidos por los expertos en la materia, ya que son técnicas para la preparación de composiciones inmunógenas, que incluyen las vacunas. La preparación de la composición inmunógena es un asunto rutinario que puede lograr el experto en la materia utilizando técnicas bien conocidas sin demasiada o excesiva experimentación y por lo tanto no requiere ser descrita en detalle en la presente memoria.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una proteína o polipéptido quimérico que es codificado y/o expresado por el ácido nucleico quimérico y/o la molécula portadora de la presente invención. El polipéptido quimérico comprende a) el sitio III de una glicoproteína de lisavirus, b) un dominio transmembranario de una glicoproteína (o una parte funcional del mismo), y c) un dominio citoplásmico de la glicoproteína de un lisavirus. En las formas de realización preferidas de este aspecto de la invención, los polipéptidos quiméricos comprenden además el sitio II de una glicoproteína de lisavirus. En las formas de realización, el dominio transmembranario (o una parte del mismo) es de la glicoproteína de un lisavirus. En otras formas de realización, el dominio transmembranario (o una parte del mismo) es de una glicoproteína transmembranaria diferente de una glicoproteína de un lisavirus. En otras formas de realización, el dominio transmembranario (o una parte del mismo) y el dominio citoplásmico son del mismo lisavirus. En las formas de realización, el sitio III y el dominio citoplásmico son del mismo lisavirus.

Los sitio II y sitio III se pueden obtener a partir de cualquier lisavirus, y ambos pueden proceder, pero no necesariamente, del mismo lisavirus. Además, la secuencia del sitio II y/o sitio III no tiene que ser idéntica a un sitio II o sitio III de una glicoproteína de un lisavirus. En las formas de realización, la secuencia de uno o ambos no es idéntica a ninguna de las secuencias de sitio II o sitio III conocidas de los lisavirus, pero muestra por lo menos 60% de identidad con una de las secuencias de lisavirus, que se extiende 10 restos a cada lado de la secuencia de sitio II

o sitio III.

En las formas de realización preferidas, el polipéptido quimérico de la divulgación comprende además por lo menos un determinante antigénico diferente al sitio III o al sitio II de la glicoproteína de lisavirus. El otro determinante antigénico puede ser una proteína antigénica, o su parte antigénica, a partir de otro virus de la rabia o virus relacionado con la rabia, a partir de otro virus, de un parásito, una bacteria, o cualquier otro organismo o célula que

expresa un determinante antigénico indeseable. Por lo tanto, la divulgación proporciona un polipéptido quimérico que comprende, como el único determinante antigénico, el sitio III de un lisavirus. Debido a que la antigenicidad depende, por lo menos hasta cierto punto, del individuo al que es administrada la composición inmunógena, un polipéptido quimérico que presente únicamente un determinante antigénico en un organismo puede presentar más de un determinante antigénico en otro. Sin embargo, según la invención, si un polipéptido quimérico presenta únicamente un determinante antigénico en por lo menos un individuo, a pesar del número que presenta en otros individuos, es un polipéptido quimérico según la forma de realización de la invención.

La divulgación también proporciona un polipéptido quimérico con múltiples antígenos que incluyen, pero no se limitan a, antígenos de la rabia. El polipéptido quimérico se puede utilizar como, o como parte de, una composición inmunógena, tal como una vacuna. Así, el polipéptido de la divulgación es un polipéptido inmunógeno que contiene por lo menos una región (la cual puede ser aislada como un fragmento) que induce una respuesta inmunógena. En las formas de realización en las que están presentes un sitio II, un sitio III, y otro determinante antigénico, se prefiere, aunque no necesariamente, que el otro determinante antigénico esté localizado entre el sitio II y sitio III en la secuencia de aminoácidos lineales (primarios) del polipéptido. Un antígeno preferido distinto del sitio II o sitio III es un antígeno tumoral de una célula tumoral.

Preferentemente, los ácidos nucleicos quiméricos, las moléculas portadoras y los polipéptidos quiméricos (las “moléculas”) de la divulgación se pueden aislar y/o purificar. Los términos “aislado” y “purificado” se refieren a un nivel de pureza que se puede conseguir utilizando tecnología actual. Las moléculas de la divulgación no necesitan ser absolutamente puras (es decir, no contienen absolutamente ninguna molécula de otras macromoléculas celulares), sino que deben ser suficientemente puras de modo que un experto en la materia reconozca que ya no están presentes en el entorno en el cual se encontraron originalmente (es decir, el medio celular). De esta forma, una molécula purificada o aislada según la divulgación es aquella que se ha eliminado de al menos alguna otra macromolécula presente en el entorno natural en el cual se encontró. Más preferentemente, las moléculas de la divulgación están esencialmente purificadas y/o aisladas, lo que significa que la composición en la cual están presentes está casi completamente, o incluso absolutamente, libre de otras macromoléculas encontradas en el entorno en el cual se encontraron originalmente las moléculas de la divulgación. De esta forma, el aislamiento y purificación no ocurre por adición o eliminación de sales, disolventes o elementos de la tabla periódica, sino deben incluir la eliminación de al menos algunas macromoléculas.

Como se puede apreciar a partir de la descripción anterior, la invención proporciona una composición inmunógena. La composición inmunógena puede comprender el ácido nucleico quimérico, la proteína quimérica, y/o la molécula portadora de la invención. Por ejemplo, los polipéptidos quiméricos de la invención se pueden utilizar para obtener una composición inmunógena. La composición inmunógena puede constar esencialmente del polipéptido quimérico,

o puede comprender el polipéptido quimérico además de otros componentes, incluyendo, pero sin limitarse a, adyuvantes, excipientes, estabilizadores, vectores supramoleculares (documento EP 696.191, Samain et al.) y antígenos. Los componentes normalmente incluidos en composiciones inmunógenas son bien conocidos por los expertos en la materia, ya que son las técnicas para la preparación de composiciones inmunógenas , tales como vacunas. Por lo tanto, el experto en la materia puede conseguir la preparación de la composición inmunógena utilizando técnicas bien conocidas, sin indebida o excesiva experimentación.

La composición inmunógena de acuerdo con la invención es una composición que provoca una respuesta inmune por lo menos para lisavirus. Debido a que los ácidos nucleicos quiméricos (y por lo tanto las moléculas portadoras y polipéptidos) de la divulgación pueden comprender determinantes antigénicos de los diversos genotipos de lisavirus en diferentes combinaciones, la composición inmunógena de la invención puede proporcionar un amplio espectro de protección contra lisavirus que inducen encefalomielitis, incluyendo virus de la rabia. Además, debido a que las secuencias que codifican múltiples epítopos de lisavirus se pueden incluir en un ácido nucleico quimérico, la composición inmunógena de la invención puede proporcionar una respuesta inmune a múltiples genotipos (que incluye a todos) de lisavirus. Preferiblemente, la composición inmunógena de la invención provoca una respuesta inmunitaria tanto celular como humoral.

Además, la composición inmunógena de la invención puede proporcionar epítopos procedentes no solamente de lisavirus, sino también de cualquier otro organismo (incluyendo antígenos producidos por células humanas, tales como antígenos no deseables encontrados en la superficie de células cancerosas). Esto permite la construcción de composiciones inmunógenas que incluyen, pero no se limitan a, vacunas que tienen amplia aplicabilidad, ya que una composición individual se puede utilizar para provocar una respuesta inmune a múltiples patógenos. Por ejemplo, se puede obtener una composición inmunógena que proporcione una respuesta inmunológica protectora frente a una amplia escala de lisavirus, mientras que al mismo tiempo proporciona una respuesta protectora frente a otros virus, tales como polio e influencia. Dicha composición inmunógena multivalente se proporciona por la naturaleza quimérica de los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención, así como la presencia del sitio III de un lisavirus, el cual confiere una fuerte respuesta inmunógena a los epítopos del polipéptido antigénico.

La composición inmunógena de la invención provoca una respuesta inmunógena en individuos a quienes se administra. La respuesta inmunógena puede provocar una respuesta inmune protectora, pero dicha respuesta no es necesaria. Según la invención, se hace referencia a las composiciones inmunogénas que provocan una respuesta

protectora como vacunas. Las respuestas inmunógenas se pueden potenciar, o de otra forma modificar, por la inclusión de componentes, además de los ácidos nucleicos quiméricos, proteínas quiméricas y moléculas portadoras de la invención. De manera alternativa, las composiciones inmunógenas pueden constar esencialmente de los ácidos nucleicos quiméricos, proteínas quiméricas y moléculas portadoras de la invención. La divulgación comprende vacunas de ADN que comprenden los ácidos nucleicos quiméricos y/o las moléculas portadoras de la invención.

La divulgación proporciona un procedimiento para obtener una composición inmunógena. En una forma de realización, el procedimiento comprende aislar y/o purificar el ácido nucleico o polipéptido quimérico o la molécula portadora. En otra forma de realización, el procedimiento comprende aislar el ácido nucleico o polipéptido o la molécula portadora, luego combinarlo con componentes adicionales. Los componentes adicionales pueden ser cualquier compuesto adecuado que no tenga un efecto adverso en la inmunogenicidad, seguridad o efectividad del ácido nucleico, polipéptido o molécula portadora de la invención. Los componentes adicionales incluyen pero no se limitan a compuestos y aditivos que se añaden típicamente a composiciones inmunógenas para aumentar la inmunogenicidad, estabilidad y biodisponibilidad. Dichos aditivos se describen anteriormente, y son conocidos por los expertos en la materia.

En una forma de realización de la invención, el procedimiento para obtener una composición inmunógena es un procedimiento para expresar un polipéptido (híbrido) quimérico para uso en la producción de una composición inmunógena. En esta forma de realización, el ácido nucleico quimérico o la molécula portadora de la invención se expresa (transcribe y traduce) de modo que se produce el polipéptido quimérico. El polipéptido quimérico así producido es entonces aislado y/o purificado hasta un nivel aceptable, de modo que se puede utilizar para obtener una composición inmunógena. La producción de una composición inmunógena en esta forma de realización de la invención es según la divulgación en la presente memoria. Como se utiliza en la presente memoria, un polipéptido es un polímero de aminoácidos, e incluye péptidos (más de 3 aminoácidos de longitud), y proteínas (más de 100 aminoácidos de longitud). La producción del polipéptido quimérico se puede realizar in vivo o in vitro. Preferiblemente, la producción ocurre in vivo mediante expresión en cultivos bacterianos o de tejido, y el polipéptido quimérico se aísla de esos cultivos utilizando técnicas conocidas de purificación de proteínas.

