BRPI0009746B1 - molécula de veículo contendo plasmídeo pg-pviii compreendendo uma seqúência que codifica uma parte de uma glicoproteína de lissavírus contendo pelo menos o sítio iii da glicoproteína de lissavírus mas não contendo o sítio ii, e, composição imunogênica - Google Patents

Abstract

"molécula de veículo, composição imunogênica, polipeptídeo, método para tratar um indivíduo, e, plasmídeos pebl1-pv e pviii". a presente invenção provê ácidos nucleicos quiméricos, preferivelmente contidos em um vetor de expressão, que codificam polipeptídeos imunogênicos quiméricos. os ácidos nucleicos codificam pelo menos um sítio iii de uma proteína de lissavírus, que foi constatada como aperfeiçoando a imunogenicidade de epítopos de lissavírus para a proteção contra a raiva. as proteínas e ácidos nucleicos quiméricos podem também conter determinantes antigênicos para outros epítopos que aqueles de lissavírus. deste modo, a invenção provê polipeptídeos e ácidos nucleicos quiméricos, que eliciam uma forte resposta imune para antígenos múltiplos. o uso dos métodos da presente invenção permite a vacinação de dna sem a necessidade de suprir antígenos múltiplos em moléculas de dna separadas.

Description

"MOLÉCULA DE VEÍCULO CONTENDO PLASMÍDEO PG-PVIII COMPREENDENDO UMA SEQÜÊNCIA QUE CODIFICA UMA PARTE DE UMA GLICOPROTEÍNA DE LISSAVÍRUS CONTENDO PELO MENOS O SÍTIO III DA GLICOPROTEÍNA DE LISSA VÍRUS MAS NÃO CONTENDO O SÍTIO II, E, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA". A presente invenção refere-se a ácidos nucleicos de lissavírus quimérico, e a proteínas e polipeptídeos quiméricos codificados por estes ácidos nucleicos. Mais particularmente, a invenção refere-se a ácidos nucleicos e proteínas de lissavírus quimérico, que podem ser usados em composições imunogênicas, tais que vacinas. Deste modo, a invenção refere-se também a moléculas de veículo para expressar ácidos nucleicos de lissavírus quimérico, métodos de produção de proteínas e polipeptídeos de lissavírus quimérico, e métodos de tratamento de indivíduos para melhorar, curar, ou proteger contra a infecção por lissavírus. A raiva é uma doença encefalopática causada por membros do gênero Lissavírus dentro da família Rhabdoviridiae. A raiva infecta todos os animais de sangue quente e é quase invariavelmente fatal em humanos, se não tratada. Com base nas comparações de seqüência de nucleotídeo e análises filogenéticas, o gênero Lissavírus foi dividido em 7 genótipos (GT). O GT 1 inclui vírus de raiva clássicos e cepas de vacina, enquanto que os GT2 a GT7 correspondem a vírus relacionados à raiva, incluindo o vírus de morcego Lagos (GT2); o vírus Mokola (GT3); o vírus Duvenhage (GT4); o lissavírus de morcego Europeu 1 (EBL-1; GT5); o lissavírus de morcego Europeu 2 (EBL-2: GT6) e o lissavírus de morcego Australiano (GT7).

Com base na antigenicidade, o gênero Lissavírus foi primeiramente dividido em quatro serótipos. Mais recentemente, este gênero foi dividido em dois grupos principais de acordo com a reatividade cruzada do anticorpo de neutralização do vírus (VNAb) O Grupo 1 consiste de GT1, GT4, GT5, GT6, e GT7, enquanto que o Grupo 2 consiste de GT2 e GT3. Os vírus do Grupo 2 não são patogênicos quanto injetados perifericamente em camundongos. A virulência de lissavírus é dependente, pelo menos em parte, da glicoproteína presente na capa viral. De forma interessante, as glicoproteínas de vírus do grupo 2 apresentam um alto grau de identidade, na região contendo aminoácidos, que desempenham uma função chave na patogenicidade, para a seqüência correspondente de vírus GT1 aviralentos (vide, por exemplo, Coulon et al, 1998, “An avirulent mutant of rabies vims is unable to infect motoneurons in vivo and in vitro”, J. Virol. 72:273-278). A glicoproteína (G) de vims da raiva é composta de um domínio citoplásmico, um domínio transmembrana, e um ectodomínio. A glicoproteína é um trímero, com os ectodomínios expostos na superfície do vims. O ectodomínio está envolvido na indução de ambas a produção de VNAb e a proteção após a vacinação, tanto pré- e pós-exposição ao vims. Portanto, muita atenção foi focalizada em G no desenvolvimento de vacinas de subunidade de raiva. Estruturalmente, G contém três regiões, a região amino-terminal (N-terminal), uma região de “articulação” ou de “ligação”, e a região carbóxi-terminal (C-terminal) (vide Figura 1).

Como registrado na Figura 1, é considerado geralmente que o ectodomínio da glicoproteína (G) possui dois sítios antigênicos principais, o sítio II e o sítio III, que são reconhecidos em cerca de 72,5% (sítio II) e 24% (sítio III) de anticorpos monoclonais neutralizantes (MAb), respectivamente. O sítio II está localizado na metade N-terminal da proteína e o sítio III está localizado na metade C-terminal da proteína. As duas metades são separadas por uma articulação flexível em tomo da região linear (aminoácido 253 a 257).

O ectodomínio G contém ainda um sítio menor (sítio a), e vários epítopos reconhecidos por MAbs únicos (I: resíduo de aminoácido 231; V: resíduo 294, e VI: resíduo 264) (5, 10, 18, 21 ref. 2). O sítio II é conformacional e descontínuo (resíduos de aminoácido 34 a 42 e resíduos de aminoácidos 198 a 200, que são associados por pontes de dissulfeto), enquanto que o sítio ΠΙ é conformacional e contínuo (resíduos 330 a 338). A lisina 330 e a arginina 333 no sítio IIII desempenham uma função chave na neurovirulência e podem estar envolvidas no reconhecimento de receptores neuronais (vide, por exemplo, Coulon et al. supra, e Tuffereau et al, 1998, "Neuronal cell surface molecules mediate especific binding to rabies viras glycoprotein expressed by a recombinant baculoviras on the surfaces of lepidopteran cells”, J. ViroL 72:1085 - 1091). Os sítios II e III parecem estar próximos um do outro na estrutura tridimensional e expostos na superfície da proteína (Gaudin, Y.1997, "Folding of rabies viras glycoprotein; epitope acquisition and interaction with endoplasmic reticulum chaperones”, J. ViroL 71: 3742-3750). Entretanto, em baixo pH, a molécula assume uma conformação inativa de fusão, na qual o sítio II não é acessível a MAbs, enquanto que os sítios a e III permanecem mais ou menos expostos (Gaudin, Y. et al. 1995 "Biological function of the low- pH, fusion-inacive conformation os rabies viras glycoprotein (G): G is transported in a fiision-inactive state-like conformation”, J. Virol. 69: 5528-5533; Gaudin, Y., et al. 1991, "Reversible conformational changes and fusion activity os rabies viras glycloprotein”, J. Virol. 65: 4853-4859).

Além disso, várias regiões distribuídas ao longo do ectodomínio estão envolvidas na indução de células T auxiliadoras (Th) (MacFarlan, R. et al. 1984, "T cell responses to cleaved rabies viras glycoprotein and to synthetic peptídes”, J. Immunol. 133: 2748-2752; Wunner, W. et al., 1985 "Localization of immunogenic domains on the rabies viras glycoprotein”, Ann. Inst. Pasteur 136 E: 353-362). Com base nestas propriedades imunológicas e estruturais, foi sugerido que a molécula G pode conter duas partes imunologicamente ativas, cada qual potencialmente capaz de induzir ambas as células VNAb e Th (Bahloul, C. et al, 1998, “DNA-based immunization for exploring the enlargment of immunological cross -reativity against the lyssavirases”, Vaccina 16: 417-425).

