JP7374893B2 - ネコカリシウイルスワクチン - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１７年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５９６，５０８号、２０１７年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５８２，０５０号、２０１７年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５８１，９５５号および２０１７年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５９９，４０１号の優先権を主張し、その内容全体を参照により本明細書に組み入れる。

本発明は、ネコカリシウイルスのための新しいワクチンに関する。ワクチンを単独でまたは他の保護剤と組み合わせて製造および使用する方法も提供される。

ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）は通常、ネコの上気道疾患を引き起こす。ＦＣＶは、ネコヘルペスウイルスとともに、あらゆるネコ呼吸器疾患のうち約８０％の原因であると考えられている。ＦＣＶ感染の最も一般的な特徴および臨床徴候は、舌および口腔粘膜上の小胞（潰瘍）の発現である。これらの小胞は小さな個々の潰瘍として始まり、舌の大部分に広がり、影響を及ぼすことがある。小胞は通常、飲食を妨げず、一般的には問題なく治癒する。感染したネコには発熱も観察されることが多い。

ＦＣＶの特定の株はまた、跛行症候群（ｌｉｍｐｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）として知られている疾患をネコに引き起こす。跛行症候群は、発熱、関節および筋肉の痛み（跛行）、ならびに時に舌／口腔潰瘍を特徴とする。さらに、ＦＣＶのいくつかの株は、感染したネコに慢性口内炎を引き起こす。その他のあまり一般的でない臨床徴候は、結膜炎、鼻炎および時に肺炎である。ＦＣＶに感染したネコは持続的に感染する可能性があり、長期間にわたって感染性ウイルスを排出する可能性がある。

ＦＣＶは、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる一本鎖のポジティブセンスＲＮＡゲノムを含む。ゲノムは３’末端でポリアデニル化され、ウイルスにコードされたタンパク質によって５’末端で結合されている。第１のオープンリーディングフレームは、単一のポリペプチドに発現するウイルスプロテアーゼとＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとをコードする。次いで、このポリペプチドはウイルスプロテアーゼによって翻訳後切断される。第２のオープンリーディングフレームは、Ａ～Ｆと呼ばれる６つの領域を有する主要なキャプシドタンパク質（すなわち、ＦＣＶキャプシドタンパク質）をコードする［Ｓｃｏｔｔら、６０ Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ．：６５２－６５８（１９９９）］。領域Ａは切断されて、成熟キャプシドタンパク質を生成する。ＯＲＦ２の領域Ｂ、ＤおよびＦはＦＣＶ分離株間で比較的保存されているが、領域ＣおよびＥは可変であり、ＯＲＦ２の領域Ｅは、主要なＢ細胞エピトープを含む［Ｒａｄｆｏｒｄら、３８（２）Ｖｅｔ Ｒｅｓ．：３１９－３３５（２００７）を参照］。ＯＲＦ３は、マイナーな構造タンパク質をコードする［Ｓｏｓｎｏｖｔｓｅｖ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２７７ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１９３－２０３（２０００）］。

ある種の病原体から保護するために、いくつかのベクター戦略が長年にわたってワクチンに採用されてきた。そのようなベクター戦略の１つには、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）［Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９－４０１（１９９７）］、シンドビス（ＳＩＮ）［Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：６４３９－６４４６（１９９３）］およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）［Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６－１３６１（１９９１）］を含むいくつかの異なるアルファウイルスから開発されたアルファウイルス由来レプリコンＲＮＡ粒子（ＲＰ）［Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎら、Ａｎｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．１３（１）：１－９（２０１２）ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ１４６６２５２３１２００００１１；Ｋａｍｒｕｄら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ９１（Ｐｔ ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］の使用が含まれる。ＲＰワクチンは、増殖欠損アルファウイルスＲＮＡレプリコンを宿主細胞に送達し、インビボで所望の（１または複数の）抗原導入遺伝子の発現をもたらす［Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９（２）：３８９－４０１（１９９７）］。ＲＰは、いくつかの従来のワクチン製剤と比較した場合、魅力的な安全性および有効性プロファイルを有する［Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎら、Ａｎｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．１３（１）：１－９（２０１２）］。ＲＰプラットフォームは、病原抗原をコードするために使用されており、ブタおよび家禽用のいくつかの米国農務省認可ワクチンの基礎となっている。

ＦＣＶ分離株は、単一の血清型に属すると長い間特徴付けられてきたが、抗原的に非常に多様であり、ＦＣＶ Ｆ９のようなＦＣＶの比較的古いワクチン株を用いてワクチン接種されたネコ由来の抗体は、現在のあらゆる野外分離株を効率的に中和しない。さらに、全身性疾患および高い死亡率を引き起こす新しいＦＣＶ株が同定されている［例えば、米国特許第７，４４９，３２３号を参照］。これらの「強毒全身性」（ＶＳ‐ＦＣＶ）分離株は局地的なアウトブレイクの原因であり、現在のワクチンもこれらの株によって引き起こされる疾患からネコを保護しないものと思われる。このことは、現行のワクチン株を用いてワクチン接種されたネコが、そのような「抗原的に異種の」ＦＣＶ株によって引き起こされる疾患から完全には保護されておらず、ワクチン接種されたネコであっても、これらの異種株が疾患のアウトブレイクの原因になり得るとの懸念につながっている。したがって、さらに広範囲に反応するウイルス中和（ＶＮ）抗体を刺激し、それにより新しい野外分離株に対する優れた保護を提供する新しいワクチンを開発することが望ましい。

本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることの承認として解釈されないものとする。

米国特許第７，４４９，３２３号

Ｓｃｏｔｔら、６０ Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ．：６５２－６５８（１９９９） Ｒａｄｆｏｒｄら、３８（２）Ｖｅｔ Ｒｅｓ．：３１９－３３５（２００７） Ｓｏｓｎｏｖｔｓｅｖ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２７７ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１９３－２０３（２０００） Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９－４０１（１９９７） Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：６４３９－６４４６（１９９３） Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６－１３６１（１９９１） Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎら、Ａｎｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．１３（１）：１－９（２０１２）ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ１４６６２５２３１２００００１１ Ｋａｍｒｕｄら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ９１（Ｐｔ ７）：１７２３－１７２７（２０１０） Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９（２）：３８９－４０１（１９９７）

したがって、本発明は、１つ以上のネコカリシウイルス（ＦＣＶ）抗原をコードするベクターを提供する。そのようなベクターは、これらのベクターを含む免疫原性組成物に使用することができる。本発明の免疫原性組成物は、ワクチンに使用され得る。本発明の一態様では、ワクチンは、ワクチン接種された対象（例えば、哺乳動物）をＦＣＶから保護する。この種の特定の実施形態では、ワクチン接種された対象はネコである。さらに特定の実施形態では、ワクチン接種された対象はイエネコである。本発明はさらに、ＦＣＶおよび他の疾患、例えばネコの他の感染性疾患に対する防御免疫を誘発するための混合ワクチンを提供する。本発明の免疫原性組成物およびワクチンを製造および使用する方法も提供される。

具体的な実施形態では、ベクターは、ネコ病原体に由来する１つ以上の抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。特定の実施形態では、ネコ病原体はネコカリシウイルス（ＦＣＶ）である。この種の具体的な実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＦＣＶキャプシドタンパク質をコードする。関連する実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＦＣＶキャプシドタンパク質の抗原性フラグメントをコードする。特定の実施形態では、ＦＣＶキャプシドタンパク質は、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質である。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質の抗原性フラグメントをコードする。さらに他の実施形態では、ＦＣＶキャプシドタンパク質は、強毒全身性ＦＣＶ（ＶＳ－ＦＣＶ）キャプシドタンパク質である。なお他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質の抗原性フラグメントをコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントおよびＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントの両方をコードする。

