PT1721982E - Ácidos nucleicos e polipéptidos quiméricos de lissavírus - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ÁCIDOS NUCLEICOS E POLIPÉPTIDOS QUIMÉRICOS DE LISSAVÍRUS A presente invenção refere-se a ácidos nucleicos quiméricos de lissavirus, proteínas e polipéptidos quiméricos codificados por esses ácidos nucleicos. Mais particularmente, a publicação refere-se a proteínas e ácidos nucleicos quiméricos de lissavirus que podem ser usados em composições imunogénicas, tais como vacinas. Portanto, a invenção refere-se também a moléculas transportadoras para a expressão de ácidos nucleicos quiméricos de lissavirus, a métodos de produção de proteínas e polipéptidos quiméricos de lissavirus e a métodos de tratamento de indivíduos para melhorar, curar ou proteger contra infecção por lissavirus. A raiva é uma doença encefalopática provocada por membros do género Lyssavirus da família Rhabdoviridae. A raiva infecta todos os animais de sangue quente e é quase invariavelmente fatal em humanos se não for tratada. Com base em comparações de sequências nucleotídicas e análises filogenéticas, dividiu-se o género Lyssavirus em 7 genótipos (GT) . 0 GT1 inclui o vírus da raiva clássico e estirpes da vacina, enquanto que os de GT2 a GT7 correspondem a vírus relacionados com a raiva incluindo o vírus do morcego de Lagos (GT2) ; vírus Mokola (GT3) ; vírus Duvenhage (GT4); vírus do morcego europeu 1 (EBL-1: GT5) ; vírus do morcego europeu 2 (EBL-2: GT6) e vírus do morcego australiano (GT7).

Com base na antigenicidade, o género Lyssavirus dividiu-se primeiro em quatro serótipos. Mais recentemente, foi dividido em dois grupos principais de acordo com a reactividade cruzada do anticorpo neutralizante do vírus 1 (VNAb) : o Grupo 1 consiste em GT2, GT4, GT5, GT6 e GT7, enquanto que o Grupo 2 consiste em GT2 e GT3. Os virus do grupo 2 não são patogénicos quando injectados perifericamente em ratos. A virulência do lissavirus depende, pelo menos em parte, da glicoproteína presente no revestimento virai. Curiosamente, as glicoproteinas dos virus do grupo 2 apresentam um elevado grau de analogia, na região que contém aminoácidos que desempenham um papel crucial na patogenicidade, com a correspondente sequência do virus GT1 avirulento (ver, por exemplo, Coulon et al., 1998, "An avirulent mutant of rabies virus is unable to infect motoneurons in vivo and in vitro", J. Virol. 72:273-278) . A glicoproteína do virus da raiva (G) é composta por um dominio citoplásmico, um domínio transmembranário e um ectodomínio. A glicoproteína é um trímero com os ectodomínios expostos à superfície do vírus. 0 ectodomínio está envolvido na indução quer da produção do VNAb como da protecção após vacinação, na pré- e na pós-exposição ao vírus. Por conseguinte, ao desenvolver vacinas de subunidades da raiva, prestou-se a maior atenção à G. Estruturalmente, a G contém três regiões, uma região com uma extremidade amino (N-terminal), uma região "charneira" ou "ligante" e uma região com uma extremidade carboxilo (C-terminal) (ver Figura 1).

Como representado na Figura 1, em geral considera-se que o ectodomínio da glicoproteína (G) tem dois sitios antigénicos principais, o sítio II e o sítio III, que são reconhecidos por cerca de 72,5% (sítio II) e 24% (sítio III) dos anticorpos monoclonais neutralizantes (MAb), respectivamente. 0 sítio II está localizado na metade N-terminal da proteína e o sítio III está localizado na 2 metade C-terminal da proteína. As duas metades estão separadas por uma charneira flexível em torno da região linear (aminoácidos 253 a 257). 0 ectodomínio de G contém ainda um sítio secundário (sítio a) e diversos epítopos reconhecidos por MAbs individuais (I: resíduo de aminoácido 231; V: resíduo 294 e VI: resíduo 264) (5, 10, 18, 21 ref. 2). O sítio II é conformacional e descontínuo (resíduos de aminoácido 34 a 42 e resíduos de aminoácido 198 a 200, que estão associados por pontes de dissulfureto), enquanto que o sítio III é conformacional e contínuo (resíduos 330 a 338) . A lisina 330 e a arginina 333 no sítio III desempenham um papel fundamental na neurovirulência e podem estar envolvidas no reconhecimento dos receptores neuronais (ver, por exemplo, Coulon et al., supra, e Tuffereau et al., 1998, "Neuronal cell surface molecules mediate specific binding to rabies virus glycoprotein expressed by a recombinant baculovirus on the surfaces of lepidopteran cells", J Virol. 72:1085-1091). Os sítios II e III parecem estar próximos um do outro na estrutura tridimensional e expostos à superfície da proteína (Gaudin, Y., 1997, "Folding of rabies virus glycoprotein: epitope acquisition and interaction with endoplasmic reticulum chaperones", J. Virol. 71:3742-3750). No entanto, a pH baixo, a molécula G adquire uma conformação inactiva à fusão na qual o sítio II não está acessível a MAbs, enquanto os sítios a e III permanecem mais ou menos expostos (Gaudin, Y. et al. , 1995, "Biological function of the low-pH, fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein (G): G is transported in a fusion-inactive statelike conformation", J. Virol. 69:5528-5533; Gaudin, Y., et al., 1991, "Reversible conformational changes and fusion activity of rabies virus glycoprotein", J. Virol. 65:4853-4859) . 3

Além disso, diversas regiões distribuídas ao longo do ectodominio estão envolvidas na indução de células auxiliares T (Th, T helper) (MacFarlan, R. et al., 1984, "T cell responses to cleaved rabies virus glycoprotein and to synthetic peptides", J. Immunol. 133:2748-2752; Wunner, W. et al, 1985, "Localization of immunogenic domains on the rabies virus glycoprotein", Ann. Inst. Pasteur, 136 E:353-362). Com base nestas propriedades estruturais e imunológicas, tem sido sugerido que a molécula G possa conter duas partes imunologicamente activas, cada uma potencialmente capaz de induzir tanto o VNAb como as células Th (Bahloul, C. et al, 1998, "DNA-based immunization for exploring the enlargement of immunological cross-reactivity against the lyssaviruses", Vaccine 16:417-425) .

As vacinas actualmente disponíveis consistem principalmente em, ou são derivadas de, vírus GT1, contra o qual protegem. Muitas estirpes vacinais não são eficazes contra GT4 e nenhuma é eficaz contra GT2 ou GT3. No entanto, a protecção que se obtém contra GT4 a 6 depende da estirpe vacinai. Por exemplo, a protecção contra o lissavírus de morcego europeu (GT5 e GT6), cujo isolamento se tornou recentemente mais frequente, por estirpes vacinais da raiva PM (Pitman-Moore) não é eficaz. A estirpe PM induz uma protecção mais fraca contra EBL1 (GT5) do que a protecção que proporciona contra a estirpe PV (virus de Pasteur).

Em parte devido à importância da raiva na saúde mundial, existe uma necessidade permanente de proporcionar vacinas que actuem de modo seguro, eficaz e rápido e composições imunogénicas para tratar e evitar esta doença. Foram propostas muitas abordagens para além das utilizadas nas preparações virais em geral e/ou desenvolvidas para 4 proporcionar uma composição imunogénica especifica para o virus da raiva, eficaz em termos de custo-eficiência. Por exemplo, como já foi referido, desenvolveram-se vacinas de subunidades. Foram ainda propostas vacinas, com algum mérito, que podiam gerar uma resposta imunitária a múltiplos serótipos da raiva, bem como a vários outros patogénios (Comissão Europeia COST/STD-3, 1996, "Advantages of combined vaccines", Vaccine 14:693-700). De facto, foi divulgado recentemente o uso de uma vacina combinada de difteria, tétano, tosse convulsa de célula inteira, poliomielite inactivada e raiva (Lang, J. et al. , 1997, "Randomised Feasibility trial of pre-exposure rabies vaccination with DTP-IPV in infants", The Lancet 349:1663-1665) . As vacinas combinadas, incluindo a raiva, foram também utilizadas na imunização de cães (cinomose, hepatite, leptospirose e parvo-virose canina), gatos (panleucopenia, calici- e parvo-virose felina) e gado (virus da febre aftosa) (Pastoret, P-P. et al., 1997, "Vaccination against rabies", In Veterinary Vaccinology, Pastoret, P-P. et al., Eds. (Elsevier): 616-628 23).

Além disso, as vacinas criadas em cultura de tecidos são dispendiosas de produzir apesar de algumas tentativas para reduzir o seu custo. Por consequência, as vacinas de ADN, que são menos dispendiosas de produzir e oferecem muitas vantagens, poderiam constituir uma alternativa valiosa. Referências a vacinas de ADN incluem inoculação de ratos com plasmideos contendo o gene codificante da glicoproteína do virus da raiva (G) . Esta inoculação é muito potente na indução de respostas imunitárias, humoral e celular, em associação com a protecção contra uma exposição intracerebral (ver, por exemplo, Lodmell, D. et al. , 1998, "DNA immunization protects nonhuman primates against rabies virus", Science Med. 4:949-952; Xiang, Z. et al., 1994, 5 "Vaccination with a plasmid vector carrying the rabies virus glycoprotein gene induces protective immunity against rabies virus", Virol. 199:132-140; e Lodmell, D. et al., 1998, "Gene gun particle-mediated vaccination with plasmid DNA confers protective immunity against rabies virus infection", Vaccine 16, 115) . A imunização do ADN pode também proteger primatas não humanos contra a raiva (Lodmell et al, 1998, supra) .

Também Jallet C. et al 1999 (J. Virol., 73(1): 225-233) e Bahloul C. et al, 1998 (Vaccine, 1604) revelam vectores plasmidicos, contendo sequências polinucleotidicas que codificam o sitio III ou o sitio II de glicoproteína de lissavirus, e antigénio de lissavirus diferentes de um sitio III ou II e a sua utilização como vacina para induzir protecção à exposição a lissavirus.

Devido à administração de ADN plasmidico gerar respostas imunitárias, humorais e celulares, incluindo produção de linfócitos T citotóxicos (CTL) (para recapitular, ver Donnelly, J. et al., 1997, "DNA Vaccines", Annu. Rev. Immunol. 15:617-648) e se basear numa tecnologia versátil, a imunização com AND plasmidico pode oferecer uma perspectiva satisfatória para vacinas polivalentes. Todavia, crê-se que o uso de uma mistura de plasmídeos ou de um plasmideo individual expressando vários antigénios levanta problemas de interferência tanto ao nivel transcricional como imunológico (Thomson, S. et al. , 1998, "Delivery of multiple CD8 cytotoxic cell epitopes by DNA vaccination", J. Immunol. 160: 1717-1723). Por conseguinte, é necessário desenvolver e produzir vacinas polivalentes à base de AND que sejam eficazes contra a raiva e várias outras doenças; que sejam seguras e que sejam eficientes em termos de custo de produção e de utilização. 6 A presente publicação proporciona sequências de ácidos nucleicos quiméricos que codificam polipéptidos quiméricos que induzem respostas imunoqénicas em indivíduos. Os ácidos nucleicos da invenção podem ser expressos para proporcionar polipéptidos quiméricos que provocam uma resposta imunitária contra vírus da raiva e/ou vírus relacionados com a raiva, bem como outros organismos ou polipéptidos patogénicos ou de outra forma indesejáveis. Mais, os ácidos nucleicos da invenção podem eles próprios provocar pelo menos uma parte da resposta imunitária. Assim, podem usar-se os ácidos nucleicos quiméricos da invenção para produzir uma composição imunogénica que se pode utilizar para tratar um indivíduo. A presente publicação proporciona também uma molécula transportadora, tal como um vector de expressão de ADN, que compreende o ácido nucleico da invenção, que codifica um polipéptido quimérico. Pode usar-se a molécula transportadora da invenção como uma composição imunogénica, ou como parte de uma composição imunogénica, para obter a desejada resposta imunitária. A desejada resposta imunitária pode ser uma resposta protectora em relação aos vírus da raiva ou relacionados com a raiva, bem como a outros organismos ou polipéptidos. Portanto, podem usar-se as moléculas transportadoras da invenção para produzir uma composição imunogénica que pode ser usada para tratar um indivíduo. Pode também usar-se a molécula transportadora para produzir um polipéptido quimérico. A presente publicação proporciona portanto uma proteína (de fusão) quimérica codificada pelo ácido nucleico da invenção ou por uma sequência de ácidos nucleicos presente na molécula transportadora da invenção. Pode usar-se a proteína quimérica para obter uma resposta imunogénica num 7 indivíduo. A proteína de fusão inclui o determinante antigénico sítio III da glicoproteína de lissavírus e pode compreender outros sítios antigénicos de um ou de muitos outros polipéptidos. Portanto, pode usar-se o polipéptido quimérico da invenção para produzir uma composição imunogénica que se pode usar para tratar um indivíduo. A presente publicação proporciona ainda composições imunogénicas, incluindo vacinas, que obtêm resposta imunológica em indivíduos a quem são administradas. A presente invenção inclui composições imunogénicas compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica um polipéptido quimérico (ou de fusão), ou os polipéptidos quiméricos assim codificados, que obtém resposta imunitária. As composições imunogénicas e vacinas da presente invenção fornecem um nível maior de estímulo imunitário e protecção superior contra vírus da raiva e alargam o espectro de protecção contra vírus relacionados com a raiva, do que o que é fornecido por composições imunogénicas conhecidas na técnica. As composições imunogénicas também proporcionam múltiplos sítios imunogénicos activos para a indução de uma resposta imunitária contra epítopos não rábicos nem com relacionados com a raiva.

Considerando as formas de realização da invenção acima, é evidente que a presente invenção proporciona ainda um método de produzir uma proteína de fusão e um método de preparar uma composição imunogénica, tal como uma vacina. A composição imunogénica preparada desse modo pode ser usada para tratar (e.g., imunizar) indivíduos.