En un aspecto adicional de la invención, están previstos unos procedimientos para preparar el ácido nucleico quimérico, las moléculas portadoras y los polipéptidos quiméricos de la invención. Los procedimientos incluyen técnicas comúnmente conocidas de manipulación genética, que son bien conocidas por los expertos en la materia. Se puede utilizar cualquier técnica conocida, que sea practicada de manera normal por el experto en la materia, para producir y purificar las moléculas quiméricas de la invención. La novedad de la invención no reside en estas técnicas, sino en las moléculas quiméricas construidas a través del uso de las mismas. En este aspecto, los procedimientos se pueden utilizar para obtener un ácido nucleico o molécula portadora para uso en la producción de una composición inmunógena, tal como una vacuna de ADN. La invención incluye por lo tanto un procedimiento para preparar una composición para su utilización en una vacuna de ADN.

La divulgación proporciona asimismo procedimientos para tratar a individuos con las composiciones inmunógenas de la invención. Preferiblemente, el procedimiento es un procedimiento de vacunación. El procedimiento comprende administrar las composiciones inmunógenas a individuos, o pacientes, en necesidad de tratamiento, que se considera que necesitan tratamiento, o que desean tratamiento profiláctico (protector) para una enfermedad o trastorno. Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido de administración en este aspecto de la invención, incluyendo, pero sin limitarse a, inyección con jeringa y aguja (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intravenosa), administración oral o en mucosas, inhalación, administración tópica (por ejemplo, aplicación directa a la piel), y mediante supositorio.

En una forma de realización de este aspecto de la exposición, el procedimiento comprende administrar los ácidos nucleicos quiméricos de la invención a un individuo, en una cantidad suficiente para provocar una reacción inmunógena en el receptor. Preferiblemente, esta respuesta es una respuesta protectora. La cantidad de ácido nucleico necesaria para dicha inmunización se puede determinar por los expertos en la materia sin experimentación indebida o excesiva. Por ejemplo, se pueden administrar composiciones que comprendan los ácidos nucleicos quiméricos y moléculas portadoras de la divulgación en una cantidad de 40 a 100 μg, intramuscularmente, en una o varias inyecciones. Una dosis de 100 μg es generalmente útil para perros, y una dosis de 40 μg para ratones (con peso de 20 g).

En otra forma de realización de este aspecto de la exposición, el procedimiento comprende administrar los polipéptidos quiméricos a un individuo. Preferiblemente, la respuesta es una respuesta protectora. La cantidad de polipéptido necesaria para dicha inmunización se puede determinar por los expertos en la materia sin experimentación indebida o excesiva. Por ejemplo, se pueden administrar composiciones que comprendan los polipéptidos quiméricos de la divulgación en una cantidad de 1 a 10 μg, intramuscularmente, en una o varias inyecciones.

En otra forma de realización de este aspecto de la exposición, el procedimiento comprende administrar la molécula portadora de la divulgación a un individuo. Preferiblemente, la respuesta es una respuesta protectora. La cantidad de

molécula portadora necesaria para dicha inmunización la puede determinar el experto en la materia sin experimentación indebida o excesiva. Por ejemplo, se pueden administrar composiciones que comprendan las moléculas portadoras de la invención en una cantidad de 40 a 100 μg, intramuscularmente, en una o varias inyecciones.

Por lo tanto, este aspecto de la divulgación proporciona un procedimiento de vacunación de ADN. El procedimiento comprende asimismo administrar cualquier combinación de los ácidos nucleicos quiméricos, los polipéptidos quiméricos y la molécula portadora de la invención, a un individuo. En las formas de realización, el individuo es un animal, y es preferentemente un mamífero. Más preferiblemente, el mamífero se selecciona del grupo que consta de un ser humano, un perro, un gato, un bóvido, un cerdo y un caballo. En una forma de realización especialmente preferida, el mamífero es un ser humano.

Los procedimientos de tratamiento incluyen administrar composiciones inmunógenas que comprendan polipéptidos, pero también composiciones que comprendan ácido nucleicos (incluyendo la molécula portadora). Los expertos en la materia son conscientes del concepto, aplicación y efectividad de vacunas de ácidos nucleicos (por ejemplo, vacunas de ADN) y las tecnologías de las vacunas de ácidos nucleicos, así como de las tecnologías a base de polipéptidos y proteínas. La tecnología a base de ácidos nucleicos permite la administración de ácidos nucleicos, desnudos o encapsulados, directamente a tejidos y células, sin la necesidad de producir proteínas codificadas antes de la administración. La tecnología se basa en la capacidad de estos ácidos nucleicos para ser captados por células del organismo receptor y expresados para producir un determinante inmunógeno al cual responde el sistema inmune del receptor. Normalmente, los antígenos expresados se despliegan en la superficie celular de células que han captado y expresado los ácidos nucleicos, pero la expresión en y la exportación de los antígenos codificados al sistema circulatorio del individuo receptor se encuentran asimismo comprendidas dentro del alcance de la presente invención. Dicha tecnología de vacunas de ácidos nucleicos incluye, pero no se limita a, el suministro de ARN y ADN desnudo, y el suministro de vectores de expresión que codifican polipéptidos de interés (moléculas portadoras). Aunque la tecnología se denomina "vacuna", es igualmente aplicable a composiciones inmunógenas que no dan como resultado una respuesta protectora. Dichos procedimientos y composiciones que inducen la no protección están comprendidos en la presente invención.

Aunque está comprendido en la presente divulgación el suministro de ácidos nucleicos y moléculas portadoras como ácido nucleico desnudo, la presente divulgación comprende asimismo el suministro de ácidos nucleicos como parte de composiciones más grandes o más complejas. Entre estos sistemas de suministro se incluyen virus, partículas similares a virus, o bacterias que contienen el ácido nucleico quimérico o molécula portadora de la invención. También se incluyen dentro del alcance de la divulgación los ácidos nucleicos y moléculas portadoras de los complejos de la divulgación con compuestos permeabilizantes de células, tales como liposomas. Otros compuestos, vectores supramoleculares (documento EP 696.191, Samain et al.) y sistemas de suministro para vacunas de ácidos nucleicos son conocidos por los expertos en la materia, y se ejemplifican en los documentos WO 90 111092 y WO 93 06223 (patentes de Vical), y se pueden obtener y utilizar sin experimentación indebida o excesiva.

Los procedimientos para tratar individuos según la divulgación incluyen tratamiento profiláctico, tratamiento terapéutico y tratamiento curativo. El tratamiento profiláctico es el tratamiento de un individuo, utilizando los procedimientos de la exposición, antes de que se identifique cualquier signo clínico de enfermedad o infección. De esta forma, el tratamiento profiláctico es un tratamiento preventivo, e incluye vacunación. El tratamiento profiláctico también incluye el tratamiento que es instituido después del comienzo de la enfermedad o infección real, pero antes de que se observe otro signo clínico de la enfermedad o infección. El tratamiento terapéutico es el tratamiento de un individuo después de que se identifica por lo menos un signo clínico de enfermedad o infección, o después de que se sabe (o que se sospecha en gran medida) que un individuo ha sido expuesto a una cantidad de un agente suficiente para ocasionar enfermedad o infección. Los procedimientos de tratamiento terapéutico no necesariamente dan como resultado la eliminación de la enfermedad o infección; sin embargo, proporcionan una mejora clínicamente detectable en por lo menos un signo clínico de la enfermedad o infección. Los procedimientos de tratamiento curativo dan como resultado la eliminación completa de los signos clínicos de la enfermedad o infección en el individuo tratado. Se incluye en los procedimientos de tratamiento curativo aquellos que dan como resultado la eliminación completa del agente causante de la infección o enfermedad, ya sea éste un virus, bacteria, o célula hospedante (tal como una célula cancerosa). También se incluye en los procedimientos de tratamiento curativo aquellos que ocasionan remisión completa de una enfermedad, es decir, la eliminación completa de cualquier signo clínico externo de infección o enfermedad, y la represión de todas las manifestaciones clínicas detectables de la infección o enfermedad.

Con respecto a vacunación de la rabia, se sabe que el virus puede ser tratado tanto profiláctica (por ejemplo, mediante vacunación de perros) como curativamente (por ejemplo, mediante una serie de inyecciones a un ser humano previamente mordido por un perro rabioso). Por lo tanto, una forma de realización preferida de la presente invención es un procedimiento de vacunación de un individuo con una vacuna que comprende la composición inmunógena de la invención. Como se expuso anteriormente, la composición inmunógena de la invención puede comprender (o codificar) múltiples determinantes antigénicos. Por lo tanto, un procedimiento de la divulgación puede incluir múltiples tipos de tratamiento para múltiples tipos de enfermedades o infecciones. Por ejemplo, un

procedimiento individual de tratamiento puede comprender tratamiento profiláctico de la polio, tratamiento profiláctico y terapéutico de la rabia, y tratamiento profiláctico de la gripe.

Será evidente para los expertos en la materia que se pueden hacer diferentes modificaciones y variaciones en la construcción de las moléculas y en la puesta en práctica de los procedimientos de la invención sin apartarse del alcance de la invención. Ahora, la invención se describirá con más detalle con referencia a ejemplos específicos de la invención, que no están concebidos para ser, y no deberían interpretarse como, limitativos del alcance de la invención en ningún caso.

Breve descripción de los dibujos y tablas

La invención se describirá con más detalle con referencia a los dibujos, en los cuales:

La figura 1 representa glicoproteínas de lisavirus y construcciones quiméricas de glicoproteínas de lisavirus. SP péptido señal; TM - dominio transmembranario; S1 - restos de aminoácidos NL; S2 - restos de aminoácidos NS; S3 restos de aminoácidos LFAV.

(A)

Representación esquemática de glicoproteína (G) de PV de lisavirus, que indica regiones que abarcan el sitio II, el sitio III y los epítopos I, V y VI, así como también se presenta en la parte superior el dominio transmembranario (TM). Los polipéptidos quiméricos están ilustrados esquemáticamente en las otras líneas, con puntos de supresión y/o fusión indicados por números de restos. Los números son las posiciones de los restos de aminoácidos en la proteína madura (péptido señal escindido).

(B)

Secuencias de aminoácidos de los polipéptidos quiméricos en los sitios de fusión. La región lineal que porta el epítopo VI (aminoácido 264) se indica subrayando en los restos 251-275. Los cuadros negros y grises señalan las secuencias de EBL-1 y Mok, respectivamente. Las líneas punteadas representan aminoácidos similares a los de la secuencia de PV, y los puntos corresponden a espacios.

(C)

Representación esquemática de las secuencias insertadas que codifican el epítopo de poliovirus C3 involucrado en la inducción de anticuerpos neutralizantes del virus (B), y el epítopo de células CD8 H-2d (CTL) de la nucleoproteína del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) involucrado en la inducción tanto de linfocitos T citotóxicos (CTL) como en la protección contra la exposición a LCMV en la glicoproteina G de lisavirus truncada (GPVIII) y quimérica (GEBL1-PV).

(D)

También se da el análisis de la secuencia PEST putativa alrededor de la unión del extremo de la parte EBL1 y el comienzo del epítopo de células B.