Vacinas correntemente disponíveis consistem predominantemente de, ou são derivadas a partir de, vírus GT1, contra os quais elas oferecem proteção. Muitas cepas de vacinas não são efetivas contra GT4, e nenhuma é efetiva contra GT2 ou GT3. Entretanto, a proteção eliciada contra GT4 a 6 depende da cepa da vacina. Por exemplo, a proteção contra os lissavírus de morcego Europeu (GT5 e GT6), cujo isolamento se tomou mais ffeqüente em anos recentes, pela cepa de vacina contra raiva PM (Pitman-Moore) não é robusta. A cepa PM induz uma proteção mais fraca contra EBL1 (GT5) do que a proteção que ela proporciona contra a cepa PV (vírus Pasteur).

Devido, em parte, à importância da raiva no universo da saúde, existe uma necessidade contínua para prover vacinas de ação rápida, segura, e composições imunogênicas para tratar e prevenir esta doença. Muitas abordagens, outras que o uso de preparações de vírus total, foram propostas e/ ou buscadas para prover uma composição imunogênica de custo eficiente, efetiva, específicas para vírus de raiva. Por exemplo, como acima discutido, vacinas de subunidade foram desenvolvidas. Além disso, vacinas, que poderíam também gerar uma resposta imune para múltiplos serótipos de raiva, assim como para outros patógenos, foram propostas como tendo algum valor (European Commision COST/STD-3, 1996, "Advantagens of combined vaccines”, Vaccine 14: 693-700). De fato, o uso de uma vacina combinada de difteria, tétano, coqueluche celular total, polimielite inativada, e raiva foram recentemente relatadas (Lang. J et al.,1997, "Randomised Feasibility trial of pre-exposure rabies vaccination with DTP-IPV em crianças”, The Lancet: 349:1663-1665). Vacinas combinadas incluindo raiva foram também usadas para a imunização da cachorros (sinomose, hepatite, leptospirose, e vírus parvo-caninos), gatos (panleucopenia, vírus calici- e parvo-felinos), e gado (vírus da febre aftosa) (Pastoret - P.-P. et al., 1997 "Vaccination against rabies”, In Veterinary Vaccinology, Pastoret, P. -P. et al. Eds. (Elsevier): 616- 628 23).

Além disso, vacinas produzidas em cultura de teeido são dispendiosas de serem produzidas, a despeito de algumas tentativas para reduzir o seu custo. Consequentemente, vacinas de DNA, que são menos dispendiosas de serem produzidas e oferecem mais vantagens, constituiríam uma alternativa válida. Relatórios de vacinações de DNA incluem a inoculação de camundongo com plasmídeos contendo o gene, que codifica a glicoproteína do vírus da raiva (G). Tal inoculação é muito potente na indução de respostas imunes humorais e celulares, em associação com a proteção contra ataque intracerebral (vide, por exemplo, Lodmell, D. et al. 1998, "DNA immunization protects nonhuman primates against rabies virus”, Science Med. 4: 949-952; Xiang, Z. et al., 1994 "Vaccination with a plasmid vector carrying the rabies virus glycoprotein gene induces protective immunity against rabies virus”, ViroL 199: 132-140; e Lodmell, D. et al., 1998, "Gene gun particle-mediated vaccination with plasmid DNA confers protective immunity against rabies virus infection, Vaccine 16, 115). A imunização com DNA pode também proteger primatas não-humanos contra raiva (Lodmell et al., 1998, supra).

Como a administração do plasmídeo de DNA gera respostas imunes humorais e celulares, incluindo a produção do Linfócito T citotóxico (CTL) (para revisão vide Donnelly, J. et al., 1997, "DNA Vaccines”, Annu.Ver. Immunol., 15: 617-648) e é baseada em uma tecnologia versátil, a imunização com o DNA de plasmídeo pode oferecer um prospecto satisfatório para vacinas multivalentes. Entretanto, o uso de uma mistura de plasmídeos ou de um único plasmídeo, que expressa vários antígenos, é tido como induzindo problemas de interferência tanto em níveis transcricionais e imunológicos (Thomson, S. et al., 1998, "Delivery of multiple CD8 cytotoic cell epitopes by DNA vaccination”, J. Immunol. 160: 1717-1723). Portanto, existe uma necessidade para desenvolver e produzir vacinas à base de DNA, que são efetivas contra raiva e várias outra doenças; que são seguras; e que possuem um custo eficiente para a produção e uso. A presente invenção fornece seqüências de ácido nucleico quiméricas, que codificam polipeptídeos quiméricos, que induzem respostas imunogênicas em indivíduos. Os ácidos nucleicos da invenção podem ser expressos para prover polipeptídeos quiméricos, que eliciam uma resposta imune contra raiva e / ou vírus relacionados à raiva, assim como outros organismos patogênicos ou de outro modo indesejáveis ou polipeptídeos. Além disso, os ácidos nucleicos da invenção, em si mesmos, podem eliciar, pelo menos, uma porção da resposta imune. Deste modo, os ácidos nucleicos quiméricos da invenção pode ser usados para produzir uma composição imunogênica, que pode ser usada para tratar um indivíduo. A presente invenção também provê uma molécula de veículo, tal que um vetor de expressão de DNA, que compreende o ácido nucleico da invenção, que codifica um polipeptídeo polimérico. A molécula de veículo da invenção pode ser usada como uma composição imunogênica, ou como parte de uma composição imunogênica, para eliciar a resposta imune desejada. A resposta imune desejada pode ser uma resposta protetora para a raiva, ou para vírus relacionados à raiva, assim como para outros organismos ou polipeptídeos. Deste modo, as moléculas de veículo da invenção podem ser usadas para produzir uma composição imunogênica, que pode ser usada para tratar um indivíduo. A molécula de veículo pode ser também usada pára produzir um polipeptídeo quimérico. A presente invenção fornece assim uma proteína (fusão) quimérica, que é codificada pelo ácido nucleico desta invenção, ou por uma seqüência de ácido nucleico presente na molécula de veículo da invenção. A proteína quimérica pode ser usada para eliciar uma resposta imunogênica em um indivíduo. A proteína de fusão compreende o determinante antigênico do sítio III de uma glicoproteína de lissavírus, e pode compreender outros sítios antigênicos a partir de um ou de múltiplos outros polipeptídeos. Deste modo, o polipeptídeo quimérico da invenção pode ser usado para produzir uma composição imunogênica, que pode ser usada para tratar um indivíduo. A presente invenção provê ainda composições imunogênicas, incluindo vacinas, que eliciam uma resposta imunológica em indivíduos, a quem elas são administradas. A presente invenção inclui composições imunogênicas, que compreendem uma seqüência de polinucleotídeo, que codifica um polipeptídeo quimérico (ou de fusão), ou o polipeptídeo quimérico assim codificado, que elicia a resposta imune. As composições imunogênicas e vacinas da presente invenção proporcionam um nível aumentado de estimulação imune e proteção aperfeiçoada contra os vírus de raiva, e ampliam o espectro de proteção contra vírus relacionados à raiva, do que é provido por composições imunogênicas conhecidas na arte. As composições imunogênicas podem também prover múltiplos sítios ativos imunogênicos para a indução de uma resposta imune contra epítopos relacionados à raiva e não-raiva.

