JP2023179547A

JP2023179547A - 多価ネコワクチン

Info

Publication number: JP2023179547A
Application number: JP2023158724A
Authority: JP
Inventors: シュ，ジーチャン; Zhichang Xu; ラフルール，ロンダ; Lafleur Rhonda; ターピー，イアン; Tarpey Ian
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2023-09-22
Publication date: 2023-12-19
Also published as: WO2019115090A1; JP7427585B2; CA3080087A1; AU2018383915A1; AU2018383915B2; AU2022209359A1; JP2021506746A; AU2018383915B9

Abstract

【課題】本発明は、新規なネコ用多価ワクチンを提供する。本発明はまた、多価ワクチンを単独でまたは他の防御剤と組み合わせて作製および使用する方法も提供する。【解決手段】ネコ病原体からの１つまたは複数の抗原をコードするベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、改変された生ネコ病原体と、を含む、免疫原性組成物、該免疫原性組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）および／またはネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）による疾患の予防を助けるためのワクチンとする。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１２月１５
日に出願された米国仮特許出願第６２／５９９４０１号、２０１７年１２月８日に出願さ
れた米国仮特許出願第６２／５９６５０８号、２０１７年１１月６日に出願された米国仮
特許出願第６２／５８２０５０号および２０１７年１１月６日に出願された米国仮特許出
願第６２／５８１９５５号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での優先権を主張する。

本発明は、新規なネコ用多価ワクチンに関する。多価ワクチンを単独でまたは他の防御
剤と組み合わせて作製および使用する方法も提供される。

ネコ呼吸器疾患には、副鼻腔炎、結膜炎、流涙、唾液分泌および口腔潰瘍に代表される
病気が含まれる。ネコの上気道疾患に関連する２つの最も一般的な病原体は、ネコカリシ
ウイルス（ＦＣＶ）とネコヘルペスウイルス１型ウイルス（ＦＨＶ－１）としても知られ
ているネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）である。これら２つのネコウイルスは
、世界中の全てのネコ呼吸器疾患のおよそ８０％の原因であると考えられている。細菌で
あるクラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）は、ネコ呼
吸器疾患でも役割を果たし得る第３の病原体である。したがって、これらの３つの病原体
に対するワクチンが現在市販されている。

ＦＶＲは、イヌヘルペスウイルス１に関連するアルファヘルペスウイルスであり、おそ
らくネコ呼吸器病原体の中で最も重要である。ＦＶＲは、極めて伝染性で、子ネコならび
にネコで重篤な疾患を引き起こし得る大きなエンベロープＤＮＡウイルスである。したが
って、ほとんどのネコは生涯を通じてＦＶＲに曝露される。市販のＮｏｂｉｖａｃ（登録
商標）Ｆｅｌｉｎｅ－１ワクチンは、改変された生ネコウイルス性鼻気管炎ウイルスを含
有している。

ＦＣＶ感染の最も一般的な特徴および臨床徴候は、舌および口腔粘膜上の小胞（潰瘍）
の発生であり、これは小さな個別の潰瘍として始まるが、舌の大部分に広がり、影響を及
ぼし得る。感染したネコでは発熱もしばしば見られる。ＦＣＶの一定の株は、リンピング
症候群（ｌｉｍｐｉｎｇｓｙｎｄｒｏｍｅ）として知られているネコの疾患も引き起こ
し、これは発熱、関節と筋肉の痛み（リンピング）、および時折の舌／口腔潰瘍を特徴と
する。さらに、ＦＣＶのいくつかの株は、感染したネコの慢性口内炎と関連付けられてい
る。ＦＣＶに感染したネコは持続感染する可能性があり、長期間にわたって感染性ウイル
スを排出し得る。

ＦＣＶ分離株は抗原的に極めて可変性で、ＦＣＶＦ９などのＦＣＶの古いワクチン株
でワクチン接種されたネコの抗体は、現在の野外分離株全てを有効に中和するわけではな
い。さらに、全身性疾患および高い死亡率に関連する新たなＦＣＶ株が同定されている［
米国特許第７４４９３２３号明細書参照］。これらの「強毒全身性（ｖｉｒｕｌｅｎｔ
ｓｙｓｔｅｍｉｃ）」（ＶＳ－ＦＣＶ）分離株は、局所的発生の原因であり、現在のワク
チンも、これらの株によって引き起こされる疾患からネコを防御するようには思われない
。

ＦＣＶは、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる一本鎖のプラス鎖
ＲＮＡゲノムを含む。ゲノムは３’末端がポリアデニル化され、５’末端がウイルスコー
ドタンパク質によって結合されている。第１のオープンリーディングフレームは、単一ポ
リペプチドで発現されるウイルスプロテアーゼおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを
コードする。次いで、このポリペプチドはウイルスプロテアーゼによって翻訳後に切断さ
れる。第２のオープンリーディングフレームは、主カプシドタンパク質（すなわち、ＦＣ
Ｖカプシドタンパク質）をコードし、これはＡ－Ｆとして示される６つの領域を有する［
Ｓｃｏｔｔｅｔａｌ．，６０Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．：６５２－６５８（１９
９９）］。領域Ａが切断されて、成熟カプシドタンパク質が産生される。ＯＲＦ２の領域
Ｂ、ＤおよびＦはＦＣＶ分離株間で比較的保存されているが、領域ＣおよびＥは可変性で
あり、ＯＲＦ２の領域Ｅは主要なＢ細胞エピトープを含んでいる［Ｒａｄｆｏｒｄｅｔ
ａｌ．，３８（２）ＶｅｔＲｅｓ．：３１９－３３５（２００７）参照］。ＯＲＦ３
は、マイナーな構造タンパク質をコードする［ＳｏｓｎｏｖｔｓｅｖａｎｄＧｒｅｅ
ｎ，２７７Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１９３－２０３（２０００）］。

クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）は、世界中の
イエネコに特有の細菌である。クラミドフィラ・フェリス（Ｃ．ｆｅｌｉｓ）は、感染し
たネコの結膜炎症、鼻炎および呼吸器系の問題を引き起こし得る。クラミドフィラ・フェ
リス（Ｃ．ｆｅｌｉｓ）は、わずか約１０００個のタンパク質をコードする比較的小さな
ゲノムを有する。この細菌は、７５０００塩基対を含むプラスミドも含む。市販のＮｏｂ
ｉｖａｃ（登録商標）Ｆｅｌｉｎｅ－１ワクチンは、改変された生クラミドフィラ・フェ
リス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）を含有している。

上記のネコ呼吸器疾患に関連する３つの病原体に加えて、ネコは通常、他の３つのウイ
ルス：ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少症（ＦＰＶまたはＦＰＬＶ）
、および狂犬病ウイルスに対してもワクチン接種される。ネコ白血病ウイルスは、イエネ
コに感染するレトロウイルスであり、世界中で重大な罹患率および死亡率をもたらしてい
る。ＦｅＬＶは主に唾液を介して伝染するが、体液との接触を通して広がることも報告さ
れている［Ｐａｃｉｔｔｉｅｔａｌ．，ＶｅｔＲｅｃ１１８：３８１－３８４（
１９８６）ｄｏｉ：１０．１１３６／ｖｒ．１１８．１４．３８１；Ｌｅｖｙｅｔａ
ｌ．，ＪＦｅｌｉｎｅＭｅｄＳｕｒｇ１０：３００－３１６（２００８）ｄｏｉ
：１０．１０１６／ｊ．ｊｆｍｓ．２００８．０３．００２］。ＦｅＬＶ感染中に観察さ
れるネコの臨床徴候には、細胞増殖性障害（リンパ系または骨髄性腫瘍）、細胞抑制性障
害（免疫抑制、貧血、骨髄抑制に関連する感染性疾患）、炎症性障害、神経障害、流産、
および腸炎が含まれる［Ｈｏｏｖｅｒｅｔａｌ．，ＪＡｍＶｅｔＭｅｄＡｓ
ｓｏｃ１９９：１２８７－１２９７（１９９１）；ＬｅｖｙａｎｄＣｒａｗｆｏｒ
ｄ，ＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉ
ｎｅ，６ｔｈｅｄ（ＥｔｔｉｎｇｅｒＳＪ，ＦｅｌｄｍａｎＥＣ．，ｅｄｓ
．）ＷＢＳａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．（２００５）］。
抗原血症の有病率は、健康なネコの１～５％から罹患したネコの１５～３０％までさまざ
まである［Ｈｏｓｉｅｅｔａｌ．ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＲｅｃｏｒｄｓ，１２８：
２９３－２９７（１９８９）；Ｂｒａｌｅｙ，ＦｅｌｉｎｅＰｒａｃｔｉｃｅ２２
：２５－２９（１９９４）；Ｍａｌｉｋｅｔａｌ．，ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＶｅ
ｔｅｒｉｎａｒｙＪｏｕｒｎａｌ７５：３２３－３２７（１９９７）；Ａｒｊｏｎａ
ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
３８：３４４８－３４４９（２０００）］。ＦｅＬＶはしばしば、付随する持続性ウイ
ルス血症を伴う持続的な感染を確立し、しばしば宿主ネコの死につながる。