(E)

Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de proteínas G de lisavirus seleccionados. La secuencia de consenso se presenta como la secuencia inferior. Los cuadros en gris claro indican los principales sitios antigénicos. Los cuadros en gris oscuro indican el péptido señal hidrófobo (SP) y el dominio transmembranario (TM). Los motivos subrayados NX(S/T) son sitios potenciales de N-glicosilación.

La figura 2 muestra microscopía de inmunofluorescencia indirecta de la producción de G de lisavirus en células Neuro-2a 48 horas después de la transfección transitoria con diversos plásmidos: pGPV-PV (A, B y C), pG-PVIII (D, E y F), pGEBL1-PV (G, H e I), pGMok-PV (J, K y L), y pGPV-Mok (M, N y O). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se permeabilizaron y tiñeron con anticuerpos: PAb anti-G del PV (A, D, G, J y M), MAb antisitio III de la G nativa del PV de PV D1 (B, E, H y K), MAb anti-sitio III de la G desnaturalizada de 6B1 (C y F), PAb anti-G de EBL-1 (I), PAb anti-G de Mok (L y N) y suero de un ratón no inmunizado (O).

La figura 3 muestra los resultados de un estudio cinético de síntesis de antígeno en células Neuro-2a transfectadas transitoriamente con pGPV-PV (a), pGEBL1-PV (b) o pG-PVIII (c). Las células se permeabilizaron a diferentes tiempos, y se tiñeron con PAb de PV (barra punteada) o MAb anti-sitio III de la G desnaturalizada de 6B1 (barra sombreada).

La figura 4 muestra los resultados de la inducción de células productoras de IL-2 mediante plásmidos que codifican diferentes G de lisavirus. Se inyectaron intramuscularmente ratones BALB/c (dos animales por cada uno de los plásmidos) (50 μl en cada músculo tibial anterior) con 40 μg de plásmido (pGPV-PV, pG-PVIII, pGEBL1-PV, pGMok-PV y pGPV-Mok). Se retiraron los bazos 21 días después, y los esplenocitos se estimularon específicamente in vitro mediante virus inactivados y purificados (PV, EBL1 o Mok), G PV, o se estimularon policlonalmente mediante concanavalina A (ConA). Luego, la cantidad de IL-2 liberada se analizó por triplicado mediante bioensayo, y los títulos se expresaron como U/ml.

La figura 5 muestra la inducción de VNAb contra genotipos de lisavirus Europeo mediante plásmido. Se inyectaron a ratones BALB/c con 40 μg de plásmido en el músculo tibial.

(A)

Inyección con pGPV-PV. Los ratones recibieron una revacunación en el día 30. Los sueros (conjunto de tres muestras) se analizaron en los días 27 y 40 para determinar VNAb contra virus de genotipos 1 (CVS y PV), 5 (EBL1b) y 6 (EBL2b).

(B)

Inyección con pGEBL1-PV. Cuatro ratones recibieron solamente una inyección de plásmido, y se recogieron muestras de sangre en diferentes intervalos mediante perforación transorbital. Los sueros se analizaron mediante RFFIT utilizando virus de PV y EBL1b para determinación de VNAb.

La figura 6 muestra protección comparativa inducida por plásmidos pGPV-PV, pGEBL1-PV y vacunas de PM y PV de la rabia, contra CVS, EBL-1b, y EBL-2b. Se inyectaron a ratones BALB/c (9 animales por serie) intraperitonealmente en los días 0 y 7 con 0,5 ml de vacuna de PM diluida 1/10° (círculos negros), o co n 2 μg de virus de PV inactivado y purificado (cuadros negros). Para las inmunizaciones a base de ADN, se inyectaron a ratones BALB/c (5 animales por cada plásmido) en el músculo tibial con PBS (círculos en blanco) o con 40 μg de diferentes plásmidos pGPV-PV (rombo), EBL1-PV (triángulo negros), cadena plasmídica de pClneo (cruz). Se inyectaron a ratones Suizos (6 animales) con pGPV-PV (cuadro blanco).

(a)

se inyectó virus inactivado. Los ratones BALB/c y Suizos se expusieron i.c. en el día 21 con aproximadamente 30 LD50 de CVS.

(b)

se inyectó virus inactivado. Los ratones BALB/c y Suizos se expusieron i.c. en el día 21 con aproximadamente 30 LD50 de EBL-1b.

(c)

se inyectó virus inactivado. Los ratones BALB/c y Suizos se expusieron i.c. en el día 21 con aproximadamente 30 LD50 de EBL-2b.

(d)

se inyectó ADN. Los ratones BALB/c y Suizos se expusieron i.c. en el día 21 con aproximadamente 30 LD50 de CVS.

(e)

d) se inyectó ADN. Los ratones BALB/c y Suizos se expusieron i.c. en el día 21 con aproximadamente 30 LD50 de EBL-1b.

(f)

d) se inyectó ADN. Los ratones BALB/c y Suizos se expusieron i.c. en el día 21 con aproximadamente 30 LD50 de EBL-2b.

La figura 7 muestra la microscopia de inmunofluorescencia indirecta de antígenos expresados en células Neuro-2a transfectadas con plásmidos.

(A)

las células se transfectaron con plásmido pGEBL1-(B-CTL)2-PV, y se tiñeron con D1 MAb de la rabia.

(B)

las células se transfectaron con plásmido pGEBL1-(B-CTL)2-PV, y se tiñeron con C3 MAb de poliovirus.

(C)

las células se transfectaron con plásmido pGEBL1-(B-CTL)2-PV, y se tiñeron con el PAb antipolivirus tipo

1.

(D) las células se transfectaron con plásmido pClneo, y se tiñeron con 1) D1 MAb de la rabia, 2) C3 MAb de poliovirus, o 3) PAb antipoliovirus tipo 1.

La figura 8 muestra la inducción de células productoras de IL2 mediante pGPVIII (A) o pGEBL1-PV (B) que portan epítopos de poliovirus y de LCMV. Se inyectaron a ratones BALB/c (dos animales para cada plásmido) i.m. (50 μg en cada músculo tibial anterior) con plásmidos. Se retiraron los bazos 14 días después, y los esplenocitos se estimularon in vitro a través de medio de cultivo celular (barra cruzada) específicamente mediante lisavirus inactivados y purificados (IPLV PV: barra fragmentada; IPLV EBL: sombras claras), o se estimularon policlonalmente mediante ConA (barra punteada). La cantidad de IL-2 liberada se analizó luego por triplicado mediante bioensayo, y los títulos se expresaron como U/ml.

(A)

Los plásmidos inyectados fueron plásmidos vacíos de pClneo, pGPVIII, y p(B-CTL)2-GPVIII.

(B)

Los plásmidos inyectados fueron pClneo, pGEBL1-PV, pGEBL1-(B)-PV, pGEBL1-(CTL)-PV, pGEBL1(CTL-B)-PV, pGEBL1-(B-CTL)2-PV.

La figura 9 muestra un estudio cinético en ratones BALB/c de producción de anticuerpos inducida por p(B-CTL)2-GPVIII o pGPVIII contra péptido de poliovirus y virus de rabia. Se inyectaron a tres ratones con 40 μg de p(B-CTL)2-GPVIII (cuadro y círculo), o pGPVIII (triángulo), o pClneo vacío (rombo). Después de perforación mediante vía retroorbital en diferentes tiempos, los sueros se analizaron mediante ELISA para determinar los anticuerpos contra péptido de poliovirus (cuadro y rombo) o el virus de rabia (círculo, triángulo y rombo).

La figura 10 muestra la influencia de un cebado en la producción de anticuerpos antipéptidos de poliovirus, inducida por p(B-CTL)2-GPVIII. Cinco grupos de tres ratones recibieron en el día 0 PBS (2 grupos), p(B-CTL)2-GPVIII (2 grupos), o pPVIII. Un grupo (inyectado con p(B-CTL)2-GPVIII) no se revacunó, mientras que el grupo inyectado con pPVIII se revacunó con p(B-CTL)2-GPVIII en el día 26. Un grupo (inyectado con p(B-CTL)2-GPVIII) se revacunó con p(B-CTL)2-GPVIII en el día 14. Todos los animales se controlaron en el día 39, mediante ELISA, para determinar la producción de anticuerpos antipeptídicos.

La figura 11 muestra la producción de anticuerpos neutralizantes del virus de rabia contra la cepa original del virus Challenge (CVS) después de la inyección del plásmido homogéneo completo pGPV en perros sabueso.

Grupo A: inyección de 100 μg de plásmido en un sitio en los días 0, 21, 42 y 175.

Grupo B: inyección de 33 μg de plásmido en tres sitios en los días 0, 21, 42 y 175.

Grupo C: inyección de 100 μg de plásmido en un sitio en los días 0 y 175.

Grupo D: inyección de disolución salina tamponada de fosfato (control).

La figura 12 muestra la respuesta de anticuerpos neutralizantes individuales contra un virus de rabia silvestre (zorro de Francia, virus de rabia silvestre del zorro FWR) después de inyección del plásmido homogéneo completo pGPV en perros sabueso. También se muestra la protección inducida contra una exposición intramuscular realizada en el día 175 con un virus de rabia silvestre aislado de perros rabiosos.

Perros nos. 1 a 3 = grupo A Perros nos. 4 a 6 = grupo B Perros nos. 7 a 9 = grupo C Perros nos. 10 a 12 = grupo D

La figura 13 muestra células N2A transfectadas con el plásmido DBL-3/PVHIII (Fugene, Roche Molecular Biochemicals) y fijadas con acetona (80%) durante 10 minutos en hielo. A) anti proteína de fusión DBL-3 GST de ratón (dilución 1/1000). B) Anti PVIII de conejo (dilución 1/400). Se muestran las reactividades de fondo vistas con el segundo anticuerpo conjugado a FITC. Esta figura muestra claramente que tanto las regiones DBL-3 como PVIII se expresaron de manera eficiente en la membrana de las células transfectadas.

Ejemplos

Para los ejemplos, se utilizaron los siguientes materiales y métodos, excepto que se especifique de otro modo.

Se adquirieron ratones BALB/c hembras (H-2d BALB/c), de 6 a 8 semanas, y ratones Suizos (14 a 16 g) de “Centre d'Elevage et de Recherche” Enero (Legenest St Isle, Francia).

Células y lisavirus. Las células BHK-21 utilizadas para la producción y titulación de lisavirus se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM) de Eagle que contiene suero fetal bovino al 5% (FBS) y suero de becerro recién nacido al 5% (Perrin, P., 1996, “Techniques for the preparation of rabies conjugates”, en Laboratory techniques in rabies, Meslin, F-X., Kaplan, M., y Koprowski, H. Eds., (WHO Ginebra): 433-445). Las células de neuroblastoma (Neuro-2a) utilizadas para estudios de transfección con plásmidos se cultivaron en MEM que contiene FBS al 8%.