なお一層特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。さらに一層具体的な実施形態では、ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＴＣ－８３ ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、シンドビス（ＳＩＮ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。なお他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。代替の実施形態では、裸のＤＮＡベクターは、ネコ病原体に由来する１つ以上の抗原をコードする核酸構築物を含む。この種の特定の実施形態では、裸のＤＮＡベクターは、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントをコードする核酸構築物を含む。

特定の実施形態では、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、１つ以上のＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードする。この種の特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、２～４個のＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードする。関連する実施形態では、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、１つ以上のＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントおよび１つ以上の非ＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードする。この種の具体的な実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、１つ以上のＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントおよび１～３個の非ＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードする。さらに具体的な実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントおよびＦＣＶ－Ｆ９様キャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントおよび１～３個の非ＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードする。

別の態様では、本発明は、１つ以上のＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物を提供する。関連する実施形態では、免疫原性組成物は、２～４個のＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。この種の特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＦＣＶキャプシドタンパク質をコードする。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＦＣＶキャプシドタンパク質の抗原性フラグメントをコードする。特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。他の実施形態では、免疫原性組成物は、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質の抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、強毒全身性ＦＣＶ（ＶＳ－ＦＣＶ）キャプシドタンパク質をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。なお他の実施形態では、免疫原性組成物は、ＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質の抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントおよびＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントの両方をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。さらに特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子であるアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。さらに一層具体的な実施形態では、免疫原性組成物は、ＴＣ－８３ ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子であるＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。

なお他の実施形態では、免疫原性組成物は、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の２つ以上のセットを含む。この種の特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の一方のセットは第１の抗原をコードし、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の他方のセットは第２の抗原をコードする。この種の特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第１のセットは、１つ以上のＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードし、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第２のセットは、１つ以上のＦｅＬＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードする。特定の実施形態では、ＦＣＶ抗原は、強毒全身性ネコカリシウイルス（ＶＳ－ＦＣＶ）分離株に由来する。他の実施形態では、ＦＣＶ抗原は、古典的（Ｆ９様）ネコカリシウイルス分離株に由来する。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第２のセットは、一方は強毒全身性ＦＣＶ分離株に由来し、他方はＦ９様ＦＣＶに由来する２つのＦＣＶ抗原またはその抗原をコードする。なお他の実施形態では、免疫原性組成物は、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第１のセットと、ＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第２のセットとを含む。関連する実施形態では、免疫原性組成物は、ＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第１のセットと、ＦｅＬＶ糖タンパク質（例えば、ｇｐ８５）またはその抗原性フラグメント（例えば、ＦｅＬＶ糖タンパク質ｇｐ７０および／またはｇｐ４５）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第２のセットとを含む。

さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、第１の抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の１つのセットと、第２の抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の別のセットと、第３の抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第３のセットとを含む。この種の特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第１のセットは、古典的（Ｆ９様）ネコカリシウイルスに由来するＦＣＶ抗原（例えば、キャプシドタンパク質）またはその抗原性フラグメントをコードし、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第２のセットは、強毒全身性ネコカリシウイルスに由来するＦＣＶ抗原（例えば、キャプシドタンパク質）またはその抗原性フラグメントをコードし、そして、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第３のセットは、ＦｅＬＶ抗原（例えば、ＦｅＬＶ ｇｐ８５）またはその抗原性フラグメントをコードする。

したがって、免疫原性組成物がアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の複数のセット（例えば、２～１０個）を含む特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第１のセットは、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントおよび／またはＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントをコードし、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の１つ以上の他のセットは、１つ以上の非ＦＣＶ抗原をコードする。

この種の特定の実施形態では、非ＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントは、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）に由来するタンパク質抗原である。他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）に由来するタンパク質抗原である。さらに他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコニューモウイルス（ＦＰＮ）に由来するタンパク質抗原である。なお他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）に由来するタンパク質抗原である。さらに他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、狂犬病ウイルスに由来するタンパク質抗原である。なお他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）に由来するタンパク質抗原である。さらに他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコ免疫不全ウイルスに由来するタンパク質抗原である。なお他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）に由来するタンパク質抗原である。さらに他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコインフルエンザウイルスに由来するタンパク質抗原である。なお他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコ汎血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）に由来するタンパク質抗原である。さらに他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネココロナウイルス（ＦＣｏＶ）に由来するタンパク質抗原である。なお他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコ鼻腔気管炎ウイルス（ＦＶＲ）に由来するタンパク質抗原である。さらに他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）に由来するタンパク質抗原である。

本発明はまた、本発明のすべてのアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、裸のＤＮＡベクター、合成メッセンジャーＲＮＡおよびＲＮＡレプリコンを含む本発明の核酸構築物を、ならびに、本発明のすべての核酸構築物（例えば、合成メッセンジャーＲＮＡ、ＲＮＡレプリコン）、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターを含む免疫原性組成物および／またはワクチンを含む。

特定の実施形態では、本発明の核酸構築物は、１つ以上のＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードする。この種の関連する実施形態では、核酸構築物は、２～４個のＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードする。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、１つ以上のＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードする核酸構築物を含む。特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、２～４個のＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードする核酸構築物を含む。

なお他の実施形態では、免疫原性組成物は、２～４個のＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードする核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターを含む。この種の特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントおよび／またはＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントおよびＦｅＬＶ糖タンパク質（ｇｐ８５）またはその抗原性フラグメントをコードする。この種の特定の実施形態では、ｇｐ８５の抗原性フラグメントは、ＦｅＬＶ糖タンパク質ｇｐ７０である。他の関連する実施形態では、ｇｐ８５の抗原性フラグメントは、ＦｅＬＶ糖タンパク質ｇｐ４５である。さらに特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子であるアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。さらに一層具体的な実施形態では、ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＴＣ－８３ ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。

さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの２つ以上のセットを含む。この種の特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの一方のセットは第１の核酸構築物を含み、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの他方のセットは第２の核酸構築物を含む。この種の具体的な実施形態では、第１の核酸構築物はＦＣＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードし、第２の核酸構築物はネコカリシウイルス（ＦＣＶ）抗原またはその抗原性フラグメントをコードする。この種の特定の実施形態では、ＦＣＶ抗原は、強毒全身性ネコカリシウイルス（ＶＳ－ＦＣＶ）分離株に由来する。他の実施形態では、ＦＣＶ抗原は、古典的（Ｆ９様）ネコカリシウイルス分離株に由来する。さらに他の実施形態では、第２の核酸構築物は、一方が強毒全身性ネコカリシウイルス分離株に由来し、他方が古典的（Ｆ９様）ネコカリシウイルス分離株に由来する２つのＦＣＶ抗原をコードする。

なお他の実施形態では、免疫原性組成物は、第１の核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの１つのセットと、第２の核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの別のセットと、第３の核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの第３のセットとを含む。この種の特定の実施形態では、第１の核酸構築物はＦｅＬＶ抗原またはその抗原性フラグメントをコードし、第２の核酸構築物は、強毒全身性ネコカリシウイルスに由来するネコカリシウイルス（ＦＣＶ）抗原またはその抗原性フラグメントをコードし、第３の核酸構築物は、古典的（Ｆ９様）ネコカリシウイルスに由来するネコカリシウイルス（ＦＣＶ）抗原またはその抗原性フラグメントをコードする。

さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、第１の核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの１つのセットと、第２の核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの別のセットと、第３の核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの第３のセットと、第４の核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの第４のセットとを含む。この種の特定の実施形態では、第１の核酸構築物は、強毒全身性ネコカリシウイルスに由来するネコカリシウイルス（ＦＣＶ）抗原またはその抗原性フラグメント、および古典的（Ｆ９様）ネコカリシウイルスに由来するネコカリシウイルス（ＦＣＶ）抗原またはその抗原性フラグメントの両方をコードする。

なお他の実施形態では、免疫原性組成物は、第１の核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターのセットと、第２の核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの別のセットと、第３の核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの第３のセットと、第４の核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの第４のセットと、第５の核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターの第５のセットとを含む。そのような実施形態では、第１の核酸構築物、第２の核酸構築物、第３の核酸構築物、第４の核酸構築物および第５の核酸構築物のヌクレオチド配列はいずれも異なる。この種の特定の実施形態では、第１の核酸構築物は、強毒全身性ネコカリシウイルスに由来するネコカリシウイルス（ＦＣＶ）抗原またはその抗原性フラグメント、および古典的（Ｆ９様）ネコカリシウイルスに由来するネコカリシウイルス（ＦＣＶ）抗原またはその抗原性フラグメントの両方をコードする。

したがって、本発明の免疫原性組成物は、非ＦＣＶ病原体に対する防御免疫を誘発するための少なくとも１つの非ＦＣＶ抗原をコードする核酸構築物を含むアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または裸のＤＮＡベクターを含有することができる。この種の特定の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）に由来するタンパク質抗原である。他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）に由来するタンパク質抗原である。さらに他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコニューモウイルス（ＦＰＮ）に由来するタンパク質抗原である。なお他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）に由来するタンパク質抗原である。さらに他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）に由来するタンパク質抗原である。なお他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコ免疫不全ウイルスに由来するタンパク質抗原である。さらに他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、狂犬病ウイルスに由来するタンパク質抗原である。なお他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）に由来するタンパク質抗原である。さらに他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコインフルエンザウイルスに由来するタンパク質抗原である。なお他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコ汎血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）に由来するタンパク質抗原である。さらに他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネココロナウイルス（ＦＣｏＶ）に由来するタンパク質抗原である。なお他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、ネコ鼻腔気管炎ウイルス（ＦＶＲ）に由来するタンパク質抗原である。なお他の実施形態では、非ＦＣＶ抗原は、クラミドフィラ・フェリスに由来するタンパク質抗原である。

本発明はさらに、ともにＦＣＶ（例えば、ＦＣＶキャプシドタンパク質）に由来する１つ以上の抗原またはその抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含み、更に、１つ以上の改変された生／弱毒化または死滅ネコ病原体を含む組合せ免疫原性組成物および／またはワクチン（多価ワクチン）を提供する。特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ＦｅＬＶに由来する抗原またはその抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と組み合わされた改変された生または死滅クラミドフィラ・フェリスをさらに含む。他の実施形態では、免疫原性組成物は、ＦｅＬＶに由来する抗原またはその抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と組み合わされた改変された生または死滅ネコ鼻腔気管炎ウイルス（ＦＶＲ）をさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、ＦｅＬＶに由来する抗原またはその抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と組み合わされた改変された生または死滅ネコ汎血球減少症ウイルス（ＦＰＬ）をさらに含む。特定の実施形態では、ワクチンは、これらの免疫原性組成物のうちの１つ以上の免疫学的有効量を含む。

さらに具体的な実施形態では、免疫原性組成物は、ＶＳ－ＦＣＶに由来するキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含み、そして更に、改変された生または死滅Ｆ９様ＦＣＶをさらに含む。なお他の実施形態では、免疫原性組成物は、ＶＳ－ＦＣＶに由来するキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含み、そして更に、改変された生または死滅Ｆ９様ＦＣＶ、改変された生または死滅クラミドフィラ・フェリス、改変された生または死滅ＦＶＲ、および改変された生または死滅ＦＰＬをさらに含む。関連する実施形態では、免疫原性組成物はまた、ＦｅＬＶに由来する抗原またはその抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。この種の特定の実施形態では、ＦｅＬＶのネコ抗原は、ＦｅＬＶウイルス糖タンパク質（ｇｐ８５）である。特定の実施形態では、本発明は、これらの免疫原性組成物のうちの１つ以上の免疫学的有効量を含むワクチンを提供する。

特定の実施形態では、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントをコードする。この種の具体的な実施形態では、ＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。この種のさらに具体的な実施形態では、ＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。この種のさらになお具体的な実施形態では、ＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。この種の具体的な実施形態では、ＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質は、配列番号１または配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされる。

関連する実施形態では、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントをコードする。この種の具体的な実施形態では、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。この種のさらに具体的な実施形態では、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。この種のさらになお具体的な実施形態では、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。この種の具体的な実施形態では、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質は、配列番号３または配列番号１３のヌクレオチド配列によってコードされる。

特定の実施形態では、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＦｅＬＶ糖タンパク質（ｇｐ８５）をコードする。この種の具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ糖タンパク質ｇｐ８５は、配列番号６のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。この種のさらに具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ糖タンパク質（ｇｐ８５）は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。この種のさらになお具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ糖タンパク質（ｇｐ８５）は、配列番号５または配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされる。

関連する実施形態では、ＦｅＬＶ糖タンパク質ｇｐ７０は、配列番号８のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。この種のさらに具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ糖タンパク質（ｇｐ８５）は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。この種のさらになお具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ糖タンパク質（ｇｐ７０）は、配列番号７または配列番号１５のヌクレオチド配列によってコードされる。

さらに他の実施形態では、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｇ）をコードする。この種の具体的な実施形態では、狂犬病ウイルス糖タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。この種のさらに具体的な実施形態では、狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｇ）は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。この種のさらになお具体的な実施形態では、狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｇ）は、配列番号９または配列番号１６のヌクレオチド配列によってコードされる。

本発明はさらに、本発明の免疫原性組成物を含む多価ワクチンを含むワクチンを含む。特定の実施形態では、ワクチンは非アジュバントワクチンである。特定の実施形態では、ワクチンは、ＦＣＶに起因する疾患の予防を補助する。関連する実施形態では、ネコがワクチンにより免疫されると、ネコ対象に抗体が誘導される。

本発明はまた、ネコ病原体、例えばＦＣＶに対してネコを免疫する方法であって、本発明のワクチンまたは多価の免疫学的有効量をネコに投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、ワクチンは筋肉内注射を介して投与される。代替の実施形態では、ワクチンは皮下注射を介して投与される。他の実施形態では、ワクチンは静脈内注射を介して投与される。なお他の実施形態では、ワクチンは皮内注射を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンは経口投与を介して投与される。なお他の実施形態では、ワクチンは鼻腔内投与を介して投与される。具体的な実施形態では、ネコはイエネコである。

本発明のワクチンおよび多価ワクチンは、プライマーワクチンおよび／またはブースターワクチンとして投与することができる。具体的な実施形態では、本発明のワクチンは、その後の投与を必要とせずに、単回接種ワクチン（１回用量）として投与される。特定の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンの両方の投与の場合、プライマーワクチンおよびブースターワクチンは、同一の経路によって投与することができる。この種の特定の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンはともに皮下注射によって投与される。代替の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンの両方の投与の場合、プライマーワクチンの投与は１つの経路によって行い、ブースターワクチンの投与は別の経路によって行うことができる。この種の特定の実施形態では、プライマーワクチンは皮下注射によって投与することができ、ブースターワクチンは経口投与することができる。