ＦｅＬＶの一本鎖ＲＮＡゲノムは、３つの遺伝子のみ：（ｉ）エンベロープ糖タンパク
質をコードするＥＮＶ遺伝子、（ｉｉ）ウイルスの主要な構造要素をコードするＧＡＧ遺
伝子、および（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼをコードするＰＯＬ遺伝子をコードする［Ｔ
ｈｏｍｓｅｎｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇ
ｙ７３：１８１９－１８２４（１９９２）］。ＦｅＬＶエンベロープ（ＥＮＶ）遺伝子
は、１つまたは複数の細胞酵素によってタンパク質分解処理されて主要なエンベロープ糖
タンパク質ｇｐ７０および関連する膜貫通タンパク質ｐ１５Ｅを産生するｇｐ８５前駆体
タンパク質をコードする［ＤｅＮｏｒｏｎｈａ，ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８
５：６１７－６２１（１９７８）；Ｎｕｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ８１：３
６７５－３６７９（１９８３）］。膜貫通タンパク質ｐ１５Ｅは、免疫抑制特性を有す
るガンマレトロウイルス間で保存されている配列を含む［Ｍａｔｈｅｓｅｔａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ２７４：６８７－６８９（１９７８）］。近年、欧州医薬品庁の動物用医
薬品委員会（ＣＶＭＰ）は、活性物質として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
）で発現されるＦｅＬＶサブグループＡのｇｐ７０表面糖タンパク質に由来する組換えｐ
４５ＦｅＬＶエンベロープ抗原を含むワクチンについて肯定的な意見を採用した。Ｆｅ
ＬＶエンベロープ糖タンパク質はＦｅＬＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答の標的であると同
時に、中和抗体であり、したがってＦｅＬＶの主要な免疫原の１つである［Ｆｌｙｎｎ
ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（５）：２３０６－２３１５（２００２）］。

ネコ汎白血球減少症（ＦＰＶまたはＦＰＬＶ）は、しばしば致命的なネコの極めて伝染
性のウイルス疾患である。汎白血球減少症という名称は、罹患した動物が示す白血球数（
白血球）が少ないことに由来している。ＦＰＬＶは、リンパ組織、骨髄、腸上皮、および
非常に幼い子ネコでは、網膜および小脳の活発に分裂している細胞に感染し、これらを破
壊する。ウイルスは妊娠中のネコでも経胎盤的に広がり、胚吸収、胎子ミイラ化、死産ま
たは流産を引き起こし得る。感染したネコは、尿、便および鼻分泌物にウイルスを排出し
、感受性ネコがこれらの分泌物または感染したネコのノミと接触すると、感受性ネコが感
染する。ＦＰＬＶ感染による臨床徴候はまた、ネコジステンパーまたはネコパルボとして
分類されている。

ネコ汎白血球減少症ウイルスは、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のパ
ルボウイルス属（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）のメンバーである。したがって、ＦＰＬＶはミ
ンク腸炎ウイルスおよびイヌ２型パルボウイルス（ＣＰＶ－２）と密接に関連している。
ＦＰＬＶは、配列決定された一本鎖ＤＮＡゲノムを有する［Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｇｅ
ｎｏｍｅＡｎｎｏｕｎｃ．Ｍａｒ－Ａｐｒ；３（２）（２０１５）：ｅ０１５５６－１
４参照］。市販のＮｏｂｉｖａｃ（登録商標）Ｆｅｌｉｎｅ－１ワクチンは、改変された
生ネコ汎白血球減少症ウイルスを含有している。

狂犬病は、ヒトおよび他の哺乳動物の脳の炎症をもたらす予防可能な人畜共通感染症で
ある。臨床狂犬病は、典型的には狂暴性狂犬病または麻痺性狂犬病に分類される急性進行
性脳炎である。狂暴性狂犬病は、不穏状態、被刺激性および攻撃性を特徴とする。麻痺性
狂犬病は、過度の唾液分泌、深い努力性呼吸、麻痺、および最終的には昏睡を特徴とする
。狂犬病の原因因子は狂犬病ウイルスであり、これはネコを含むほとんどの哺乳動物に感
染することができ、野生動物および感受性飼育動物の貯蔵所を維持している。

狂犬病ウイルスは、５つの構造タンパク質：核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ
）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリ
メラーゼをコードするエンベロープＲＮＡウイルスである［Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄｅ
ｔａｌ．，ＣｒｉｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ１０：４２７－４３９（１９９１）］
。糖タンパク質（Ｇ）は、ウイルス中和抗体を誘導する防御抗原と考えられている［Ｃｏ
ｘｅｔａｌ．，ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ１６：７５４－７５９（１９７７）］
。この疾患に対抗するために、数種類の狂犬病ワクチンが製造されている。不活化細胞培
養物由来全ウイルス死滅狂犬病ウイルスワクチンが、米国で最も一般的に使用されている
ワクチンである。これらの全ウイルス死滅狂犬病ウイルスワクチンは高レベルの抗原を必
要とするため、アジュバントが必要である。残念ながら、このアジュバントの使用は、注
射部位の反応性、過敏症、さらにはネコの注射部位肉腫の知覚されたリスクと関連してい
る。近年、改変された生ワクチンが、野生動物の免疫化のための経口ワクチンベイトでう
まく使用されている［Ｍａｈｌｅｔａｌ．，ＶｅｔＲｅｓ４５（１）：７７（２
０１４）］。さらに、糖タンパク質（Ｇ）を発現する組換えワクチンが、現在、ネコで使
用するために米国で販売されている。核酸ワクチンも実験室研究で使用されているが、現
在米国では認可されているものはない。

いくつかのベクター戦略は、一定の病原体から防御する努力においてワクチンで長年に
わたって使用されてきた。このようなベクター戦略の１つには、アルファウイルス由来の
レプリコンＲＮＡ粒子（ＲＰ）の使用が含まれ［ＶａｎｄｅｒＶｅｅｎ，ｅｔａｌ．
ＡｎｉｍＨｅａｌｔｈＲｅｓＲｅｖ．１３（１）：１－９．（２０１２）ｄｏｉ：
１０．１０１７／Ｓ１４６６２５２３１２００００１１；Ｋａｍｒｕｄｅｔａｌ．，
ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］、これ
らはベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）［Ｐｕｓｈｋｏｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ２３９：３８９－４０１（１９９７）］、シンドビス（ＳＩＮ）［Ｂｒｅｄｅｎ
ｂｅｅｋｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ６７：６４３９－
６４４６（１９９３）］およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）［Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ
ａｎｄＧａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６－１３６１
（１９９１）］を含むいくつかの異なるアルファウイルスから開発された。ＲＰワクチン
は、増殖不全アルファウイルスＲＮＡレプリコンを宿主細胞に送達し、インビボで（１ま
たは複数の）所望の抗原性導入遺伝子の発現をもたらす［Ｐｕｓｈｋｏｅｔａｌ．，
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２３９（２）：３８９－４０１（１９９７）］。ＲＰは、いくつかの
従来のワクチン製剤と比較した場合、魅力的な安全性および有効性プロファイルを有する
［ＶａｎｄｅｒＶｅｅｎ，ｅｔａｌ．ＡｎｉｍＨｅａｌｔｈＲｅｓＲｅｖ．１
３（１）：１－９．（２０１２）］。ＲＰプラットフォームは、病原性抗原をコードする
ために使用されており、ブタおよび家禽用のいくつかのＵＳＤＡ認可ワクチンの基礎とな
っている。

特に、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、特にベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ア
ルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、全身の抗ウイルス状態を触媒し、致命的なウイ
ルス攻撃から防御する［Ｋｏｎｏｐｋａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８３（２
９）：１２４３２－１２４４２（２００９）］、特に口蹄疫ウイルスに対する迅速な防御
を誘導する［Ｓｅｇｕｎｄｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８７（１０）：５４４
７－５４６０（２０１３）］ことが報告されている。したがって、アルファウイルスＲＮ
Ａレプリコン粒子は生ウイルスに対する自然免疫応答を増強するため、免疫応答に有害で
あると予想されるため、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をワクチン中で改変生ウ
イルスと組み合わせるべきではないように思われる。

本明細書中の任意の参考文献の引用は、このような参考文献が本出願に対する「先行技
術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。