Tendo em vista as modalidades acima da invenção, é evidente que a presente invenção também provê um método de produção de um ácido nucleico quimérico, um método de produção de uma molécula de veículo, um método de produção de uma proteína de fusão e um método de produção de uma composição imunogênica, tal que uma vacina. A composição imunogênica assim produzida pode ser usada para tratar (por exemplo, imunizar) indivíduos. É incluído na invenção o uso de um ácido nucleico, polipeptídeo, e/ ou molécula de veículo da invenção para eliciar uma resposta imune, tal que uma resposta imune protetora. Deste modo, a invenção inclui o uso de uma vacina, que compreende o polinucleotídeo, polipeptídeo, e / ou molécula de veículo da invenção, para tratar, seja profilaticamente ou terapeuticamente, um indivíduo. Além disso, a invenção inclui métodos de tratamento profdáticos, métodos de tratamento terapêuticos, e métodos de tratamento curativos.

Os inventores criaram seqüências de ácido nucleico quimérico, que codificam polipeptídeos quiméricos, que induzem respostas imunogênicas em indivíduos. Como acima discutido, é conhecido na arte que aquele DNA pode eliciar tanto respostas imunes humorais como celulares. Fazendo-o deste modo, é possível que os ácidos nucleicos, em si mesmos, induzam, pelo menos, parte da resposta imunogênica. Deste modo, de acordo com a invenção, os ácidos nucleicos quiméricos e as moléculas de veículo podem prover ou promover uma resposta imunogênica, quando usados de acordo com a invenção.

Como aqui usados, “quimérico” e “fusão” são usados intercambiavelmente e com referência tanto a ácidos nucleicos como a polipeptídeos. Estes termos referem-se a ácidos nucleicos e polipeptídeos, que compreendem seqüências, que não são encontradas associadas naturalmente entre si na ordem ou contexto em que elas são colocadas de acordo com a invenção. Por exemplo, uma glicoproteína quimérica pode compreender uma região C-terminal a partir de GT1 de raiva e uma região N-terminal a partir de GT3 ou GT5 de raiva. Além disso, um ácido nucleico quimérico pode compreender um segmento curto a partir de uma porção de um genótipo de raiva ligado diretamente a outro segmento a partir do mesmo genótipo, em que os dois segmentos não são naturalmente adjacentes entre si. Deste modo, um ácido nucleico de fusão ou quimérico ou polipeptídeo não compreende a seqüência natural de vírus da raiva em sua totalidade, e pode compreender seqüências heterólogas (a partir de outra cepa de lissavírus, ou de outro organismo em conjunto). Proteínas de fusão/ quiméricas possuem dois (ou mais) segmentos heterólogos, unidos em um modo conjunto através de ligações de peptídeo normais, enquanto que os ácidos nucleicos de fusão / quiméricos possuem ou dois (ou mais) segmentos heterólogos unidos de modo conjunto através de ligações de fosfodiéster normais.

Em um aspecto da invenção, os ácidos nucleicos quiméricos compreendem a) uma seqüência que codifica o sítio III de uma glicoproteína, b) uma seqüência que codifica o domínio transmembrana (ou uma porção do mesmo que é funcionalmente equivalente ao domínio da transmembrana de uma glicoproteína, e c) uma seqüência que codifica o domínio citoplásmico da glicoproteína de um lissavírus. Em modalidades preferidas deste aspecto da invenção, os ácidos nucleicos quiméricos compreendem ainda uma seqüência, que codifica o sítio II de uma glicoproteína de lissavírus. Em modalidades, a seqüência que codifica o domínio da transmembrana (ou porção do mesmo) é uma seqüência a partir de uma glicoproteína de transmembrana de um lissavírus. Em outras modalidades, a seqüência é a partir de uma glicoproteína de transmembrana, outra que uma glicoproteína de um lissavírus. Por exemplo, ela pode ser uma glicoproteína a partir de outro organismo, ou de uma proteína de transmembrana, que não é uma glicoproteína. Em modalidades, a seqüência que codifica o domínio da transmembrana (ou porção do mesmo) e a seqüência que codifica o domínio citoplásmico são do mesmo lissavírus. Em modalidades deste aspecto da invenção, a seqüência que codifica o sítio III e o domínio citoplásmico são da mesma proteína, preferivelmente uma proteína de lissavírus, tal que uma glicoproteína de lissavírus.

Em uma modalidade preferida deste aspecto da invenção, o ácido nucleico quimérico inclui seqüências, que codificam a seqüência do sítio III de uma glicoproteína de lissavírus, uma seqüência do sítio III de uma proteína de lissavírus, um domínio transmembrana de uma proteína de transmembrana, e um domínio citoplásmico de uma glicoproteína de lissavírus. O domínio da transmembrana pode ser de um lissavírus ou de outro organismo. É altamente preferido que o ácido nucleico quimérico da invenção compreenda seqüências, que codificam uma proteína antigênica (ou porção antigênica da mesma) especialmente entre as seqüências que codificam os sítios II e III.

As seqüências, que codificam o sítio II e o sítio III são sequências que abrangem o sítio II e o sítio III de uma glicoproteína de um lissavírus, respectivamente. Em modalidades, a seqüência que codifica o sítio III não é idêntica a quaisquer das seqüências de sítio III conhecidas de lissavírus, mas apresenta, pelo menos, 60% de identidade com uma das seqüências de lissavírus, que se estende 30 bp em cada lado da seqüência do sítio III. A análise de seqüência e os estudos fitogenéticos são realizados usando vários pacotes: GCG (versão 8.1, 1994), CLUSTAL W (Thompson, 1994 # 1040), PHYLIP (versão 5. 5: Felseustein, 1993, # 1042) e GDE (Genetic Data Environment, Verão 2.2: Institute Pasteur Scientific Computer Service - S.I.S.).

Em modalidades preferidas deste aspecto da invenção, a seqüência do sítio III é PV da cepa de vírus de raiva ou apresenta, pelo menos, 60% de identidade para aquela seqüência do sítio III. Resultados altamente satisfatórios são obtidos com as seguintes construções, exibidas na figura 1: PV-PV ou PVIII ou EBL1-PV ou MOK-PV. O módulo básico tem que conter pelo menos uma seqüência PV III.

Os inventores verificaram que a presença do sítio III ou das glicoproteínas de lissavírus aperfeiçoa a imunogenicidade de composições, que compreendem a glicoproteína, ou porções da mesma. Deste modo, a presente invenção inclui ácidos nucleicos quiméricos, que compreendem uma seqüência, que codifica o sítio III de uma glicoproteína de lissavírus, que está funcionalmente, operativamente e fisicamente ligada a uma seqüência homóloga ou heteróloga, que codifica um domínio transmembrana de uma seqüência natural ou sintética, que codifica uma proteína de transmembrana (ou uma porção da mesma que é funcionalmente equivalente ao domínio da transmembrana), e uma seqüência que codifica um domínio citoplásmico (ou uma porção do mesmo, que é suficiente para existir estavelmente citoplasmicamente) a partir de uma glicoproteína. Preferivelmente, a glicoproteína é aquela de um vírus e particularmente aquele de um lissavírus. As seqüências de ácido nucleico quiméricas podem ser todas a partir do mesmo lissavírus, podem ser selecionadas a partir de vários lissavírus, ou podem ser de ambos lissavírus e outros vírus e organismos. Em modalidades preferidas, as seqüências de ácido nucleico, que codificam o sítio III e o domínio citoplásmico são do mesmo lissavírus.