Está incluído na publicação o uso do ácido nucleico, do polipéptido e da molécula transportadora da invenção para obter uma resposta imunitária, tal como uma resposta imunitária protectora. Assim, a publicação inclui o uso de uma vacina compreendendo o polinucleótido, o polipéptido e/ou a molécula transportadora da invenção para tratar um indivíduo profilática ou terapeuticamente. Por conseguinte, a invenção inclui métodos de tratamento profiláticos, métodos de tratamento terapêuticos e métodos de tratamento curativos.

Os inventores criaram sequências de ácidos nucleicos quiméricos que codificam polipéptidos quiméricos que induzem respostas imunogénicas em indivíduos. Como anteriormente referido, é conhecido na técnica que o ADN pode provocar respostas imunitárias, tanto humorais como celulares. Sendo assim, é possível que os próprios ácidos nucleicos possam induzir, pelo menos parte, da resposta imunogénica. Portanto, de acordo com a publicação, os ácidos nucleicos quiméricos e as moléculas transportadoras podem proporcionar ou promover uma resposta imunogénica quando usados de acordo com a invenção.

Aqui os termos "quimérico" e "de fusão" são usados como sinónimos e referem-se tanto a ácidos nucleicos como a polipéptidos. Estes termos referem-se a ácidos nucleicos e a polipéptidos que compreendem sequências que não se encontram espontaneamente associadas entre si, na ordem ou no contexto em que estão colocadas de acordo com a invenção. Por exemplo, uma glicoproteína quimérica pode compreender uma região C-terminal de um GT1 de raiva e uma região N-terminal de um GT3 ou GT5 de raiva. Além disso, um ácido nucleico quimérico pode compreender um segmento curto de uma parte de um genótipo de raiva ligado directamente a outro segmento do mesmo genótipo, onde os dois segmentos não são espontaneamente adjacentes. Assim, um polipéptido 9 ou ácido nucleico de fusão ou quimérico não compreende a sequência original de um virus da raiva na sua globalidade e pode compreender sequências heterólogas (de uma outra estirpe de lissavirus ou de um outro organismo, em conjunto). Proteínas de fusão/quiméricas têm os dois (ou mais) segmentos heterólogos unidos entre si através de ligações péptido normais, enquanto os ácidos nucleicos de fusão/quiméricos têm os dois (ou mais) segmentos heterólogos unidos entre si através de ligações fosfodiéster normais.

Num outro aspecto desta publicação, os ácidos nucleicos quiméricos compreendem a) uma sequência que codifica o sítio III de uma glicoproteína, b) uma sequência que codifica o domínio transmembranar (ou uma parte dele que é, em termos funcionais, equivalente ao domínio transmembranar) de uma glicoproteína e c) uma sequência que codifica o domínio citoplásmico da glicoproteína de um lissavirus. Numa forma de realização preferida deste aspecto da publicação, os ácidos nucleicos quiméricos compreendem ainda uma sequência que codifica o sítio II de uma glicoproteína de lissavirus. Nas formas de realização, a sequência que codifica o domínio transmembranar (ou parte dele) é uma sequência de uma glicoproteína transmembranar de um lissavirus. Noutras formas de realização, a sequência é de uma glicoproteína transmembranar diferente da glicoproteína de um lissavirus. Por exemplo, pode ser de uma glicoproteína de um outro organismo ou de uma proteína transmembranar que não seja uma glicoproteína. Nas formas de realização, a sequência que codifica o domínio transmembranar (ou parte dele) e a sequência que codifica o domínio citoplásmico são do mesmo lissavirus. Nas formas de realização deste aspecto da invenção, a sequência que codifica o sítio III e o domínio citoplásmico são da mesma 10 proteína, preferivelmente uma proteína de lissavírus, como a glicoproteína de lissavírus.

Numa forma de realização preferida deste aspecto da invenção, o ácido nucleicos quimérico inclui sequências que codificam uma sequência de sítio III de uma glicoproteína de lissavírus, uma sequência de sítio II de uma glicoproteína de lissavírus, um domínio transmembranar de uma proteína transmembranar e um domínio citoplásmico de uma glicoproteína de lissavírus. 0 domínio transmembranar pode ser de um lissavírus ou de outro organismo. É altamente preferido que o ácido nucleico quimérico da invenção compreenda sequências que codificam uma proteína antigénica (ou uma parte antigénica dela), especialmente entre as sequências que codificam os sítios II e III.

As sequências que codificam os sítios II e III são sequências que abrangem o sítio II e o sítio III de uma glicoproteína de um lissavírus, respectivamente. Nas formas de realização, a sequência que codifica o sítio III não é idêntica a nenhuma das sequências conhecidas do sítio III de lissavírus, mas apresenta pelo menos 60% de analogia com uma das sequências de lissavírus, prolongando-se 30 bp para cada lado da sequência do sítio III. Realizaram-se análises de sequências e estudos filogenéticos usando vários pacotes: GCG (versão 8.1, 1994), CLUSTAL W (Thompson, 1994 #1040), PHYLIP (Versão 3.5: Felseustein, 1993, #1042) e GDE (Genetic Data Environment, Versão 2.2: Institute Pasteur Scientific Computer Service - S.I.S.).

Em formas de realização preferidas deste aspecto da invenção, a sequência do sítio III é da estirpe PV do vírus da raiva ou apresenta pelo menos 60% de analogia com esta sequência do sítio III. Obtiveram-se resultados muitíssimo 11 satisfatórios com as seguintes construções, apresentados na Figura 1: PV-PV ou PV III ou EBL1-PV ou MOK-PV. 0 módulo base tem de conter pelo menos uma sequência de PV III.

Os inventores descobriram que a presença do sitio III das glicoproteinas de lissavirus melhora a imunogenicidade das composições que compreendem a glicoproteína ou partes dela. Assim, a presente publicação inclui ácidos nucleicos quiméricos que compreendem uma sequência que codifica o sitio III de uma glicoproteína de lissavirus que está funcional, operativa e fisicamente ligada a uma sequência homóloga ou heteróloga que codifica um domínio transmembranar de sequências, naturais ou sintéticas, que codificam uma proteína transmembranar (ou uma parte dela que é funcionalmente equivalente ao domínio transmembranar) e uma sequência que codifica um domínio citoplásmico (ou uma parte dele que seja suficiente para existir citoplasmicamente de forma estável) de uma glicoproteína. Preferivelmente, a glicoproteína é a de um vírus e, particularmente, a de um lissavirus. As sequências de ácidos nucleicos quiméricos podem ser todas do mesmo lissavirus, podem ser seleccionadas de vários lissavirus ou podem ser quer de lissavirus quer de outros vírus e organismos. Em formas de realização preferidas, as sequências de ácidos nucleicos que codificam o sítio III e o domínio citoplásmico são do mesmo lissavirus.

Além disso, o ácido nucleico quimérico da publicação pode compreender uma sequência que codifica um polipéptido antigénico, ou uma sua parte antigénica, de um outro vírus ou organismo (uma sequência heteróloga). Por exemplo, o ácido nucleico quimérico pode compreender uma sequência que codifica um epítopo de leishmaniose, difteria, tétano, poliomielite, virus da febre aftosa, vírus do herpes, vírus 12 da cinomose canina, parvo-vírus e vírus da imunodeficiência felina. Alternativa ou conjuntamente, o ácido nucleico quimérico compreende uma sequência que codifica um antigénio tumoral. A sequência que codifica o polipéptido heterólogo (ou a sua parte antigénica) é fundida (na estrutura) com a sequência codificante detalhada acima, em qualquer sítio que resulte num produto funcional. Deste modo, o ácido nucleico quimérico da invenção proporciona a sequência codificante para múltiplos determinantes antigénicos, incluindo epítopos do vírus da raiva, mas não só.

Os ácidos nucleicos quiméricos da publicação podem ser usados para preparar uma composição imunogénica. A composição imunogénica pode consistir essencialmente no ácido nucleico quimérico ou podem compreender o ácido nucleico quimérico juntamente com outros componentes, incluindo, mas não se limitando a eles, adjuvantes, excipientes, estabilizantes, vectores supra-moleculares, como descrito na Patente Europeia N° 696.191 (Samain et al.) e antigénios. Os componentes normalmente incluídos nas composições imunogénicas são bem conhecidos do perito da área, tal como as técnicas de preparação das composições imunogénicas, tais como vacinas. Portanto, a composição imunogénica pode ser preparada pelo perito usando técnicas bem conhecidas, sem experimentação desnecessária ou excessiva.

Num outro aspecto da publicação, o ácido nucleico quimérico da invenção está presente como parte de uma molécula transportadora. 0 núcleo da molécula transportadora pode ser qualquer molécula que seja conhecida como útil para manter e, preferivelmente, expressar um ácido nucleico que codifica um polipéptido heterólogo. 0 núcleo da molécula 13 transportadora pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um fago, um fagomídeo, um cosmídeo, um vírus ou um cromossoma artificial de levedura (YAC). Estas moléculas transportadores com núcleo são vulgarmente referidas como vectores ou vectores de expressão, são bem conhecidas do perito e estão amplamente disponíveis ao público. Pode proporcionar-se a molécula transportadora da publicação como um ácido nucleico com ou sem invólucro, tal como um revestimento ou escudo virai. Pode proporcionar-se a molécula transportadora da publicação como ADN ou ARN. Incluem-se no âmbito da publicação formas modificadas destes dois ácidos nucleicos. Preferivelmente, a molécula transportadora compreende sequências que permitem a transcrição dos ácidos nucleicos quiméricos da publicação. Estas sequências estão ligadas de forma operacional aos ácidos nucleicos quiméricos da invenção (i.e., a sua operacionalidade/funcionalidade afecta directamente a expressão do ácido nucleico quimérico. Nas formas de realização, estas sequências incluem elementos reguladores que permitem uma expressão controlada dos ácidos nucleicos quiméricos, de modo a poder regular a expressão dos ácidos nucleicos quiméricos através de, por exemplo, retardar a expressão até ao momento desejado ou expressar os ácidos nucleicos quiméricos apenas em certos tecidos ou tipos de células. Estes elementos de controlo são bem conhecidos do perito na área e podem ser introduzidos ou removidos, de forma rotineira, das moléculas transportadoras, conforme o desejado ou necessário, usando técnicas e reagentes de biologia molecular bem conhecidos.

Numa forma de realização preferida da publicação, a molécula transportadora de acordo com a invenção compreende ácido nucleicos que codificam a) o sitio III da glicoproteína de um lissavírus, b) um domínio 14 transmembranar de uma glicoproteína (ou uma parte dele que é, em termos funcionais, equivalente ao domínio transmembranar) e c) uma sequência que codifica o domínio citoplásmico da glicoproteína de um lissavírus. Nas formas de realização preferidas deste aspecto da publicação, a molécula transportadora compreende ainda uma sequência que codifica o sítio II de uma glicoproteína de lissavírus. Nas formas de realização, a sequência que codifica o domínio transmembranar (ou parte dele) é uma sequência da glicoproteína de um lissavírus. Noutras formas de realização, a sequência é de uma glicoproteína transmembranar diferente da glicoproteína de um lissavírus. Nas formas de realização, a sequência que codifica o domínio transmembranar (ou parte dele) e a sequência que codifica o domínio citoplásmico são do mesmo lissavírus. Nas formas de realização, a sequência que codifica o sítio III e o domínio citoplásmico são do mesmo lissavírus.

Numa forma de realização preferida, a molécula transportadora compreende ainda pelo menos uma sequência antigénica para além do sítio III ou do sítio II de um lissavírus. A(s) sequência(s) antigénica(s) adicional(ais) podem ser de qualquer organismo e incluem, sem se lhes limitarem, sequências antigénicas de parasitas (por exemplo, leishmaniose), bactérias, vírus, células tumorais. A molécula transportadora da invenção, ao proporcionar a região de glicoproteína de lissavírus necessária à imunogenicidade reforçada (sítio III), permite a produção de uma resposta imunitária de alto nível, não apenas ao antigénio de lissavírus (sítios III e II), mas ao(s) antigénio(s) heterólogo (s) fundidos às sequências de lissavírus. A molécula transportadora pode ser usada para obter uma resposta imunitária a múltiplos antigénios de diferentes organismos. 15 A molécula transportadora da publicação compreende, de preferência, uma sequência quimérica que codifica um polipéptido quimérico que compreende pelo menos um determinante antigénico que é o sitio III de um lissavirus. Mais preferivelmente, a molécula transportadora compreende uma sequência quimérica que codifica um polipéptido quimérico que compreende o sitio III de um lissavirus e, pelo menos, um outro determinante antigénico seleccionado do grupo que consiste num antigénio do mesmo lissavirus, do qual derivou o sitio III, e um antigénio heterólogo. Os outros determinantes antigénicos incluem, sem se lhes limitarem, os de parasitas patogénicos, virus e bactérias, e os de células tumorais. Podem usar-se as moléculas transportadoras da publicação para preparar uma composição imunogénica. A composição imunogénica pode consistir essencialmente na molécula transportadora ou pode compreender a molécula transportadora juntamente com outros componentes, incluindo, mas não se limitando a eles, adjuvantes, excipientes, estabilizantes, vectores supra-moleculares (EP 696.191, Samain et al.) e antigénios. Os componentes normalmente incluídos nas composições imunogénicas são bem conhecidos do perito da área, tal como as técnicas de preparação das composições imunogénicas, incluindo vacinas. A preparação da composição imunogénica é um assunto rotineiro que o perito pode realizar usando técnicas bem conhecidas, sem experimentação desnecessária ou excessiva, não sendo assim necessário descrevê-la aqui em detalhe.