米国特許第７４４９３２３号明細書

Ｓｃｏｔｔｅｔａｌ．，６０Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．：６５２－６５８（１９９９）Ｒａｄｆｏｒｄｅｔａｌ．，３８（２）ＶｅｔＲｅｓ．：３１９－３３５（２００７）ＳｏｓｎｏｖｔｓｅｖａｎｄＧｒｅｅｎ，２７７Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１９３－２０３（２０００）Ｐａｃｉｔｔｉｅｔａｌ．，ＶｅｔＲｅｃ１１８：３８１－３８４（１９８６）ｄｏｉ：１０．１１３６／ｖｒ．１１８．１４．３８１Ｌｅｖｙｅｔａｌ．，ＪＦｅｌｉｎｅＭｅｄＳｕｒｇ１０：３００－３１６（２００８）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｆｍｓ．２００８．０３．００２Ｈｏｏｖｅｒｅｔａｌ．，ＪＡｍＶｅｔＭｅｄＡｓｓｏｃ１９９：１２８７－１２９７（１９９１）ＬｅｖｙａｎｄＣｒａｗｆｏｒｄ，ＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，６ｔｈｅｄ（ＥｔｔｉｎｇｅｒＳＪ，ＦｅｌｄｍａｎＥＣ．，ｅｄｓ．）ＷＢＳａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．（２００５）Ｈｏｓｉｅｅｔａｌ．ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＲｅｃｏｒｄｓ，１２８：２９３－２９７（１９８９）Ｂｒａｌｅｙ，ＦｅｌｉｎｅＰｒａｃｔｉｃｅ２２：２５－２９（１９９４）Ｍａｌｉｋｅｔａｌ．，ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＪｏｕｒｎａｌ７５：３２３－３２７（１９９７）Ａｒｊｏｎａｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３８：３４４８－３４４９（２０００）Ｔｈｏｍｓｅｎｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ７３：１８１９－１８２４（１９９２）ＤｅＮｏｒｏｎｈａ，ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８５：６１７－６２１（１９７８）Ｎｕｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ８１：３６７５－３６７９（１９８３）Ｍａｔｈｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２７４：６８７－６８９（１９７８）Ｆｌｙｎｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（５）：２３０６－２３１５（２００２）Ｌｉｕｅｔａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＡｎｎｏｕｎｃ．Ｍａｒ－Ａｐｒ；３（２）（２０１５）：ｅ０１５５６－１４Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄｅｔａｌ．，ＣｒｉｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ１０：４２７－４３９（１９９１）Ｃｏｘｅｔａｌ．，ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ１６：７５４－７５９（１９７７）Ｍａｈｌｅｔａｌ．，ＶｅｔＲｅｓ４５（１）：７７（２０１４）ＶａｎｄｅｒＶｅｅｎ，ｅｔａｌ．ＡｎｉｍＨｅａｌｔｈＲｅｓＲｅｖ．１３（１）：１－９．（２０１２）ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ１４６６２５２３１２００００１１Ｋａｍｒｕｄｅｔａｌ．，ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ７）：１７２３－１７２７（２０１０）Ｐｕｓｈｋｏｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２３９：３８９－４０１（１９９７）Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ６７：６４３９－６４４６（１９９３）ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍａｎｄＧａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６－１３６１（１９９１）Ｐｕｓｈｋｏｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２３９（２）：３８９－４０１（１９９７）ＶａｎｄｅｒＶｅｅｎ，ｅｔａｌ．ＡｎｉｍＨｅａｌｔｈＲｅｓＲｅｖ．１３（１）：１－９．（２０１２）Ｋｏｎｏｐｋａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８３（２９）：１２４３２－１２４４２（２００９）Ｓｅｇｕｎｄｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８７（１０）：５４４７－５４６０（２０１３）

したがって、本発明は、１つまたは複数のネコ病原体からの１つまたは複数の抗原をコ
ードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、１つまたは複数の改変された生ネコ
病原体と共に含む免疫原性組成物を含む。本発明の免疫原性組成物の全てが、多価ワクチ
ンにも使用され得る。このタイプの特定の実施形態では、ワクチン接種される対象がネコ
である。さらに特定の実施形態では、ワクチン接種される対象がイエネコである。本発明
の免疫原性組成物およびワクチンを作製および使用する方法も提供される。

特定の実施形態では、免疫原性組成物が、１つまたは複数のネコカリシウイルス（ＦＣ
Ｖ）抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、改変された生ネコ病原
体とを含む。他の実施形態では、免疫原性組成物が、１つまたは複数のネコ白血病ウイル
ス（ＦｅＬＶ）抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、改変された
生ネコ病原体とを含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物が、１つまたは複数の
狂犬病ウイルス抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、改変された
生ネコ病原体とを含む。一定の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、ネコウイルス
性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）である。他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、
ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）である。さらに他の実施形態では、改変された
生ネコ病原体が、改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ
ｆｅｌｉｓ）である。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変され
た生Ｆ９様ネコカリシウイルス（ＦＣＶＦ９様）である。さらに他の実施形態では、改
変された生ネコ病原体が、改変された生ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅ
ｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）である。本発明はさらに、これらのアルファウ
イルスＲＮＡレプリコン粒子と改変された生ネコ病原体の任意の組み合わせを含む免疫原
性組成物を提供する。このタイプの具体的な実施形態では、免疫原性組成物が、ＦＣＶ抗
原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、ＦｅＬＶ抗原をコードするアル
ファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、改変された生ＦＶＲ、改変された生ＦＰＬＶ、およ
び改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）
を含む。

このタイプの一定の実施形態では、免疫原性組成物が、ＦＣＶカプシドタンパク質をコ
ードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。さらに特定の実施形態では、Ｆ
ＣＶカプシドタンパク質がＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質である。他の実施形態では
、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質の抗原
性断片をコードする。さらに他の実施形態では、ＦＣＶカプシドタンパク質が、強毒全身
性ＦＣＶ（ＶＳ－ＦＣＶ）カプシドタンパク質である。さらに他の実施形態では、アルフ
ァウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質の抗原性断片をコ
ードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶ
Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片とＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質ま
たはその抗原性断片の両方をコードする。

他の実施形態では、免疫原性組成物が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗
原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含み、ＶＳ－ＦＣＶカプ
シドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列との９５％以上の同一性を含むアミノ酸配
列を含む。より具体的な実施形態では、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質が、配列番号２
のアミノ酸配列を含む。さらにより具体的な実施形態では、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパ
ク質が、配列番号１または配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされる。関連
する実施形態では、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶＦ９様
カプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする。このタイプの具体的な実施形態
では、ＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列との９５％以上
の同一性を含むアミノ酸配列を含む。より具体的な実施形態では、ＦＣＶＦ９様カプシ
ドタンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実
施形態では、ＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質が、配列番号３または配列番号１３のヌ
クレオチド配列によってコードされる。

関連する実施形態では、免疫原性組成物が、１つまたは複数のネコ白血病ウイルス（Ｆ
ｅＬＶ）抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。一定の実施形
態では、ＦｅＬＶ抗原がＦｅＬＶ糖タンパク質（例えば、ｇｐ８５）である。他の実施形
態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦｅＬＶｇｐ８５の抗原性断片を
コードする。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ糖タンパク質の抗
原性断片がＦｅＬＶｇｐ７０である。関連する実施形態では、ＦｅＬＶ糖タンパク質の
抗原性断片がＦｅＬＶｇｐ４５である。このタイプのより具体的な実施形態では、Ｆｅ
ＬＶｇｐ８５が、配列番号６のアミノ酸配列との９５％以上の同一性を含むアミノ酸配
列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶｇｐ８５が、配列番号６
のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶｇｐ
８５が、配列番号５または配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされる。関連
する実施形態では、ＦｅＬＶｇｐ７０が、配列番号８のアミノ酸配列との９５％以上の
同一性を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ
ｇｐ７０が、配列番号８のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実施形
態では、ＦｅＬＶｇｐ７０が、配列番号７または配列番号１５のヌクレオチド配列によ
ってコードされる。

さらに他の実施形態では、免疫原性組成物が、狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｇ）をコ
ードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。さらに他の実施形態では、アル
ファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、狂犬病ウイルスＧの抗原性断片をコードする。こ
のタイプのより具体的な実施形態では、狂犬病ウイルスＧが、配列番号１０のアミノ酸配
列との９５％以上の同一性を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのなおさらに具体的な
実施形態では、狂犬病ウイルスＧが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。このタイプの
さらにより具体的な実施形態では、狂犬病ウイルスＧが、配列番号９または配列番号１６
のヌクレオチド配列によってコードされる。

特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ベネズエラウマ脳炎
（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。このタイプのより具体的な実
施形態では、ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＴＣ－８３ＶＥＥアル
ファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡ
レプリコン粒子が、シンドビス（ＳＩＮ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である
。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、セムリキ森林ウ
イルス（ＳＦＶ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。代替実施形態では、裸
のＤＮＡベクターが、１つまたは複数のネコ病原体に由来する１つまたは複数の抗原をコ
ードする。このタイプの特定の実施形態では、裸のＤＮＡベクターが、ＦＣＶカプシドタ
ンパク質またはその抗原性断片をコードする。このタイプの具体的な実施形態では、裸の
ＤＮＡベクターが、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする
。このタイプの他の実施形態では、裸のＤＮＡベクターがＦｅＬＶｇｐ８５またはその
抗原性断片をコードする。

一定の実施形態では、免疫原性組成物が、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と
、１つまたは複数のＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、１つまたは複数の
ＦｅＬＶ糖タンパク質またはその抗原性断片、ならびに／あるいは１つまたは複数の狂犬
病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプ
リコン粒子とを含むことができる。このタイプの特定の実施形態では、アルファウイルス
ＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片とＦＣ
ＶＦ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片の両方をコードする。関連する実施
形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質
またはその抗原性断片とＦｅＬＶｇｐ８５またはその抗原性断片の両方をコードする。
他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶＦ９様カプシド
タンパク質またはその抗原性断片とＦｅＬＶｇｐ８５またはその抗原性断片の両方をコ
ードする。別の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ－ＦＣＶ
カプシドタンパク質またはその抗原性断片と狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原
性断片の両方をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコ
ン粒子が、ＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片と狂犬病ウイルスＧ
タンパク質またはその抗原性断片の両方をコードする。さらに他の実施形態では、アルフ
ァウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性
断片、ＦｅＬＶｇｐ８５またはその抗原性断片、および狂犬病ウイルスＧタンパク質ま
たはその抗原性断片をコードする。別の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコ
ン粒子が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、ＦＣＶＦ９様カプ
シドタンパク質またはその抗原性断片、およびＦｅＬＶｇｐ８５またはその抗原性断片
をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、Ｖ
Ｓ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、ＦｅＬＶｇｐ８５またはその抗
原性断片、狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片、およびＦＣＶＦ９様カ
プシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、アルフ
ァウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦｅＬＶｇｐ８５またはその抗原性断片、および
狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態で
は、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦｅＬＶｇｐ８５またはその抗原性断
片、ＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片、および狂犬病ウイルスＧ
タンパク質またはその抗原性断片をコードする。