La línea celular T citotóxica dependiente de interleuquina-2 (IL-2) (CTLL) se cultivó como se describe anteriormente (Perrin, P. et al., 1988, “Interleukin-2 increases protection against experimental rabies”, Immunobiol. 177:199-209) en medio RPMI-1640 (Gibco: Flowbio, Courbevoie, Francia) que contiene FBS al 10%, 1 mM de piruvato de sodio, 1 mM de aminoácidos no esenciales, 5x10-5 M 2-mercaptoetanol, tampón HEPES (Flow Laboratories, Bethesda, USA), y 5 a 10 unidades (para 1x104 células) de IL-2 de rata (sobrenadante de esplenocitos estimulado con concanavilina

A: Con A). Las células se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada que contiene 7,5% CO2.

Se multiplicaron (se hicieron pasar) cepas de la rabia de virus fijo PV-Paris/BHK-21, CVS, así como cepas de virus relacionados con la rabia (EBL1b, EBL2b, LCMV, y Mok), en células BHK-21 como se describe anteriormente por Perrin, P., 1996, más arriba. Los lisavirus de murciélago Europeo utilizados fueron EBL1b (número de cepa 8916FRA), derivads de un aislado de murciélago de Francia, y EBL2b (número de cepa 9007FIN, un obsequio de H. Bouhry), aislado de un ser humano en Finlandia (Amengal, B. et al., 1997, “Evolution of European bat lissaviruses”,

J. Gen. Virol. 78:2319-2328). La cepa Arm/53b de LCMV fue provista amablemente por Drs. M. Oldstone y M. McChesney (Scripps Clinic, La Jolla, CA).

Antígenos y vacunas del virus de rabia. Los lisavirus inactivados y purificados (IPRV) se prepararon como se describe por Perrin, P., 1996, más arriba. Los virus se purificaron a partir de sobrenadantes de células infectadas inactivadas (β-propiolactona) y clarificadas, mediante ultracentrifugación a través de un gradiente de sacarosa. La glicoproteína de PV se solubilizó a partir de IPRV, y se purificó (G PV) como se describe anteriormente por Perrin,

P., 1996, más arriba, y Perrin, P., et al., 1985, “Rabies immunosomes (subunit vaccine) structure and immunogenicity”, Vaccine, 3:325-332.

Los dos virus de la rabia inactivados utilizados para estudios de protección comparativos se prepararon con dos cepas diferentes: 1) PM como vacuna comercial para uso humano; (Pasteur Vaccins Mames-la Coquette Francia; Lote Y0047); 2) PV como vacuna para uso en laboratorio (IPRV).

Construcción de plásmidos que expresan genes de G de lisavirus. Se seleccionó la región (aminoácidos 253275) que solapa el único epítopo no conformacional (VI) (Figura 1) para la construcción de genes quiméricos, debido a que supuestamente está estructuralmente menos limitada que los dos sitios II y III antigénicos principales. Los genes de G de lisavirus homogéneos y quiméricos (véase la figura 1) se introdujeron en el vector de expresión eucariótico pClneo (Promega), se propagaron y se amplificaron en cepa DH5α de E. coli mediante protocolos de clonación molecular estándares, bien conocidos por el experto en la materia. Los plásmidos pGPV-PV y pGMok-PV se prepararon como se describe anteriormente (Bahloul, C., et al., 1998, “DNA-based immunization for exploring the enlargement of immunological cross-reactivity against the lyssaviruses”, Vaccine 16:417-425). Los plásmidos pGPV-Mok, pG-PVIII y pGEBL1-PV se obtuvieron de la siguiente manera.

Para pGPV-Mok, la secuencia codificante de la parte del sitio II de G PV (aminoácidos 1-257) se amplificó mediante RT-PCR utilizando cebadores degenerados:

PVXbal: (SEQ ID NO.: 1)

PVBc/I: (SEQ ID NO.:2)

El producto de PCR se insertó en el sitio Smal de pUC19, después se cortó con Bc/I y EcoRI, y se ligó entre los mismos sitios en pGMok-Mok, dando pGPV-Mok, que contiene una fusión en marco de aminoácidos 1-257 de G PV con aminoácidos 258-503 de G Mok.

El gen de pG-PVIII, con una supresión en marco interno entre el extremo del péptido señal de PV y el resto 253, se obtuvo introduciendo un adaptador sintético entre los sitios de restricción EcoRI y Bc/I del plásmido pGMok-PV. Este adaptador de PV, que contiene un solo sitio EcoRl, se generó hibridando 200 picomoles de cada cebador en 250 mM de Tris-HCI pH 7,7. El plásmido pG-PVIII se depositó el 22 de diciembre de 1998 en el Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Paris, Francia, y se le dio el número de acceso I-2115.

PVp1: (SEQ ID NO.: 3)

Pvp2: (SEQ ID NO.4)

Para generar el gen de pGEBL1-PV, se generó un adaptador sintético que corresponde a los aminoácidos 2-14 de EBL-1a (cepa 8615POL) (1) y sitios de restricción BestEll y EcoRl individuales, de la misma manera que aquella para pG-PVIII, mediante hibridación con:

EBL1p1: (SEQ ID NO.: 5)

EBL1p2: (SEQ ID NO.: 6)

Este adaptador de EBL1 se ligó en marco en el sitio EcoRl de pG-PVIII. Se generó entonces un fragmento que corresponde a los aminoácidos 15-253 de EBL-1a (cepa 8615POL), mediante RT-PCR de ARN viral, utilizando cebadores EBL1 p3 y EBL1 p4:

EBL1p3: (SEQ ID NO.: 7)

EBL1p4: (SEQ ID NO.: 8)

El producto de RT/PCR se digirió con BstEll y EcoRl, y se ligó en los mismos sitios introducidos mediante el adaptador de EBL1, dando como resultado una fusión en marco entre el péptido señal de PV, la parte EBL1a del sitio II y la parte del sitio III de PV. La identidad de cada constructo se confirmó mediante secuenciación automática con reacción de terminador con colorante sobre un secuenciador ABI 377 (Perkin-Elmer). El pEBL1-PV se depositó en el CNCM el 22 de diciembre de 1998, y se le asignó el número de acceso 1-2114.

Inserción de epítopos de células B y CD8 extrañas en genes de G truncados o quiméricos. Los genes truncado (pGPVIII) y quimérico (pGEBL1-PV), dados a conocer anteriormente, que contienen un sitio de clonación EcoRl único, se utilizaron para la inserción de epítopos de células B y CD8 extrañas. Los genes de G de lisavirus se introdujeron en le vector de expresión eucariótico pClneo (Promega), se propagaron y se amplificaron en cepa DH5α de Eschericia coli mediante protocolos estándares de clonación molecular.

Los epítopos de las células B y CD8 se insertaron en el sitio de restricción EcoRl de los genes de G de lisavirus truncados o quiméricos, en la región de bisagra (aminoácidos 253 a 275) de la molécula en la posición 253. El epítopo de células B (denominado *B+) correspondió al fragmento C3 (aminoácidos 93 a 103: DNPASTTNKDK: SEQ ID NO: 9) de la proteína del poliovirus VP1. El epítopo de células CD8 (denominado *CTL+) correspondió a los

aminoácidos 119-127 (PQASGVYMG: SEQ ID NO:10) o a los aminoácidos 117-132 (ERPQASGVYMGNLTAQ: SEQ ID NO:11) de la nucleoproteína del virus de la coriomeningitis linfocítica. Los plásmidos p(B-CTL)2-GPVIII, pGEBL1(B)-PV, pGEBL1-(CTL)-PV, pGEBL1-(B-CTL)-PV, pGEBL1-(B-CTL)2-PV, y pGEBL1-(CTL-B)-PV se obtuvieron de la siguiente manera (véase también la figura 1):

El gen de P(B-CTL)2-GPVIII se generó mediante clonación de dos etapas de un adaptador sintético en el sitio de restricción EcoRI único, hibridando 200 picomoles de cada uno de los cebadores:

*B-CTLP1+: (SEQ ID NO:12)

*B-CTLp2+: (SEQ ID NO:13)

Para pGEBL1-(B)-PV, pGEBL1-(CTL)-PV, los adaptadores sintéticos utilizados para la inserción fueron respectivamente:

B: Bp3+: (SEQ ID NO: 14) *Bp4+: (SEQ ID NO: 15) CTL: CTLp5+: (SEQ ID NO: 16) *CTLp6+: (SEQ ID NO:17).

Para la construcción de los plásmidos pGEBL1-(B-CTL)-PV y pGEBL1-(CTL-B)-PV, se utilizaron pGEBL1-(B)-PV y pGEBL1-(CTL)-PV en las mismas condiciones como anteriormente para insertar las secuencias de CTL y B, respectivamente, en los genes quiméricos.

La identidad de cada constructo se confirmó mediante secuenciación automática con reacción de terminador con colorante en un secuenciador ABI 377 (Perkin-Elmer).

Experimentos de expresión transitoria. La capacidad de los plásmidos para inducir la expresión transitoria de antígenos relacionados con G se estudió después de la transfección de células Neuro 2a utilizando el procedimiento mediado por liposomas catiónicos DOTAP, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim). Cada pocillo de una microplaca de cultivo celular (Falcon) se inoculó con 3 x 104 células (en MEM, 10% FBS), y se incubó durante 24 horas a 37°C en una atmósfera hum idificada que contiene 7,5% de CO2. La placa se lavó entonces con MEM sin FBS, y se incubó como antes durante 1 hora. El sobrenadante celular se eliminó, y los pocillos se lavaron y se llenaron con un volumen total de 50 μI de disolución de transfección, la cual contiene 0,1 μg de plásmido y 6 μl de DOTAP (metilsulfato de (N-(1-2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio) en disolución salina estéril tamponada con HEPES (150 mM de NaCI, 20 mM de HEPES) incubada previamente a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las placas se incubaron durante 5 horas a 37°C en presencia de 7,5% de CO 2. Se añadieron a cada pocillo 200 μl de MEM que contiene FBS al 2%, y la placa se incubó durante 24 a 140 horas en las mismas condiciones, antes del análisis de la expresión transitoria mediante inmunofluorescencia indirecta.

La capacidad de los plásmidos para inducir la expresión transitoria de G y antígenos extraños relacionados se estudió después de la transfección de células Neuro 2a utilizando el reactivo de transfección FuGENE 6, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim). Cada pocillo de una cámara Labtek de cultivo celular Nunc (Life Technologies) se inoculó con 3 x 104 células (en MEM, 10% FBS), y se incubó durante 24 horas a 37°C en una atmósfera humedecida que contiene 7,5% de CO2. Las placas se lavaron entonces con MEM sin FBS, y los pocillos se llenaron con 50 μl de disolución de transfección: 0,1 μg de plásmido, 3 μl de reactivo de transfección FuGENE 6, y 47 μl de medio. La placa se incubó durante 18 horas a 37°C en presencia de 7,5% de CO 2. Se añadieron a cada pocillo 200 μl de MEM que contiene 5% FBS, y la placa se incubó otras 24 horas en las mismas condiciones, antes del análisis de la expresión transitoria mediante inmunofluorescencia indirecta.