Em adição, o ácido nucleico quimérico da invenção pode compreender uma seqüência, que codifica um polipeptídeo antigênico, ou uma porção antigênica do mesmo, a partir de outro vírus ou organismo (uma seqüência heteróloga). Por exemplo, o ácido nucleico quimérico pode compreender, em adição aos elementos acima expostos, uma seqüência que codifica um epítopo de leishmaniose, difteria, tétano, poliomielite, vírus da febre aftosa, vírus da herpes, vírus de sinomose, parvovírus, e vírus de imunodeficiência felina. Altemativamente, ou em adição, o ácido nucleico quimérico pode compreende uma seqüência, que compreende uma seqüência, que codifica um antígeno de tumor. A seqüência que codifica o polipeptídeo heterólogo (ou porção antigênica do mesmo) é fundida (em quadro) com a seqüência de codificação acima detalhada, em qualquer sítio que resulte em um produto funcional. Deste modo, o ácido nucleico quimérico da invenção provê a seqüência de codificação para determinantes antigênicos múltiplos, incluindo, mas não limitado a, epítopos de vírus de raiva.

Os ácidos nucleicos quiméricos da invenção podem ser usados para produzir uma composição imunogênica. A composição imunogênica pode consistir essencialmente do ácido nucleico quimérico ou pode compreender o ácido nucleico quimérico em adição a outros componentes, incluindo, mas não limitada a, coadjuvantes, excipientes, estabilizadores, vetores supra moleculares, como descrito na Patente Européia N 696.191(Samain et al.) e antígenos. Os componentes tipicamente incluídos em composições imunogênicas são bem conhecidos daqueles versados na arte, como o são as técnicas para a preparação de composições imunogênicas, tais que vacinas. Portanto, a preparação da composição imunogênicas pode ser alcançada pelo perito versado usando técnicas bem conhecidas, sem experimentação indevida ou excessiva.

Em outro aspecto da invenção, o ácido nucleico quimérico da invenção está presente como parte de uma molécula de veículo. O núcleo da molécula de veículo pode ser qualquer molécula, que seja conhecida como sendo útil para manter, e preferivelmente expressar, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo. O núcleo da molécula de veículo pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacteriófago, um fagemídeo, um cosmídeo, um vírus ou um cromossomo artificial de levedura (YAC). Tais moléculas de veículo de núcleo são também comumente referidas como vetores ou vetores de expressão, e são bem conhecidas daquele perito versado na arte e estão amplamente disponíveis para o público. A molécula de veículo da invenção pode ser provida como um ácido nucleico nu, ou embalado, tal que em uma capa ou casca viral. As moléculas de veículo podem ser providas como DNA e ou RNA. Formas modificadas destes dois ácidos nucleicos estão incluídas dentro do escopo da invenção. Preferivelmente, a molécula de veículo compreende seqüências, que permitem a transcrição dos ácidos nucleicos quiméricos da invenção. Estas seqüências estão operacionalmente ligadas aos ácidos nucleicos quiméricos da invenção (isto é a sua operação / função afeta diretamente a expressão do ácido nucleico quimérico). Em modalidades, estas seqüências incluem elementos reguladores, que permitem a expressão controlada dos ácidos nucleicos quiméricos, de tal modo que a expressão dos ácidos nucleicos quiméricos possa ser regulada por, por exemplo, o retardo da expressão até que desejado, ou a expressão dos ácidos nucleicos quiméricos apenas em certos tecidos ou tipos de célula. Tais elementos de controle são bem conhecidos para o perito no campo e podem ser rotineiramente inseridos ou removidos a partir das moléculas de veículo, como desejado ou necessário, usando reagentes e técnicas de biologia molecular bem conhecidos.

Em uma modalidade da invenção, uma molécula de veículo de acordo com a invenção compreende ácidos nucleicos, que codificam a) o sítio III da glicoproteína de um lissavírus, b) um domínio transmembrana de uma glicoproteína (ou uma porção do mesmo que é funcionalmente equivalente ao domínio da transmembrana), e (c) uma seqüência que codifica o domínio citoplásmico da glicoproteína de um lisavírus. Em modalidades preferidas deste aspecto da invenção, a molécula de veículo compreende adicionalmente uma seqüência que codifica o sítio II de uma glicoproteína de lisavírus. Em modalidades, a seqüência que codifica o domínio da transmembrana (ou porção do mesmo) é uma seqüência a partir da glicoproteína de um lissavírus. Em outras modalidades, a seqüência é de uma glicoproteína de transmembrana, outra que uma glicoproteína de um lissavírus. Em modalidades, a seqüência que codifica o domínio da transmembrana (ou uma porção do mesmo) e a seqüência que codifica o domínio citoplásmico são do mesmo lissavírus. Em modalidades, a seqüência que codifica o sítio III e o domínio citoplásmico são do mesmo lissavírus.

Em uma modalidade preferida, a molécula de veículo compreende adicionalmente, pelo menos, uma seqüência antigênica outra que o sítio III ou sítio II de um lissavírus. A(s) seqüência(s) antigênica (s) adicional (ais) pode ser de qualquer organismo e inclui(em), mas não está(ão) limitada(s),a seqüências antigênicas de parasitas (por exemplo, leishmânia), bactérias, vírus, e células tumorais. A molécula de veículo da presente invenção, pelo provimento da região da glicoproteína de lissavírus requerida para a imunogenicidade aumentada (sítio II), permite a produção de um alto nível de resposta imune, não apenas para os antígenos de lissavírus (sítios II III), mas para o(s) antígeno (s) heterólogo (s) fundido às seqüências de lissavírus. A molécula de veículo, pode, deste modo, ser usada para eliciar uma resposta imune para múltiplos antígenos de organismos diferentes. A molécula de veículo da invenção compreende preferivelmente uma seqüência quimérica, que codifica um polipeptídeo quimérico, que compreende, pelo menos, um determinante antigênico, que é o sítio II de um lissavírus. Mais preferivelmente, a molécula de veículo compreende uma seqüência quimérica, que codifica um polipeptídeo quimérico que compreende o sítio III de um lissavírus e, pelo menos, um outro determinante antigênico selecionado a partir do grupo que consiste de um antígeno a partir do mesmo lissavírus a partir do qual o sítio III foi derivado e um antígeno heterólogo. Os outros determinantes antigênicos incluem, mas não estão limitados, a aqueles parasitas patogênicos, vírus e bactérias, e aqueles de células tumorais. As moléculas de veículo da invenção podem ser usadas para produzir uma composição imunogênica. A composição imunogênica pode consistir essencialmente da molécula de veículo ou pode compreender a molécula de veículo em adição a outros componentes, incluindo, mas não limitados a, adjuvantes, excipientes, estabilizadores, vetores supra moleculares (EP 696.191, Samain et al.), e antígenos. Os componentes incluídos tipicamente em composições imunogênicas são bem conhecidos daquele versado na arte, assim como o são as técnicas para a preparação de composições imunogênicas, incluindo vacinas. A preparação da composição imunogênica é uma matéria de rotina, que pode ser executada pelo perito versado na arte usando técnicas bem conhecidas sem experimentação indevida ou excessiva e, deste modo, não precisa ser aqui descrita em detalhe.