したがって、本発明は、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、複数のネコ病原
体抗原をコードする本発明のいずれか１つまたは複数のアルファウイルスＲＮＡレプリコ
ン粒子および／または単一ネコ病原体抗原をコードする本発明のいずれか１つまたは複数
のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを含む免疫原性組成物を提供する。特定の実
施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生ＦＶＲである。他の実施形態では
、改変された生ネコ病原体が、改変された生ＦＰＬＶである。さらに他の実施形態では、
改変された生ネコ病原体が、改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏ
ｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）である。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が
、改変された生ＦＣＶＦ９様である。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原
体が、改変された生ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃ
ｈｉｓｅｐｔｉｃａ）である。特定の実施形態では、２つ以上の改変された生ネコ病原体
が免疫原性組成物に含まれる。このタイプの具体的な実施形態では、免疫原性組成物が、
改変された生ＦＶＲおよび改変された生クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）
を含む。他の実施形態では、３つ以上の改変された生ネコ病原体が免疫原性組成物に含ま
れる。このタイプの具体的な実施形態では、免疫原性組成物が、改変された生ＦＶＲ、改
変された生クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）を含み、改変された生ネコ病
原体がＦＰＬＶである。さらに他の実施形態では、４つ以上の改変された生ネコ病原体が
免疫原性組成物に含まれる。このタイプの具体的な実施形態では、免疫原性組成物が、改
変された生ＦＶＲ、改変された生クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、改変
された生ＦＰＬＶ、および改変された生Ｆ９様ＦＣＶを含む。特定の実施形態では、免疫
原性組成物中のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の全てが、ベネズエラウマ脳炎（
ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。さらにより具体的な実施形態で
は、免疫原性組成物中のＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の全てが、ＴＣ－
８３ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。

さらなる実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、他のネコ病原体に
由来するタンパク質抗原（またはその抗原性断片）をコードし得る。このタイプの特定の
実施形態では、タンパク質抗原が、ネコニューモウイルス（ＦＰＮ）に由来する。さらに
他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）に由来する。さら
に他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）に由来
する。さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコ免疫不全ウイルスに由来する。
さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）に由来する。
さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコインフルエンザウイルスに由来する。
さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネココロナウイルス（ＦＣｏＶ）に由来す
る。

本発明はさらに、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、本発明の１つま
たは複数の改変された生（例えば、弱毒化）ネコ病原体と共に、死滅ネコ病原体と共に含
む免疫原性組成物および／またはワクチン（多価ワクチン）を提供する。特定の実施形態
では、免疫原性組成物が、死滅クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ
ｆｅｌｉｓ）、および／または死滅ＦＶＲ、および／または死滅Ｆ９様ＦＣＶ、および
／または死滅ＶＳ－ＦＣＶ、および／または死滅ＦｅＬＶ、および／または死滅ＦＰＬＶ
をさらに含み得る。一定の実施形態では、ワクチンが、免疫学的有効量の１つまたは複数
のこれらの免疫原性組成物を含む。

本発明は、本発明の免疫原性組成物を含むワクチンおよび多価ワクチンをさらに含む。
特定の実施形態では、多価ワクチンが非アジュバントワクチンである。一定の実施形態で
は、ワクチンが、ＦＣＶ、および／またはＦｅＬＶ、および／またはＦＶＲ、および／ま
たはＦＰＬＶ、および／または狂犬病ウイルス、および／またはクラミドフィラ・フェリ
ス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）による疾患の予防を助ける。関連する実
施形態では、ネコがワクチンで免疫されると、ネコ対象で抗体が誘導される。本発明はさ
らに、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および裸のＤＮＡベクターの全て
を含む。

本発明はまた、ネコ病原体、例えばＦＣＶに対してネコを免疫する方法であって、免疫
学的有効量の本発明のワクチンまたは多価ワクチンをネコに投与するステップを含む方法
を提供する。特定の実施形態では、ワクチンが筋肉内注射を介して投与される。代替実施
形態では、ワクチンが皮下注射を介して投与される。他の実施形態では、ワクチンが静脈
内注射を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンが皮内注射を介して投与
される。さらに他の実施形態では、ワクチンが経皮注射を介して投与される。さらに他の
実施形態では、ワクチンが経口投与を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワク
チンが鼻腔内投与を介して投与される。具体的な実施形態では、ネコがイエネコである。

本発明のワクチンおよび多価ワクチンは、プライマーワクチンおよび／またはブースタ
ーワクチンとして投与され得る。具体的な実施形態では、本発明のワクチンが、その後の
投与を必要とせずに、単発ワクチン（１回用量）として投与される。一定の実施形態では
、プライマーワクチンとブースターワクチンの両方の投与の場合、プライマーワクチンお
よびブースターワクチンが、同一経路によって投与され得る。このタイプの一定の実施形
態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンが共に皮下注射によって投与され
る。代替実施形態では、プライマーワクチンとブースターワクチンの両方の投与の場合、
プライマーワクチンの投与がある経路によって実施され、ブースターワクチンが別の経路
によって実施され得る。このタイプの一定の実施形態では、プライマーワクチンが皮下注
射によって投与され、ブースターワクチンが経口投与され得る。

本発明はさらに、ＦＣＶに対してネコを免疫する方法であって、免疫学的有効量の上記
の本発明のワクチンをネコに注射するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態で
は、ワクチンが、例えば、約１×１０^４～約１×１０^１０個のＲＰまたはそれ以上を含み
得る。さらに特定の実施形態では、ワクチンが、約１×１０^５～約１×１０^９個のＲＰを
含み得る。さらにより特定の実施形態では、ワクチンが、約１×１０^６～約１×１０^８個
のＲＰを含み得る。特定の実施形態では、ネコがイエネコである。

特定の実施形態では、本発明のワクチンが、０．０５ｍＬ～３ｍＬ用量で投与される。
さらに特定の実施形態では、投与される用量が０．１ｍＬ～２ｍＬである。なおさらに特
定の実施形態では、投与される用量が０．２ｍＬ～１．５ｍＬである。さらにより特定の
実施形態では、投与される用量が０．３～１．０ｍＬである。なおさらに特定の実施形態
では、投与される用量が０．４ｍＬ～０．８ｍＬである。

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明を参照することによってよりよく
理解されよう。

本発明は、安全で有効な多価ワクチンを提供する。特定の実施形態では、ワクチンが非
アジュバントである。本発明のこの態様では、ワクチンがネコ注射部位肉腫を誘発しない
が、それでもネコカリシウイルス（ＦＣＶ）および／またはネコ白血病ウイルス（ＦｅＬ
Ｖ）による感染、ならびにネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）、および／または
ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）、および／または生クラミドフィラ・フェリス
（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）による感染によって引き起こされる疾患か
らのワクチン接種ネコ（ｖａｃｃｉｎａｔｅｓ）の防御を助ける。

アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子による自然免疫系の既知の増強にもかかわらず
、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と改変された生ウイルスの両方を含む本発明の
多価ワクチンは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が改変された生ウイルスの免疫
学的効果を有意に妨害することなく、予想外に安全で有効である。

実際、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、特にベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ア
ルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、全身の抗ウイルス状態を触媒し、致命的なウイ
ルス攻撃から防御することが以前示された［Ｋｏｎｏｐｋａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．，８３（２９）：１２４３２－１２４４２（２００９）］。さらに、ＶＥＥアルフ
ァウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、口蹄疫ウイルスに対する迅速な防御を誘導すること
が報告されている［Ｓｅｇｕｎｄｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８７（１０）：
５４４７－５４６０（２０１３）］。したがって、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒
子と改変された生ウイルスの両方を含むワクチンは、改変された生ウイルスの免疫学的効
果の実質的な阻害をもたらすと予測されただろう。しかしながら、驚くべきことに、アル
ファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の存在による自然免疫応答の増強は、付随する改変さ
れた生ウイルスによって誘導される免疫応答に有害ではないことが判明した。

したがって、特定の態様では、本発明は、ＦＣＶカプシドタンパク質もしくはその抗原
性断片および／またはＦｅＬＶｇｐ８５もしくはその抗原性断片をコードするアルファ
ウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、改変された生ネコＦＶＲ、および／または改変された
生ＦＰＬＶ、および／または改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏ
ｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）と共に含むワクチンを提供する。本発明のさらに別の態様では
、ワクチンが、ＦＣＶカプシドタンパク質もしくはその抗原性断片および／またはＦｅＬ
Ｖｇｐ８５もしくはその抗原性断片をコードする裸のＤＮＡベクターを、改変された生
ネコＦＶＲ、および／または改変された生ネコＦＰＬＶ、および／または改変された生ク
ラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）と共に含む。

本発明のワクチンは、アジュバントの非存在下でネコに投与することができ、依然とし
てＦＣＶに対するワクチン接種されたネコの防御を有効に助けることができる。

本発明をより完全に理解するために、以下の定義が提供される。

説明における便宜上の単数の用語の使用は、決してそのように限定することを意図する
ものではない。よって、例えば、「ポリペプチド（ａｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を含
む組成物への言及は、１つまたは複数のこのようなポリペプチドへの言及を含む。さらに
、「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」への言及は、特に指示されない限り、複数
のこのようなアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子への言及を含む。