Num outro aspecto, a presente publicação proporciona uma proteína ou polipéptido quiméricos e/ou expressos pelo ácido nucleico quimérico e/ou pela molécula transportadora da presente invenção. 0 polipéptido quimérico compreende a) o sítio III de uma glicoproteína de lissavirus, b) um 16 domínio transmembranar de uma glicoproteína (ou uma parte funcional dele) e c) um domínio citoplásmico da glicoproteína de um lissavírus. Nas formas de realização preferidas deste aspecto da invenção, os polipéptidos quiméricos compreendem ainda o sítio II de uma glicoproteína de lissavírus. Nas formas de realização, o domínio transmembranar (ou parte dele) é da glicoproteína de um lissavírus. Noutras formas de realização, o domínio transmembranar (ou parte dele) é de uma glicoproteína transmembranar diferente da glicoproteína de um lissavírus. Noutras formas de realização, o domínio transmembranar (ou parte dele) e o domínio citoplásmico são do mesmo lissavírus. Nas formas de realização, o sítio III e o domínio citoplásmico são do mesmo lissavírus. 0 sítio II e o sítio III podem ser obtidos a partir de qualquer lissavírus e ambos podem, mas não necessariamente, vir do mesmo lissavírus. Além disso, a sequência do sítio II e/ou do sítio III não tem de ser idêntica a um sítio II ou a um sítio III de uma glicoproteína de um lissavírus. Nas formas de realização, a sequência de um ou de ambos não é idêntica a nenhuma das sequências de lissavírus de sítio II ou de sítio III conhecidas, mas apresenta pelo menos 60% de analogia com uma das sequências de lissavírus, prolongando-se 10 resíduos para cada lado da sequência do sítio II ou do sítio III.

Em formas de realização preferidas, o polipéptido quimérico da publicação compreende ainda pelo menos um determinante antigénico para além do sítio II ou do sítio III da glicoproteína de lissavírus. O outro determinante antigénico pode ser uma proteína antigénica, ou uma sua parte antigénica, de outros vírus da raiva ou vírus relacionados com a raiva, de outros vírus, de um parasita, 17 uma bactéria ou qualquer outro organismo ou célula que expresse um determinante antigénico indesejável. Assim, a publicação proporciona um polipéptido quimérico que compreende, como o único determinante antigénico, o sitio III de um lissavirus. Devido à antigenicidade depender, pelo menos em certa medida, do indivíduo a quem é administrada a composição imunogénica, um polipéptido quimérico tendo apenas um determinante antigénico num organismo pode ter mais do que um determinante antigénico num outro. Todavia, de acordo com a invenção, se um polipéptido quimérico tiver apenas um determinante antigénico em pelo menos um indivíduo, independentemente do número que tenha noutros indivíduos, é um polipéptido quimérico de acordo com esta forma de realização da invenção. A publicação proporciona também polipéptidos quiméricos com múltiplos antigénios, incluindo antigénios da raiva, mas não só. 0 polipéptido quimérico pode ser usado como uma composição imunogénica , ou como parte dela, tal como uma vacina. Assim, o polipéptido da publicação é um polipéptido imunogénico que contém pelo menos uma região (que se pode isolar como um fragmento) que induz uma resposta imunogénica. Nas formas de realização onde estão presentes um sítio II, um sítio III e um outro determinante antigénico é preferível, mas não necessário, que o outro determinante antigénico esteja localizado entre o sítio II e o sítio III na sequência de aminoácido linear (primária) do polipéptido. Um antigénio preferido, para além do sítio II ou do sítio III, é um antigénio tumoral de uma célula tumoral.

Preferivelmente, os ácidos nucleicos quiméricos, as moléculas transportadoras e os polipéptidos quiméricos (as 18 "moléculas") da publicação são isolados e/ou purificados. Os termos "isolado" e "purificado" referem-se a um nivel de pureza que se atinge usando tecnologia corrente. As moléculas da publicação não necessitam de ser absolutamente puras (i.e., não conter absolutamente quaisquer outras moléculas ou outras macromoléculas celulares), mas devem ser suficientemente puras de modo a que um vulgar perito possa reconhecer que deixaram de estar presentes no ambiente onde foram inicialmente encontradas (i.e., o meio celular). Assim, uma molécula purificada ou isolada de acordo com a publicação é uma molécula que foi removida de pelo menos uma outra macromolécula presente no ambiente natural onde foi encontrada. Mais preferivelmente, as moléculas da publicação são basicamente purificadas e/ou isoladas, o que significa que a composição onde se encontram está quase completamente, ou mesmo absolutamente, isenta de outras macromoléculas encontradas no ambiente em que as moléculas da publicação são originalmente encontradas. 0 isolamento e a purificação não ocorrem por adição ou remoção de sais, solventes ou elementos da tabela periódica, mas têm de incluir a remoção de pelo menos algumas macromoléculas.

Com se pode ver pelo revelado acima, a invenção proporciona uma composição imunogénica. A composição imunogénica pode compreender o ácido nucleico quimérico, a proteína quimérica e/ou a molécula transportadora da invenção. Por exemplo, podem usar-se os polipéptidos quiméricos da invenção para preparar uma composição imunogénica. A composição imunogénica pode consistir essencialmente no polipéptido quimérico ou pode compreender o polipéptido quimérico juntamente com outros componentes, incluindo, mas não se limitando a eles, adjuvantes, excipientes, estabilizantes, vectores supra-moleculares (EP 696.191, 19

Samain et al.) e antigénios. Os componentes normalmente incluídos nas composições imunogénicas são bem conhecidos do perito da área, tal como as técnicas de preparação das composições imunogénicas, tais como vacinas. Portanto, a preparação da composição imunogénica pode ser realizada pelo perito usando técnicas bem conhecidas, sem experimentação desnecessária ou excessiva. A composição imunogénica de acordo com a invenção é uma composição que provoca uma resposta imunológica, pelo menos ao lissavírus. Uma vez que os ácido nucleicos quiméricos (e portanto as moléculas transportadoras e os polipéptidos) da publicação podem compreender determinantes antigénicos de vários genótipos de lissavírus em diversas combinações, a composição imunogénica da invenção pode proporcionar um largo espectro de protecção contra lissavírus que induzem encefalomielite, incluindo o vírus da raiva. Além disso, uma vez que as sequências que codificam múltiplos epítopos de lissavírus se podem incluir num ácido nucleico quimérico, a composição imunogénica da invenção pode provocar uma resposta imunológica a múltiplos genótipos (ou a todos) de lissavírus. Preferivelmente, a composição imunogénica da invenção obtém uma resposta imunológica tanto celular como humoral.

Além disso, a composição imunogénica da invenção pode proporcionar epítopos não apenas de lissavírus, mas também de qualquer outro organismo (incluindo antigénios produzidos por células humanas, tais como antigénios indesejáveis encontrados à superfície de células cancerosas). Isto permite a construção de composições imunogénicas, incluindo, mas não se limitando a vacinas, tendo uma aplicação ampla em que uma única composição pode ser usada para obter um resposta imunológica a múltiplos 20 patogénios. Por exemplo, pode preparar-se uma composição imunogénica que proporcione uma resposta imunológica protectora a uma ampla gama de lissavirus, enquanto simultaneamente proporciona uma resposta protectora a outros vírus, tais como polio e gripe. Essa composição imunogénica polivalente é obtida devido à natureza quimérica dos ácidos nucleicos e dos polipéptidos da invenção, bem como à presença de sítio III de um lissavirus que confere uma resposta imunogénica forte aos epítopos do polipéptido antigénico. A composição imunogénica da invenção provoca uma resposta imunogénica em indivíduos a quem foi administrada. A resposta imunogénica pode provocar uma resposta imunológica protectora, mas essa resposta não é indispensável. De acordo com a invenção, as composições imunogénicas que provocam uma resposta protectora são designadas por vacinas. As respostas imunogénicas podem ser reforçadas ou, de outro modo, modificadas pela inclusão de componentes, em adição aos ácidos nucleicos quiméricos, proteínas quiméricas e moléculas transportadoras da invenção. Em alternativa, as composições imunogénicas podem consistir essencialmente nos ácidos nucleicos quiméricos, proteínas quiméricas e moléculas transportadoras da invenção. A publicação inclui vacinas de ADN que compreendem os ácidos nucleicos quiméricos e/ou as moléculas transportadoras da invenção. A publicação proporciona um método de preparar uma composição imunogénica. Numa forma de realização, o método compreende isolar e/ou purificar o ácido nucleico quimérico ou polipéptido ou molécula transportadora. Numa outra forma de realização, o método compreende isolar e/ou purificar o ácido nucleico ou polipéptido ou molécula transportadora, 21 depois combiná-los com outros componentes. Os outros componentes podem ser qualquer composto adequado que não tenha um efeito adverso na imunogenicidade, segurança ou eficácia do ácido nucleico, polipéptido ou molécula transportadora da invenção. Os componentes suplementares incluem, mas não se limitam a, compostos e aditivos que são normalmente adicionados a composições imunogénicas par aumentar a imunogenicidade, a estabilidade e a biodisponibilidade. Esses aditivos são revelados acima e são bem conhecidos do perito.

Numa forma de realização da invenção, o método de preparar uma composição imunogénica é um método de expressar um polipéptido quimérico (hibrido) para usar na produção de uma composição imunogénica. Nesta forma de realização, o ácido nucleico quimérico ou molécula transportadora da invenção são expressos (transcritos ou traduzidos) de forma a produzir o polipéptido quimérico. 0 polipéptido quimérico produzido desta forma é então isolado e/ou purificado para um nivel aceitável, de modo a que possa ser usado para preparar uma composição imunogénica. A produção de uma composição imunogénica nesta forma de realização da invenção está de acordo com a presente publicação. Como aqui usado, um polipéptido é um polímero de aminoácidos e inclui péptidos (mais de 3 aminoácidos de comprimento) e proteínas (mais de 100 aminoácidos de comprimento). Pode realizar-se a produção do polipéptido quimérico in vivo ou in vitro. Preferivelmente, a produção ocorre in vivo por expressão em culturas bacterianas ou de tecidos e o polipéptido quimérico é isolado das culturas usando técnicas conhecidas de purificação de proteínas.

Num outro aspecto da invenção, proporcionam-se métodos de produzir o ácido nucleico quimérico, as moléculas 22 transportadoras e os polipéptidos quiméricos da invenção. Os métodos incluem métodos de engenharia genética vulgarmente conhecidos que são bem conhecidos do perito. Pode usar-se qualquer técnica bem conhecida, executada regularmente pelo perito, para produzir e purificar as moléculas quiméricas da invenção. A inovação da invenção não se prende com essas técnicas, mas com as moléculas quiméricas construídas através do seu uso. Neste aspecto, podem usar-se os métodos para obter um ácido nucleico ou molécula transportadora para usar na preparação de uma composição imunogénica, tal como uma vacina de ADN . A invenção inclui portanto um método de preparação de uma composição para usar numa vacina de ADN. A publicação proporciona igualmente métodos de tratamento de indivíduos com composições imunogénicas da invenção. Preferivelmente, o método é um método de vacinação. 0 método compreende administrar as composições imunogénicas a indivíduos, ou pacientes, com necessidade de tratamento, suspeitos de necessitarem de tratamento ou que pretendam um tratamento profilático (protector) para uma doença ou distúrbio. Pode usar-se qualquer método de administração conhecido neste aspecto da invenção, incluindo, mas não se lhes limitando, injecção com seringa e agulha (e.g., subcutânea, intramuscular ou intravenosa), administração oral ou nas mucosas, inalação, administração tópica (e.g., aplicação directa na pelo) e por supositório.

Numa realização deste aspecto da publicação, o método compreende a administração a um indivíduo dos ácidos nucleicos quiméricos da invenção numa quantidade suficiente para obter uma resposta imunogénica do receptor. Preferivelmente, esta resposta é uma resposta protectora. A quantidade de ácido nucleico necessária para essa 23 sem imunização pode ser determinada pelos peritos, experimentação indevida ou excessiva. Por exemplo, composições que compreendem os ácidos nucleicos quiméricos e as moléculas transportadoras da publicação podem ser administradas numa quantidade de 40 a 100 μρ intramuscularmente, numa ou em várias injecções. Uma dosagem de 100 μρ é em geral útil para cães e uma dosagem de 40 μρ para ratos (peso de 20 g).

Numa outra realização deste aspecto da publicação, o método compreende a administração a um indivíduo dos polipéptidos quiméricos da publicação. Preferivelmente, a resposta é uma resposta protectora. A quantidade de polipéptido necessária para essa imunização pode ser determinada pelos peritos, sem experimentação indevida ou excessiva. Por exemplo, composições que compreendem os polipéptidos quiméricos da publicação podem ser administradas numa quantidade de 1 a 10 μρ intramuscularmente, numa ou em várias injecções.

Numa outra realização deste aspecto da publicação, o método compreende a administração a um indivíduo da molécula transportadora da publicação. Preferivelmente, a resposta é uma resposta protectora. A quantidade de molécula transportadora necessária para essa imunização pode ser determinada pelos peritos, sem experimentação indevida ou excessiva. Por exemplo, composições que compreendem as moléculas transportadoras da invenção podem ser administradas numa quantidade de 40 a 100 μρ intramuscularmente, numa ou em várias injecções.

Assim, este aspecto da publicação proporciona um método de vacinação de ADN. O método inclui também a administração a um indivíduo de qualquer combinação dos ácidos nucleicos quiméricos, dos polipéptidos quiméricos e das moléculas 24 transportadoras da invenção. Nas formas de realização, o indivíduo é um animal e, de preferência, mamífero. Mais preferivelmente, o mamífero é seleccionado no grupo que consiste num humano, um cão, um gato, um bovino, um porco e um cavalo. Numa forma de realização especialmente preferida, o mamífero é um humano.

Os métodos de tratamento incluem a administração de composições imunogénicas que compreendem polipéptidos, mas também composições que compreendem ácidos nucleicos (incluindo a molécula transportadora). Os peritos na técnica estão cientes do conceito, aplicação e eficácia das vacinas de ácido nucleico (e.g., vacinas de ADN) e da tecnologia das vacinas de ácido nucleico, bem como das tecnologias à base de proteínas e de polipéptidos. A tecnologia à base de ácido nucleico permite a administração de ácidos nucleicos, com ou sem invólucro, directamente nos tecidos e células, sem ser necessário produzir proteínas codificadas antes da administração. A tecnologia baseia-se na capacidade destes ácidos nucleicos serem captados por células do organismo receptor e expressas para produzir um determinante imunogénico ao qual o sistema imunitário do receptor responde. Normalmente, os antigénios expressados são revelados na superfície celular das células que captaram e expressaram os ácidos nucleicos, mas a expressão e exportação dos antigénios codificados para o sistema circulatório do indivíduo receptor também está no âmbito da presente invenção. Esta tecnologia de vacina de ácido nucleico, inclui, mas não se lhe limita, fornecer ADN e ARN sem invólucro e fornecer vectores de expressão que codificam polipéptidos de interesse (moléculas transportadoras). Apesar da tecnologia se designar por "vacina", aplica-se igualmente a composições imunogénicas que não originem uma resposta protectora. Estes métodos e 25 composição que não induzem protecção estão incluídos na presente invenção.