Em outro aspecto, a presente invenção provê uma proteína ou polipeptídeo quimérico, que é codificado e/ ou expresso pelo ácido nucleico quimérico e/ ou molécula de veículo da presente invenção. O polipeptídeo quimérico compreende a) o sítio III de uma proteína de lissavírus, b) um domínio transmembrana de uma glicoproteína (ou uma porção funcional do mesmo), e c) um domínio citoplásmico da glicoproteína de um lissavírus. Em modalidades preferidas deste aspecto da invenção, os polipeptídeos quiméricos compreendem adicionalmente o sítio II de uma glicoproteína de lissavírus. Em modalidades, o domínio transmembrana (ou porção do mesmo) é da glicoproteína de um lissavírus. Em outras modalidades, o domínio da transmembrana (ou porção do mesmo) é de uma glicoproteína de transmembrana, outra que uma glicoproteína de um lissavírus. Em outras modalidades, o Domínio transmembrana (ou porção do mesmo) e o domínio citoplásmico são do mesmo lissavírus. Em modalidades, o sítio III e o domínio citoplásmico são do mesmo lissavírus. O sítio II e o sítio III podem ser obtidos a partir de qualquer lissavírus, e ambos podem, mas não necessariamente, vir do mesmo lissavírus. Além disso, a seqüência do sítio II e/ ou do sítio III não precisa ser idêntica a um sítio II ou sítio III de uma glicoproteína de um lissavírus. Em modalidades, a seqüência de um ou ambos não é idêntica a qualquer das sequências do sítio II ou sítio III conhecidas, mas apresenta, pelo menos, 60% de identidade com uma das seqüências de lissavírus, estendendo-se 10 resíduos em cada lado da seqüência do sítio II ou do sítio III.

Em modalidades preferidas, o polipeptídeo quimérico da invenção compreende adicionalmente, pelo menos, um determinante antigênico, outro que o sítio II ou sítio III da glicoproteína de lissavírus. O outro determinante antigênico pode ser qualquer proteína antigênica, ou porção antigênica da mesma, de outro vírus da raiva ou víms relacionado à raiva, de outro vírus, de um parasita, uma bactéria, ou qualquer outro organismo ou célula que expresse um determinante antigênico indesejável. Deste modo, a invenção provê um polipeptídeo quimérico, que compreende, como o único determinante antigênico, o sítio III de um lissavírus. Como a antigenicidade depende, pelo menos em alguma extensão, do indivíduo a quem a composição imunogênica é administrada, um polipeptídeo quimérico tendo apenas um determinante antigênico em um organismo pode ter mais do que um determinante antigênico em outro. Entretanto, de acordo com a invenção, se um polipeptídeo quimérico tiver apenas um determinante antigênico em pelo menos um indivíduo, independentemente do número que ele tem em outros indivíduos, ele é um polipeptídeo quimérico de acordo com esta modalidade da invenção. A invenção também provê um polipeptídeo quimérico com múltiplos antígenos incluindo, mas não limitados a, antígenos de raiva. O polipeptídeo quimérico pode ser usado como, ou como parte da, composição imunogênica, tal que uma vacina. Deste modo, o polipeptídeo da invenção é um polipeptídeo imunogênico, que contém pelo menos uma região (que pode ser isolada como um fragmento) que induz uma resposta imunogênica. Em modalidades, em que um sítio II, um sítio III, e outro determinante antigênico estão presentes, preferivelmente, mas não necessariamente, o outro determinante antigênico deve estar localizado entre o sítio II e o sítio III na seqüência de aminoácido (primária) linear do polipeptídeo. Um antígeno preferido, outro que o sítio II ou sítio III, é um antígeno de tumor de uma célula tumoral.

Preferivelmente, os ácidos nucleicos quiméricos, as moléculas de veículo e os polipeptídeos quiméricos (as “moléculas”) da invenção são isolados e/ ou purificados. Os termos “isolados” e “purificados” referem-se a um nível de pureza, que é alcançável usando a tecnologia corrente. As moléculas da invenção não precisam ser absolutamente puras (isto é não conter absolutamente moléculas ou outras macromoléculas celulares), mas devem ser suficientemente puras, de tal modo que aquele versado na arte pudesse reconhecer que elas não estão mais presentes no ambiente, no qual elas se encontravam originalmente (isto é, o meio celular). Deste modo, uma molécula purificada ou isolada de acordo com a invenção é uma, que tenha sido removida a partir de, pelo menos, uma outra macromolécula presente no ambiente natural, no qual ela foi encontrada. Mais preferivelmente, as moléculas da invenção são essencialmente purificadas e/ou isoladas, o que significa que a composição, na qual elas estão presentes, está quase completamente, ou mesmo absolutamente, isenta de outras macromoléuclas encontradas no ambiente, no qual as moléculas da invenção são originalmente encontradas. O isolamento e a purificação não ocorre por adição ou remoção de sais, solventes, ou elementos da tabela periódica, mas precisam incluir a remoção de, pelo menos, algumas macromoléculas.

Como pode ser visto a partir da exposição acima, a invenção provê uma composição imunogênica. A composição imunogênica pode compreender o ácido nucleico quimérico, a proteína quimérica, e/ou outra molécula de veículo da invenção. Por exemplo, os polipeptídeos quiméricos da invenção podem ser usados para produzir uma composição imunogênica. A composição imunogênica pode consistir essencialmente do polipeptídeo quimérico, ou pode compreende o polipeptídeo quimérico em adição a outros componentes, incluindo, mas não limitado a, adjuvantes, excipientes, estabilizadores, vetores supra moleculares (EP 696.191, Samin et al.) e antígenos. Os componentes incluídos tipicamente em composições imunogênicas são bem conhecidos daquele versado na arte, como o são as técnicas para a preparação de composições imunogênicas, tais que vacinas. Portanto, a preparação da composição imunogênica pode ser alcançada pelo perito habilitado usando técnicas em conhecidas, sem experimentação indevida ou excessiva. A composição imunogênica de acordo com a invenção é uma composição, que elicia uma resposta imune, pelo menos para lissavírus. Como os ácidos nucleicos quiméricos (e deste modo as moléculas de veículo e polipeptídeos) da invenção podem compreender determinantes antigênicos a partir dos vários genótipos de lissavírus em várias combinações, a composição imunogênica da invenção pode prover um amplo espectro de proteção contra lissavírus, que induzem encefalomielite, incluindo vírus da raiva. Além disso, como as seqüências, que codificam epítopos de lisavírus múltiplos, podem ser incluídas em um ácido nucleico quimérico, a composição imunogênica da invenção pode prover uma resposta imune para múltiplos (incluindo todos) genótipos de lissavírus. Preferivelmente, a composição imunogênica da invenção elicia tanto uma resposta celular, como uma resposta imune humoral.