Anticuerpos. Los anticuerpos policlonales (PAb) dirigidos contra PV y Mok G se obtuvieron como se describe por Perrin, P., 1996, “Techniques for the preparation of rabies conjugates”, en Laboratory techniques in rabies, Meslin, F-X., Kaplan, M., y Koprowski, H., Eds. (WHO Ginebra):433-445, mediante inmunización de conejo con glicoproteína de virus purificado. El PAb contra el virus EBL-1b se obtuvo mediante inmunización de ratón con virus inactivado y purificado.

También se utilizaron tres anticuerpos monoclonales (MAb) dirigidos contra PV G. El PVE12 MAb (un MAb desarrollado por M. Lafon et al., 1985 “Use of a monoclonal antibody for quantitation of rabies vaccines glycoprotein by enzyme immunoassay”, J. Biol. Standard 13:295-301) reconoce el sitio II de G nativa. El D1 MAb (isotipo IgG 1), producido en nuestro laboratorio, reconoce el sitio III de G nativa, pero no de G tratada con SDS. El 6A1 MAb (un MAb reportado en 18 de 2) reconoce la proteína G desnaturalizada con SDS, y más precisamente dos péptidos localizados en dirección 3’ del sitio III, cerca de la parte COOH terminal del ectodominio de G (aminoácidos 342-433 y 397-450).

Microscopía de inmunofluorescencia. La expresión transitoria de antígenos de G en células transfectadas se calculó con y sin permeabilización (30 minutos de incubación con acetona al 80% sobre hielo, seguido del secado

por aire). Las células transfectadas se incubaron durante 1 hora a 37°C con PAb o MAb. Se lavaron con PBS, y se incubaron durante 1 hora a 37°C con anticuerpo secu ndario conjugado con anti-FITC de conejo o de ratón (Nordic Immunol. Labs, Países Bajos). Las células se lavaron, se montaron en glicerol, y se examinaron en un microscopio de fluorescencia invertida Leica.

Dos anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra PV G (D1 MAb isotipo IgG 1) y poliovirus (C3 MAb) se utilizaron para tinción de antígeno mediante inmunofluorescencia indirecta (IIF). D1 MAb reconoce el sitio III de G nativa pero no de G tratada con SDS, y C3 MAb reconoce la región 93-103 de la proteína VP1 de cápsida de PV-1. También se utilizó un anticuerpo policlonal neutralizante de conejo, dirigido contra el poliovirus tipo 1 nativo.

La expresión transitoria se evaluó después de la fijación de paraformaldehído al 3% (Sigma) (20 minutos de incubación a temperatura ambiente) sin permeabilización. Las células fijas fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente con MAb. Se lavaron con disolución salina tamponada con fosfato (PBS), y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo secundario conjugado con anti-FITC de ratón o de conejo de cabra (Nordic Immunol. Labs, Países Bajos). Las células se lavaron, se montaron en Mowiol (Sigma) y se examinaron en un microscopio de fluorescencia invertida Leica.

Análisis de secuencia PEST putativa. Las secuencias PEST polipeptídicas, implicadas potencialmente en la degradación rápida de proteína, se analizaron con el programa de ordenador de búsqueda PEST desarrollado de acuerdo con Rogers, et al., 1986, “Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hipótesis”, Science 234: 364-369.

Inyección de plásmidos en ratones. Para estudios inmunológicos, se anestesiaron ratones BALB/c con pentobarbital (30 mg/kg) y se inyectaron 20-50 μg de plásmido (diluido en PBS) en cada músculo tibial anterior. Esto fue más efectivo que la inyección a través de la ruta de cuadriceps (observación personal). Se recogió sangre para el ensayo de anticuerpo de suero, durante varios días mediante perforación retro-orbital.

Para estudios de protección contra LCMV, los ratones recibieron 3,5 μg de cardiotoxina (Laoxan A.P., Les Ulis, Francia) en cada pata, cuatro días antes de la anestesia y de la inmunización para degenerar el músculo.

Ensayo de liberación de interleuquina-2. Catorce días después de la inyección, los bazos se retiraron de los ratones BALB/c sin tratamiento, o de los inyectados con plásmido. Los esplenocitos (alícuotas de 1 ml que contienen 6x106) se estimularon con 0,5 μg de antígeno de lisavirus (por ejemplo, IPLV-PV e IPLV-EBL1) o 5 μg de concanavilina A (Miles), en placas de 24 pocillos (Nuclon-Delta, Nunc), y se cultivaron de acuerdo con procedimientos estándar en medio de RPMI-1640 (Gibco) que contiene 10% FBS, 1 mM de piruvato de sodio, 1 mM de aminoácidos no esenciales, 5x10-6 M de 2-mercaptoetanol, 10 mM de tampón HEPES (Flow Laboratories). Las células se incubaron durante 24 horas a 37°C en una atmósfera humedecida que contiene 7% de CO2. En estas condiciones, las células que producen IL-2 son principalmente células CD4+. La IL-2 producida en sobrenadantes de cultivos de esplenocitos se tituló mediante bioanálisis utilizando células CTLL como se describe anteriormente por Perrin, P. et al., 1996, “The antigen-specific cell-mediated immune response in mice is suppressed by infection with pathogenic lyssaviruses”, Res. Virol. 147:289-299. La proliferación celular se determinó por triplicado, basándose en la absorción de 3H-timidina (New England Nuclear). La concentración de IL-2 se determinó como unidades por ml (U/ml), utilizando IL-2 recombinante de ratón (Genzyme Corporation, Cambridge, MA, USA) como referencia. Las células CTLL crecieron en presencia de IL-2 de ratón y anticuerpos anti-IL-4, pero no en presencia de IL-4 (hasta 10 U/ml), y en ausencia de IL-2. De esta manera, la IL-2 se detectó de manera predominante mediante esta técnica.

Ensayos de anticuerpo. Para el ensayo de anticuerpos de suero, se recogió sangre durante varios días mediante perforación retro-orbital. Se tituló IgG de rabia mediante ensayo inmunoabsorbente enlazado con enzima (ELISA), utilizando microplacas recubiertas con glicoproteína de rabia purificada. El título correspondió a la dilución reciproca de la muestra de suero que da la densidad óptica equivalente al doble de la dada por el suero (diluido 1/20) de ratones inyectados con PBS. Los isotipos totales anti-IgG o IgG1, IgG2a e IgG3 de la rabia se analizaron mediante ELISA utilizando microplacas recubiertas con IPRV como se describe anteriormente por Perrin, P. et al., 1996, “The influence of the type of immunosorbent on rabies antibody EIA; advantages of purified glycoprotein over whole virus”,

J. Biol. Standard. 14:95, con sueros de isotipo anti-IgG de ratón de conejo como el anticuerpo secundario (Nordic Immunol. Labs, Países Bajos) y un conjugado de peroxidasa anti-IgG de conejo de cabra (Nordic Immunol. Labs, Países Bajos) como el anticuerpo terciario.

Los anticuerpos neutralizantes de lisavirus se titularon mediante la prueba de inhibición de foco fluorescente rápido (RRFFIT) (descrita por Smith, J. et al., 1996, “A rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) for determining virusneutralizing antibody”, en Laboratory techniques in rabies, cuarta edición (Eds. Meslin, F-X; Kaplan, M y Koprowski, H) WHO, Ginebra.: 181-189), con las modificaciones descritas anteriormente de Perrin, P. et al., 1986, J. Biol. Standard. 14:95. Se usaron los sobrenadantes de células infectadas (virus PV, CVS y EBL2) y virus purificados (virus Mok y EBL1). Los títulos de anticuerpo anti-PV o CVS se expresan en unidades internacionales por ml (IU/ml), utilizando el Segundo Estándar Internacional (Statens Seruminstitut, Copenhague, Dinamarca) como referencia. Para la determinación del título del anticuerpo contra otros lisavirus, la dilución de suero que provoca 50% de

inhibición de la velocidad de enfoque fluorescente se definió como la que tiene el mismo título de VNAb en cuanto a referencia ensayada contra CVS.

Los anticuerpos a PV-1 se analizaron mediante ELISA como se describe anteriormente, utilizando microplacas recubiertas con un péptido sintético constituido por un trímero de aminoácidos 93-103 de VP1. También se ensayó mediante ELISA la producción de anti-IgG de LCM.

Ensayo de protección. La actividad protectora de vacunas y plásmidos se determinó de acuerdo con el ensayo de potencia de NIH. Se inyectaron diluciones de vacuna de manera intraperitoneal (i.p.) en ratones, en los días 0 y 7, mientras que los plásmidos (40 μg) se inyectaron en cada músculo tibial anterior, en el día 0 únicamente. Los ratones se expusieron entonces de manera intracerebral (i.c.), en el día 21, a alrededor de 30 LD50 de diversos lisavirus (CVS, LCMV, EBL1b, o EBL2b). Los animales se observaron durante 28 días o, de manera alternativa, se sacrificaron en el día 21 después de la exposición, y se recogieron muestras de sangre con el fin de controlar la eliminación de virus y la producción de anti-IgG de LCMV.

Ejemplo 1

Expresión transitoria de genes G de lisavirus

Se utilizaron plásmidos que contienen genes de G de lisavirus homogéneos (pGPV-PV), truncados (pG-PVIII), y quiméricos (pGEBL1-PV, pGMok-PV y PGPV-Mok), para transfectar células Neuro 2a. La tinción celular mediante inmunofluorescencia indirecta se da en la figura 2, y se puede resumir de la siguiente manera.

Después de la transfección con pGPV-PV, se detectó el antígeno con PV PAb (figura 2A), PV D1 MAb (figura 2B), o PV E12 MaA (no se muestra), principalmente en la membrana celular (resultados similares con células no permeabilizadas, no se muestran los datos), y se detectaron muy pocas con 6A1 MAb (figura 2C). Las células transfectadas con pG-PVIII tuvieron forma redonda, y se tiñeron completamente (tanto el citoplasma como la membrana) con PV PAb (figura 2D) o 6A1 MAb (figura 2F), pero no con PV D1 MAb (figura 2E). Las células transfectadas con pGEBL1-PV se tiñeron principalmente en la membrana celular con PV PAb (figura 2G), PV D1 MAb (figura 2H) o EBL-1 PAb (figura 2I). Las células transfectadas con pGMoK-PV se tiñeron (principalmente en la membrana) con PV PAb (figura 2J), PV D1 MAb (figura 2K), Mok PAb (figura 2L), y muy pocas se tiñeron con 6A1 MAb (no se muestra). Las células transfectadas con pGP-Mok se tiñeron con PV PAb (figura 2M) o Mok Pab, y tuvieron forma redonda (figura 2N). La transfección celular distingue dos tipos de antígenos de G: 1) teñidos principalmente en la membrana de células de forma normal, en particular utilizando MAb neutralizante dirigido contra el sitio II (PV E12) y III (PV D1); y 2) teñidos tanto en el citoplasma como en la membrana de células de forma redonda, en particular utilizando MAb (6A1), que reconoce la molécula de G desnaturalizada.