Apesar de estar no âmbito da presente publicação fornecer ácidos nucleicos e moléculas transportadoras como ácido nucleico sem invólucro, a presente publicação inclui também fornecer ácidos nucleicos como parte de composições maiores e mais complexas. Incluem-se entre estes sistemas de fornecimento os vírus, partículas tipo vírus ou bactérias contendo o ácido nucleico quimérico ou a molécula transportadora da invenção. Também se incluem no âmbito da publicação complexos dos ácidos nucleicos e moléculas transportadoras divulgadas com compostos de permeabilização celular, como lipossomas. Outros compostos que são do conhecimento do perito, vectores supra-moleculares (EP 696.191, Samain et al.) e sistemas de fornecimento de vacinas de ácido nucleico, como se exemplifica em WO 90 111092 e WO 93 06223 (patentes de Vical), podem ser produzidos e usados sem experimentação indevida ou excessiva.

Os métodos de tratamento de indivíduos de acordo com a publicação incluem tratamento profilático, tratamento terapêutico e tratamento curativo. O tratamento profilático consiste em tratar um indivíduo, usando os métodos da publicação, antes de se identificar qualquer sinal clínico de doença ou infecção. Assim, o tratamento profilático é um tratamento preventivo e inclui vacinação. O tratamento profilático também inclui tratamento que é aplicado depois do início efectivo da infecção ou doença, mas antes de se observar qualquer sinal clínico da doença ou infecção. O tratamento terapêutico consiste em tratar um indivíduo depois de se identificar pelo menos um sinal clínico de doença ou infecção ou depois de se saber (ou de ser 26 altamente suspeito) que um indivíduo foi exposto a uma quantidade de um agente suficiente para provocar doença ou infecção. Os métodos de tratamento terapêuticos não conduzem necessariamente à eliminação da doença ou infecção, no entanto, proporcionam uma melhoria clinicamente detectável em pelo menos um sinal clínico da doença ou infecção. Os métodos de tratamento curativos conduzem à eliminação completa dos sinais clínicos da doença ou infecção. Incluem-se nos métodos de tratamento curativos os que conduzem à supressão completa do agente causador da infecção ou doença, seja ele um vírus, uma bactéria ou uma célula hospedeira (como uma célula cancerosa). Incluem-se ainda nos métodos de tratamento curativos os que provocam remissão completa da doença, i.e. eliminação completa de todos os sinais clínicos exteriores de infecção ou doença e repressão de todas as manifestações clínicas detectáveis da infecção ou doença.

Em relação à vacinação da raiva, sabe-se que o vírus pode ser tratado quer profilaticamente (e.g., por vacinação de cães) quer curativamente (e.g., por uma série de injecções a um humano que tenha sido mordido por um cão com raiva) . Assim, uma forma de realização preferida da presente invenção é um método de vacinação de um indivíduo com uma vacina que compreende a composição imunogénica da invenção. Como discutido acima, a composição imunogénica da invenção pode compreender (ou codificar) múltiplos determinantes antigénicos. Portanto, um método da publicação pode incluir múltiplos tipos de tratamento para múltiplos tipos de doenças ou infecções. Por exemplo, um único tipo de tratamento pode incluir tratamento profilático de polio, tratamento profilático e terapêutico da raiva e tratamento profilático da gripe. 27

Será evidente para o vulgar perito na técnica que se podem realizar diversas modificações e alterações na construção das moléculas e na aplicação dos métodos da invenção, sem se afastar do âmbito da mesma. A invenção será agora descrita em mais pormenor com referência a exemplos específicos da invenção, que não pretendem, nem são elaborados para, limitar o âmbito da invenção de nenhuma forma.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E TABELAS A invenção será descrita em maior pormenor com referência aos desenhos, nos quais: A Figura 1 representa glicoproteínas de lissavírus e construções quiméricas de glicoproteínas de lissavírus. SP - Péptido sinal; TM - Domínio transmembranar; SI - residuos de aminoácido NL; S2 - resíduos de aminoácido NS ; S3 -resíduos de aminoácido LFAV. (A) Representação esquemática de glicoproteína de PV de lissavírus (G) que indica as regiões que incluem o sítio II, o sítio III e os epítopos I, V e VI, apresentando-se também o domínio transmembranar (TM) no topo. Os polipéptidos quiméricos estão representados esquematicamente nas outras linhas, com os pontos de supressão e/ou fusão indicados por números de resíduos. Os números são as posições de resíduos de aminoácido na proteína madura (péptido sinal clivado) (B) Sequências de aminoácidos dos polipéptidos quiméricos nos sítios de fusão. A região linear que comporta o epítopo VI (aminoácido 264) está indicada pelo sublinhado nos resíduos 251-275. Os rectângulos pretos e cinzentos assinalam as sequências EBL-1 e Mok, 28 respectivamente. 0 tracejado representa aminoácidos semelhantes aos da sequência de PV e os pontos correspondem a espaços. (C) Representação esquemática das sequências inseridas que codificam o epítopo de polivírus C3 envolvido na indução de anticorpo neutralizante do virus (B) e o epitopo de células CD8 H-2d (CTL) da nucleoproteína do virus da coriomeningite linfocitica (LCMV) envolvido na indução tanto dos linfócitos T citotóxicos (CTL), como na protecção contra a exposição a LCMV na proteína G de lissavírus truncada (GPVIII) e quimérica (GEBL1-PV). (D) Apresenta-se ainda a análise da sequência PEST putativa em torno da junção da extremidade da parte EBL1 e do início do epítopo celular B. (E) Comparação das sequências de aminoácidos deduzidas de proteínas G de lissavírus seleccionados. Apresenta-se a sequência de consenso como a sequência inferior. Os quadros cinzentos claros indicam os sitios antigénicos principais. Os quadros cinzentos escuros indicam o péptido sinal (SP) hidrófobo e o domínio transmembranar (TM). Os motivos NX/S/T) sublinhados são sítios de N-glicolização prováveis. A Figura 2 mostra microscopia de imunofluorescência indirecta de produção de G de lissavírus em células Neuro-2a, 48 h depois da transfecção com vários plasmídeos: pGPV PV (A, B e C) , pG-PVIII (D, E e F) , pGEBLl-PV (G, Hei), pGMok-PV (J, K e L) e pGPV-Mok (Μ, N e 0). Quarenta e oito horas depois da transfecção, as células foram permeabilizadas e coradas com anticorpos: anti-PV G PAb (A, D, G, J e M), MAb anti-sítio III da G nativa de PV G nativa de PV Dl (B, E, H e K), MAb anti-sítio III da G desnaturada de 6B1 (C e F), Pab anti-G de EBL-1 (I), Pab anti-G de Mok (L e N) e soro de um rato imunizado (0). 29 A Figura 3 mostra os resultados de um estudo cinético de sintese antigénica de células Neuro-2a transfectadas transitoriamente com pGPV-PV (a), pGEBLl-PV (b) ou pG-PVIII (c) . As células foram permeabilizadas em momentos diferentes e coradas com PAb PV (barra a ponteado) ou MAb anti-sitio III de G desnaturada de 6B1 (barra sombreada). A Figura 4 mostra os resultados de indução de células produtoras de IL-2 por plasmídeos que codificam várias G de lissavírus. Injectaram-se ratos BALB/c (dois animais para cada plasmídeo) i.m. (50 μΐ em cada músculo tibial anterior) com 40 μρ de plasmídeo (pGPV-PV, pG-PVIII, pGEBLl-PV, pGMok-PV e pGPV-Mok). Retiraram-se os baços 21 dias mais tarde e estimularam-se especificamente os esplenócitos in vitro por um vírus inactivado e purificado (PV, EBL1 ou Mok) , G de PV, ou estimularam-se policlonalmente com concanavalina A (ConA). Analisou-se então, em triplicado, a quantidade de IL-2 libertada por bioensaio e expressaram-se os títulos em U/ml. A Figura 5 mostra a indução de VNAb contra genótipos de lissavírus europeu por plasmídeo. Injectaram-se ratos BALB/c com 40 μρ de plasmídeo no músculo tibial. (A) Injecção com pGPV-PV. Os ratos receberam um reforço no dia 30. Analisaram-se os soros (conjunto de 3 amostras) nos dias 27 e 40 para determinar VNAb contra vírus de genótipos 1 (CVS e PV), 5 (EBL1 b) e 6 (EBL2b). (B) Injecção com pGEBLl-PV. Quatro ratos receberam uma única injecção de plasmídeo e recolheram-se amostras de sangue a vários intervalos por punção trans-orbital. Analisaram-se os soros por RFFIT usando vírus PV e EBL1 para determinar VNAb. 30 A Figura 6 mostra protecção comparativa induzida por plasmideos pGPV-PV, pGEBLl-PV e vacinas de PM e PV da raiva contra CVS, EBL-lb e EBL-2b. Injectaram-se ratos BALB/c (9 animais por série) i.p., nos dias 0 e 7, com 0,5 ml de vacina de PM, diluída 1/10° (círculos negros) ou com 2 μρ de vírus PV inactivados e purificados (quadrados negros) . Para as imunizações à base de ADN, inj ectaram-se ratos BALB/c (5 animais para cada plasmídeo) no músculo tibial com PBS (círculos brancos) com 40 μρ de diversos plasmideos pGPV-PV (losangos), EBL1-PV (triângulos negros), cadeia de pCIneo (cruzes). Injectaram-se ratos suíços (6 animais) com pGPV-PV (quadrados brancos). (a) Injectou-se vírus inactivado • Expuseram-se ratos BALB/c e suíços i.c. no dia 20 com cerca de 30 DL50 de CVS . (b) Injectou-se vírus inactivado • Expuseram-se ratos BALB/c e suíços i.c. no dia 20 com cerca de 30 DL50 de EBL-lb. (c) Injectou-se vírus inactivado • Expuseram-se ratos BALB/c e suíços i.c. no dia 20 com cerca de 30 DL50 de EBL-2b. (d) Injectou-se ADN. Expuseram-se ratos BALB/c e suíços i.c. no dia 20 com cerca de 3 0 DL50 de CVS. (e) Injectou-se ADN. Expuseram-se ratos BALB/c e suíços i.c. no dia 20 com cerca de 30 DL50 de EBL-lb. (f) Injectou-se ADN. Expuseram-se ratos BALB/c e suíços i.c. no dia 20 com cerca de 30 DL50 de EBL-12. A Figura 7 mostra microscopia de imunofluorescência indirecta de antigénios expressos em células Neuro-2a transfectadas com plasmideos. 31 (A) As células foram transfectadas com plasmídeo pGEBLl-(B-CTL)2-PV e coradas com o MAb Dl da raiva. (B) As células foram transfectadas com plasmídeo pGEBLl-(B-CTL)2-PV e coradas com o Mab C3 de polivírus. (C) As células foram transfectadas com plasmídeo pGEBLl-(B-CTL) 2-PV e coradas com o PAb anti-polivírus de tipo 1. (D) As células foram transfectadas com plasmídeo pCIneo e coradas tanto com 1) o MAb Dl da raiva, 2) o Mab C3 de polivírus, como com o 3) PAb anti-polivírus de tipo 1. A Figura 8 mostra a indução de células produtoras de IL-2 por pGPWIII (A) ou pGEBLl-PV(B) comportando epítopos de LCMV e polivírus. Injectaram-se ratos BALB/c (dois animais para cada plasmídeo) i.m. (50 μρ em cada músculo tibial anterior) com plasmídeos. Retiraram-se os baços 14 dias mais tarde e estimularam-se os esplenócitos in vitro por meio de cultura celular (barra axadrezada), especificamente por lissavírus inactivado e purificado (IPLV PV: barra sombreada, IPLV EBL1: sombreado claro), ou estimularam-se policlonalmente por ConA (barra pontilhada). Analisou-se então, em triplicado, a quantidade de IL-2 libertada por bioensaio e expressaram-se os títulos em U/ml. (A) Os plasmídeos injectados foram o plasmídeo vazio de pCIneo, o pGPVIII e o p(B-CTL)2-GPVIII. (B) Os plasmídeos injectados foram os pCIneo, pGEBLl-PV, pGEBLl-(B)-PV, pGEBLl-(CTL)-PV, pGEBLl-(CTL-B)-PV, pGEBLl-(B-CTL)2-PV.

em ratos BALB/c, de p (B-CTL)2-GPVIII ou e vírus da raiva, de p(B-CTL)2-GPVIII A Figura 9 mostra um estudo cinético, produção de anticorpos induzida por pGPVIII contra péptido de polivírus Injectaram-se três ratos com 40 μς 32 (quadrado e círculo) ou pGPVIII (triângulo) ou pCIneo vazio (losango). Depois de punção por via retro-orbital em vários momentos, analisaram-se os soros por ELISA para determinar os anticorpos contra péptido de polivírus (quadrado e losango) ou vírus da raiva (círculo, triângulo e losango). A Figura 10 mostra a influência da utilização de um iniciador na produção de anticorpos antipéptido de polivírus induzida por p(B-CTL)2-GPVIII. , Cinco grupos de três ratos receberam, no dia 0, PBS (2 grupos), p(B-CTL)2-GPVIII (2 grupos) ou pPVIII. Um grupo (injectado com p (B-CTL)2-GPVIII) não recebeu reforço, enquanto que o grupo injectado com pPVIII recebeu um reforço de p(B-CTL)2-GPVIII no dia 26. Um grupo (injectado com p(B-CTL)2-GPVIII) recebeu reforço com p(B-CTL)2-GPVIII no dia 14. Todos os animais foram controlados por ELISA no que respeita à produção de anticorpos antipéptido no dia 39. A Figura 11 mostra a produção de anticorpos neutralizantes do vírus da raiva contra o vírus da raiva da estirpe CVS (CVS, challenge virus Standard) após injecção do plasmídeo homogéneo completo pGPV em cães beagle.