本明細書で使用される場合、「およそ」という用語は、「約」という用語と互換的に使
用され、値が、指示される値の５０パーセント以内であることを示す、すなわち、１ミリ
リットル当たり「およそ」１×１０^８個のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含有
する組成物は、１ミリリットル当たり０．５×１０^８～１．５×１０^８個のアルファウイ
ルスＲＮＡレプリコン粒子を含有する。

本明細書で使用される場合、「ネコ」という用語は、ネコ科（Ｆｅｌｉｄａｅ）の任意
のメンバーを指す。イエネコ、純血種および／または雑種の伴侶ネコ、ならびに野生また
は野生化したネコが全てネコである。

本明細書で使用される場合、「レプリコン」という用語は、存在する場合に、細胞培養
物または動物宿主で親ウイルスの増殖を成功させることができる１つまたは複数の要素（
例えば、構造タンパク質のコード配列）を欠く改変されたＲＮＡウイルスゲノムを指す。
適切な細胞状況では、レプリコンは自身を増幅し、１つまたは複数のサブゲノムＲＮＡ種
を産生し得る。

本明細書で使用される場合、「ＲＰ」と略される「アルファウイルスＲＮＡレプリコン
粒子」という用語は、構造タンパク質、例えば、Ｐｕｓｈｋｏら［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２
３９（２）：３８９－４０１（１９９７）］によって記載されるように、同様にアルファ
ウイルスに由来するカプシドおよび糖タンパク質にパッケージングされたアルファウイル
ス由来ＲＮＡレプリコンである。レプリコンはアルファウイルスの構造成分（例えば、カ
プシドおよび糖タンパク質）をコードしないため、ＲＰは（ヘルパープラスミドまたは類
似の成分なしで）細胞培養物または動物宿主で増殖できない。

「ＦＣＶＦ９様」および「Ｆ９様ＦＣＶ」という用語は、相互におよび「古典的ＦＣ
Ｖ」という用語と互換的に使用され、本明細書で使用される場合、ＦＣＶＦ９株が典型
的代表と考えられるＦＣＶの古い、以前のユニバーサルワクチン株として特徴付けられ得
るＦＣＶである。直接対照的に、強毒全身性「ＶＳ－ＦＣＶ」または本明細書で互換的に
使用される「（ＶＳ）ＦＣＶ」と呼ばれるＦＣＶは、異常に毒性であり、ＦＣＶＦ９様
株の抗体によって中和できない新たなクラスのＦＣＶである［米国特許第７４４９３２３
号明細書；Ｒａｄｆｏｒｄｅｔａｌ．，３８（２）Ｖｅｔｒｅｓ．３１９－３３５
（２００７）参照］。

「由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｆｒｏｍ）」、「由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ
ｆｒｏｍ）」および「由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇｆｒｏｍ）」という用語は
、所与のタンパク質抗原およびそれを天然でコードする病原体またはその病原体の株に関
して互換的に使用され、本明細書で使用される場合、その所与のタンパク質抗原の非改変
および／または切断アミノ酸配列が、その病原体またはその病原体の株によってコードさ
れていることを意味する。病原体に由来するタンパク質抗原についての本発明の核酸構築
物内のコード配列は、病原体または病原体の株（自然弱毒化株を含む）におけるそのタン
パク質抗原の対応する配列に対して発現されたタンパク質抗原のアミノ酸配列の改変およ
び／または切断をもたらすように遺伝子操作されたかもしれない。

本明細書で使用される場合、「防御する」、または「防御を提供する」、または「防御
免疫を誘発する」、「疾患の予防を助ける」、および「防御を助ける」という用語は、感
染の兆候からの完全な防御を要しない。例えば、「防御を助ける」は、防御が、攻撃後、
基礎となる感染の症状が少なくとも減少する、ならびに／あるいは根底にある細胞、生理
学的もしくは生化学的原因または症状を引き起こす機序の１つまたは複数が減少するおよ
び／または排除されるように十分であることを意味することができる。この文脈で使用さ
れる「減少する」は、感染の生理学的状態だけでなく、感染の分子状態を含む、感染の状
態に関連することを意味する。

本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、動物に投与すると、野生型微生物による
感染から生じる疾患からの防御を最小限助けるのに十分強力な、すなわち、疾患の予防を
助ける、および／または疾患を予防、改善もしくは治癒するのに十分強力な免疫応答を誘
導する、典型的には水を含有する液体などの薬学的に許容される担体と組み合わせた１つ
または複数の抗原を含む、動物、例えばネコ（一定の実施形態では、ヒトを含むが、他の
実施形態では、具体的にヒトではない）に施用するのに適した組成物である。

本明細書中で使用される場合、多価ワクチンは、２つ以上の異なる抗原を含むワクチン
である。このタイプの特定の実施形態では、多価ワクチンが、２つ以上の異なる病原体に
対するレシピエントの免疫系を刺激する。

「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書で互換的に使用され、
免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質として定義される。これに関連して、ア
ジュバントは、１つまたは複数のワクチン抗原／分離株に対する免疫応答を増強するため
に使用される。したがって、「アジュバント」は、特定の抗原に対する免疫応答を非特異
的に増加させ、したがって、任意の所与のワクチンに必要な抗原の量、および／またはの
目的の抗原に対する十分な免疫応答を生成するために必要な注射の頻度を減少させる薬剤
である。これに関連して、アジュバントは、１つまたは複数のワクチン抗原／分離株に対
する免疫応答を増強するために使用される。例えば、アメリカ猫獣医師協会のネコワクチ
ン接種ガイドラインは、非アジュバントＦｅＬＶワクチンの使用を提案している［ＡＡＦ
ＰＦｅｌｉｎｅＡｄｖｉｓｏｒｙＰａｎｅｌ，１５：７８５－８０８（２０１
３）］。

本明細書中で使用される場合、「非アジュバントワクチン」は、アジュバントを含有し
ないワクチンまたは多価ワクチンである。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、修飾された名詞が
医薬品での使用に適切であることを意味するために形容詞的に使用される。これが、例え
ば、医薬品ワクチンの賦形剤を説明するために使用される場合、これは、その賦形剤が組
成物の他の成分と適合性であり、意図したレシピエント動物、例えばネコに不利に有害で
はないとして特徴付ける。

「非経口投与」は、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射および
注入を含む。

本明細書で使用される場合、特定のタンパク質（例えば、タンパク質抗原）に関する「
抗原性断片」という用語は、抗原性である、すなわち、免疫グロブリン（抗体）またはＴ
細胞抗原受容体などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することができるそのタ
ンパク質の断片である。例えば、ＦＣＶカプシドタンパク質の抗原性断片は、抗原性であ
るカプシドタンパク質の断片である。好ましくは、本発明の抗原性断片は、抗体および／
またはＴ細胞受容体認識に対して免疫優性である。特定の実施形態では、所与のタンパク
質抗原に関する抗原性断片が、完全長タンパク質の抗原性の少なくとも２５％を保持する
そのタンパク質の断片である。好ましい実施形態では、抗原性断片が、完全長タンパク質
の抗原性の少なくとも５０％を保持する。より好ましい実施形態では、抗原性断片が、完
全長タンパク質の抗原性の少なくとも７５％を保持する。抗原性断片は、２０個のアミノ
酸程度の小さなものである場合もあれば、その一方で、完全長タンパク質から１個のアミ
ノ酸だけが失われている大きな断片である場合もある。特定の実施形態では、抗原性断片
が、２５～１５０個のアミノ酸残基を含む。他の実施形態では、抗原性断片が、５０～２
５０個のアミノ酸残基を含む。例えば、ＦｅＬＶの場合、ＦｅＬＶｇｐ４５糖タンパク
質およびＦｅＬＶｇｐ７０糖タンパク質はＦｅＬＶｇｐ８５糖タンパク質の抗原性断
片であるが、ＦＣＶの場合、ＦＣＶカプシドタンパク質の１つの抗原性断片がＯＲＦ２の
領域Ｅを含む。

本明細書で使用する場合、両方の配列のアミノ酸残基が同一である場合、１つのアミノ
酸配列は第２のアミノ酸配列と１００％「同一」であるまたは１００％の「同一性」を有
する。したがって、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基の５０％が同一である場合、ある
アミノ酸配列は第２のアミノ酸配列と５０％「同一」である。配列比較は、所与のタンパ
ク質、例えば比較されるタンパク質、またはポリペプチドの一部に含まれるアミノ酸残基
の連続ブロックにわたって行われる。特定の実施形態では、２つのアミノ酸配列間の対応
を変える可能性がある選択された欠失または挿入が考慮される。

本明細書で使用する場合、ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列同一性％は、アラインメ
ント・デフォルト・パラメータおよび同一性についてのデフォルトパラメータと共にＣ，
ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ、ＮＣ２７５１９）
、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．ＭＤ）、ＯｘｆｏｒｄＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒＧｒｏｕｐＰＬＣ（１９９６）およびＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム
を用いて決定することができる。これらの市販のプログラムを使用して、同一または類似
のデフォルトパラメータを用いて配列類似性を決定することもできる。あるいは、例えば
、デフォルトパラメータを使用するＧＣＧ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒ
ｏｕｐ、ＧＣＧパッケージ用プログラムマニュアル、バージョン７、マディソン、ウィス
コンシン州）パイルアッププログラムを使用して、デフォルトフィルター条件下でのＡｄ
ｖａｎｃｅｄＢｌａｓｔ検索を使用することができる。