本発明はさらに、ＦＣＶに対してネコを免疫する方法であって、上記のワクチンの免疫学的有効量をネコに注射することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、ワクチンは、例えば、約１×１０^４～約１×１０^１０又はそれ以上のＲＰを含むことができる。さらに特定の実施形態では、ワクチンは、約１×１０^５～約１×１０^９のＲＰを含むことができる。さらになお特定の実施形態では、ワクチンは、約１×１０^６～約１×１０^８のＲＰを含むことができる。特定の実施形態では、ネコはイエネコである。

特定の実施形態では、本発明のワクチンは、０．０５ｍＬ～３ｍＬの用量で投与される。さらに特定の実施形態では、投与される用量は、０．１ｍＬ～２ｍＬである。なお一層特定の実施形態では、投与される用量は、０．２ｍＬ～１．５ｍＬである。さらに他の実施形態では、投与される用量は、０．５ｍＬ～２．０ｍＬである。なお他の実施形態では、投与される用量は、０．３～１．０ｍＬである。さらに一層特定の実施形態では、投与される用量は、０．４ｍＬ～０．８ｍＬである。

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明を参照することによってさらによく理解されるであろう。

本発明は、効果的で安全なＦＣＶワクチンを提供する。特定の実施形態では、ワクチンはアジュバント化されていない。一態様では、本発明のワクチンは、ネコ注射部位肉腫を誘発しないが、それでもなお、ＦＣＶ感染によって引き起こされる上気道疾患および／または跛行症候群からのワクチン接種対象の保護に役立つ。特定の実施形態では、ＦＣＶキャプシドタンパク質は、強毒全身性ＦＣＶ（ＶＳ－ＦＣＶ）に由来する。関連する実施形態では、ＦＣＶキャプシドタンパク質は、ＦＣＶ Ｆ９株（Ｆ９様ＦＣＶ）のようなさらに古い株に由来する。

したがって、本発明のワクチン組成物は、レシピエントワクチン接種動物の防御免疫の誘発を補助する、ネコカリシウイルスの１つ以上の株由来の抗原をコードする免疫学的有効量のベクターを含む。さらに、本発明は、ワクチン接種の信頼性を改善して、ＦＣＶに感染したネコのネコの上気道疾患の減少を補助し、それにより、疾患を比較的一過性または軽度なものとし、および／または感染の減少をもたらす新しい免疫原性組成物を提供する。本発明の特定の態様では、ワクチンは、例えば、ＶＳ－ＦＣＶ、または代わりに、ＦＣＶ Ｆ９様株のような古典的株に由来するＦＣＶキャプシドをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）を含む。

さらに具体的な実施形態では、ワクチンは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）のキャプシドタンパク質および糖タンパク質を含み、そして、ＦＣＶキャプシドタンパク質および／またはその抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）を含む。さらになお具体的な実施形態では、ワクチンは、ＶＥＥの無毒性ＴＣ－８３株のキャプシドタンパク質および糖タンパク質を含み、そして、１つ以上のＦＣＶキャプシドタンパク質および／またはその１つ以上の抗原性フラグメントをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）を含む。

本発明の別の態様では、ワクチンは、１つ以上のＦＣＶキャプシドタンパク質および／またはその１つ以上の抗原性フラグメントをコードする裸のＤＮＡベクターを含む。本発明のワクチンは、アジュバントの非存在下でネコに投与し、ワクチン接種されたネコをＦＣＶに対して保護することを依然として効果的に補助することができる。

本発明をさらに完全に理解するために、以下の定義が提供される。

説明の便宜のための単数形の用語の使用は、決してそのように限定することを意図するものではない。したがって、例えば、「ポリペプチド」を含む組成物への言及は、そのようなポリペプチドのうちの１つ以上への言及を含む。さらに、「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」への言及は、特に指示しない限り、複数のそのようなアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子への言及を含む。

本明細書で使用される場合、用語「およそ」は、用語「約」と区別なく使用され、ある値が示された値の５０％以内であること、すなわち、１ミリリットル当たり「およそ」１×１０^８のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含有する組成物が、１ミリリットル当たり０．５×１０^８～１．５×１０^８のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含有することを意味する。

本明細書で使用される場合、用語「ネコ」は、ネコ科の任意の一員を指す。イエネコ、純血種および／または雑種のペット用ネコ、および野生又は野良ネコはいずれもネコである。

本明細書で使用される場合、用語「レプリコン」は、それらが存在するならば、細胞培養物または動物宿主に対して親ウイルスの増殖を成功させることができるであろう１つ以上の要素（例えば、構造タンパク質のコード配列）を欠く改変されたＲＮＡウイルスゲノムを指す。好適な細胞の状況では、レプリコンはそれ自体を増幅し、１つ以上のサブゲノムＲＮＡ種を生成し得る。

本明細書で使用される場合、「ＲＰ」と略される用語「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」は、例えば、Ｐｕｓｈｋｏら［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９（２）：３８９－４０１（１９９７）］によって記載されるように、構造タンパク質、例えば、同じくアルファウイルスに由来するキャプシドおよび糖タンパク質に包み込まれたアルファウイルス由来ＲＮＡレプリコンである。レプリコンはアルファウイルスの構造成分（例えば、キャプシドおよび糖タンパク質）をコードしないため、ＲＰは細胞培養物または動物宿主では（ヘルパープラスミドまたは類似の成分を用いることなく）増殖することができない。

用語「ＦＣＶ Ｆ９様」および「Ｆ９様ＦＣＶ」は、相互に、および用語「古典的ＦＣＶ」と区別なく使用され、本明細書で使用される場合、ＦＣＶ Ｆ９株が典型的な代表であると考えられる、ＦＣＶの比較的古く、以前の万能なワクチン株として特徴付けられ得るＦＣＶである。これとは対照的に、強毒全身性「ＶＳ－ＦＣＶ」または本明細書で区別なく使用される「（ＶＳ）ＦＣＶ」と称されるＦＣＶは、比較的新しいクラスのＦＣＶであり、非常に強毒性であり、ＦＣＶ Ｆ９様株に対して生じた抗体によって中和することができない［米国特許第７，４４９，３２３号；Ｒａｄｆｏｒｄら、３８（２）Ｖｅｔ ｒｅｓ ３１９－３３５（２００７）を参照］。

用語「非ＦＣＶ」は、それぞれの病原体および／または抗原（または免疫原）がＦＣＶ病原体およびＦＣＶ抗原（または免疫原）のいずれでもなく、非ＦＣＶタンパク質抗原（または免疫原）がＦＣＶに由来しないことを意味するように、病原体および／または抗原（または免疫原）のような用語を修飾するために使用される。

用語「由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｅ ｆｒｏｍ）」、「由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ）」および「由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ ｆｒｏｍ）」は、所与のタンパク質抗原およびそれを天然にコードする病原体またはその病原体の株に関して区別なく使用され、本明細書で使用される場合、その所与のタンパク質抗原の未改変および／または切断アミノ酸配列が、その病原体またはその病原体の株によってコードされていることを意味する。本発明の核酸構築物内では、病原体に由来するタンパク質抗原のコード配列は、それが由来する病原体または病原体の株（自然弱毒株を含む）におけるそのタンパク質抗原の対応する配列に対して、発現されたタンパク質抗原のアミノ酸配列の改変および／または切断をもたらすように遺伝的に操作され得る。

本明細書で使用される場合、用語「保護する」、または「保護を提供する」、または「防御免疫を誘発する」、「疾患の予防を補助する」、および「保護を補助する」は、感染の何らかの兆候からの完全な保護を必要としない。例えば、「保護に役立つ」は、惹起後に、根底にある感染の症状が少なくとも減少し、および／または症状を引き起こす、根底にある細胞性、生理学的または生化学的な原因または機構のうちの１つ以上が減少および／または排除されるように、保護が十分であることを意味し得る。これに関連して使用される場合、「減少した」は、感染の生理学的状態だけでなく、感染の分子状態を含め、感染の症状に関連することを意味すると理解されたい。