Grupo A: Injecção de 100 μρ de plasmídeo num local nos dias 0, 21, 42 e 175.

Grupo B: Injecção de 33 μg de plasmídeo em três locais nos dias 0, 21, 42 e 175.

Grupo C: Injecção de 100 μρ de plasmídeo num local nos dias 0 e 175.

Grupo D: Injecção de solução salina com tampão fosfato (controlo). 33 A Figura 12 mostra a resposta de anticorpos neutralizantes do indivíduo contra um vírus da raiva selvagem (raposa de França, vírus de FWR) após injecção do plasmídeo homogéneo completo pGPV em cães beagle. Mostra ainda a protecção induzida contra uma exposição intramuscular realizada no dia 175 ao vírus da raiva selvagem isolado de cães raivosos.

Cães n°s 1 a 3 = grupo A Cães n°s 4 a 6 = grupo B Cães n°s 7 a 9 = grupo C Cães noS 10 a 12 = grupo D A Figura 13 mostra células N2A transfectadas com o plasmídeo DBL-3/PVIII (Fugene, Roche Molecular

Biochemicals) e fixadas com acetona (80%) por 10 min. em gelo. A.) Proteína de fusão com GST de rato anti-DBL-3 (diluição de 1/1000) . B.) Coelho anti-PVIII de (diluição de 1/400). Mostram-se as reactividades de fundo vistas com o segundo anticorpo conjugado a FITC. Esta figura mostra claramente que tanto as regiões DBL-3 como PVIII foram eficazmente expressas na membrana das células.

EXEMPLOS

Para os Exemplos, usaram-se os materiais e os métodos seguintes, salvo indicação em contrário.

Ratos. Adquiriram-se ratos BALB/c (H-2d BALB/C) fêmea, de 6 a 8 semanas de idade e suíços (14 a 16 g) no "Centre d'Elevage et de Recherche Janvier" (Le Genest St Isle, França). 34 Células e lissavirus. As células BHK-21 utilizadas para a produção e titulação de lissavirus crescerem em meio essencial minimo (MEM) de Eagle contendo soro de bovino fetal (FBS) a 5% e soro de vitelo recém-nascido a 5% (Perrin, P., 1996, "Techniques for the preparation of rabies conjugates", In Laboratory techniques in rabies, Meslin, F-X., Kaplan, M. e Koprowski, H. Eds., (WHO Geneva)433-445). As células de neuroblastoma (Neuro-2a) usadas em estudos de transfecção com plasmideos cresceram em MEM contendo FBS a 8%.

Cultivou-se a linhagem de células T citotóxicas (CTLL) dependente da interleucina 2 (IL-2) como descrito anteriormente (Perrin, P. et al., 1988, "Interleukin-2 increases protection against experimental rabies", Immunobiol. 177:199-209) em meio RPMI-1640 (Gibco: Flowbio, Courbevoie, França) contendo FBS a 10%, piruvato de sódio lmM, aminoácidos não essenciais 1 mM, 2-mercaptoetanol 5 x 10~5 M, tampão HEPES (Flow Laboratories, Bethesda, EUA) e 5 alO unidades (para 1 x 104 células) de esplenócito de IL-2 de rato (sobrenadante de esplenócitos estimulados com concanavilina A: ConA). Incubaram-se as células a 37°C em atmosfera húmida contendo C02 a 7,5%.

Multiplicaram-se (passaram-se) estirpes da raiva CVS, PV-Paris/BHK-21 fixas, bem como estirpes de virus relacionados com a raiva (EBL1 b, EBL2b, LCMV e Mok) em células BHK-21, como descrito anteriormente por Perrin, P., 1996, supra.

Usou-se o lissavirus de morcego europeu EBLlb (estirpe número 8916FRA) derivado de um morcego isolado em França e EBL2b (estirpe número 9007FIN; uma oferta de H. Bouhry) isolado de um humano na Finlândia (Amengal, B. et al., 1997, "Evolution of European bat lyssaviruses", J. Gen. Virol. 78:2319-2328). A estirpe Arm/53b de LCMV foi 35 gentilmente cedida pelos Drs. M. Oldstone e M. McChesney (Scripps Clinic, La Jolla, CA).

Vacinas e antigénios do virus da raiva. Prepararam-se lissavirus inactivados e purificados (IPRV) como descrito por Perrin, P., 1996, supra. Purificou-se o virus a partir dos sobrenadantes de células infectadas, inactivadas (β-propiolactona) e clarificadas por ultracentrifugação através de um gradiente de sucrose. Solubilizou-se a glicoproteina de PV a partir de IPRV e purificou-se (G PV) como anteriormente descrito por Perrin, P., 1996, supra e Perrin, P., et al., 1985, "Rabies immunosomes (subunit vaccine) structure and immunogenicity", Vaccine, 3:325-332.

Prepararam-se os dois virus da raiva inactivados usados para estudos de protecção comparativos entre duas estirpes diferentes: 1) PM como vacina comercial para uso humano (Pasteur Vaccins Marnes-la-Coquette, França; Lote Y0047); 2) PV como vacina para uso laboratorial.

Construção de plasmídeos que expressam genes de G de lissavirus. Escolheu-se a região (aminoácidos 253-275) que se sobrepõe ao único epítopo não conformacional (VI) (Figura 1) para a construção dos genes quiméricos por ser, presumivelmente, menos constrangida em termos estruturais do que os dois principais sitios antigénicos II e III. Introduziram-se os genes de G de lissavirus quiméricos e homogéneos (ver Figura 1) no vector de expressão eucariótico pCIneo (Promega), propagou-se e amplificou-se na estirpe DH5a de E. coli usando protocolos de clonagem molecular normalizados, bem conhecido do perito. Prepararam-se plasmídeos pGPV-PV e pGMok-PV como descrito anteriormente (Bahloul, C., et al. , 1998, "DNA-based immunization for exploring the enlargement of immunological 36 cross-reactivity against the lyssaviruses", Vaccine 16:417-425). Obtiveram-se os plasmídeos pGPV-Mok, pG-PVIII e pGEBLl-PV como se segue.

Para pGMok-PV, amplificou-se a sequência codificante da parte do sitio II de G PV (aminoácidos 1-257) por RT-PCR usando iniciadores degenerados. PVXbal : (SEQ ID NO.:1) PVBcll : (SEQ ID NO.:2)

Inseriu-se o produto da PCR no sitio Smal de pUC19, depois excisou-se com Bell de EcoRI e ligou-se entre os mesmos sitios em pGMok-Mok originando pGPV-Mok, contendo uma fusão na estrutura de aminoácidos 1-257 de G PV com aminoácidos 258-503 de G Mok.

Obteve-se o gene de pG-PVIII, com uma supressão na estrutura interna entre o fim do péptido sinal de PV e o residuo 253, por introdução de um adaptador sintético entre os sitios de restrição EcoRI e Bell do plasmídeo pGMok-PV. Este adaptador de PV que contém um único sitio EcoRI foi gerado por hibridização de 200 picomoles de cada iniciador em de Tris-HCI 250 mM, pH 7,7. Depositou-se o pG-PVIII em 22 de Dezembro de 1998 na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Paris, França e foi-lhe atribuido o Número de Acesso 1-2115. PVpl: (SEQ ID NO.: 3) PVp2: (SEQ ID NO.:4)

Para gerar o gene de pGEBLl-PV, gerou-se um adaptador sintético que corresponde aos aminoácidos 2-14 de EBL-la (estirpe 8615POL) (1) e aos sitios de restrição BstEII e 37

EcoRI individuais do mesmo modo que para pG-PVIII, por hibridização de: EBLlpl: (SEQ ID NO.:5) EBLlp2: (SEQ ID NO.:6)

Ligou-se este adaptador de EBL1 à estrutura no sitio EcoRI de pG-PVIII. Gerou-se então um fragmento que corresponde aos aminoácidos 15-253 de EBL-la (estirpe 8615POL) por RT-PCR de ARN virai usando iniciadores EBL1 p3 e EBL1 p4: EBL1 p3: (SEQ ID NO.:7) EBLlp4: (SEQ ID NO.:8)

Digeriu-se o produto da RT/PCR com BstEII e EcoRI e ligou-se nos mesmos sítios introduzidos através do adaptador de EBLl, resultando numa fusão na estrutura entre o péptido sinal de PV, parte do sítio II de EBL la e parte do sítio III de PV. Confirmou-se a analogia de cada construção por sequenciação automática com reacção de terminação com corante, num sequenciador ABI 377 (Perkin-Elmer). Depositou-se o pEBLl-PV no CNCM em 22 de Dezembro de 1998 e foi-lhe atribuído o Número de Acesso 1-2114.

Inserção de epitopos de células B e CD8 estranhas em genes de G truncados ou quiméricos. Usaram-se os genes, anteriormente referidos, truncados (pGPVIII) e quiméricos (pGEBLl-PV), contendo um local de clonagem de EcoRI único, para a inserção de epitopos de células B e CD8 estranhas. Introduziram-se os genes de G de lissavírus no vector de expressão eucariótico pClneo (Promega), propagaram-se e amplificaram-se na estirpe DH5a de Eschericia coli (por protocolos de cloDnagem molecular normalizados). 38

Inseriram-se epítopos de células B e CD8 no sítio de restrição de EcoRI dos genes de G de lissavírus quiméricos e truncados na região charneira (aminoácidos 253 to 275) da molécula na posição 253. 0 epítopo da célula B (designado *B+) correspondia ao fragmento C3 (aminoácido 93 a 103: DNPASTTNKDK: SEQ ID NO.:9) da proteína do polivírus VP1. O epítopo da célula CD8 (designado *CTL+) correspondia aos aminoácidos 119-127 (PQASGVYMG: SEQ ID NO.:10) ou aos aminoácidos 117-132 (ERPQASGVYMGNLTAQ: SEQ ID NO.:ll) da nucleoproteína do vírus de coriomeningite linfocitária. Obtiveram-se os plasmídeos p(B-CTL)2-GPVIII, pGEBLl-(B)-PV, pGEBLl-(CTL)-PV, pGEBLl-(B-CTL)-PV, pGEBLl-(B-CTL)2-PV e pGEBLl-(CTL-B)-PV como se segue (ver também Figura 1):

Gerou-se o gene de p(B-CTL)2-GPVIII através de uma clonagem em duas etapas de um adaptador sintético no sítio de restrição EcoRI único por hibridização de 200 picomoles de cada iniciador: *B-CTLpl+: (SEQ ID NO.:12) *B-CTLp2+: (SEQ ID NO.:13).

Para pGEBLl-(B)-PV, pGEBLl-(CTL)-PV, os adaptadores sintéticos usados para a inserção foram, respectivamente: B: *Bp3+: (SEQ ID NO.:14) *Bp4+: (SEQ ID NO.:15) CTL: *CTLp5+: (SEQ ID NO.: 16) *CTLp6+: (SEQ ID NO.:17).

Para a construção dos plasmídeos pGEBLl-(B-CTL)-PV e pGEBLl-(CTL-B)-PV, usaram-se pGEBLl-(B)-PV e pGEBLl-(CTL)-PV sob as mesmas condições acima para inserir as sequências CTL e B, respectivamente, nos genes quiméricos. 39

Confirmou-se a analogia de cada construção por sequenciação automática com reacção de terminação com corante, num sequenciador ABI 377 (Perkin-Elmer).

Ensaios de expressão transitória. Testou-se a capacidade dos plasmideos induzirem expressão transitória de antigénios relacionados com G, depois da transfecção de células Neuro 2a, usando o método mediado por lipossomas catiónicos de DOTAP de acordo com as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim) . Cada cavidade de uma microplaca de cultura celular (Falcon) foi inoculada com 3 x 104 células (em MEM, FBS a 10%) e incubada por 24 h a 37°C em atmosfera húmida contendo CO2 a 7,5%. Depois, lavou-se a placa com MEM sem FBS e incubou-se como acima por lh. Removeu-se o sobrenadante celular, lavaram-se as cavidades e encheram-se com um volume total de 50 μΐ de solução de transfecção que contém 0,1 μρ de plasmídeo e 6 μΐ de DOTAP ( (N-(1-2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N- trimetilamoniometilsulfato) em solução salina com tampão HEPES estéril (NaCl 150 mM, HEPES 20 mM) previamente incubada à temperatura ambiente por 15 min. Incubaram-se as placas por 5 h a 37°C na presença de C02 a 7,5%.

Adicionaram-se 200 μΐ de MEM contendo FBS a 2% a cada cavidade e incubou-se a placa por 24 a 140 h nas mesmas condições, antes da análise da expressão transitória por imunofluorescência indirecta.

Testou-se a capacidade dos plasmideos induzirem expressão transitória de G e antigénios relacionados estranhos, depois da transfecção de células Neuro 2a, usando o reagente de transfecção FuGENE 6 de acordo com as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim). Inoculou-se cada cavidade de uma câmara Labtek de cultura celular, Nunc (Life Technologies) com 3 x 104 células (em MEM, FBS a 10%) 40 e incubou-se por 24 h a 37°C em atmosfera húmida contendo CO2 a 7,5%. Lavaram-se as placas e encheram-se com um 50 μΐ de solução de transfecção: 0,1 μρ de plasmideo, 3 μΐ de reagente de transfecção FuGENE 6 e 47 μΐ de Meio. Incubou-se a placa por 18 h a 37°C na presença de C02 a 7,5%. Adicionaram-se 200 μΐ de MEM contendo FBS a 5% a cada cavidade e incubou-se a placa por mais 24 h nas mesmas condições, antes da análise da expressão transitória por imunofluorescência indirecta.

Anticorpos. Obtiveram-se anticorpos monoclonais (PAb) dirigidos contra PV e Mok G como descrito por Perrin, P., 1996, "Techniques for the preparation of rabies conjugates", In Laboratory techniques in rabies, Meslin, F-X., Kaplan, M., e Koprowski, H. Eds. (WHO Geneva) . : 433-445, por imunização de coelho com glicoproteína de vírus purificado. Obteve-se PAb contra vírus EBL-lb por imunização de rato com vírus inactivado e purificado.