本明細書で使用される場合、「不活性化」微生物という用語は、「死滅」微生物という
用語と互換的に使用される。本発明の目的のために、「不活性化」微生物は、動物で免疫
応答を誘発することができるが、動物に感染することができない生物である。本発明の抗
原（例えば、不活化ネコカリシウイルス）は、バイナリーエチレンイミン（ｂｉｎａｒｙ
ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ホルマリン、β－プロピオラクトン、チメロサール、
または熱からなる群から選択される因子によって不活化され得る。特定の実施形態では、
本発明のＲＰと組み合わされた不活性化ネコカリシウイルス分離株が、バイナリーエチレ
ンイミンによって不活性化される。

本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、凍結乾燥され、滅菌水希釈剤で再
水和され得る。他方、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が個別に保存されているが
、投与前に他のワクチン成分と混合することを意図している場合、アルファウイルスＲＮ
Ａレプリコン粒子をそれらの成分の安定化溶液、例えば高スクロース溶液中に保存するこ
とができる。

本発明のワクチンは、静脈内、筋肉内、皮下、経口、鼻腔内、皮内および／または腹腔
内ワクチン接種を含む任意の標準的な経路によって容易に投与することができる。当業者
であれば、ワクチン組成物が、好ましくは各タイプのレシピエント動物および投与経路に
対して適切に製剤化されることを理解するだろう。

よって、本発明はまた、ネコ病原体に対してネコを免疫する方法を提供する。このよう
な方法の１つは、ネコが適切な抗病原体抗体を産生するように、免疫学的有効量の本発明
のワクチンをネコに注射するステップを含む。

多価ワクチン
したがって、本発明は、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、１つまたは複数
のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを含む多価ワクチンを提供する。例えば、タ
ンパク質抗原またはその抗原性断片のコード配列、またはネコワクチンで有用なタンパク
質抗原のこのようなコード配列の組み合わせを、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子
（ＲＰ）に添加する、あるいは例えば、多価ワクチン中のＦＣＶカプシドタンパク質およ
び／またはＦｅＬＶ糖タンパク質（ｇｐ８５）をコードするものと同じＲＰに組み合わせ
ることができる。

具体的な実施形態では、ワクチンが、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、Ｆ
ＣＶＦ９様カプシドタンパク質もしくはその抗原性断片、および／またはＶＳ－ＦＣＶ
カプシドタンパク質もしくはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリ
コン粒子とを、ＦｅＬＶｇｐ８５またはその抗原性断片をコードする別のアルファウイ
ルスＲＮＡレプリコン粒子と共に含む。他の実施形態では、ワクチンが、少なくとも１つ
の改変された生ネコ病原体と、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片を
コードする１つのアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、ＦｅＬＶｇｐ８５または
その抗原性断片をコードする別のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、さらにＦＣ
ＶＦ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする第３のアルファウイル
スＲＮＡレプリコン粒子とを含む。さらに他の実施形態では、ワクチンが、少なくとも１
つの改変された生ネコ病原体と、ＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断
片、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、およびＦｅＬＶｇｐ８５
またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを含む。

１つまたは複数のこのようなタンパク質抗原が由来し得る病原体の例としては、ネコウ
イルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球
減少症ウイルス（ＦＰＬ）、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、他のＦＣＶ株、ネコパル
ボウイルス（ＦＰＶ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ免疫不全ウイルス
、ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）、狂犬病ウイルス、ネコインフルエンザウイルス、イヌイ
ンフルエンザウイルス、鳥インフルエンザ、イヌニューモウイルス、ネコニューモウイル
ス、クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）（ＦＫＡ
クラミドフィラ・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｐｓｉｔｔａｃｉ））、ボ
ルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）
、およびバルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）種（例えば、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂ
．ｈｅｎｓｅｌａｅ））が挙げられる。特定の実施形態では、これらのネコまたはイヌ病
原体の１つまたは複数からのカプシドタンパク質または類似タンパク質のコード配列を、
ＦＣＶ抗原と同じＲＰに挿入することができる。あるいは、またはそれと組み合わせて、
これらのネコまたはイヌ病原体の１つまたは複数からのカプシドタンパク質または類似タ
ンパク質のコード配列を、１つまたは複数の他のＲＰに挿入することができ、これをワク
チンで、ＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質もしくはその抗原性断片および／またはＶＳ
－ＦＣＶカプシドタンパク質もしくはその抗原性断片をコードするＲＰと組み合わせるこ
とができる。

したがって、本発明は、１つまたは複数の本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン
粒子（ＲＰ）［例えば、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片］を１つ
または複数の改変された生（弱毒化）ウイルス分離株、例えば、ＦＣＶの生弱毒化古ワク
チン株、例えば生弱毒化ＦＣＶＦ９、および／または生弱毒化ネコヘルペスウイルス、
および／または生弱毒化ネコパルボウイルス、および／または生弱毒化ネコ白血病ウイル
ス、および／または生弱毒化ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、および／または生弱毒化ネコ免
疫不全ウイルス、および／または生弱毒化ボルナ病ウイルス、および／または生弱毒化狂
犬病ウイルス、および／または生弱毒化ネコインフルエンザウイルス、および／または生
弱毒化イヌインフルエンザウイルス、および／または生弱毒化鳥インフルエンザ、および
／または生弱毒化イヌニューモウイルス、および／または生弱毒化ネコニューモウイルス
と共に含むワクチンを提供する。さらに、生弱毒化クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａ
ｍｙｄｏｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）、および／または生弱毒化ボルデテラ・ブロンキセプ
チカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、および／または生弱毒
化バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）種（例えば、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂ．ｈｅ
ｎｓｅｌａｅ））もこのような多価ワクチンに含めることができる。

さらに、１つまたは複数の本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子［例えば、
ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする］を含む本発明のワ
クチンは、１つまたは複数の改変された生ウイルス分離株と共に、１つまたは複数の死滅
ウイルス分離株、例えば死滅ＦＣＶ株、および／または死滅ネコヘルペスウイルス、およ
び／または死滅ネコパルボウイルス、および／または死滅ネコ白血病ウイルス、および／
または死滅ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、および／または死滅ネコ免疫不全ウイルス、およ
び／または死滅ボルナ病ウイルス、および／または死滅狂犬病ウイルス、および／または
死滅ネコインフルエンザウイルス、および／または死滅イヌインフルエンザウイルス、お
よび／または死滅鳥インフルエンザウイルス、および／または死滅イヌニューモウイルス
、および／または死滅ネコニューモウイルスをさらに含むことができる。さらに、クラミ
ドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）、および／またはボル
デテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、
および／または生弱毒化バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）種（例えば、バルトネラ
・ヘンセラ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ））のバクテリンもこのような多価ワクチンに含める
ことができる。

また、本明細書に開示される特定の構成、プロセスステップ、および材料は、いくぶん
変化し得るので、本発明はこのような構成、プロセスステップ、および材料に限定されな
いことも理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびその等価物に
よってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明すること
のみを目的としており、限定を意図するものではないことも理解されたい。

配列

以下の実施例は、本発明のさらなる理解を提供するのに役立つが、本発明の有効な範囲
を制限することを決して意味するものではない。

［実施例］
［実施例１］
ＦＣＶカプシドタンパク質のコード配列のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子への組
み込み
導入
ＲＮＡウイルスは、遺伝子操作されたワクチン抗原をゲノムに導入するためのベクター
媒体として使用されている。しかしながら、現在までのそれらの使用は、主にウイルス抗
原をＲＮＡウイルスに組み込み、次いで、ウイルスをレシピエント宿主に導入することに
限定されてきた。その結果、組み込まれたウイルス抗原に対する防御抗体が誘導される。
アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、病原性抗原をコードするために使用されてい
る。このようなアルファウイルスレプリコンプラットフォームは、ベネズエラウマ脳炎ウ
イルス（ＶＥＥ）［Ｐｕｓｈｋｏｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２３９：３８９－
４０１（１９９７）］、シンドビス（ＳＩＮ）［その内容全体がこれにより本明細書に組
み込まれる、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌ
ｏｇｙ６７：６４３９－６４４６（１９９３）］およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ
）［その内容全体がこれにより本明細書に組み込まれる、Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍａｎｄ
Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６－１３６１（１９
９１）］を含むいくつかの異なるアルファウイルスから開発された。さらに、アルファウ
イルスＲＮＡレプリコン粒子は、ブタおよび家禽用のいくつかのＵＳＤＡ認可ワクチンの
基礎となっている。これらには、ブタ流行性下痢ワクチン、ＲＮＡ粒子（製品コード１９
Ｕ５．Ｐ１）、ブタインフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ａ５．Ｄ０）、鳥
インフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ｏ５．Ｄ０）、および処方製品、ＲＮ
Ａ粒子（製品コード９ＰＰ０．００）が含まれる。

アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子構築
ＲＰ－ＦＣＶ：
ＦＣＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列を使用して、インシリコでコドン最適化（ネ
ココドン使用）ヌクレオチド配列を作製した。最適化配列は、商用ベンダー（ＡＴＵＭ、
Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）によって合成ＤＮＡとして調製された。したがって、合成遺伝子を
、それぞれＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質およびＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質の
アミノ酸配列に基づいて設計した。ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列［配
列番号２］、またはＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質の［配列番号４］をコードする構
築物を、ネコについてコドン最適化し、隣接配列はアルファウイルスレプリコンプラスミ
ドへのクローニングに適していた。