本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、動物、例えばネコ（特定の実施形態ではヒトを含むが、他の実施形態ではヒトに特異的ではない）に適用するのに適した、水を含有する液体などの薬学的に許容される担体と典型的に組み合わされた１つ以上の抗原を含む組成物であり、動物に投与すると、野生型微生物による感染から生じる疾患からの保護を最小限に補助するのに十分に強力な、すなわち、疾患の予防、および／または疾患の予防、改善または治癒を補助するのに十分な強力な免疫応答を誘導する。

本明細書で使用される場合、多価ワクチンとは、２つ以上の異なる抗原を含むワクチンである。この種の特定の実施形態では、多価ワクチンは、２つ以上の異なる病原体に対してレシピエントの免疫系を刺激する。

用語「アジュバント」および「免疫刺激剤」は、本明細書では区別なく使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つ以上の物質として定義される。これに関連して、アジュバントは、１つ以上のワクチン抗原／分離株に対する免疫応答を増強するために使用される。したがって、「アジュバント」は、特定の抗原に対する免疫応答を非特異的に増加させ、ひいては、任意の所与のワクチンに必要な抗原の量、および／または目的の抗原に対する適切な免疫応答をもたらすために必要な注射の頻度を減少させる薬剤である。これに関連して、アジュバントは、１つ以上のワクチン抗原／分離株に対する免疫応答を増強するために使用される。例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｌｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒｓ Ｆｅｌｉｎｅ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓは、非アジュバントＦｅＬＶワクチンの使用を提案している［ＡＡＦＰ Ｆｅｌｉｎｅ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｐａｎｅｌ，１５：７８５－８０８（２０１３）］。

本明細書で使用される場合、「非アジュバントワクチン」は、アジュバントを含有しないワクチンまたは多価ワクチンである。

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、その修飾された名詞が医薬品に使用するのに適切であることを意味するように形容詞的に使用される。用語「薬学的に許容される」は、例えば、医薬品ワクチン中の賦形剤を説明するために使用される場合、組成物の他の成分と適合し、意図されるレシピエント動物、例えばネコに不都合なほど有害ではないとして賦形剤を特徴付ける。

非経口投与」には、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射および注入が含まれる。

本明細書で使用される場合、特定のタンパク質（例えば、タンパク質抗原）に関する用語「抗原性フラグメント」は、抗原性の、すなわち免疫系の抗原認識分子、例えば、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体と特異的に相互作用することができる、そのタンパク質のフラグメントである。例えば、ＦＣＶキャプシドタンパク質の抗原性フラグメントは、抗原性であるキャプシドタンパク質のフラグメントである。具体的な実施形態では、ＦＣＶキャプシドタンパク質の抗原性フラグメントは、主要なＢ細胞エピトープを含む、ＯＲＦ２の領域Ｅを含む。好ましくは、本発明の抗原性フラグメントは、抗体および／またはＴ細胞受容体認識に対して免疫優性である。特定の実施形態では、所与のタンパク質抗原に関する抗原性フラグメントは、全長タンパク質の抗原性の少なくとも２５％を保持する、そのタンパク質のフラグメントである。好ましい実施形態では、抗原性フラグメントは、全長タンパク質の抗原性の少なくとも５０％を保持する。さらに好ましい実施形態では、抗原性フラグメントは、全長タンパク質の抗原性の少なくとも７５％を保持する。抗原性フラグメントは、２０アミノ酸程度の小さなものである場合もあれば、極端な場合、全長タンパク質から１つのアミノ酸だけが失われている大きなフラグメントである場合もある。特定の実施形態では、抗原性フラグメントは、２５～１５０のアミノ酸残基を含む。他の実施形態では、抗原性フラグメントは、５０～２５０のアミノ酸残基を含む。例えば、ＦｅＬＶの場合、ＦｅＬＶ ｇｐ４５糖タンパク質およびＦｅＬＶ ｇｐ７０糖タンパク質は、ＦｅＬＶ ｇｐ８５糖タンパク質の抗原性フラグメントである。

本明細書で使用される場合、２つの配列のアミノ酸残基が同一である場合、１つのアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列に対して１００％「同一」であるか、１００％の「同一性」を有する。したがって、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基の５０％が同一である場合、アミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列と５０％「同一」である。配列比較は、所与のタンパク質、例えば、比較されるタンパク質、またはポリペプチドの一部に含まれるアミノ酸残基の連続したブロックに対して行われる。特定の実施形態では、普通なら２つのアミノ酸配列間の対応を変更する可能性がある選択された欠失または挿入が考慮に入れられる。

本明細書で使用される場合、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列のパーセント同一性は、アライメントのデフォルトパラメーター、および同一性のためのデフォルトパラメーターとともに、Ｃ，ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ，ＮＣ ２７５１９），Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ ＭＤ），Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ ＰＬＣ（１９９６）およびＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用して決定することができる。これらの市販のプログラムは、同じまたは類似のデフォルトパラメーターを使用して配列類似性を決定するために使用することもできる。あるいは、例えば、デフォルトパラメーターを使用するＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のパイルアッププログラムを使用して、デフォルトのフィルター条件下でＡｄｖａｎｃｅｄ Ｂｌａｓｔ検索を使用することができる。

本明細書で使用される場合、用語「不活化」微生物は、用語「死滅」微生物と区別なく使用される。本発明の目的では、「不活化」微生物とは、動物に免疫応答を誘導することができるが、動物に感染することができない生物である。本発明の抗原（例えば、不活化ネコカリシウイルス）は、バイナリーエチレンイミン、ホルマリン、ベータプロピオラクトン、チメロサールからなる群から選択される薬剤、または熱によって不活化されてもよい。特定の実施形態では、本発明のＲＰと組み合わされた不活化ネコカリシウイルス分離株は、バイナリーエチレンイミンによって不活化される。

本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、凍結乾燥され、滅菌水希釈剤によって再水和されてもよい。一方、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を別個に保存するが、投与前に他のワクチン成分と混合することを意図する場合、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、これらの成分の安定化溶液、例えば高スクロース溶液中で保存することができる。

本発明のワクチンは、静脈内、筋肉内、皮下、経口、鼻腔内、皮内および／または腹腔内ワクチン接種を含む任意の標準的な経路によって容易に投与することができる。当業者であれば、ワクチン組成物が好ましくは各種のレシピエント動物および投与経路に対して適切に製剤化されることを理解するであろう。

したがって、本発明はまた、ＦＣＶおよび／または他のネコ病原体に対してネコを免疫する方法を提供する。そのような方法の１つは、本発明のワクチンの免疫学的有効量をネコに注射することを含み、その結果、ネコは適切なＦＣＶ抗体を産生する。

多価ワクチン
本発明はまた、多価ワクチンを提供する。例えば、ネコ用ワクチンに有用なタンパク質抗原もしくはその抗原性フラグメントのコード配列、またはタンパク質抗原のそのようなコード配列の組合せは、ワクチン中のＦＣＶ［例えば、ＦＣＶキャプシドタンパク質］のネコ抗原をコードするものとして、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）に付加するか、同じＲＰ中で組み合わせることができる。具体的な実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントおよびＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントの両方をコードし、非ＦＣＶ抗原をコードする。したがって、そのような多価ワクチンは本発明に含まれる。