Em adição, a composição imunogênica da invenção pode prover epítopos não apenas de lissavírus, mas de qualquer outro organismo, assim como (incluindo antígenos produzidos por células humanas, tais que antígenos indesejáveis, encontrados sobre a superfície de células cancerosas). Isto permite a construção de composições imunogênicas, incluindo, mas não limitada a vacinas, tendo ampla aplicabilidade, pelo fato de que uma única composição pode ser usada para eliciar uma resposta imune a múltiplos patógenos. Por exemplo, pode ser produzida uma composição imunogênica, que provê uma resposta imunológica protetora para uma ampla faixa de lissavírus, enquanto que, ao mesmo tempo, provê uma resposta protetora para outros vírus, tais que pólio e influenza. Uma tal composição imunogênica multivalente é provida pela natureza quimérica dos ácidos nucleicos e polipeptídeos da invenção, assim como pela presença do sítio III de um lissavírus, o que confere uma forte resposta imunogênica a epítopos do polipeptídeo antigênico. A composição imunogênica da invenção elicia uma resposta imunogênica em indivíduos, aos quais é administrada. A resposta imunogênica pode eliciar uma resposta imune protetora, mas uma tal resposta não é necessária. De acordo com a invenção, as composições imunogênicas, que podem eliciar uma resposta protetora, são referidas como vacinas. As respostas imunogênicas podem ser aumentadas, ou de outro modo modificadas, pela inclusão de componentes, em adição aos ácidos nucleicos quiméricos, proteínas quiméricas, e moléculas de veículo da invenção. Altemativamente, as composições imunogênicas podem consistir essencialmente dos ácidos nucleicos quiméricos, proteínas quiméricas, e moléculas de veículo da invenção. Deste modo, a invenção abrange vacinas de DNA, que compreendem os ácidos nucleicos quiméricos e/ ou as moléculas de veículo da invenção. A invenção provê assim um método de produção de uma composição imunogênica. Em uma modalidade, o método compreende isolar e/ ou purificar o ácido nucleico quimérico ou polipeptídeo da molécula de veículo. Em outra modalidade, o método compreende isolar o ácido nucleico ou polipeptídeo ou a molécula de veículo, e então combiná-lo com componentes adicionais. Os componentes adicionais podem ser qualquer composto adequado, que não possua um efeito adverso sobre a imunogenicidade, segurança ou eficácia do ácido nucleico, polipeptídeo, ou molécula de veículo da invenção. Os componentes adicionais incluem, mas não estão limitados a, compostos e aditivos, que são tipicamente adicionados a composições imunogênicas para aumentar a imunogenicidade, estabilidade, e biodisponibilidade. Tais aditivos estão expostos acima e são bem conhecidos para o perito habilitado.

Em outra modalidade deste aspecto da invenção, o método de produção de uma composição imunogênica é um método de expressão de um polipeptídeo quimérico (híbrido) para uso na produção de uma composição imunogênica. Nesta modalidade, o ácido nucleico quimérico ou molécula de veículo da invenção é expresso (transcrito e traduzido), de tal modo que o polipeptídeo quimérico é produzido. O polipeptídeo quimérico assim produzido é então isolado e/ou purificado a um nível aceitável, de tal modo que ele possa ser usado para produzir uma composição imunogênica. A produção de uma composição imunogênica nesta modalidade da invenção está de acordo cora a exposição nesta. Como aqui usado, um polipeptídeo é um polímero de aminoácidos e inclui peptídeos (mais do que 3 aminoácidos de comprimento), e proteínas (mais do que 100 aminoácidos de comprimento). A produção do polipeptídeo quimérico pode ser realizada in vivo ou in vitro. Preferivelmente, a produção ocorre in vivo por expressão em culturas de tecido ou bacterianas, e o polipeptídeo quimérico é isolado a partir destas culturas usando técnicas de purificação de proteína bem conhecidas.

Em um outro aspecto da invenção, método de produção do ácido quimérico, moléculas de veículo, e polipeptídeos quiméricos da invenção são providos. Os métodos incluem técnicas de engenharia genética conhecidas, que são bem conhecidas para o perito habilitado. Qualquer técnica conhecida, que seja rotineiramente praticada pelo perito habilitado pode ser usada para produzir e purificar as moléculas quiméricas d a invenção. A novidade da invenção não reside nestas técnicas, mas nas moléculas quiméricas construídas através do seu uso. Neste aspecto, os métodos podem ser usados para produzir um ácido nucleico ou molécula de veículo para uso na produção de uma composição imunogênica, tal que uma vacina de DNA. A invenção inclui assim um método de produção de uma composição para uso em uma vacina de DNA. A invenção também provê métodos de tratamento de indivíduos com as composições imunogênicas da invenção. Preferivelmente, o método é um método de vacinação. O método compreende administrar as composições imunogênicas a indivíduos, pacientes, que tenham necessidade de tratamento, suspeitos de necessitarem de tratamento, ou que desejem tratamento profilático (protetor) para uma doença ou distúrbio. Qualquer método conhecido de administração pode ser usado neste aspecto da invenção, incluindo, mas não limitado a, injeção com seringa e agulha (por exemplo, subcutânea, intramuscular, intravenosa), administração oral ou pela mucosa, inalação, administração tópica (por exemplo, por aplicação diretamente á pele) e por supositório.

Em uma modalidade deste aspecto da invenção, o método compreende administrar os ácidos nucleicos quiméricos da invenção a um indivíduo, em uma quantidade suficiente para eliciar uma reação imunogênica no recipiente. Preferivelmente, esta resposta é uma resposta protetora. A quantidade de ácido nucleico necessária para uma tal imunização pode ser determinada por aqueles de habilidade na arte, sem experimentação indevida ou excessiva. Por exemplo, composições, que compreendem os ácidos nucleicos quiméricos e as moléculas de veículo da invenção podem ser administradas em uma quantidade de 40 a 100 pg intramuscularmente, em uma ou várias injeções. Uma dosagem de lOOpg é geralmente útil para cães, e uma dosagem de 40 pg para camundongos (peso 20 g).

Em outra modalidade deste aspecto da invenção, o método compreende administrar os polipeptídeos quiméricos da invenção a um indivíduo. Preferivelmente, a resposta é uma resposta protetora. A quantidade de polipeptídeo necessária para uma tal imunização pode ser determinada por Aqueles de habilidade na arte, em experimentação indevida ou excessiva. Por exemplo, composições, que compreendem os polipeptídeos poliméricos da invenção, podem ser administradas em uma quantidade de 1 a 10 pg, intramuscularmente, em uma ou várias injeções.

Em outra modalidade deste aspecto da invenção, o método compreende administrar a molécula de veículo da invenção a um indivíduo. Preferivelmente, a resposta é uma resposta protetora. A quantidade de molécula de veículo, necessária para uma tal imunização, pode ser determinada por aqueles de habilidade na arte sem experimentação indevida ou excessiva. Por exemplo, composições, que compreendem as moléculas de veículo da invenção, podem ser administrada em uma quantidade de 40 a 100 pg intramuscularmente, em uma ou várias injeções.

Deste modo, este aspecto da invenção provê um método de vacinação de DNA. O método também inclui administrar qualquer combinação dos ácidos nucleicos quiméricos, dos polipeptídeos quiméricos, e da molécula de veículo da invenção a um indivíduo. Em modalidades, o indivíduo é um animal, e é preferivelmente um mamífero. De modo mais preferido, o mamífero é selecionado a partir do grupo, que consiste de um ser humano, um cão, um gato, um animal bovino, um porco, e um cavalo. Em uma modalidade especialmente preferida. O mamífero é um ser humano.

Os métodos de tratamento incluem administrar composições imunogênicas compreendendo polipeptídeos, mas composições compreendendo ácidos nucleicos (incluindo a molécula de veículo) do mesmo modo. Aqueles de habilidade na arte são conhecedores do conceito, aplicação e eficácia das vacinas de ácido nucleico (por exemplo, vacinas de DNA) e a tecnologia da vacina de ácido nucleico, assim como de tecnologias à base de proteína e polipeptídeo. A tecnologia à base de ácido nucleico permite a administração de ácidos nucleicos, nus ou encapsulados, diretamente a tecidos e células, sem a necessidade de produção de proteínas codificadas anteriormente à administração. A tecnologia está baseada na capacidade de que estes ácidos nucleicos sejam absorvidos pela células do organismo receptor e expressos para produzir um determinante imunogênico, ao qual o sistema imune do receptor responde. Tipicamente, os antígenos expressos são exibidos sobre a superfície celular das células que foram absorvidas e expressam os ácidos nucleicos, mas a expressão e a exportação dos antígenos codificados no sistema circulatório do indivíduo receptor está também dentro do escopo da presente invenção. Tal tecnologia de vacina de ácido nucleico inclui, mas não está limitada, ao fornecimento de DNA e RNA nu, e ao fornecimento de vetores de expressão, que codificam polipeptídeos de interesse (moléculas de veículo). Embora a tecnologia seja denominada “vacina”, ela é igualmente aplicável a composições imunogênicas, que não resultam em uma resposta protetora. Tais composições e métodos, que induzem a não-proteção, estão abrangidos dentro da presente invenção.