La cinética de la expresión de proteína G se estudió con la transfección de células con tres plásmidos representativos: pGPV-PV (homogéneo), pGEBL1-PV (quimérico) y pG-PVIII (truncado). El pGPV-PV produjo antígenos de G en aproximadamente 60% de células cuando se sometieron a tinción con PV PAb, mientras que muy pocas células se tiñeron con PV 6A1 MAb en cualquier punto de tiempo (figura 3a). Aproximadamente 55% de células transfectadas con pGEBL1-PV se sometieron a tinción con PV Pab, y hasta 15% con 6A1 MAb (figura 3b), indicando que algunas moléculas de G estaban desnaturalizadas. De 10 a 20 por ciento de células transfectadas con pG-PVIII tuvieron forma redonda y se tiñeron con PV Pab, mientras que 5 a 10% fueron positivas con 6A1 MAb, indicando que las moléculas de G estaban desnaturalizadas (figura 3c).

Ejemplo 2

Inducción de células que producen IL-2

Se evaluó la capacidad de los plásmidos pGPV-PV, pG-PVIII, pGEBL1-PV, pGMok-PV y pGPV-Mok para inducir células que producen IL-2, y los resultados se muestran en la figura 4. Los plásmidos con la parte del sito III de PV, ya sea sin fusionar (pG-PVIII) o con cualquier parte del sitio II de lisavirus (pGPV-PV, pGEBL1-PV y pGMok-PV), indujeron de manera eficiente células que producen IL-2 (240 a 550 mU/ml). Esto fue cierto incluso para pG-PVIII, que, sin embargo, tuvo únicamente baja eficiencia tanto para la transfección celular (véase lo anterior) como para la inducción de anticuerpos (véase a continuación). Para los plásmidos quiméricos EBL1-PV y Mok-PV, la respuesta de células T fue mayor después de la estimulación con PV inactivada y purificada que con los virus EBL-1 b o Mok. Este no fue debido a la calidad de los antígenos purificados, porque la inmunización de los ratones BALB/c con virus PV, EBL-1b, o Mok inactivados y purificados, seguido de la estimulación in vitro con el mismo antígeno, indujo niveles similares de producción de IL-2 (PV: 250 mU/ml, EBL-1b: 350 mU/ml y Mok: 400 mU/ml). Por el contrario, el plásmido pGPV-Mok indujo únicamente una respuesta celular Th débil (título de IL-2: 50 mU/ml), que fue producida de manera similar in vitro después de la estimulación con virus PV o Mok inactivados y purificados.

Ejemplo 3

Ensayos serológicos

El plásmido pG-PVIII truncado no indujo la producción de anticuerpos de la rabia, cuando se analizó mediante RFFIT y ELISA. Sin embargo, cuando se inyectó IL-2 junto con pG-PVIIII, y después sólo 7 días después, se detectaron mediante ELISA anticuerpos el día 21 únicamente (no se muestran los datos). De este modo, la parte del sitio III se expresó in vivo, e indujo una producción débil de anticuerpos no neutralizantes, la cual se impulsó mediante IL-2 exógena.

Por el contrario, cuando la parte del sitio III de PV se enlazó con la parte del sitio II homóloga, como en pGPV-PV, mostró fuerte inmunogenicidad. Una sola inyección de plásmido pGPV-PV en ratones dio como resultado niveles elevados de VNAb medidos 27 días más tarde, tanto contra el virus PV como CVS homólogos y el virus EBL-2b heterólogo (figura 5a). El isotipo de anticuerpo inducido fue principalmente IgG 2a, pero también se observó una respuesta débil de IgG 1 (no se muestran los datos). Sin embargo, la correlación entre títulos de VNAb contra PV fue más fuerte con IgG 2a (r=0,974) que con el título de IgG 1 (r=0,71), indicando que el VNAb inducido por inmunización a base de ADN fue principalmente IgG 2a. El título de VNAb contra los virus PV y CVS homólogos aumentó cuando los ratones recibieron una inyección de recuerdo en el día 30 y sus sueros de verificaron en el día 40, pero no los títulos de VNAb contra el virus EBL-2b heterólogo, que permaneció sin cambios (figura 5a). En estas condiciones, también se demostró una relación entre el nivel de VNAb inducido por pGPV-PV y la protección de ratones contra una exposición i.c. con CVS: todos los animales con un título de VNAb (en el día 20) por encima de 1,5 IU/ml sobrevivieron a la exposición en el día 21 (no se muestra). Por el contrario, no se produjo ninguna cantidad significativa de VNAb contra EBL-1b después de una sola inyección o después de una revacunación.

De este modo, se investigó la capacidad de la parte del sitio III de PV para llevar la parte del sitio II de EBL1 heterólogo, siguiendo la observación previa de que el plásmido quimérico pGMok-PV indujo VNAb contra los virus PV y Mok. Una sola inyección del plásmido quimérico pGEBL1-PV indujo de manera similar VNAb contra los virus PV y EBL-1b (figura 5b). Catorce días después de la inyección, los títulos fueron 2 IU/ml, y aumentaron hasta 17 IU/ml después de 80 días. El nivel de producción de VNAb contra EBL-1b fue siempre más elevado que aquel contra PV, pero la diferencia no fue significativa.

Tomados juntos, estos resultados demostraron claramente que los genes de G quiméricos que codifican la parte del sitio III de PV y la parte del sito II de G de otros lisavirus, tales como EBL-1 b o Mok, son inductores muy potentes de VNAb contra virus progenitores. Por el contrario, el constructo de pGPV-Mok simétrico no induce VNAb contra ninguno de los virus PV o Mok (no se muestra).

Ejemplo 4

Ensayos de protección contra lisavirus Europeos

Se estudió la capacidad tanto del plásmido pGPV-PV homogéneo como del plásmido pGEBL1-PV quimérico para inducir la protección contra una exposición i.c. con virus que representan genotipos de lisavirus implicados en la transmisión de encefalomielitis en Europa (CVS para GT1, EBL1b para GT5, y EBL2b para GT6). Se comparó su eficiencia con la de una vacuna disponible comercialmente (cepa PM: GT1) y una preparación de laboratorio (cepa PV: GT1) (figura 6).

La cadena plasmídica (pClneo) no indujo protección contra ningún virus (figura 6d, e y f). Por el contrario, pGPV-PV protegió al 70% de ratones BALB/c (y 85% de Suizos) contra CVS (figura 6d), al 30% contra EBL1b (figura 6e), y al 72% contra EBL2b (figura 6f). En las mismas condiciones, pGEBL1-PV protegió al 60% de ratones BALB/c contra CVS (figura 6d), al 75% contra EBL1b (figura 6e) y al 80% contra EBL2b (figura 6f). De este modo, si la inmunización con cualquiera de los dos plásmidos no mostró diferencia significativa en la protección contra CVS (GT1) y EBL2b (GT6), el pGEBL1-PV quimérico fue mucho más eficiente contra EBL1b (GT5), y es claramente el mejor candidato para la protección con inmunización a base de ADN contra los tres genotipos de lisavirus Europeo.

En cuanto a la protección inducida por vacunas de cultivo celular inactivado utilizando las cepas PM y PV contra las mismas exposiciones: una dosis humana de vacuna de PM diluida 1/10 protegió al 80% de ratones contra CVS (figura 6a), al 36% contra EBL1b (figura 6b), y al 80% contra EBL2b (figura 6c). En las mismas condiciones, 2 μg de PV IPRV protegió al 100% de ratones tanto contra CVS (figura 6a) como contra EBL1b (figura 6b), y al 85% contra EBL2b (figura 6c). Parece que para una dosis de vacuna que protegió de 80 a 85% de los animales contra EBL2b, la cepa de PV protegió al 100% y la cepa de PM únicamente al 36% contra EBL1b. De este modo, la cepa de PM es menos efectiva que la cepa de PV contra EBL1b.

Ejemplo 5

Expresión transitoria de genes de G de lisavirus

Los plásmidos que contienen las secuencias codificantes de antígeno extraño asociadas con los genes de G de lisavirus truncado (pG-PVIII) o quimérico (pGEBL1-PV) se estudiaron para determinar su capacidad para transfectar de manera transitoria células Neuro 2a. Excepto para pG(B-CTL)2-PVIII, que indujo una tinción de IIF (en el citoplasma) únicamente después de la permeabilización, todos los plásmidos indujeron la expresión de antígenos relacionados con poliovirus y lisavirus en la membrana celular de células no permeabilizadas, como se dio a conocer previamente para los mismos plásmidos sin epítopos extraños.

Con fines ilustativos, en la figura 7 se dan los resultados de la transfección obtenidos con pGEBL1-(B-CTL)2-PV. Se evidenció la parte de G del virus de la rabia, reconocida por PV D1 MAb (figura 7A), y el inserto de poliovirus reconocido por el C3 MAb (figura 7B) o el PAb anti poliovirus tipo 1 (figura 7C), mientras que no se observó tinción con los mismos MAb y PAb en células transfectadas con PClneo (figura 7D). Esto indica claramente que, excepto para pG(B-CTL)2-PVIII, la glicoproteína pGEBL1-PV quimérica permitió la expresión del epítopo de células B de poliovirus, solo o en asociación con el epítopo de células CTL de LCMV, en la membrana de superficie celular bajo una forma nativa, mientras que se mantuvo la expresión de G de lisavirus.

Ejemplo 6

Inmunogenicidad de epítopos extraños portados por la glicoproteína truncada

El gen de pGPVIII truncado se utilizó para llevar y expresó los epítopos de célula B de C3 VP1 y de CD8+CTL de LCMV, en ratones después de la inmunización a base de ADN.

Aunque el gen de pGPVIII indujo células que producen IL-2 que pueden ser estimuladas in vitro mediante IPRV 21 días después de la inyección, no se observó producción después de 14 días (figura 8A). Sin embargo, se observó una producción significativa con pG(B-CTL)2-GPVIII, después de 14 días (figura 8A). Esto indica que la fusión de epítopos extraños con GPVIII mejora de manera significativa la producción de células Th dirigidas a la parte del sitio III de G de la rabia.

Aunque pGPVIII no indujo anticuerpos antirabia en ausencia de IL-2 exógena (figura 9), el estudio cinético de anticuerpo inducido por pG(B-CTI-)2-GPVIII mostró que la producción significativa de anticuerpo ocurrió tanto contra G de la rabia como contra el péptido de poliovirus (figura 9). Esto también indica que la fusión de epítopos extraños con GPVIII mejora de manera significativa la producción de anticuerpo dirigido a la parte del sitio III de PV G de la rabia. Más aún, el GPVIII truncado fue capaz de llevar y permitir la expresión de epítopo de célula B de poliovirus in vivo con producción de anticuerpos.