ＦＣＶカプシドタンパク質を発現するよう設計されたＶＥＥレプリコンベクターは、以
下の修正をして、以前記載されたように［その内容が参照により本明細書に組み込まれる
、米国特許第９４４１２４７号明細書参照］構築した。ＴＣ－８３由来レプリコンベクタ
ー「ｐＶＥＫ」［米国特許第９４４１２４７号明細書に開示および記載されている］を、
制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。ＦＣＶカプシド遺伝子のコドン最適化オー
プンリーディングフレームヌクレオチド配列を含み、５’隣接配列（５’－ＧＧＣＧＣＧ
ＣＣＧＣＡＣＣ－３’）［配列番号１１］および３’隣接配列（５’－ＴＴＡＡＴＴＡＡ
－３’）を有するＤＮＡプラスミドを、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで同様に消化し
た。次いで、合成遺伝子カセットを消化したｐＶＥＫベクターにライゲートした。

ＴＣ－８３ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の作製は、以前記載された方法［その内容
が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書および米国特
許第８４６０９１３号明細書］に従って行った。手短に言えば、ｐＶＨＶレプリコンベク
ターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドを、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼおよびキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）を使用してイ
ンビトロ転写前に、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化した。重要なことに、作製で使用されるヘ
ルパーＲＮＡは、以前記載されたように［Ｋａｍｒｕｄｅｔａｌ．，ＪＧｅｎＶ
ｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］、ＶＥＥサブゲノムプ
ロモーター配列を欠く。レプリコンおよびヘルパー成分の精製ＲＮＡを組み合わせ、Ｖｅ
ｒｏ細胞の懸濁液と混合し、４ｍｍキュベットで電気穿孔し、ＯｐｔｉＰｒｏ（登録商
標）ＳＦＭ細胞培養培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＷａｌｔｈａｍＭＡ）に戻し
た。一晩のインキュベーション後、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、懸濁液を
ＺｅｔａＰｌｕｓＢｉｏＣａｐデプスフィルター（３Ｍ、Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ、ＭＮ）
に通過させ、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、最後
に４００ｍＭＮａＣｌ緩衝液で保持ＲＰを溶出することによって、細胞および培地から
精製した。溶出したＲＰを最終的な５％スクロース（ｗ／ｖ）に製剤化し、０．２２ミク
ロン膜フィルターに通過させ、保存用に一定分量に分注した。機能的ＲＰの力価を、感染
したＶｅｒｏ細胞単層の免疫蛍光アッセイによって決定した。

ＲＰ－ＦｅＬＶ：
ＦｅＬＶｇｐ８５のアミノ酸配列を使用して、インシリコでコドン最適化（ネココド
ン使用）ヌクレオチド配列を作製した。最適化配列は、商用ベンダー（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗ
ａｒｋ、ＣＡ）によって合成ＤＮＡとして調製された。したがって、ｇｐ８５のアミノ酸
配列に基づいて合成遺伝子を設計した。構築物（ｇｐ８５＿ｗｔ）は野生型アミノ酸配列
［配列番号２］であり、ネコについてコドン最適化し、隣接配列はアルファウイルスレプ
リコンプラスミドへのクローニングに適切であった。

ＦｅＬＶｇｐ８５を発現するよう設計されたＶＥＥレプリコンベクターは、以下の修
正をして、以前記載されたように［その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、
米国特許第９４４１２４７号明細書参照］構築した。ＴＣ－８３由来レプリコンベクター
「ｐＶＥＫ」［米国特許第９４４１２４７号明細書に開示および記載されている］を、制
限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。ＦｅＬＶｇｐ８５遺伝子のコドン最適化オ
ープンリーディングフレームヌクレオチド配列を含み、５’隣接配列（５’－ＧＧＣＧＣ
ＧＣＣＧＣＡＣＣ－３’）［配列番号１１］および３’隣接配列（５’－ＴＴＡＡＴＴＡ
Ａ－３’）を有するＤＮＡプラスミドを、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで同様に消化
した。次いで、合成遺伝子カセットを消化したｐＶＥＫベクターにライゲートし、得られ
たクローンの名前を「ｐＶＨＶ－ＦｅＬＶｇｐ８５」に変更した。「ｐＶＨＶ」ベクタ
ー命名法は、ｐＶＥＫのマルチクローニングサイトのＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位を介し
てクローニングされた導入遺伝子カセットを含むｐＶＥＫ由来レプリコンベクターを指す
ように選択した。

ＴＣ－８３ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の作製は、以前記載された方法［その内容
全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書および米
国特許第８４６０９１３号明細書］に従って行った。手短に言えば、ｐＶＨＶレプリコン
ベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドを、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼおよびキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）を使用し
てインビトロ転写前に、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化した。重要なことに、作製で使用され
るヘルパーＲＮＡは、以前記載されたように［Ｋａｍｒｕｄｅｔａｌ．，ＪＧｅｎ
Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］、ＶＥＥサブゲノ
ムプロモーター配列を欠く。レプリコンおよびヘルパー成分の精製ＲＮＡを組み合わせ、
Ｖｅｒｏ細胞の懸濁液と混合し、４ｍｍキュベットで電気穿孔し、ＯｐｔｉＰｒｏ（登
録商標）ＳＦＭ細胞培養培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＷａｌｔｈａｍＭＡ）に
戻した。一晩のインキュベーション後、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、懸濁
液をＺｅｔａＰｌｕｓＢｉｏＣａｐデプスフィルター（３Ｍ、Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ、Ｍ
Ｎ）に通過させ、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、
最後に４００ｍＭＮａＣｌ緩衝液で保持ＲＰを溶出することによって、細胞および培地
から精製した。溶出したＲＰを最終的な５％スクロース（ｗ／ｖ）に製剤化し、０．２２
ミクロン膜フィルターに通過させ、保存用に一定分量に分注した。機能的ＲＰの力価を、
感染したＶｅｒｏ細胞単層の免疫蛍光アッセイによって決定した。

ＲＰ－ＲＶ
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの非毒性ＴＣ－８３株のカプシドタンパク質および糖タン
パク質とパッケージングされた狂犬病ウイルス（ＲＶ）からの狂犬病ウイルス糖タンパク
質（Ｇ）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンを調製した
。狂犬病ウイルスＧタンパク質のヌクレオチド配列を、ヒトについてコドン最適化した。
得られた配列は、１００％のアミノ酸同一性を有しているにもかかわらず、生狂犬病ウイ
ルス糖タンパク質（Ｇ）配列に対してわずか約８５％のヌクレオチド同一性しか有さない
。ワクチンを、哺乳動物対象に投与される単一用量として、例えば、１２週以上のネコお
よびイヌに皮下的に、あるいは初回投与とそれに続く１回または複数回のブースター投与
を含む複数回用量で使用することができる。

狂犬病糖タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列を使用して、インシリコでコドン最適化（ヒ
トコドン使用）ヌクレオチド配列を作製した。最適化配列は、商用ベンダー（ＡＴＵＭ、
Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）によって合成ＤＮＡとして調製された。したがって、狂犬病糖タン
パク質のアミノ酸配列に基づいて合成遺伝子［配列番号９］を設計した。構築物（ＲＡＢ
Ｖ－Ｇ）は野生型アミノ酸配列［配列番号１０］であり、ヒトについてコドン最適化し、
隣接配列はアルファウイルスレプリコンプラスミドへのクローニングに適切であった。

狂犬病Ｇを発現するよう設計されたＶＥＥレプリコンベクターは、以下の修正をして、
以前記載されたように［その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４
４１２４７号明細書参照］構築した。ＴＣ－８３由来レプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［
米国特許第９４４１２４７号明細書に開示および記載されている］を、制限酵素ＡｓｃＩ
およびＰａｃＩで消化した。狂犬病Ｇ遺伝子のコドン最適化オープンリーディングフレー
ムヌクレオチド配列を含み、５’隣接配列（５’－ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣ－３’）
［配列番号１１］および３’隣接配列（５’－ＴＴＡＡＴＴＡＡ－３’）を有するＤＮＡ
プラスミドを、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで同様に消化した。次いで、合成遺伝子
カセットを消化したｐＶＥＫベクターにライゲートし、得られたクローンの名前を「ｐＶ
ＨＶ－ＲＡＢＶ－Ｇ」に変更した。「ｐＶＨＶ」ベクター命名法は、ｐＶＥＫのマルチク
ローニングサイトのＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位を介してクローニングされた導入遺伝子
カセットを含むｐＶＥＫ由来レプリコンベクターを指すように選択した。