Embora esteja dentro da presente invenção fornecer ácidos nucleicos e moléculas de veículo como ácido nucleico nu, a presente invenção também abrange o fornecimento de ácidos nucleicos como parte de composições maiores ou mais complexas. Estão incluídos dentro destes sistemas de fornecimento vírus, partículas tipo vírus, ou bactérias contendo o ácido nucleico quimérico ou molécula de veículo da invenção. Além disso, complexos dos ácidos nucleicos da invenção e moléculas de veículo com compostos de permeabilização celular, tais que lipossomas, estão incluídos dentro do escopo da invenção. Outros compostos, vetores supra moleculares (EP 696.191 Samian et al.) e sistemas de fornecimento para vacinas de ácido nucleico são também conhecidos do perito habilitado, e exemplificados na WO 90 111 092 e WO 93 06223 (patentes de Vical), e podem ser produzidos e usados sem experimentação indevida ou excessiva.

Os métodos de tratamento de indivíduos de acordo com a invenção incluem o tratamento profilático, tratamento terapêutico, e tratamento curativo. O tratamento profilático é o tratamento de um indivíduo, usando os métodos da invenção, antes que qualquer sinal clínico de doença ou infecção seja identificado. Deste modo, o tratamento profilático é um tratamento preventivo e inclui vacinação. O tratamento profilático também inclui tratamento, que é instituído após infecção real ou princípio da doença, mas antes que pelo menos um sinal clínico da doença ou infecção seja observado. O tratamento terapêutico é o tratamento de um indivíduo após, pelo menos, um sinal clínico de doença ou infecção ser identificado, ou após é indivíduo ter tomado conhecimento (ou ter elevada suspeita) de ter sido exposto a uma quantidade de um agente suficiente para causar doença ou infecção. Os métodos de tratamento terapêutico não resultam necessariamente na eliminação da doença ou infecção; entretanto, eles proporcionam uma melhora clinicamente detectável em, pelo menos, um sinal clinico da doença ou infecção. Métodos de tratamento curativo resultam na eliminação completa dos sinais clínicos da doença ou infecção no indivíduo tratado. Incluídos nos métodos de tratamento curativo estão aqueles, que resultam na remoção completa do agente causador da infecção ou doença, seja ele um vírus, bactéria, ou célula hospedeira (tal que uma célula cancerosa). Também incluídos nos métodos de tratamento curativo estão aqueles, que causam a remissão completa de uma doença, isto é a eliminação completa de sinais clínicos exteriores de infecção ou doença, e a repressão de todas as manifestações clínicas detectáveis da infecção ou doença.

Com relação à vacinação contra raiva, é conhecido que o vírus pode ser tratado, tanto profilaticamente (por exemplo, por vacinação de cachorros) como curativamente (por exemplo, por uma série de injeções em um ser humano previamente mordido por um cachorro raivoso). Deste modo, uma modalidade preferida da presente invenção consiste em um método de vacinação de um indivíduo com uma vacina, que compreende a composição imunogênica da invenção. Como acima discutido, a composição imunogênica da invenção pode compreender (ou codificar) determinantes antigênicos múltiplos. Portanto, um método da invenção pode incluir múltiplos tipos de tratamento para múltiplos tipos de doenças ou infecções. Por exemplo, um método de tratamento único pode compreender o tratamento profilático da pólio, o tratamento profilático e terapêutico da raiva, e o tratamento profilático da influenza.

Será evidente para aqueles de habilidade ordinária na arte, que várias modificações a variações podem ser introduzidas na construção das moléculas e na prática dos métodos da invenção, sem que haja afastamento do espírito e do escopo da invenção. A invenção será agora descrita em maior detalhe com referência a exemplos específicos da invenção, que não se destinam a ser, e não devem ser construídos como, limitando o escopo da invenção em qualquer modo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E TABELAS A invenção será agora descrita em maior detalhe com referência aos desenhos, nos quais: A figura 1 ilustra glicoproteínas de lissavírus e construções quiméricas de glicoproteínas de lissavírus. SP- peptídeo de sinal; TM -domínio transmembrana; Sr resíduos de aminoácido NL; S2 - resíduos de aminoácido NS; S3- resíduos de aminoácido LFAV. (A) Representação esquemática de glicoproteína (G de lissavírus PV, indicando as regiões que abrangem o sítio II, sítio III, e epítopos I, V e VI, assim como o domínio da transmembrana (TM) é apresentado no topo. Polipeptídeos quiméricos são esquematicamente ilustrados nas outras linhas, com pontos de deleção e/ ou fusão indicados pelos números de resíduo. Os números são posições de resíduos de aminoácido na proteína madura (peptídeo de sinal clivado). (B) Seqüências de aminoácido dos polipeptídeos quiméricos nos sítios de fusão. A região linear, que porta 0 epítopo VI (aminoácido 264) é indicada pelo sublinhamento nos resíduos 251-275. Quadros pretos e cinzas descrevem as seqüências EBL-1 e Mok, respectivamente. Tracejados representam aminoácidos similares àqueles da sequência PV, e pontos correspondem a lacunas. (C) Representação esquemática das seqüências inseridas, que codificam 0 epítopo de poliovírus C3 envolvido na indução do anticorpo de neutralização de vírus (B), e 0 epítopo da célula CD8 - H2d (CTL) de nucleoproteína (LCMV) de vírus de coriomeningite linfócito envolvido na indução de ambos os linfócitos T citotóxicos (CTL) e proteção contra provocação de LCMV na proteína G de lissavírus truncado (GPVIII) e quimérico (GEBL-l-PV). (D) Análise da seqüência PEST putativa em tomo da junção do final da parte EBL 1 e início do epítopo de célula B é também relatada. (E) Comparação das seqüências de aminoácido deduzidas de proteínas G de lissavírus selecionados. A seqüência de consenso é apresentada como a seqüência de base. Quadros cinza claro indicam os sítios antigênicos principais. Quadros cinza escuro indicam o peptídeo de sinal hidrofóbico (SP) e o domínio transmembrana TM. Motivos NX(S/T) sublinhados são sítios de N-glicosilação potenciais. A figura 2 apresenta a microscopia de imunofluorescência indireta de produção de lissavírus G em células Neuro-2a 48 horas após transfecção transitória com vários plasmídeos: pGPV -PV (A, B e C), pG-PVIII (D, E e F), pGEBLl-PV (G, H e I), pGMok -PV (J, K e L) e p GPV-Mok (Μ, N e O). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram permeabilizadas e manchadas com anticorpos: anti-PV G Pab (A, D, G, J e M), PV Dl anti-nativo PV G sítio III Mab (B, E, H e K) m 6B1 anti-desnaturado G sítio III MAB 8 e F), anti-EBL- 1 G Pab (I), anti-Mok G Pab (L e N) e soro de camundongo não-imunizado (0). A figura 3 mostra os resultados de um estudo cinético de síntese de antígeno em células Neuro-2a transitoriamente transfectadas com pGPV-PV (a), pGEBLl-PV (b) ou pG-PVIII (c). As células foram permeabilizadas em vários momentos e manchadas com PV PAb (barra pontilhada) ou G anti-desnaturada sítio III6B1 MAb (barra hachurada). A figura 4 mostra os resultados de indução de células que produzem IL-2 por plasmídeos que codificam vários lissavírus G. Camundongos BALB/ c (dois animais para cada plasmídeo) foram injetados i. m. (50 μΐ em cada músculo tibial anterior) com 40 pg de plasmídeo (pGPV-PV, pG-PVIII, pGEBLl-PV, pGMOk-PV e pGPV- Mok). Os baços foram removidos 21 dias após e esplenócitos foram especificamente estimulados in vitro por vírus purificados e inativados (PV, EBL1 ou Mok), G PV, ou policlonalmente estimulados por concavalina A (ConA). A quantidade de IL- 2 liberada foi então testada, em triplicatas, por bioensaio e titulações expressas como U/ ml. A figura 5 apresenta a indução de VNAb contra genótipos de lissavírus Europeu por plasmídeo. Camundongos BALB/c foram injetados com 40pg de plasmídeo no músculo tibial. (A) Injeção com pGPV-PV. Os camundongos receberam um reforço no dia 30. (Soros (reservatório de 3 amostras) foram testados nos dias 27 a 49 quanto VNAb contra vírus de genótipos 1 (CVS e PV), 5 (EBL lb), e 6 (EBL 2b). (B) Injeção com pGEBLl-PV. Quatro camundongos receberam apenas uma injeção de plasmídeo e amostras de sangue foram coletadas em vários intervalos por perfuração transorbital. Os soros foram testados por RFFIT usando víms PV e EBLlb para a determinação de VNAb.