そのようなタンパク質抗原のうちの１つ以上が由来し得る病原体の例には、ネコ鼻腔気管炎ウイルス（ＦＶＲ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎血球減少症ウイルス（ＦＰＬ）ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、他のＦＣＶ株、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ免疫不全ウイルス、ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）、狂犬病ウイルス、ネコインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、トリインフルエンザ、イヌニューモウイルス、ネコニューモウイルス、クラミドフィラ・フェリス（ＦＫＡクラミジア・シタッシ（ＦＫＡ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ））、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）およびバルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）属（例えば、Ｂ．ヘンセラ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ））を含み得る。特定の実施形態では、これらのネコ病原体またはイヌ病原体のうちの１つ以上に由来するキャプシドタンパク質または類似タンパク質のコード配列をＦＣＶ抗原と同じＲＰに挿入することができる。あるいは、またはそれと組み合わせて、これらのネコ病原体またはイヌ病原体のうちの１つ以上に由来するキャプシドタンパク質または類似タンパク質のコード配列を１つ以上の他のＲＰに挿入することができ、これをワクチン中で、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントおよび／またはＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントをコードするＲＰと組み合わせることができる。

さらに、１つ以上の他の生弱毒ウイルス分離株、例えば、生弱毒ＦＣＶ Ｆ９様ウイルス（例えば、改変された生ＦＣＶ Ｆ９）および／または生弱毒ネコヘルペスウイルスおよび／または生弱毒ネコパルボウイルスおよび／または生弱毒ネコ白血病ウイルスおよび／または生弱毒ネコ伝染性腹膜炎ウイルスおよび／または生弱毒ネコ免疫不全ウイルスおよび／または生弱毒ボルナ病ウイルスおよび／または生弱毒狂犬病ウイルスおよび／または生弱毒ネコインフルエンザウイルスおよび／または生弱毒イヌインフルエンザウイルスおよび／または生弱毒トリインフルエンザおよび／または生弱毒イヌニューモウイルスおよび／または生弱毒ネコニューモウイルスとともに、ＦＣＶの１つ以上の抗原［例えば、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントおよび／またはＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメント］をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）を加えることができる。さらに、生弱毒クラミドフィラ・フェリスおよび／または生弱毒ボルデテラ・ブロンキセプチカおよび／または生弱毒バルトネラ属（例えば、Ｂ．ヘンセラ）も、そのような多価ワクチンに含めることができる。

さらに、１つ以上の他の死滅ウイルス分離株、例えば、死滅ＦＣＶ株および／または死滅ネコヘルペスウイルスおよび／または死滅ネコパルボウイルスおよび／または死滅ネコ白血病ウイルスおよび／または死滅ネコ伝染性腹膜炎ウイルスおよび／または死滅ネコ免疫不全ウイルスおよび／または死滅ボルナ病ウイルスおよび／または死滅狂犬病ウイルスおよび／または死滅ネコインフルエンザウイルスおよび／または死滅イヌインフルエンザウイルスおよび／または死滅トリインフルエンザウイルスおよび／または死滅イヌニューモウイルスおよび／または死滅ネコニューモウイルスとともに、ＦＣＶの１つ以上の抗原［例えば、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメントおよび／またはＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその抗原性フラグメント］をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）を加えることができる。さらに、クラミドフィラ・フェリスおよび／またはボルデテラ・ブロンキセプチカおよび／またはバルトネラ属（例えば、Ｂ．ヘンセラ）のバクテリン（またはバクテリンの亜分画、例えば線毛亜分画）もそのような多価ワクチンに含めることができる。

また、本発明は、本明細書に開示される特定の構成、プロセス工程および材料に限定されず、したがって、構成、プロセス工程および材料はいくらか変動し得ることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明する目的のみのために使用され、限定することを意図しないことをさらに理解されたい。

配列
ネコカリシウイルスキャプシド（ＶＳ－ＦＣＶ）配列番号１
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ネコカリシウイルスキャプシド（ＶＳ－ＦＣＶ）配列番号２
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ネコカリシウイルス（ＶＳ－ＦＣＶ）キャプシド（配列番号１２）
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ネコカリシウイルス（Ｆ９様）キャプシド（配列番号３）
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ネコカリシウイルス（Ｆ９様）キャプシド（配列番号４）
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ＩＰＡＧＤＹＡＩＴＮＧＴＧＮＤＩＴＴＡＴＧＹＤＴＡＤＩＩＫＮＮＴＮＦＲＧＭＹＩＣＧＳＬＱＲＡＷＧＤＫＫＩＳＮＴＡＦＩＴＴ
ＡＴＬＤＧＤＮＮＮＫＩＮＰＣＮＴＩＤＱＳＫＩＶＶＦＱＤＮＨＶＧＫＫＡＱＴＳＤＤＴＬＡＬＬＧＹＴＧＩＧＥＱＡＩＧＳＤＲＤＲ
ＶＶＲＩＳＴＬＰＥＴＧＡＲＧＧＮＨＰＩＦＹＫＮＳＩＫＬＧＹＶＩＲＳＩＤＶＦＮＳＱＩＬＨＴＳＲＱＬＳＬＮＨＹＬＬＰＰＤＳＦ
ＡＶＹＲＩＩＤＳＮＧＳＷＦＤＩＧＩＤＳＤＧＦＳＦＶＧＶＳＧＦＧＫＬＥＦＰＬＳＡＳＹＭＧＩＱＬＡＫＩＲＬＡＳＮＩＲＳＰＭＴ
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ネコカリシウイルス（Ｆ９様）キャプシド（配列番号１３）
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ネコ白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ８５）配列番号５
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ネコ白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ８５）配列番号６
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ネコ白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ８５）配列番号１４
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ネコ白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ７０）配列番号７
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ネコ白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ７０）配列番号８
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ＣＬＶＳＲＰＰＹＹＥＧＩＡＩＬＧＮＹＳＮＱＴＮＰＰＰＳＣＬＳＴＰＱＨＫＬＴＩＳＥＶＳＧＱＧＭＣＩＧＴＶＰＫＴＨＱＡＬＣＮＫＴＱＱＧＨＴＧＡＨ
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ネコ白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ７０）配列番号１５
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狂犬病ウイルスＧ（配列番号９）
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狂犬病ウイルスＧ（配列番号１０）
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狂犬病ウイルスＧ（配列番号１６）
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以下の実施例は、本発明のさらなる認識を提供するのに役立つが、本発明の有効な範囲を制限することを決して意味するものではない。

［実施例］
［実施例１］
アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子へのＦＣＶキャプシドタンパク質のコード配列の組込み
緒言
ＲＮＡウイルスは、ゲノムに遺伝子操作されたワクチン抗原を導入するためのベクタービヒクルとして使用されてきた。しかし、現在までのそれらの使用は、ＲＮＡウイルスにウイルス抗原を組み込み、次いでレシピエント宿主にウイルスを導入することに主に限定されてきた。その結果、組み込まれたウイルス抗原に対する防御抗体が誘導される。アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、病原抗原をコードするために使用されている。そのようなアルファウイルスレプリコンプラットフォームは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）［Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９－４０１（１９９７）］、シンドビス（ＳＩＮ）［これによりその内容全体が本明細書に組み込まれるＢｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：６４３９－６４４６（１９９３）］およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）［これによりその内容全体が本明細書に組み込まれるＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６－１３６１（１９９１）］を含むいくつかの異なるアルファウイルスから開発されている。さらに、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ブタおよび家禽用のいくつかの米国農務省認可ワクチンの基礎となっている。これらには、ブタ流行性下痢ワクチン（ＲＮＡ粒子）（製品コード１９Ｕ５．Ｐ１）、ブタインフルエンザワクチン（ＲＮＡ）（製品コード１９Ａ５．Ｄ０）、トリインフルエンザワクチン（ＲＮＡ）（製品コード１９Ｏ５．Ｄ０）および処方品（ＲＮＡ粒子）（製品コード９ＰＰ０．００）が含まれる。

アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の構築
ＦＣＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を使用して、インシリコでコドン最適化（ネココドン使用）ヌクレオチド配列を生成した。最適化された配列は、商用業者（ＡＴＵＭ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）によって合成ＤＮＡとして調製された。したがって、ＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質およびＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、合成遺伝子をそれぞれ設計した。ＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質［配列番号２］またはＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質［配列番号４］のアミノ酸配列をコードする構築物を、アルファウイルスレプリコンプラスミドへのクローニングに適切なフランキング配列を有するようにネコ用にコドン最適化した。

以前に記載されたように［米国特許第９，４４１，２４７号を参照；その内容は参照により本明細書に組み込まれる］、以下の改変を加えて、ＦＣＶキャプシドタンパク質を発現するように設計されたＶＥＥレプリコンベクターを構築した。制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩを用いて、ＴＣ－８３由来レプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［米国特許第９，４４１，２４７号に開示され記載されている］を消化した。制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩを用いて、ＦＣＶキャプシドタンパク質遺伝子のうちの１つ（ＦＣＶ Ｆ９様またはＶＳ－ＦＣＶのいずれか）のコドン最適化オープンリーディングフレームヌクレオチド配列を含み、５’フランキング配列（５’－ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣ－３’）［配列番号１１］および３’フランキング配列（５’－ＴＴＡＡＴＴＡＡ－３’）を有するＤＮＡプラスミドを同様に消化した。次いで、同様に消化されたｐＶＥＫベクターに合成遺伝子カセットをライゲーションし、それぞれＦＣＶ Ｆ９様およびＶＳ－ＦＣＶキャプシドタンパク質をコードする得られたクローンを、「ｐＶＨＶ－Ｆ９」および「ｐＶＨＶ－Ｋａｌｅｍ」と再命名した。「ｐＶＨＶ」ベクターの命名は、ｐＶＥＫの多重クローニング部位中のＡｓｃＩ部位およびＰａｃＩ部位を介してクローニングされた導入遺伝子カセットを含むｐＶＥＫ由来レプリコンベクターを指すように選択された。

二重構築物を作製するために、ＶＥＥサブゲノムプロモーターおよびＦＣＶ Ｋａｌｅｍ（ＶＳ－ＦＣＶ）キャプシド配列をコードするｐＶＨＶベクター領域をＰＣＲによって除去し、Ｆ９ ＦＣＶキャプシド配列の３’末端とＶＥＥ ３’ＵＴＲ配列との間のｐＶＨＶ－Ｆ９ベクターにライゲーションした。サブゲノムプロモーター配列の重複、およびＦＣＶ Ｋａｌｅｍキャプシド配列の確認は、「ｐＶＨＶ－Ｆ９－Ｋａｌｅｍ」と呼ばれる最終ベクタークローンの配列決定によって達成した。

ＴＣ－８３ ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の作製は、以前に記載された方法［米国特許第９，４４１，２４７号および米国特許第８，４６０，９１３号；その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる］に従って行った。要約すると、ｐＶＨＶレプリコンベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドを、ＮｏｔＩ制限酵素を用いて線形化した後、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびキャップ類似体（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してインビトロ転写を行った。重要なことに、この作製に使用されるヘルパーＲＮＡは、以前に記載されているように、ＶＥＥサブゲノムプロモーター配列を欠いている［Ｋａｍｒｕｄら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ９１（Ｐｔ ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］。レプリコンおよびヘルパー成分の精製ＲＮＡを組み合わせ、Ｖｅｒｏ細胞の懸濁液と混合し、４ｍｍキュベットで電気穿孔し、ＯｐｔｉＰｒｏ（登録商標）ＳＦＭ細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）に戻した。一晩インキュベーションした後、ＺｅｔａＰｌｕｓ ＢｉｏＣａｐデプスフィルター（３Ｍ，Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ，ＭＮ）に懸濁液を通し、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、最後に４００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液を用いて、保持されたＲＰを溶出することによって、細胞および培地からアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を精製した。溶出したＲＰを、最終的な５％スクロース（ｗ／ｖ）に配合し、０．２２ミクロンのメンブレンフィルターに通し、保存のためにアリコートに分注した。感染Ｖｅｒｏ細胞単層に対する免疫蛍光アッセイにより機能性ＲＰの力価を決定した。

［実施例２］
ネコを対象とした二重構築物ＦＣＶワクチンの有効性および安全性の評価
ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）の無毒性ＴＣ－８３株のキャプシドタンパク質および糖タンパク質とともに、２つの異なるＦＣＶ株、強毒全身性株（ＶＳ－ＦＣＶ）および古典的ワクチン株（ＦＣＶ Ｆ９様）由来のキャプシドタンパク質をコードする増殖欠損ＲＮＡ粒子（ＲＰ）を含む二重構築物ワクチンを５％スクロースに配合し、凍結保存した。以下の表１に示すように、この二重構築物ワクチンを使用して、２つのＦＣＶ株による惹起に対する有効性を評価した。各ネコ１０匹の２群に、１３～１４週齢の時点で、次いで２１日後に、プライム／ブーストレジメンで二重構築物ＦＣＶワクチンを接種した。対照ネコの２群に、同じレジメンにより、細胞培養培地（Ｅａｒｌｅ塩を含む最小必須培地、ＥＭＥＭ）からなるプラセボワクチンを接種した。

ワクチン接種後、ワクチンに対するあらゆる局所的または全身的反応、およびＦＣＶ感染の臨床徴候についてネコを観察することにより、ワクチンに対する有害反応についてネコを観察した。ワクチン接種したネコのいずれにも有害反応は観察されなかった。

ブースターワクチン接種の３週間後、第１群および第２群のネコに、ＦＣＶ株２５５（古典的ＦＣＶ惹起株）の強毒培養物を鼻腔内投与して惹起した。ブースターワクチン接種の３週間後、第３群および第４群のネコに、強毒全身性ＦＣＶ惹起株（ＦＣＶ株Ｋａｌｅｍ）の強毒培養物を鼻腔内投与して惹起した。

以下のように惹起後１４日間にわたり、ＦＣＶ感染の臨床徴候についてネコを観察した。ネコを観察し、死亡、抑鬱／嗜眠、体温、鼻および口腔の潰瘍、鼻および眼の分泌物、跛行、脱水ならびにくしゃみを含む臨床徴候を連日スコア化した。惹起後１４日間の間隔をあけて４日間にわたり体重を測定した。観察された各臨床徴候に、重症度と、臨床徴候が観察された日数とに基づいて加重数値スコアを付与した。次いで、各ネコに、毎日の加重スコアの合計に基づいて合計の加重スコアを付与した。次いで、各治療群の平均および中央値加重スコアを計算した。惹起が有効であると考えるためには、対照ネコの８０％にＦＣＶ感染の臨床徴候（発熱以外）が認められなければならない。惹起の結果を以下の表２に要約する。

プラセボワクチンを接種した対照ネコの１００％がＦＣＶ感染の臨床徴候（発熱以外）を示したため、両株に対する惹起は有効であると考えられた。

ＦＣＶの強毒全身性および古典的ワクチン株をコードする二重構築物ＲＰ‐ＦＣＶワクチンは、２つの異なるＦＣＶ株、すなわち、古典的ＦＣＶ株および強毒全身性ＦＣＶ株に対してネコを保護した。この実験用ワクチンはネコに対して安全であることが分かった。