ＴＣ－８３ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の作製は、以前記載された方法［その内容
全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書および米
国特許第８４６０９１３号明細書］に従って行った。手短に言えば、ｐＶＨＶレプリコン
ベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドを、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼおよびキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）を使用し
てインビトロ転写前に、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化した。重要なことに、作製で使用され
るヘルパーＲＮＡは、以前記載されたように［Ｋａｍｒｕｄｅｔａｌ．，ＪＧｅｎ
Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］、ＶＥＥサブゲノ
ムプロモーター配列を欠く。レプリコンおよびヘルパー成分の精製ＲＮＡを組み合わせ、
Ｖｅｒｏ細胞の懸濁液と混合し、４ｍｍキュベットで電気穿孔し、ＯｐｔｉＰｒｏ（登
録商標）ＳＦＭ細胞培養培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に
戻した。一晩のインキュベーション後、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、懸濁
液をＺｅｔａＰｌｕｓＢｉｏＣａｐ（登録商標）デプスフィルター（３Ｍ、Ｍａｐｌｅ
ｗｏｏｄ、ＭＮ）に通過させ、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩
水で洗浄し、最後に４００ｍＭＮａＣｌ緩衝液で保持ＲＰを溶出することによって、細
胞および培地から精製した。溶出したＲＰを最終的な５％スクロース（ｗ／ｖ）に製剤化
し、０．２２ミクロン膜フィルターに通過させ、保存用に一定分量に分注した。機能的Ｒ
Ｐの力価を、感染したＶｅｒｏ細胞単層の免疫蛍光アッセイによって決定した。

［実施例２］
ネコにおける２つのＲＰ構築物と３つの改変された生画分とを含む混合ワクチンの安全性
の評価
凍結乾燥された五価ネコ混合ワクチンの種々の製剤および再構成方法を、ネコにおける
それらの安全性に関して評価した。五価ワクチンの望ましい提示は０．５ｍＬ用量であり
、最適な製剤および充填方法は０．５ｍＬ充填である。安定剤は、１．１％ＮＺ－アミン
（カゼイン酵素加水分解物）、１．１％ゼラチンおよび７．５％スクロースを含有し、提
供される割合は最終濃度を表す。５つの画分を添加するための体積および最終的な効力の
制約により、０．５ｍＬを超える体積が必要な場合は、製品を製剤化して１．０ｍＬまで
充填し、０．５ｍＬの希釈剤で再構成することができる。これにより、投与用量の安定剤
成分の濃度が２倍になる。これらの抗原を含むこのような濃縮用量の安定剤の安全性は、
以前はネコで試験されていなかった。

１．０ｍＬ充填／０．５ｍＬ再水和フォーマットがネコで安全でない場合、１．０ｍＬ
の希釈剤で再水和した１．０ｍＬ充填体積の第３の選択肢も試験した。ワクチンをブレン
ドし、次いで、凍結乾燥した。ワクチンは、１．１％ゼラチン、１．１％ＮＺアミンおよ
び７．５％スクロースを含有する安定剤中、ネコ白血病ウイルス糖タンパク質（ＲＰ－Ｆ
ｅＬＶ）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子およびネコカリシウイルス
カプシドタンパク質（ＲＰ－ＦＣＶ）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒
子を、市販のワクチン、Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）Ｆｅｌｉｎｅ－１の成分、すなわち
、改変された生（ＭＬＶ）ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬ）、改変された生ネコウ
イルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）および改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃ
ｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）と共に含有していた。以下の表１に記載される
ように、五価ネコ混合ワクチンの種々の製剤を調製し、再構成した。

ワクチンを同用量の各抗原を含有するよう製剤化し（０．５ｍＬケークワクチンは２倍
の各抗原の濃度で製剤化した）、安定剤を全ての製剤に一定の濃度で使用した（０．５ｍ
Ｌ希釈剤で再水和される１．０ｍＬケークワクチンは、再水和時に２倍の濃度の安定剤を
含有していた）。

実験ネコ対象を、７～８週齢（典型的には、ネココアワクチンの最小ワクチン接種年齢
を有する）と、２１日後に再度、指示された体積のそれぞれの試験ワクチンでワクチン接
種した。ネコを、啼鳴、刺痛、掻痒、噛みつき、ワクチンの注射時の突然の動き、または
異常な反応（以下の表２および表３を参照）などの疼痛または不快感を示し得る試験ワク
チンに対する反応について各ワクチン接種の直後に１５分間観察した。臨床評価は、ワク
チン接種の４～６時間後、およびワクチン接種後３日間、毎日獣医師によって実施した。

臨床評価は、注射部位の触診、触れると痛い、腫脹、発赤または膿瘍を含む任意の局所
反応についての観察を含んでいた。ネコを、抑うつ、嗜眠、跛行、嘔吐、振戦、激越およ
び下痢などの任意の全身反応についても観察した。体温も測定し、ワクチン接種の４～６
時間後、および各ワクチン接種後２日間、毎日記録した。局所反応についての注射部位の
触診をさらに各ワクチン接種の７日後～２１日後に週３回実施した。

全てのワクチン製剤および再水和プロトコルが安全であることが分かった。ネコのいず
れにも局所反応も全身反応も観察されなかった。２回目のワクチン接種の５時間後に体温
１０３．６℃を示した処置群３（０．５ｍＬケーク／０．５ｍＬ希釈剤）の１匹のネコを
除いて、全てのネコの各測定期間での体温は正常であった。したがって、五価ワクチンの
３つの調製物全てが許容されることが分かった。

本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきでは
ない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の種々の修正が、前記説明から
当業者には明らかになるだろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内にあること
を意図している。

さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸
サイズ、および全ての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために提供される
ことを理解されたい。

Claims

ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒
子と、改変された生ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）、改変された生ネコ汎白
血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）、改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍ
ｙｄｏｐｈｉｌａｆｅｌｉｓ）およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択さ
れる改変された生ネコ病原体とを含む免疫原性組成物。
前記ＦＣＶ抗原がカプシドタンパク質またはその抗原性断片である、請求項１に記載の
免疫原性組成物。
前記カプシドタンパク質が、ＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質、ＦＣＶＦ９様カプ
シドタンパク質の抗原性断片、強毒全身性ＦＣＶ（ＶＳ―ＦＣＶ）カプシドタンパク質お
よびＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質の抗原性断片からなる群から選択される、請求項２
に記載の免疫原性組成物。
前記カプシドタンパク質が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片で
ある、請求項３に記載の免疫原性組成物。
前記アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質、
ＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質の抗原性断片、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）糖タ
ンパク質（ｇｐ８５）、ｇｐ８５の抗原性断片、狂犬病ウイルスＧタンパク質、狂犬病ウ
イルスＧタンパク質の抗原性断片、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択
される抗原もコードする、請求項４に記載の免疫原性組成物。
前記カプシドタンパク質が、ＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片
である、請求項３に記載の免疫原性組成物。
ＦｅＬＶ糖タンパク質（ｇｐ８５）、ｇｐ８５の抗原性断片、狂犬病ウイルスＧタンパ
ク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質の抗原性断片、およびこれらの任意の組み合わせから
なる群から選択される抗原をコードする１つまたは複数の追加のアルファウイルスＲＮＡ
レプリコン粒子を含む、請求項１、２、３、４、５または６に記載の免疫原性組成物。
ＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする追加のアルファ
ウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む、請求項４に記載の免疫原性組成物。
前記ＶＳ―ＦＣＶカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列との少なくとも９
５％の同一性を含むアミノ酸配列を含む、請求項３、４、５、７または８に記載の免疫原
性組成物。
前記ＦＣＶＦ９様カプシドタンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列との少なくとも
９５％の同一性を含むアミノ酸配列を含む、請求項３、５、６、７、８または９に記載の
免疫原性組成物。
前記ＦｅＬＶ糖タンパク質（ｇｐ８５）が、配列番号６のアミノ酸配列との少なくとも
９５％の同一性を含むアミノ酸配列を含む、請求項５、７、９または１０に記載の免疫原
性組成物。
前記狂犬病ウイルスＧタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列との少なくとも９５
％の同一性を含むアミノ酸配列を含む、請求項５、７、９、１０または１１に記載の免疫
原性組成物。
前記アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルフ
ァウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、１１または１２に記載の免疫原性組成物。
前記追加のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）
アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、請求項７、８、９、１０、１１、１２ま
たは１３に記載の免疫原性組成物。
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４に記
載の免疫原性組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、ＦＣＶによる疾患の予防を助
けるためのワクチン。
強毒全身性ネコカリシウイルス（ＶＳ－ＦＣＶ）カプシドタンパク質またはその抗原性
断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、改変された生ネコウイルス
性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）と、改変された生ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ
）と、改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｆｅｌｉ
ｓ）とを含む、ＦＣＶによる疾患の予防を助けるためのワクチンであって、前記アルファ
ウイルスＲＮＡレプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡ
レプリコン粒子であるワクチン。
ネコカリシウイルスＦ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードするアル
ファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む、請求項１６に記載のワクチン。
前記アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ネコカリシウイルスＦ９様カプシドタ
ンパク質またはその抗原性断片をさらにコードする、請求項１６に記載のワクチン。
死滅または改変された生Ｆ９様ネコカリシウイルスをさらに含む、請求項１６に記載の
ワクチン。
ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）糖タンパク質（ｇｐ８５）またはその抗原性断片をコ
ードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む、請求項１６、１７、１８
または１９に記載のワクチン。
前記アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）糖タ
ンパク質（ｇｐ８５）またはその抗原性断片をさらにコードする、請求項１６、１７、１
８または１９に記載のワクチン。
非アジュバントワクチンである、請求項１５、１６、１７、１８、１９、２０または２
１に記載のワクチン組成物。
病原性ＦＣＶに対してネコを免疫する方法であって、免疫学的有効量の請求項１５、１
６、１７、１８、１９、２０、２１または２２に記載のワクチンを前記ネコに投与するス
テップを含む方法。