Também se usaram três anticorpos monoclonais (MAb) dirigidos contra G PV. O MAb PVE12 (um MAb desenvolvido por M. Lafon et al. , 1985, "Use of a monoclonal antibody for quantitation of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay", J. Biol. Standard 13:295-301) reconhece o sítio II de G nativa. O MAb Dl (isótopo de IgG 1) , produzido no nosso laboratório, reconhece o sítio III da G nativa, mas não da tratada com SDS. O MAb 6A1 (um MAb descrito em 18 de 2) reconhece a proteína G desnaturada com SDS e, mais precisamente, dois péptidos localizados a jusante do sítio III, perto da parte do terminal COOH do ectodomínio de G (aminoácidos 342-433 e 397-450).

Microscopia de imunofluorescência. Avaliou-se a expressão transitória de antigénios de G em células transfectadas com 41 e sem permeabilização (30 min de incubação com acetona a 80% em gelo, seguida de secagem por ar) . Incubaram-se as células transfectadas por lha 37°C com PAb ou MAb. Lavaram-se com PBS e incubaram-se por lha 37°C com anticorpo secundário conjugado com FITC de cabra anti-coelho ou anti-rato (Nordic lmmunol. Labs, Paises Baixos) . Lavaram-se as células, montaram-se em glicerol e examinaram-se num microscópio de fluorescência invertido Leica.

Usaram-se dois anticorpos monoclonais de rato dirigidos contra G PV (MAb Dl de isótopo IgG 1) e poliovírus (Mab C3) para coloração antigénica por imunofluorescência indirecta (IIF) . O MAb Dl reconhece o sitio III de G nativa, mas não da tratada com SDS e o Mab C3 reconhece a região 93-103 da proteina VP1 da cápside PV-1. Usou-se também, um anticorpo policlonal neutralizante de coelho dirigido contra o polivirus de tipo 1 nativo.

Avaliou-se a expressão transitória após fixação de paraformaldeido a 3% (Sigma) (20 min de incubação à temperatura ambiente), sem permeabilização. Incubaram-se as células fixas por 1 h à temperatura ambiente com MAb. Lavaram-se com solução salina com tampão fosfato (PBS) e incubaram-se por 1 h à temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado com FITC de cabra anti-coelho ou anti-rato (Nordic lmmunol. Labs, Países Baixos). Lavaram-se as células, montaram-se em Mowiol (Sigma) e examinaram-se num microscópio de fluorescência invertido Leica.

Análise da sequência PEST putativa. Analisaram-se as sequências PEST de polipéptido provavelmente envolvidas na degradação rápida de proteína com o programa de computador para pesquisa de PEST desenvolvido de acordo com Rogers, S. 42 et al.,1986, "Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis", Science 234:364-369.

Injecção de plasmideos em ratos. Para estudos imunológicos, anestesiaram-se ratos BALB/c com pentobarbital (30 mg/kg) e injectaram-se 20-50 pg de plasmídeo (diluído em PBS) em cada músculo tibial anterior. Esta via é mais eficaz do gue injecção por via dos quadricípites (observação pessoal). Recolheu-se sangue para o ensaio de anticorpos do soro, em diversos dias, por punção retro-orbital.

Para estudos de protecção contra LCMV, os ratos receberam 3,5 μρ de cardiotoxina (Latoxan A.P., Les Ulis, França) em cada pata, quatro dias antes da anestesia e imunização, para degenerar o músculo.

Ensaio de libertação de interleucina-2. Catorze dias depois da injecção, removeram-se os baços dos ratos BALB/c injectados com plasmídeo ou sem tratamento. Estimularam-se esplenócitos (alíquotas de 1 ml contendo 6xl06) com 0,5 μρ de antigénio de lissavírus (e.g., IPLV-PV e IPLV-EBL1) ou 5 μρ de concanavilina A (Miles) em placas de 24 cavidades (Nuclon-Delta, Nunc) e cultivaram-se de acordo com os procedimentos normalizados em meio RPMI-1640 (Gibco) contendo FBS a 10%, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais 1 mM, 2-mercaptoetanol 5xl0“5 M, tampão HEPES 10 mM (Flow Laboratories). Incubaram-se as células por 24 h a 37°C em atmosfera húmida contendo C02 a 7%. Nestas condições, as células produtoras de IL-2 são sobretudo células CD4+. Titulou-se a IL-2 produzida nos sobrenadantes das culturas de esplenócitos por bioensaio usando células CTLL, como previamente descrito por Perrin, P. et al., 1996, "The antigen-specific cell-mediated immune response 43 in mice is suppressed by infection with pathogenic lyssaviruses", Res. Virol. 147:289-299. Determinou-se a proliferação celular, em triplicado, com base na absorção de 3H-timidina (New England Nuclear). Determinou-se a concentração de IL-2 em unidades por ml (U/ml) usando IL-2 recombinante de rato (Genzyme Corporation, Cambridge, MA, EUA) como referência. As células CTLL cresceram na presença de anticorpos anti-IL-4 e IL-2 de rato, mas não na presença de IL-4 (até 10 U/ml) e na ausência de IL-2. Assim, a IL-2 foi determinada predominantemente por esta técnica.

Ensaios de anticorpo. Para ensaio de anticorpos do soro, recolheu-se sangue em vários dias por punção retro-orbital. Titulou-se IgG da raiva por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) usando microplacas revestidas com glicoproteína da raiva purificada. O titulo correspondeu à diluição reciproca da amostra de soro que dá a densidade óptica equivalente ao dobro da fornecida pelo soro (diluído 1/20) dos ratos injectados com PBS. Testaram-se por ELISA o IgG anti-raiva total ou os isótopos IgGl, IgG2a e IgG3 usando microplacas revestidas com IPRV, como previamente descrito por Perrin, P. et al., 1986, "The influence of the type of immunosorbent on rabies antibody EIA; advantages of purified glycoprotein over whole virus", J. Biol. Standard. 14:95, com soros de isótopo de IgG de coelho anti-rato como anticorpo secundário (Nordic lmmunol. Labs, Países Baixos) e um conjugado com peroxidase de IgG de cabra anti-coelho (Nordic lmmunol. Labs, Países Baixos) como anticorpo terciário.

Titularam-se os anticorpos neutralizantes de lissavírus pelo teste rápido de inibição do foco fluorescente (RFFIT) (descrito por Smith, J. et al., 1996, "A rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) for determining virus- 44 neutralizing antibody", em Laboratory techniques in rabies, 4a edição (Eds Meslin, F-X; Kaplan, M. e Koprowski, H) WHO, Genebra.: 181-189), com as anteriores alterações de Perrin, P. et al., 1986, J. Biol. Standard. 14:95. Usaram-se sobrenadantes de células infectadas (vírus PV, CVS e EBL2) e vírus purificados (vírus Mok e EBL1). Expressaram-se os títulos dos anticorpos anti-PV ou anti-CVS em unidades internacionais por ml (Ul/ml) usando a 2a Norma Internacional (Statens Seruminstitut, Copenhaga, Dinamarca) como referência. Para determinar o título do anticorpo contra outros lissavírus, definiu-se a diluição do soro que provoca 50% de inibição da taxa do foco fluorescente como tendo o mesmo título de VNAb que para a referência determinada contra CVS.

Testaram-se por ELISA os anticorpos para PV-1 como anteriormente descrito, usando microplacas revestidas com um péptido sintético constituído por um trímero de aminoácidos 93-103 de VP1. Também se testou por ELISA a produção IgG anti-LCM.

Teste de protecção. Determinou-se a actividade protectora de vacinas e plasmídeos de acordo com o teste da potência do NIH (Instituto Nacional de Saúde). Injectaram-se intra-peritonealmente (i.p.) diluições de vacina em ratos nos dias 0 e 7, enquanto se injectaram plasmídeos (40 pg) em cada músculo tibial apenas no dia 0. Depois, expuseram-se os ratos intra-cerebralmente (i.c.) no dia 21 a cerca de 30 DL50 de vários lissavírus (CVS, LCMV, EBLlb ou EBL2b). Observaram-se os animais durante 28 dias ou, em alternativa, sacrificaram-se no dia 21 após a exposição e recolheram-se amostras de sangue para controlar a eliminação do vírus e a produção de IgG anti-LCMV. 45

Exemplo 1

Expressão transitória de genes de G de lissavirus

Usaram-se plasmídeos que contêm genes de G de lissavirus homogéneos (pGPV-PV), truncados (pG-PVIII) e quiméricos (pGEBLl-PV, pGMok-PV e pGPV-Mok) para transfectar células Neuro 2a. Apresenta-se na Figura 2 a coloração celular por imunofluorescência indirecta e pode resumir-se como se segue.

Após transfecção com pGPV-PV, detectaram-se antigénios com PAb PV (Figura 2A) , MAb Dl PV (Figura 2B) ou Mab E12 PV (não mostrado), a maioria na membrana celular (resultados semelhantes com células não permeabilizadas; dados não mostrados) e detectaram-se muito poucos com MAb 6A1 (Figura 2C). As células transfectadas com pG-PVIII eram esféricas e estavam completamente coradas (tanto o citoplasma como a membrana) com PAb PV (Figura 2D) ou MAb 6A1 (Figura 2F) , mas não com MAb Dl PV (Figura 2E). As células transfectadas com pGEBLl-PV estavam coradas sobretudo na membrana celular com PAb PV (Figura 2G) , MAb Dl PV (Figura 2H) ou PAb EBL-1 (Figura 21) . As células transfectadas com pGMok-PV estavam coradas (sobretudo na membrana) com PAb PV (Figura 2J), MAb Dl PV (Figura 2K) , PAb Mok (Figura 2L) e muito poucas estavam coradas com MAb 6A1 (não mostrado) . As células transfectadas com pGPV-Mok estavam coradas com PAb PV (Figura 2M) ou PAb Mok e eram esféricas (Figura 2N) . A transfecção celular distingue dois tipos de antigénios de G: 1) os corados principalmente na membrana de células de forma normal, em particular usando neutralização Mab dirigida ao sitio II (E12 PV) e III (Dl); e 2) os corados tanto no citoplasma como na membrana de células esféricas, 46 em particular usando MAb (6A1), que reconhece a molécula G desnaturada.

Estudou-se a cinética da expressão da proteína em transfecção celular com três plasmídeos representativos: pGPV-PV (homogéneo), pGEBLl-PV (quimérico) e pG-PVIII (truncado). 0 pGPV-PV produziu antigénios de G em cerca de 60% de células quando coradas com PAb PV, enquanto que muito poucas células foram coradas com MAb 6A1 PV em qualquer momento (Figura 3a) . Cerca de 55% das células transfectadas com pGEBLl-PV foram coradas com PAb PV e até 15% com MAb 6A1 (Figura 3b), indicando que algumas moléculas de G estavam desnaturadas. Dez a trinta por cento das células transfectadas com pG-PVIII eram esféricas e coradas com PAb PV, enquanto que 5 a 10% eram positivas com MAb 6A1, indicando as moléculas de G estavam desnaturadas (Figura 3c).

Exemplo 2

Indução de células produtoras de IL-2

Avaliou-se a capacidades dos plasmídeos pGPV-PV, pG-PVIII, pGEBLl-PV, pGMok-PV e pGPV-Mok induzirem as células produtoras de IL-2 e mostram-se os resultados na Figura 4. Os plasmídeos com a parte do sítio III de PV, quando não fundidos (pG-PVIII), ou com qualquer parte do sítio III de lissavírus (pGPV-PV, pGEBLl-PV e pGMok-PV) induzem eficientemente as células produtoras de IL-2 (240 a 550 mU/ml). Isto verifica-se mesmo para pG-PVIII, que, no entanto, tem apenas uma baixa eficiência quer na transfecção celular (ver acima) como na indução de anticorpos (ver abaixo). Para os plasmídeos quiméricos EBL1-PV e Mok-PV, a resposta das células T foi maior depois 47 de estimulação com PV inactivado e purificado do que com virus EBL-1 b ou Mok. Tal não se deveu à qualidade dos antiqénios purificados porque a imunização de ratos BALB/c com virus PV, EBL-1 b ou Mok, inactivados ou purificados, seguida de estimulação in vitro com o mesmo antigénio induziu niveis semelhantes de produção de IL-2 (PV: 250 mU/ml, EBL-lb: 350 mU/ml e Mok: 400 mU/ml). Em contraste, o plasmideo pGPV-Mok induziu apenas uma resposta das células Th fraca (titulo de IL-2: 50 mU/ml) , que é produzida de forma semelhante in vitro após estimulação com virus PV ou Mok, tanto inactivado como purificado.

Exemplo 3

Ensaios serológicos O plasmideo pG-PVIII truncado não induz a produção de anticorpos da raiva, quando avaliada por RFFIT e ELISA. Todavia, quando se injectou IL-2 juntamente com pG-PVIII, e só passados 7 dias, detectaram-se anticorpos por ELISA apenas no dia 21 (não mostrado) . Assim, a parte do sitio III foi expressada in vivo e induziu uma produção fraca de anticorpos não neutralizantes, que foi reforçada por IL-2 exógeno.

Pelo contrário, quando se ligou a parte do sitio III de PV à parte do sitio II homóloga, como em pGPV-PV, revelou forte imunogenicidade. Uma única injecção de plasmideo pGPV-PV em ratos resultou em niveis elevados de VNAb, medidos 27 dias depois, contra quer os virus PV e CVS homólogos quer os virus EBL-2b heterólogos (Figura 5a) . O isótopo de anticorpo induzido foi sobretudo IgG 2a, mas também se observou uma resposta IgG 1 fraca (não mostrada). No entanto, a correlação entre os titulos de VNAb contra PV 48 foi maior com IgG 2a (r=0,974) do que com o titulo de IgG 1 (r=0,71), o que indica que o VNAb induzido por imunização à base de ADN era sobretudo IgG 2a. 0 titulo de VNAb contra os vírus PV e CVS homólogos aumentou quando os ratos receberam uma injecção de reforço no dia 30 e se analisaram os seus soros no dia 40, mas não os títulos de VNAb contra os vírus EBL-2b heterólogos que permaneceram inalterados (Figura 5a) . Nestas condições, demonstrámos igualmente uma relação entre o nível de VNAb induzido por pGPV-PV e a protecção dos ratos contra uma exposição i.c. com CVS: todos os animais com um título de VNAb (no dia 20) acima de 1,5 Ul/ml sobreviveram à exposição no dia 21 (não mostrado). Pelo contrário, não se produziu uma quantidade significativa de VNAb contra EBL-lb depois de uma única injecção ou depois de um reforço.