［実施例３］
２つの異なるＲＮＡ粒子ワクチンの投与による阻害の評価
血清学的応答、惹起に対する有効性および阻害を含む、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ＦＣＶワクチンの複数の態様を評価するために試験を実施した。古典的ＦＣＶワクチン株（Ｆ９）のキャプシドタンパク質をコードするＲＰ－ＦＣＶ構築物ワクチンを、ゼラチン、ＮＺアミンおよびスクロースからなる安定剤に配合し、凍結乾燥した。ネコ５匹の２群に、１７週齢の時点でＲＰ－ＦＣＶワクチンを接種した。２１日後、第１群のネコにはＲＰ－ＦＣＶワクチンのブースター用量のみを投与し、第２群のネコにはＲＰ－ＦＣＶワクチンのブースター用量と、表３に示す一定用量のＲＰ－狂犬病ワクチンとを同時に投与した。ＲＰ－狂犬病ウイルスワクチンは、同じＴＣ－８３ ＶＥＥアルファウイルスプラットフォームにおいて狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｇ）をコードする構築物である。

各ワクチン接種後、ワクチンに対するあらゆる局所的または全身的反応についてネコを観察することにより、ワクチンに対する有害反応についてネコを観察した。ワクチン接種したネコのいずれにも有害反応は観察されなかった。

初回ワクチン接種日（試験０日目）、ブースターワクチン接種日（試験２１日目）、および初回ワクチン接種の６週間後（試験４２日目）にネコを採血し、血清を採取した。血清中和アッセイによって、ＦＣＶ Ｆ９に対する抗体価について血清を試験した。また、迅速蛍光焦点抑制試験（ＲＦＦＩＴ）によって、狂犬病ウイルスに対する抗体価についても血清を試験した。ＲＩＦＦＴの結果は、国際単位／ｍＬ（ＩＵ／ｍＬ）として報告する。以下の表４および表５に血清学的結果を要約する。

ＦＣＶ（Ｆ９）抗体価（ブースター後に採取した血清試料に対する）の比較に基づくと、ＲＰ－狂犬病ウイルスワクチンとの同時接種は、ＲＰ－ＦＣＶ（Ｆ９）ワクチンに対する抗体反応を阻害しない。

この試験には、ＲＰ－狂犬病ウイルスワクチンのみを接種した対照群は含めなかったが、第２群のブースター後狂犬病力価を比較するために、他の試験から過去に得られたデータを以下の表６に示す。

ＲＰ－狂犬病ウイルスワクチンの効力、およびワクチン接種後の狂犬病抗体価に基づくと、ＲＰ－ＦＣＶワクチンの事前接種は、ＲＰ－狂犬病ウイルスワクチンに対する抗体反応を阻害しない。ベクター免疫は、プラットフォームに基づくワクチンの懸念事項であるが、この試験結果は、有効性を損なうことなく、複数のＲＰに基づくワクチンを動物に使用することができることを示唆している。

ＲＰ－狂犬病ウイルスとの同時ワクチン接種がＲＰ－ＦＣＶ（Ｆ９）の有効性を阻害しないことを確認するために、試験を修正し、継続した。ワクチン接種されていない対照として役立つように、同年齢のネコ５匹の群を試験に追加した。第１群および第２群の初回ワクチン接種の７９日後、全ネコに強毒の古典的ＦＣＶ株（ＦＣＶ ２５５）を鼻腔内投与して惹起した。

惹起後１４日間にわたり、ＦＣＶ感染の以下の臨床徴候、すなわち、死亡、抑鬱／嗜眠、体温、鼻および口腔の潰瘍、鼻および眼の分泌物、跛行、脱水ならびにくしゃみについてネコを観察し、連日スコア化した。惹起後１４日間の間隔をあけて４日間にわたり体重を測定した。観察された各臨床徴候に、重症度と、臨床徴候が観察された日数とに基づいて加重数値スコアを付与した。次いで、各ネコに、毎日の加重スコアの合計に基づいて合計の加重スコアを付与した。次いで、各治療群の平均および中央値加重スコアを計算した。惹起が有効であると考えるためには、対照ネコの８０％にＦＣＶ感染の臨床徴候（発熱以外）が認められなければならない。惹起の結果を以下の表に要約する。

ワクチン接種しなかった対照ネコの１００％がＦＣＶ感染の臨床徴候（発熱以外）を示したため、惹起は有効であると考えられた。両ワクチン接種群（第１群および第２群）は、強毒のＦＣＶ惹起から有意に保護された（両群についてｐ値０．０１２）。

臨床スコアの比較に基づくと、ＲＰ－狂犬病ウイルスワクチンとの同時ワクチン接種は、ＲＰ－ＦＣＶ（Ｆ９）ワクチンの有効性を阻害しない。この実験用ワクチンはネコに対して安全であることが分かった。

［実施例４］
単一のＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質をコードするＲＰ構築物のネコに対するワクチン有効性の評価
単一のＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質（ＲＰ－ＦＣＶ Ｆ９）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含むネコ用ワクチンの有効性をさらに評価するために本試験を実施した。古典的ＦＣＶ惹起に対して、ワクチンとプラセボ対照群とを比較した。この一価ワクチンまたはプラセボのいずれかをネコに接種し、その後、古典的ＦＣＶを用いて惹起した。臨床スコアは、ＦＣＶ感染の典型的な徴候、主に口腔および外部の潰瘍ならびに鼻炎に基づき、これをＦＣＶ惹起後１４日間にわたりスコア化した。スコアリングシステムは、上記の実施例２および３で説明したものと同じである。一方、プラセボ対照の平均臨床スコアは９２であったが、ＲＰ－ＦＣＶ Ｆ９ワクチンの平均臨床スコアはわずか２であった。また、驚いたことに、ＲＰ－ＦＣＶ Ｆ９ワクチンのスコアは、単一の弱毒化生ＦＣＶ Ｆ９様ウイルスを個別に含めた２つのワクチンにより得られたスコアよりも顕著に低かった。この実験はさらに、ＦＣＶの古典的ワクチン株をコードするＲＰ－ＦＣＶワクチンが、ＦＣＶ Ｆ９様ウイルスからネコを保護することを示している。

本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の説明から当業者には明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。

さらに、核酸またはポリペプチドに与えられるすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子量値は近似値であり、説明のために提供されていることを理解されたい。

Claims (7)

1. 以下をコードするベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）に起因する疾患の予防を補助するためのワクチンであって；
   （ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質、または
   （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む、ＦＣＶ Ｆ９様キャプシドタンパク質、および、
   配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む、強毒全身性ＦＣＶ（ＶＳ－ＦＣＶ）キャプシドタンパク質；
   そして、ここで、該ワクチンは、薬学的に許容される担体を更に含む、
   ワクチン。
2. 第２のＦＣＶ抗原をコードする追加のＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含み、ここで、前記第２のＦＣＶ抗原が、前記ＦＣＶキャプシドタンパク質が由来するものとは異なるＦＣＶ株に由来する、請求項１に記載のワクチン。
3. 非ＦＣＶネコ病原体に対する防御免疫を誘発するための少なくとも１つの非ＦＣＶ抗原をさらに含む、請求項１～２のいずれかに記載のワクチン。
4. 非ＦＣＶ抗原に由来する少なくとも１つのタンパク質抗原をコードするヌクレオチド配列を含むＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載のワクチン。
5. 非アジュバントワクチンである、請求項１～４のいずれかに記載のワクチン。
6. 病原性ＦＣＶに対してネコを免疫する方法であって、請求項１～５のいずれかに記載のワクチンの免疫学的有効量を前記ネコに投与することを含む方法。
7. ネコ被験者に対して免疫学的有効量のワクチンを投与することからなる方法に使用するための、請求項１～５のいずれかに記載のワクチン。