La producción de anticuerpos inducida por p(B-CTL)2-GPVIII contra un péptido de poliovirus también se estudió después de cebar con pGPVIII o con el propio p(B-CTL)2-GPVIII (figura 10). Cuando se inyectó p(B-CTL)2-GPVIII sin cebador, y se controló 13 días (PBS/ p(B-CTL)2-GPVIII -D26-) o 39 días después (p(B-CTL)2-GPVIII -D0-), el título de anticuerpo antipeptídico fue de 65 y 80, respectivamente. Sin embargo, si se realiza un cebado con pGPVIII o p(B-CTL)2-GPVIII, el título fue de 200 y 600, respectivamente. Esto demuestra claramente que los dos tipos de cebado mejoran la producción de anticuerpos contra un péptido de poliovirus.

Ejemplo 7

Inmunogenicidad de epítopos extraños portados por la glicoproteína quimérica

La inmunogenicidad tanto de epítopos celulares B como CD8 T, y la consecuencia de su inserción en la inmunogenicidad de la glicoproteína quimérica, se analizó de acuerdo con respuestas inmunes humorales y mediadas por células, tras la inmunización a base de ADN. Cuando se insertaron epítopos en el plásmido pGEBL1-PV quimérico, la inducción de células productoras de IL-2, capaces de ser estimuladas por IPLV, dependió de los epítopos insertados. Se obtuvieron dos tipos de resultados, y se muestran en la figura 8B: i) la producción de IL-2 inducida por pGEBL1-(B-CTL)2-PV, pGEBL1-(CTL-B)-PV, y pGEBL1-(CTL)-PV fue similar a la inducida por pGEBL1-PV; y ii) se inhibió la producción de IL-2 inducida por pGEBL1-(B-CTL)-PV (no se muestran los datos) y pGEBL1-(B)-PV. En consecuencia, parece que la G de EBL1-PV quimérica puede llevar epítopos celulares B y CD8 T extraños sin efectos negativos en su capacidad para inducir células productoras de IL-2. Sin embargo, en lo que respecta al epítopo de células B, se observó un efecto de posición debido a que su inserción inmediatamente detrás de la secuencia de EBL1 fue perjudicial para la inducción de células auxiliares T estimuladas por G de lisavirus. Sin embargo, este fenómeno no se probó con pGEBL1-(B-CTL)2-PV.

La inserción de epítopos extraños en pGEBL1-PV también se estudió para determinar su consecuencia en la inducción de anticuerpos contra péptido de poliovirus y VNAb tanto contra lisavirus de PV como de EBL1 (Tabla 1). Los cuatro plásmidos que contienen el epítopo de células B (pGEBL1-(B)-PV, pGEBL1-(CTL-B)-PV, pGEBL1-(B

CTL)2-PV, y pGEBL1-(B-CTL)-PV) indujeron anticuerpo contra el péptido de poliovirus. Sin embargo, cuando el epítopo de células B siguió a la secuencia de EBL1 (pGEBL1-(B-CTL)-PV y pGEBL1-(B)-PV), la producción de anticuerpos fue más débil que cuando el epítopo de B se separó mediante el epítopo de células CD8 (pGEBL1(CTL-B)-PV). Los resultados para pGEBL1-(B-CTL)2-PV fueron intermedios. La inserción de epítopos extraños indujo una disminución de producción de VNAb anti-lisavirus, pero se mantuvo a un nivel elevado cuando los animales se inyectaron con pGEBL1-(CTL)-PV o pGEBL1-(CTL-B)-PV. Sin embargo, cuando el epítopo de células B se insertó inmediatamente detrás de la secuencia de EBL1, se observó una producción no tan grande de un VNAb antilisavirus.

En resumen, la G de EBL1-PV quimérica puede llevar y permitir la expresión in vivo de epítopos de células B neutralizantes de poliuvirus y lisavirus, pero la presencia del epítopo de célulsa B de poliuvirus, inmediatamente detrás de la secuencia de EBL1 (excepto para inserción de (B-CTL)2), es perjudicial para la inmunogenicidad tanto de la parte del sitio II como del sitio III de la glicoproteína quimérica. Por otro lado, cuando los epítopos extraños se fusionaron con la G de PVIII truncada, se puede inducir tanto la producción de anticuerpos auxiliares T como no neutralizantes.

Ejemplo 8

Protección contra una dosis letal de LCMV

Ya que el epítopo celular CD8 T está implicado en la inducción de protección contra LCMV, se estudió la G truncada y quimérica que lleva el epítopo celular CD8* T de LCMV, para determinar su actividad protectora (Tabla 2). El p(B-CTL)2-GPVIII truncado indujo únicamente una protección parcial. Cuando los epítopos celulares B y CD8 T se insertaron en el GEBL1-PV quimérico, se observó una protección significativa con pGEBL1-(CTL-B)-PV contra una exposición letal con LCMV (70% de ratones sobrevivieron). En estas condiciones, los animales que sobrevivieron eliminan completamente el virus cuando se controlaron mediante RT-PCR 21 días después de la infección (no se muestran los datos). Esto indica que la G quimérica es muy potente para llevar un epítopo celular CD8 protector. Sin embargo, en cuanto a las respuestas inmunes de anti-lisavirus y poliovirus, la inserción del epítopo celular B de poliovirus inmediatamente detrás de la secuencia de EBL1 indujo una inhibición de la actividad protectora del siguiente epítopo celular CD8.

Ejemplo 9

Secuencia PEST putativa

Debido a que se observó claramente un efecto de posición perjudicial para la posición de la inserción del epítopo celular B antes o después del epítopo celular CTL, se analizó la presencia de secuencias PEST putativas en losdiferentes plásmidos (figura 1D). Únicamente dos plásmidos (pGEBL1-(B)-PV y pGEBL1-(B-CTL)2-PV) contuvieron secuencias PEST putativas debido a la unión del extremo de EBL1 y la secuencias del epítopo celular B. Sin embargo, la sustitución de la serina (S) en pGEBL1-(B-CTL)2-PV por una leucina (L) en pGEBL1-(B)-PV redujo el valor PEST de +8,38 a +4,20.

Ejemplo 10

Inmunización y exposición de perros

Perros sabueso de 4 a 8 años se asignaron en cuatro grupos experimentales (Tabla 3). Se mantuvieron en jaulas aisladas, y se alimentaron con alimento comercial (400 g cada día). Se inyectaron de manera intramuscular en la pata posterior con 100 μg de plásmido (grupo A, B y C) o PBS (grupo D). El plásmido se inyectó en un sitio en el día 0, 21, 42, y 175 (grupo A), o en el día 0 y 175 (grupo C). También se inyectó en tres sitios (3x33 μg) en el día 0, 21, 42, y 175 (grupo B). Las muestras de sangre se recogieron (a partir de perforación de vena) en los días 0, 28, 49, 70, 120, 175, y 189.

Los anticuerpos neutralizantes de lisavirus se titularon mediante prueba de inhibición de foco fluorescente rápida (RFFIT), con las modificaciones descritas anteriormente de (28 de los perros) utilizar virus PV, CVS o FWR) célula. Los títulos de anticuerpos neutralizantes anti-PV, CVS o FWR se expresan en unidades internacionales por ml (IU/ml) utilizando el 2nd International Standard (Statens Seruminstitut, Copenhague, Dinamarca) como referencia, o como la dilución de suero recíproca que inhibe 50% del foco fluorescente. En estas condiciones, un título de 40, 70,

o 60 (dilución de suero recíproca) fue equivalente a 0,5 IU/mI contra PV, CVS o FWR, respectivamente.

Como se muestra en la figura 11, se puede inducir un anticuerpo neutralizante de virus (VNAb) mediante el plásmido que contiene el gen que codifica los grupos de proteína G (A, B y D), mientras que no se detectó ningún anticuerpo en animales inyectados con PBS (grupo D), cualquiera que sea el protocolo de inyección. Los niveles más destacados de VNAb se obtuvieron después de una inyección y una revacunación en el día 21 (grupo A), o en el día 175 (grupo C). Conforme se produce la seroconversión para 0,5 IU/ml, se puede concluir que todo los animales se

habían seroconvertido. Más aún, de acuerdo con la bibliografía, se puede concluir que todos los perros inyectados con plásmido están protegidos contra un ataque de virus de rabia.

Estos resultados son representativos y la dosificación se puede extrapolar a otros animales susceptibles a la rabia, incluyendo seres humanos.

Ejemplo 11

pG-PVIII como un portador para proteína extraña: dominio de P. falciparum que media la adhesión a sulfato de condroitina A: un receptor para infección de placenta humana

La malaria durante el primer embarazo provoca un alto índice de muerte fetal y neonatal. La disminución de susceptibilidad durante embarazos subsecuentes se correlaciona con la adquisición de anticuerpos que bloquean la unión de glóbulos rojos infectados a sulfato de condroitina A (CSA), un receptor para parásitos en la placenta. De manera reciente, se ha identificado un dominio dentro de una proteína 1 de membrana de eritrocito de Plasmodium falciparum (PfEMP-1) que se une a CSA (Buffet et al. P. falciparum domain mediating adhesion to chondroitin sulfate

A: A receptor for human placental infection (1999) P.N.A.S. 96:12743-12748). Se clonó un gen var que se expresa en glóbulos rojos parasitados de unión a CSA (PRBCs). El gen tuvo 8 dominios de tipo receptor, y se desmotró que el dominio de tipo unión de Duffy (DBL), llamado DBL-3, une CSA y exhibe la misma especificidad de unión que PRBCs.

Puesto que los anticuerpos protectores presentes después del embarazo bloquean la unión a CSA de parásitos de diferentes partes del mundo, DBL-3, aunque variante, puede inducir inmunidad reactiva cruzada que protegerá a mujeres embarazadas y sus fetos. De este modo, el dominio DBL-3 se vuelve un candidato como una vacuna paramujeres embarazadas en África.

El dominio DBL-3 contiene un número de cisteínas que parecen ser cruciales para el pliegue correcto de la región de unión a CSA. Este pliegue no puede ser lograble, muy probablemente, en sistemas de expresión bacteriana (datos no publicados). Un enfoque importante para inducir anticuerpos capaces de interferir con la unión a CSA de eritrocitos infectados es aplicar una estrategia de vacuna de ADN utilizando el dominio DBL-3 fusionado a la parte PV III de la rabia. Se ha mostrado que la parte PVIII de la glicoproteína de la rabia promueve función auxiliar eficiente.

La invención se ha descrito en detalle anteriormente haciendo referencia a las formas de realización preferidas. Sin embargo, el experto en la materia apreciará que pueden introducirse diversas modificaciones y variaciones en la puesta en práctica de la presente invención sin apartarse del alcance de la misma.