Assim, investigámos a capacidade da parte do sítio III de PV transportar a parte do sítio II do EBLl heterólogo, na sequência das nossas observações anteriores de que o plasmídeo quimérico pGMok-PV induzia VNAb contra tanto o vírus PV como Mok. Uma única injecção do plasmídeo quimérico pGEBLl-PV induziu, de forma semelhante, o VNAb contra tanto o vírus PV como EBL-1 b (Figura 5b) . Catorze dias depois da injecção, os títulos eram 2 Ul/ml e aumentaram para 17 Ul/ml passados 80 dias. O nível de produção de VNAb contra EBL-1 b foi sempre superior do que o contra PV, mas a diferença não era significativa.

Considerados em conjunto, estes resultados demonstram claramente que os genes de G quiméricos que codificam a parte do sítio III de PV e a parte do sítio II de G de outros lissavírus, tais como EBL-1 b ou Mok, são indutores muito potentes de VNAb contra os dois vírus parentais. Pelo 49 contrário, a construção de pGPV-Mok simétrica não induz VNAb nem contra virus PV nem Mok (não mostrado).

Exemplo 4

Ensaios de protecção contra lissavirus europeu

Testámos a capacidade de quer o plasmideo pGPV-PV homólogo, como o plasmideo pGEBLl-PV quimérico, induzirem protecção contra uma exposição i.c. a virus que representam genótipos de lissavirus envolvidos na transmissão de encefalomielite na Europa (CVS para GT1, EBL1 b para GT5 e EBL2b para GT6). Comparámos a sua eficiência com a de uma vacina comercialmente disponível (estirpe de PM: GT1) e de uma preparação laboratorial (estirpe de PV: GT1) (Figura 6).

A cadeia plasmídica (pClneo) não induz protecção contra qualquer vírus (Figura 6d, e e f). Pelo contrário, o pGPV-PV protegeu 70% dos ratos BALB/c (e 85% dos suíços) contra CVS (Figura 6d), 30% contra EBL1 b (Figura 6e) e 72% contra EBL2b (Figura 6f). Nas mesmas condições, o pGEBLl-PV protegeu 60% de ratos BALB/c contra CVS (Figura 6d) , 75% contra EBL1 b (Figura 6e) e 80% contra EBL2b (Figura 6f) . Assim, se a imunização com qualquer dos dois plasmídeos não revelou uma diferença significativa na protecção contra CVS (GT1) e EBL2b (GT6) , o pGEBLl-PV quimérico foi de longe mais eficiente contra EBL1 b (GT5) e é claramente o melhor candidato para a protecção com imunização à base de ADN contra os três genótipos de lissavirus europeu.

No que respeita à protecção induzida por vacinas de culturas celulares inactivadas usando as estirpes de PM e PV contra as mesmas exposições: uma dose humana de vacina de PM diluída 1/10° protegeu 80% dos ratos contra CVS 50 (Figura 6a) , 36% contra EBLlb (Figura 6b) e 80% contra EBL2b (Figura 6c). Nestas mesmas condições, 2 μg de PV IPRV protegeu 100% de ratos contra CVS (Figura 6a) e EBL1 b (Figura 6b) e 85% contra EBL2b (Figura 6c). Parece que para uma dose de vacina que protegeu 80 a 85% dos animais contra EBL2b, a estirpe de PV protegeu 100% e a estirpe de PM apenas 36% contra EBLlb. Portanto, a estirpe de PM é menos eficaz do que a estirpe de PV contra EBL1 b.

Exemplo 5

Expressão transitória de genes de G de lissavirus

Testaram-se os plasmideos contendo o antigénio estranho que codificam sequências associadas aos genes G de lissavirus truncado (pG-PVIII) ou quimérico (pGEBLl-PV) em relação à sua capacidade de transfectarem de forma transitória as células Neuro 2a. Com excepção do pG(B-CTL)2-PVIII, que só induziu uma coloração por IFF (no citoplasma) após permeabilização, todos os plasmideos induziram a expressão de antigénios relacionados com polio- e lissavirus na membrana celular de células não permeabilizadas, como referido anteriormente para os mesmos plasmideos sem epitopos estranhos. A titulo ilustrativo, apresentam-se os resultados da transfecção obtidos com pGEBLl-(B-CTL)2-PV na Figura 7. Evidenciaram-se a parte G do virus da raiva reconhecida por MAb Dl PV (Figura 7A) e a inserção de polivirus reconhecida pelo Mab C3 (Figura 7B) ou o anti-polivírus PAb de tipo 1 (Figura 7C) , enquanto não se observou coloração com os mesmos MAb e PAb em células transfectadas com PClneo (Figura 7D) . Isto indica claramente que, com excepção do pG(B-CTL)2-PVIII, a glicoproteina de pGEBLl-PV quimérica 51 permite a expressão do epítopo de célula B de polivirus, sozinho ou associado ao epítopo da célula CTL de LCMV, na superfície da membrana celular numa forma nativa enquanto se manteve a expressão da G de lissavírus.

Exemplo 6

Imunogenlcldade de epitopos estranhos transportados pela glicoproteina truncada

Usou-se o gene de pGPVIII truncado para transportar e expressar os epitopos da célula B de C3 VP1 e CD8+ CTL de LCMV em ratos depois de imunização à base de ADN.

Embora o gene de pGPVIII induzisse as células produtoras de IL-2 que podem ser estimuladas in vitro por IPRV 21 dias depois da injecção, não se observou produção passados 14 dias (Figura 8A) . No entanto, observou-se uma produção considerável com pG (B-CTL)2-GPVIII passados 14 dias (Figura 8A) . Isto indica que a fusão de epitopos estranhos com GPVIII reforça consideravelmente a produção de células Th dirigidas à parte do sítio III da G da raiva.

Apesar do pGPVIII não induzir anticorpos anti-raiva na ausência de IL-2 exógena (Figura 9) , o estudo cinético do anticorpo induzido por pG(B-CTL)2-GPVIII mostrou que ocorria considerável produção de anticorpos tanto contra o péptido do polivirus como a G da raiva (Figura 9) . Isto também indica que a fusão de epitopos estranhos com GPVIII reforça consideravelmente a produção de anticorpos dirigidos à parte do sítio III da G de PV. Além disso, o GPVIII truncado era capaz de transportar e possibilitar a expressão de epítopo de célula B de polivirus in vivo com produção de anticorpos. 52

Foi igualmente testada a produção de anticorpos induzida por P(B-CTL)2-GPVIII contra um péptido de poliovirus depois de iniciação tanto com o pGPVIII como com o próprio p (B-CTL)2-GPVIII (Figura 10) . Quando se injectou o p (B-CTL)2-GPVIII sem iniciação e se fez o controlo 13 dias (PBS / p (B-CTL)2-GPVIII -D26-) ou 39 dias depois (p(B-CTL)2-GPVIII -D0-) , o título de anticorpo de anti-péptido era 65 e 80, respectivamente. No entanto, ao realizar uma iniciação com pGPVIII ou p(B-CTL)2-GPVIII, o titulo era 200 e 600, respectivamente. Isto demonstra claramente que os dois tipos de iniciação aumentam a produção de anticorpos contra um polipéptido de poliovirus.

Exemplo 7

Imunogenicidade de epitopos estranhos transportados pela glicoproteína quimérica

Analisou-se a imunogenicidade dos epitopos das células B e CD8 T e a consequência da sua inserção na imunogenicidade da glicoproteína quimérica de acordo com respostas imunitárias mediadas humoral e celularmente, após imunização à base de ADN. Quando se inserem epitopos no plasmídeo pGEBLl-PV quimérico, a indução de células produtoras de IL-2 capazes de serem estimuladas por IPLV depende dos epitopos inseridos. Obtiveram-se dois tipos de resultados que se mostram na Figura 8B: i) a produção de IL-2 induzida por pGEBLl-(B-CTL)2-PV, pGEBLl-(CTL-B)-PV e pGEBLl-(CTL)-PV foi semelhante à induzida por pGEBLl-PV, e ii) a produção de IL-2 induzida por pGEBLl-(B-CTL)-PV (dados não mostrados) e pGEBLl-(B)-PV foi inibida. Consequentemente, parece que a G de EBL1-PV quimérica pode transportar epitopos de células B e CD8 T estranhos sem 53 efeitos negativos na sua capacidade para induzir células produtoras de IL-2. Todavia, no que respeita ao epitopo de células B, observou-se o efeito de posição uma vez que a sua inserção imediatamente atrás da sequência EBL1 foi prejudicial para a indução de células auxiliares T estimuladas pela G de lissavirus. No entanto, com pGEBLl-(B-CTL)2-PV este fenómeno não foi relevante.

Estudou-se também a inserção de epítopos estranhos em pGEBLl-PV relativamente à sua consequência sobre a indução de anticorpos contra péptido de polivirus e de VNAb contra os dois lissavirus PV e EBL1 (Tabela 1). Os quarto plasmideos que contêm epitopo da célula B (pGEBLl-(B)-PV, pGEBLl-(CTL-B)-PV, pGEBLl-(B-CTL)2-PV e pGEBLl-(B-CTL)-PV) induziram anticorpos contra péptido de polivirus. No entanto, quando o epitopo da célula B se seguiu à sequência EBL1 (pGEBLl-(B-CTL)-PV e pGEBLl-(B)-PV), a produção de anticorpos foi mais fraca do que quando o epitopo de B estava separado pelo epitopo da célula CD8 (pGEBLl-(CTL-B)-PV) . Os resultados para pGEBLl-(B-CTL)2-PV foram intermédios. A inserção de epitopos estranhos induziu uma diminuição de produção de VNAb anti-lissavirus, mas manteve-se num nível elevado quando os animais foram injectados com pGEBLl-(CTL)-PV ou pGEBLl-(CTL-B)-PV. No entanto, quando o epitopo da célula B foi inserido imediatamente atrás da sequência EBL1, não se observou uma produção tão grande de VNAb anti-lissavírus.

Em resumo, a G de EBL1-PV quimérica pode transportar e possibilitar a expressão in vivo de epítopos de célula B neutralizantes tanto de poliovírus como de lissavirus, mas a presença de epitopo de célula B imediatamente atrás da sequência EBL1 (excepto para a inserção (B-CTL)2) é prejudicial tanto para a parte de sítio II como para a 54 parte de sítio III da glicoproteína quimérica. Por outro lado, quando os epítopos estranhos foram fundidos com a G de PVIII truncada, tanto a produção de anticorpo não neutralizante como de auxiliar T pode ser induzida.

Exemplo 8

Protecção contra uma dose letal de LCMV

Como o epítopo de célula CD8 T está envolvido na indução de protecção contra LCMV, testaram-se a G truncada e quimérica que transporta o epítopo da célula CD8+ T de LCMV em relação à sua actividade protectora (Tabela 2) . 0 p (B-CTL)2-GPVIII truncado induziu apenas uma protecção parcial. Quando os epítopos das células B e CD8 T foram inseridos na GEBL1-PV quimérica, observou-se uma protecção considerável com pGEBLl-(CTL-B)-PV contra uma exposição letal a LCMV (sobreviveram 70% dos ratos). Nestas condições, os animais sobreviventes eliminaram completamente o vírus, quando controlados por RT-PCR, 21 dias após a infecção (dados não mostrados) . Isto indica que a G quimérica é muito potente para transportar um epítopo de célula CD8 protector. Todavia, tal como para as respostas imunitárias anti-lissavírus e poliovírus, a inserção do epítopo de célula B de poliovírus imediatamente atrás da sequência EBLl induziu uma inibição da actividade protectora do epítopo de célula CD8 seguinte.

Exemplo 9

Sequência PEST putativa

Uma vez que se observou claramente um efeito de posição prejudicial da inserção do epítopo de célula B antes ou 55 depois do epítopo de célula CTL, analisou-se a presença de sequências PEST putativas nos diferentes plasmideos (Figura ld). Só dois plasmideos (pGEBLl-(B)-PV e pGEBLl-(B-CTL)2-PV) continham sequências PEST putativas devido à junção da extremidade das sequências EBL1 e do epitopo de célula B. No entanto, a substituição da serina (S) em pGEBLl- (B-CTL)2-PV por uma leucina (L) em pGEBLl-(B)-PV reduziu o valor PEST de +8,38 para +4,20.

Exemplo 10

Imunização e exposição de cães

Distribuíram-se cães beagle, de idades compreendidas entre os 4 e os 8 anos, por quarto grupos experimentais (Tabela 3). Mantiveram-se em jaulas isoladas e alimentaram-se com comida comercial (400 g por dia). Injectaram-se intramuscularmente na coxa tanto com 100 μρ de plasmídeo (grupo A, B e C) como com PBS (grupo D) . Injectou-se plasmídeo num sítio nos dias 0, 21, 42 e 175 (grupo A) ou nos dias 0 e 175 (grupo C) . Injectou-se também em três sítios (3 x 33 μρ) nos dias 0, 21, 42 e 175 (grupo B) . Recolheram-se amostras de sangue (por punção venosa) nos dias 0, 28, 49, 70, 120, 175 e 189.

Titularam-se os anticorpos neutralizantes de lissavírus pelo teste rápido de inibição de foco fluorescente (RFFIT), com as modificações celulares anteriormente descritas (28 dos cães) , usando vírus PV, CVS ou FWR. Expressaram-se os títulos de anticorpos neutralizantes anti-PV, CVS ou FWR em unidades internacionais por ml (Ul/ml) usando a 2a Norma Internacional (Statens Seruminstitut, Copenhaga, Dinamarca) como referência ou como a diluição de soro recíproca que inibe em 50% o foco fluorescente. Nestas condições, um 56 título de 40, 70 ou 60 (diluição de soro recíproca) era equivalente a 0,5 Ul/ml contra PV, CVS ou FWR, respectivamente.