Tabla 1. Producción de anticuerpos inducida por el plásmido pGEBL1-PV quimérico que porta varias combinaciones de epítopos extraños de células B y CD8+ T

Plásmido inyectado

Anticuerpo neutralizante (U/ml) contra: Anticuerpo antipéptido de poliovirus

Virus de la rabia

Lisavirus 1 de murciélago Europeo (Dilución reciproca)

pGEBL1-(B-CTL)2-PV

0,9 (0,05) 1,1 (0,07) 1100 (200)

pGEBL1-(CTL-B)-PV

1,8 (0,2) 8,0 (1,0) 1510 (490)

pGEBL1-(B-CTL)-PV

0,06 (0,06) 0,6 (0,07) 810 (210)

pGEBL1-(CTL)-PV

2,6 (0,2) 5,2 (0,2) 0 (0)

pGEBL1-(B)-PV

0,1 (0,01) 0,21 (0,09) 355 (45)

pGEBL1-PV

5,9 (2,1) 21,9 (1,8) 0 (0)

pClneo

0 (0) 0 (0) 0 (0)

La tabla 1 muestra la producción de anticuerpos inducida por el plásmido pGEBL1-PV quimérico que porta varios epítopos extraños. Los ratones BALB/c (tres para cada plásmido) se inyectaron con 50 μg de varios plásmidos en cada músculo tibial. El suero se analizó en el día 21 para determinar el anticuerpo neutralizante del virus EBL1 o de la rabia, mediante el procedimiento de RFFIT (título expresado en IU/ml), y para determinar el anticuerpo antipéptido de poliovirus mediante ELISA. Los resultados se expresan como el título medio, y la desviación estándar se da en paréntesis.

Tabla 2. Protección inducida por el plásmido pGPVIII truncado y el pGEBL1-PV quimérico que codifican el epítopo CD8+ de LCMV

Plásmido inyectado

Supervivencia de animales (%)

pClneo

0/10 (0)

p(B-CTL)2-GPVIII

2/5 (40)

pGEBL1-(B-CTL)-PV

0/10 (0)

pGEBL1-(CTL-B)-PV

7/10 (70)

5 La tabla 2 muestra la protección inducida por el plásmido pGEBL1 quimérico que porta los epítopos CD8+ de LCMV. Los ratones BALB/c (tres para cada plásmido) se inyectaron con 40 μg de diversos plásmidos, y se expusieron i.c en el día 21. El porcentaje de animales que sobrevivieron se da entre paréntesis.

Tabla 3. Característica de perros y protocolo de inyección 10

Grupo

Número de perro Sexo* Edad Inyección

(Años)

Producto inyectado Número de sitio Día

A

1 M 8 Plásmido 1 0, 21, 42 y 175

2

F 6 Plásmido 1 0, 21, 42 y 175

3

F 6 Plásmido 1 0, 21, 42 y 175

B

4 F 6 Plásmido 3 0, 21, 42 y 175

5

M 6 Plásmido 3 0, 21, 42 y 175

6

F 8 Plásmido 3 0, 21, 42 y 175

C

7 M 4 plásmido 1 0 y 175

8

F 7 plásmido 1 0 y 175

9

F 4 plásmido 1 0 y 175

D

10** M 4 PBS 1 0, 21, 42 y 175

11

M 4 PBS 1 0, 21, 42 y 175

12

M 4 PBS 1 0, 21, 42 y 175

* M: macho; F: hembra ** Descartado en el día 160 (enfermo)

Listado de secuencias

<110> Institut Pasteur 15

<120> Ácidos nucléicos y polipéptidos de lisavirus quimérico

<130> d18780 20 <150> US60/129501

<151> 1999-04-15

<150> PCT/IB00/00564

<151> 2000-04-17 25

<150> EP 00917245

<151> 2000-04-17

<160> 17 30

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 34

<212> ADN <213> Virus de la Rabia

5

<400> 1 ttctagagcc accatggttc ctcaggctct cctg 34

10

<210>2 <211> 23 <212> ADN <213> Virus de la Rabia

15 20

<400> 2 attgatcaac tgaccgggag ggc <210> 3 <211> 98 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebadores de adaptador sintético 23

25

<400> 3 aattctagag ccgccaccat ggttcctcag gctctcctgt ttgtacccct tctggttttt ccattgtgtt ttgggaagaa ttcccccccc ggtcagtt 60 98

30

<210> 4 <211> 98 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

35

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebadores de adaptador sintético <400> 4 gatcaactga ccgggggggg aattcttccc aaaacacaat ggaaaaacca gaaggggtac aaacaggaga gcctgaggaa ccatggtggc ggctctag 60 98

40

<210> 5 <211>54 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

45

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebadores de adaptador sintético

50 55

<400> 5 aatttcccaa tctacaccat cccggataaa atcggaccgt ggtcacctat tccg <210>6 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebadores de adaptador sintético 54

60

<400> 6 aattcggaat aggtgaccac ggtccgattt tatccgggat ggtgtagatt ggga 54

65

<210> 7 <211> 63 <212> ADN <213> Virus de la Rabia

<400> 7 ccgtggtcac ctattgatat aaaccatctc agctgcccaa acaacttgat cgtggaagatgag

63

5

<210> 8 <211> 27 <212> ADN <213> Virus de la Rabia

15

<400> 8 ggaattcgag caccattctg gagcttc <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Proteína VP1 de poliovirus 27

<400> 9

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> nucleoproteína de virus de coriomeningitis linfocítica

<400> 10

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> nucleoproteína de virus de coriomeningitis linfocítica

<400> 11

35

<210> 12 <211> 78 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebadores de adaptador sintético

45

<400> 12 aattcagata acccggcgtc gaccactaac aaggataagc tgttcgcagt gcctcaggcc tctggtgtgt atatgggt 60 78

<210>13 <211>78 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebadores de adaptador sintético

55

<400> 13 aattacccat atacacacca gaggcctgag gcactgcgaa cagcttatcc ttgttagtgg tcgacgccgg gttatctg 60 78

<210> 14 <211> 32

<212> ADN <213> Secuencia Artificial

5

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebadores de adaptador sintético

<400> 14 aatttggata acccggcgtc gaccactaac aa

32

10

<210> 15 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

15

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebadores de adaptador sintético

20

<400> 15 aattcttatc cttgttagtg gtcgacgccg gg 32

25

<210> 16 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebadores de adaptador sintético

30

<400> 16 aatttggata gacctcaggc ctctggtgtg tatatgggta atcttacggc ccag 54

35

<210> 17 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

40

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebadores de adaptador sintético <400> 17 aattctggga agtaagatta cccatataca caccagaggc ctgaggtctc tcca 54

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Composición inmunógena que comprende un polipéptido quimérico codificado por una molécula portadora que

   contiene una secuencia polinucleotídica, en la que dicha secuencia polinucleotídica comprende: 5

   -

   una secuencia que codifica una parte de una glicoproteína de lisavirus que contiene por lo menos el sitio III de la glicoproteína, y

   -

   una secuencia que codifica por lo menos una secuencia antigénica diferente al sitio III o sitio II de la

   10 glicoproteína de lisavirus seleccionada de entre el grupo constituido por secuencias de proteína antigénica, o su parte antigénica, a partir de otro virus de la rabia o virus relacionado con la rabia.
2. 2. Composición inmunógena según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia polinucleotídica contenida en la

   molécula portadora comprende una secuencia que codifica por lo menos la mitad terminal del extremo C de una 15 glicoproteína de lisavirus que consiste en los aminoácidos 253 a 505 de la glicoproteína de lisavirus.
3. 3. Composición inmunógena según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia polinucleotídica contenida en la molécula portadora comprende además una secuencia que codifica un dominio transmembranario de una proteína transmembranaria.
4. 4. Composición inmunógena según la reivindicación 3, en la que dicho dominio transmembranario es de una glicoproteína de lisavirus.
5. 5. Composición inmunógena según la reivindicación 3, en la que dicho dominio transmembranario es de una 25 proteína diferente a la glicoproteína de lisavirus.
6. 6. Composición inmunógena según las reivindicaciones 3 a 5, en la que dicha secuencia polinucleotídica contenida en la molécula portadora comprende además una secuencia que codifica un dominio citoplásmico de la glicoproteína de dicho lisavirus.
7. 7. Composición inmunógena según la reivindicación 4, en la que dicha secuencia polinucleotídica contenida en la molécula portadora comprende además una secuencia que codifica un dominio citoplásmico de la glicoproteína de un lisavirus, siendo el dominio transmembranario y el dominio citoplásmico del mismo lisavirus.

   35 8. Composición inmunógena según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia polinucleotídica contenida en la molécula portadora comprende:

   a) una secuencia que codifica una secuencia de sitio II de una glicoproteína de un lisavirus;

   40 b) una secuencia que codifica una secuencia de sitio III de una glicoproteína de un lisavirus;

   c) un dominio transmembranario de una proteína transmembranaria;

   d) un dominio citoplásmico de una proteína transmembranaria; y

   45 e) una secuencia que codifica por lo menos una secuencia antigénica diferente al sitio III o sitio II de la glicoproteína de lisavirus seleccionada de entre el grupo constituido por secuencias de proteína antigénica, o su parte antigénica, a partir de otro virus de la rabia o virus relacionado con la rabia.

   50 9. Composición inmunógena según las reivindicaciones 1 a 8 que comprende además un componente seleccionado de entre el grupo constituido por adyuvantes, excipientes, estabilizantes, vectores supramoleculares y antígenos.
8. 10. Composición inmunógena según las reivindicaciones 1 a 9, que es una vacuna.

   55 11. Composición inmunógena según las reivindicaciones 1 a 10, que comprende inmunidad celular y humoral.
9. 12. Procedimiento para la preparación in vivo o in vitro de un polipéptido quimérico comprendido en la composición inmunógena según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque dicho procedimiento comprende las etapas siguientes:

   60 a) producir mediante un procedimiento in vivo o in vitro dicho polipéptido quimérico a partir de una molécula portadora como en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que codifica dicho polipéptido quimérico; y

   b) purificar el polipéptido obtenido en la etapa a). 65

10. 13.

    Procedimiento para la preparación in vivo de un polipéptido quimérico según la reivindicación 12, en el que en la etapa a), dicho polipéptido quimérico es producido por la expresión de la molécula portadora en cultivos tisulares o bacterianos y en la etapa b), el polipéptido quimérico obtenido es aislado de estos cultivos.

11. 14.

    Procedimiento para la preparación in vivo o in vitro de un polipéptido quimérico según la reivindicación 12 o 13, que comprende además una etapa c) que consiste en combinar el polipéptido quimérico con componentes seleccionados de entre el grupo constituido por compuestos o aditivos que pueden mejorar la inmunogenicidad, la estabilidad y la biodisponibilidad de la composición inmunógena.