Como se mostra na Figura 11, um anticorpo neutralizante de virus (VNAb) pode ser induzido pelo plasmídeo que contém o gene codificante da proteína G (grupos A, B e D) , enquanto que não se detectaram anticorpos nos animais injectados com PBS (grupo D) para qualquer protocolo de injecção. Obtiveram-se níveis mais elevados de VNAb depois de uma injecção e um reforço no dia 21 (grupo A) ou no dia 175 (grupo C). Como ocorre a seroconversão para 0,5 Ul/ml, pode concluir-se que todos os animais se seroconverteram. Além disso, de acordo com a bibliografia, pode também concluir-se que todos os cães injectados com plasmídeo estão protegidos contra a exposição ao vírus da raiva.

Estes resultados são representativos e a dosagem pode ser extrapolada para outros animais sensíveis à raiva, incluindo humanos.

Exemplo 11 pG-PVIII como um transportador de proteína estranha: mediação pelo domínio de P. falciparum da adesão a sulfato de condroitina A: um receptor para infecção placentária humana

Durante a primeira gravidez, a malária provoca uma elevada taxa de mortalidade fetal e neonatal. 0 decréscimo de susceptibilidade durante as gravidezes subsequentes correlaciona-se com a aquisição de anticorpos que bloqueiam as ligações de glóbulos vermelhos infectados ao sulfato de condroitina A (CSA), um receptor de parasitas na placenta. 57

Recentemente, os inventores identificaram um domínio dentro de uma proteína-1 da membrana eritrocitária de Plasmodium falciparum específica (PfEMP-1) que liga o CSA (Buffet et al. P. falciparum domain mediating adhesion to chondroitin sulfate A: A receptor for human placental infection (1999) P.N.A.S. 96: 12743-12748). Os inventores clonaram um gene var expresso em glóbulos vermelhos parasitados de ligação a CSA (PRBCs). 0 gene tem oito domínios de tipo receptor e os inventores demonstraram que o domínio de tipo ligação de Duffy (DBL), designado DBL-3, liga CSA e apresenta a mesma especificidade de ligação dos PRBCs.

Como os anticorpos presentes depois da mulher engravidar bloqueiam a ligação ao CSA de parasitas de várias regiões do mundo, o DBL-3, embora variável, pode induzir imunidade por reacção cruzada que irá proteger a grávida e o seu feto. Portanto, o domínio DBL-3 torna-se um candidato a vacina para mulheres grávidas em África. 0 domínio DBL-3 contém diversas cisteínas aparentemente cruciais para o enrolamento correcto da região de ligação ao CSA. Muito provavelmente, não se consegue obter o enrolamento em sistemas de expressão bacterianos (dados não publicados). Uma abordagem importante para induzir anticorpos capazes de interferir com a ligação CSA de eritrócitos infectados é aplicar uma estratégia de vacina de ADN usando o domínio DBL-3 fundido com a parte PVIII da raiva. Verificou-se que a parte PVIII da glicoproteína da raiva promove função auxiliar eficiente. A invenção foi descrita acima em pormenor com referência às formas de realização preferidas. Todavia, será do conhecimento do técnico que se podem fazer diversas 58 modificações e variações na prática da presente invenção sem se afastar do seu âmbito.

TABELA 1. Produção de anticorpos induzida pelo plasmídeo pGEBLl-PV quimérico que transporta várias combinações de epitopos estranhos de células B e CD8+ T

Plasmideo inj ectado Anticorpos neutralizantes (Ul/ml) contra: Anticorpos anti-péptido de polivirus Virus da raiva Lissavirus 1 de morcego europeu (Diluição reciproca) pGEBLl-(B-CTL)2-PV 0,9 (0,05) 1,1 (0,07) 1100 (200) pGEBLl-(CTL-B)-PV 1,8 (0.2) 8,0 (1,0) 1510 (490) pGEBLl-(B-CTL)-PV 0,06 (0,06) 0,6 (0,07) 810 (210) pGEBLl-(CTL)-PV 2,6 (0,2) 5,2 (0,2) 0 (0) pGEBLl-(B)-PV 0,1 (0,01) 0,21 (0,09) 355 (45) pGEBLl-PV 5,9 (2.1) 21,9 (1,8) 0 (0) pCIneo 0 (0) 0 (0) 0 (0) A TABELA 1 mostra a produção de anticorpos induzida pelo plasmideo pGEBLl-PV quimérico que transporta vários epitopos estranhos. Injectaram-se ratos BALB/c (três para 59 cada plasmídeo) com 50 μρ de vários plasmídeos em cada músculo tibial. Analisaram-se os soros no dia 21 em relação à raiva ou aos anticorpos neutralizantes do virus EBL1 pelo método RFFIT (expressaram-se os titulos em Ul/ml) e em relação a anticorpos anti-péptido de polivirus por ELISA. Expressaram-se os resultados como o titulo médio e apresenta-se o desvio padrão entre parêntesis.

TABELA 2. Protecção induzida pelo plasmideo pGPVIII truncado e o pGEBLl-PV quimérico que codificam o epítopo CD8+ de LCMV

Plasmídeo injectado Animais sobreviventes (%) pCIneo 0/10 (0) p(B-CTL)2-GPVIII 2/5 (40) pGEBLl-(B-CTL)-PV 0/10 (0) pGEBLl- (CTL-B)-PV 7/10 (70) A TABELA 2 mostra a protecção induzida pelo plasmideo pGPVIII truncado e o pGEBLl-PV quimérico que codificam o epitopo CD8+ de LCMV. Injectaram-se ratos BALB/c (três para cada plasmideo) com 40 μρ de vários plasmídeos e expuseram i.c. no dia 21. Apresenta-se a percentagem de animais sobreviventes entre parêntesis. TABELA 3: Características dos cães e protocolo de injecção 60

Grupo Número do cão Sexo* Idade Inj ecção (anos) Produto inj ectado Número do sítio Dia A 1 M 8 Plasmídeo 1 0, 21, 42 e 175 2 F 6 Plasmídeo 1 0, 21, 42 e 175 3 F 6 Plasmídeo 1 0, 21, 42 e 175 B 4 F 6 Plasmídeo 3 0, 21, 42 e 175 5 M 6 Plasmídeo 3 0, 21, 42 e 175 6 F 8 Plasmídeo 3 0, 21, 42 e 175 C 7 M 4 Plasmídeo 1 0 e 175 8 F 7 Plasmídeo 1 0 e 175 9 F 4 Plasmídeo 1 0 e 175 D 10** M 4 PBS 1 0, 21, 42 e 175 11 M 4 PBS 1 0, 21, 61 42 e 175 12 M 4 PBS 1 0, 21, 42 e 175 * M: macho; F: fêmea ** Rejeitado no dia 160 (doente) LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Instituto Pasteur <120> Ácidos nucleicos e polipéptidos de lissavirus quiméricos <130> Dl8780 <150> US60/129501 <151> 1999-04-15 <150> PCT/IB00/00564 <151> 2000-04-17 <150> EP 00917245.3 <151> 2000-04-17 <160> 17 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Virus da raiva 62 <400> 1 ttctagagcc accatggttc ctcaggctct cctg 34

<210> 2 <211> 23 <212> ADN <213> Vírus da raiva <400> 2 attgatcaac tgaccgggag ggc 23

<210> 3 <211> 98 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciadores de adaptador sintético <400> 3 aattctagag ccgccaecat ggttcetcag gctGtcctgt ttgtacccct tctggttfctt 60 ccattgtgtt ttgggaagaa ttcccccccc ggtcagtt $8

<210> 4 <211> 98 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciadores de adaptador sintético 63 <400> 4 gatcaactga ccgggggggg aattefctcce aaaacacaat ggaaaaacea gaaggggtac 60 aãacaggaga gcetgaggaa ceatggtggc ggctctag 98

<210> 5 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: iniciadores de adaptador sintético <400> 5 aatttcccaa tctacaccat cccggataaa atcggaccgt ggtcacctat tccg 54

<210> 6 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciadores de adaptador sintético <400> 6 aattcggaat aggtgaccac ggtccgattt tatccgggat ggtgtagatt ggga 54 <210> 7 <211> 63 64

<212> ADN <213> Vírus da raiva <400> 7 cogfcggtcac efcattgatat aaaccatctc agctgcccaa acaacttgat cgtggaagat 60 gag <210> 8 <211> 27 <212> ADN <213> Vírus da raiva <4 0 0> 8 ggaattcgag caccattctg gagcttc 27

<210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> proteína de poliovírus VP1 <400> 9 Ãsp Aen Pro Ala Ser Thr Thr Asa Lys Asp Lys I 5 10

<210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> nucleoproteína do vírus da coriomeningite linfocítica <4 0 0> 10

Pro Gin Ala Ser 1

Gly Vai Tyr Met 65 <210> 11

<211> 16 <212> PRT <213> nucleoproteína do vírus da coriomeningite linfocítica <4 0 0> 11

Gin Arg Pro Gin Ala Ser Gly Vai Tyr Met Gly Asa Leu Thr Ala Glrj 1 5 10 15

<210> 12 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciadores de adaptador sintético <4 0 0> 12 aattcagata acccggcgtc gaccactaac aaggataagc tgttcgcagt gcctcaggcc 60 tctggtgtgt atatgggt 78

<210> 13 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de uma sequência artificial: iniciadores de adaptador sintético 66 <4 Ο 0> 13 aattacccat atacacacca gaggcctgag gcaetgcgaa cagcttatcc ttgttagtgg 60 tcgacgecgg gttatctg ?ê <210> 14 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciadores de adaptador sintético <4 0 0> 14 aatttggata acccggcgtc gaccactaac aa 32 <210> 15 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciadores de adaptador sintético <4 0 0> 15 aattcttatc cttgttagtg gtcgacgccg gg 32 <210> 16 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência artificial 67 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciadores de adaptador sintético <4 0 0> 16 aatttggaga gacctcaggc ctctggtgtg tatatgggta atcttacggc ccag 54

<210> 17 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciadores de adaptador sintético <4 0 0> 17 aattctggga agtaagatta cccatataca caccagaggc ctgaggtctc tcca 54 30-05-2013 68

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição imunogénica caracterizada por compreender um polipéptido quimérico codificado por uma molécula transportadora contendo uma sequência polinucleotídica, em que a referida sequência polinucleotidica compreende: - uma sequência que codifica uma parte de uma glicoproteína de lissavirus, contendo pelo menos um sitio III da glicoproteína, e uma sequência que codifica pelo menos uma sequência antigénica diferente do sitio III ou do sitio II da glicoproteina de lissavirus, seleccionada no grupo que consiste em sequências de proteínas antigénicas, ou suas partes antigénicas, de um outro vírus da raiva ou de vírus relacionado com a raiva.
2. 2. A composição imunogénica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida sequência polinucleotídica contida na molécula transportadora compreender uma sequência que codifica pelo menos a metade C-terminal de uma glicoproteína de lissavirus que consiste nos aminoácidos 253 a 505 de glicoproteína de lissavirus.
3. 3. A composição imunogénica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida sequência polinucleotídica contida na molécula transportadora compreender ainda uma sequência que codifica um domínio transmembranar de uma proteína transmembranar.
4. 4. A composição imunogénica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o referido domínio transmembranar ser de uma glicoproteína de lissavirus. 1
5. 5. A composição imunogénica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o referido domínio transmembranar ser de uma proteína diferente de uma glicoproteína de lissavírus.
6. 6. A composição imunogénica, de acordo com as reivindicações 3 a 5, caracterizada por a referida sequência polinucleotídica contida na molécula transportadora compreender ainda uma sequência que codifica um domínio citoplásmico da glicoproteína do referido lissavírus.
7. 7. A composição imunogénica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por a referida sequência polinucleotídica contida na molécula transportadora compreender ainda uma sequência que codifica um domínio citoplásmico da glicoproteína de um lissavírus, sendo o domínio transmembranar e o domínio citoplásmico do mesmo lissavírus.
8. 8. A composição imunogénica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por a referida sequência polinucleotídica contida na molécula transportadora compreender: a) uma sequência que codifica uma sequência de sítio II de uma glicoproteína de lissavírus; b) uma sequência que codifica uma sequência de sítio III de uma glicoproteína de lissavírus; c) um domínio transmembranar de uma proteína transmembranar; d) um domínio citoplásmico de uma proteína transmembranar; e e) uma sequência que codifica pelo menos uma sequência antigénica diferente do sítio III ou do sítio II da glicoproteína de lissavírus seleccionada no grupo que consiste em sequências de proteínas antigénicas, ou suas partes antigénicas, de um outro vírus da raiva ou de vírus relacionado com a raiva. 2
9. 9. A composição imunogénica, de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizada por compreender um componente seleccionado no grupo consistindo em adjuvantes, excipientes, estabilizadores, vectores supramoleculares e antigénios.
10. 10. A composição imunogénica, de acordo com as reivindicações 1 a 9, caracterizada por ser uma vacina.
11. 11. A composição imunogénica, de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizada por induzir imunidade humoral e celular.
12. 12. Um método para a preparação in vitro ou in vivo de um polipéptido quimérico compreendido na composição imunogénica, de acordo com as reivindicações 1 a 11, caracterizado por compreender as etapas de: a) produzir por um método in vitro ou in vivo o referido polipéptido quimérico a partir de uma molécula transportadora, como numa qualquer das reivindicações 1 a 8, codificando o referido polipéptido quimérico; e b) purificar o polipéptido obtido na etapa a).
13. 13. O método para a preparação in vivo de um polipéptido quimérico, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por na etapa a) o referido polipéptido quimérico ser produzido por expressão da molécula transportadora em culturas bacterianas ou tissulares e, na etapa b), o polipéptido quimérico obtido ser isolado dessas culturas.
14. 14. O método para a preparação in vitro ou in vivo de um polipéptido quimérico, de acordo com as reivindicações 12 ou 13, caracterizado por compreender ainda uma etapa c) de 3 combinar o polipéptido quimérico com componentes seleccionados do grupo consistindo em compostos ou aditivos capazes de reforçar a imunogenicidade, a estabilidade e a biodisponibilidade da composição imunogénica. 30-05-2013 4