A figura 6 apresenta a proteção comparativa induzida por plasmídeos pGPV-PV, pGEBLl-PV e vacinas de raiva PM e PV contra CVS, EBL-lb, e EBL-2b. Camundongos BALB/c (9 animais por série) foram injetados i.p. nos dias 0 e 7 com 0,5 ml de vacina PM diluída a 1/10 (círculos sólidos) ou com 2 pg de vírus PV inativado e purificado (quadrados sólidos). Para imunizações à base de DNA, camundongos BALB/c (5 animais para cada plasmídeo) foram injetados no músculo tibial com PBS (círculos abertos) ou com 40 pg de vários plasmídeos pGPV-PV (losangos), EBL-1 PV (triângulo sólido), espinha dorsal pClneo (cruzado). Camundongos suíços (6 animais) foram injetados com pGPV-PV (quadrado aberto) (a) Vírus inativado foi injetado. Camundongos BALB/c e Suíço foram desafiados i.c. no dia 21 com cerca de 30 LD5o de CVS. (b) Vírus inativado foi injetado. Camundongos BALB/c e Suíço foram desafiados i.c. no dia 21 com cerca de 30 LD50 de EBL-lb. (c) Vírus inativado foi injetado. Camundongos BALB/c e Suíço foram desafiados i.c. no dia 21 com cerca de 30 LD50 deEBL- 2b. (d) DNA foi injetado. Camundongos BALB/c e Suíço foram desafiados i.c. no dia 21 com cerca de 30 LD50 de CVS. (e) DNA foi injetado. Camundongos BALB/c e Suíço foram desafiados i.c. no dia 21 com cerca de 30 LD50 de EBL-1. (f) DNA foi injetado. Camundongos BALB/c e Suíço foram desafiados i.c. no dia 21 com cerca de 30 LD50 de EBL- 20. A figura 7 apresenta microscopia dc imunofluorescência indireta de antígenos expressos em células Neuro-2a transfectadas com plasmídeos. (A) As células foram transfectadas com o plasmídeo pGEBLl-(B- CTL)2-PV e manchadas com Dl MAb de raiva. (B) As células foram transfectadas com o plasmídeo pGEBLl (B-CTL)2-PV e manchadas com o vírus de pólio MAb. (C) As células foram transfectadas com o plasmídeo pGEBL 1- (B-CTL)2- PV e manchadas com o vírus antipólio PAb tipo 1. (D) As células foram transfectadas com o plasmídeo pClneo e manchadas ou com o Dl Mab de raiva, 2) o vírus da pólio C3 MAb, ou 3) o vírus antipólio PAb tipo 1. A figura 8 apresenta a indução de células que produzem IL2 por pGPVIII(A) ou p GEBLl-PV(B) que portam vírus de pólio e epítopos de LCMV. Camundongos BALB/c (dois animais para cada plasmídeo) foram injetados i.m. (50 pg em cada músculo tibial anterior) com plasmídeos. Os baços foram removidos 14 dias após e os esplenócitos foram estimulados in vitro por meio de cultura celular (barra cruzada) especificamente por lissavírus inativados e purificados (IPLV PV; barra misturada; IPLV EBL: sombreados claros) ou policlonalmente estimulados por ConA (barra pontilhada). A quantidade de IL-2 liberada foi então testada em triplicatas por bioensaio e as titulações expressas como U/ ml. (A) os plasmídeos injetados foram plasmídeo pClneo vazio, pGPVIII, e p(B-CTL)2-GPVIII. (B) Os plasmídeos injetados foram pClneo, pGEBLl-PV, pGEBLl-(B) -PV, p GEBL1-(CTL)-PV, pGEBLl- (CTL-B) - PV, p GEBL1- (B-CTL)2-PV. A figura 9 mostra um estudo cinético em camundongos BALB/c de produção de anticorpos induzida por p(B-CTL)2-GPVIII ou pGPVIII contra peptídeo de vírus de pólio e vírus de raiva. Três camundongos foram injetados com 40pg de p(B-CTL)2-GPVIII (quadrado e círculo), ou pGPVIII (triângulo), ou pClneo vazio (losango). Após perfuração por via retroorbital em tempos variados, os soros foram testados por ELISA quanto à determinação de anticorpo contra peptídeo de vírus de pólio (quadrado e losango) de vírus da raiva (círculo, triângulo e losango). A figura 10 mostra a influência de uma iniciação sobre a produção de anticorpos de anti-peptídeo de vírus de pólio induzida por p(B-CTL)2-GPVIII. Cinco grupos de três camundongos receberam no dia 0 PBS (2 grupos), p(B-CTL)2-GPVIII (2 grupos), ou pPVIII. Um grupo (injetado com p(B-CTL)2-GPVIII) não foi reforçado, enquanto que o grupo injetado com pPVIII foi reforçado com p(B-CTL)2-GPVIII no dia 26. Um grupo (injetado com p(B-CTL)2-GPVTIT) foi reforçado com p (B-CTL)2-GPVIII no dia 14. Todos os animais foram controlados quanto à produção de anticorpo de anti-peptídeo no dia 39 por ELISA. A figura 11 mostra a produção de anticorpos de neutralização do vírus da raiva contra o padrão de vírus de desafio (EVS) após injeção do plasmídeo totalmente homogêneo em cachorros da raça Beagle.

Grupo A: injeção de 100 pg de plasmídeo em um sítio nos dias 0, 21, 42 e 175.

Grupo B: Injeção de 33 pg de plasmídeo em três sítios nos dias 0, 21,42, e 175.

Grupo C: Injeção de lOOpg de plasmídeo em um sítio nos dias 0 e 175.

Gmpo D: Injeção de solução salina tamponada com fosfato (controle). A figura 12 mostra a resposta de anticorpo de neutralização individual contra um vírus de raiva selvagem (forma de raposa da França, vírus de raiva selvagem de raposa FWR) após injeção do plasmídeo homogêneo completo pGPV em cachorros da raça Beagle. Ela mostra também a proteção induzida contra um desafio intramuscular efetuado no dia 175 com um vírus de raiva selvagem isolado a partir de cachorros raivosos.

Cachorros n°s. 1 a 3 = gmpo A

Cachorros n°s 4 a 6 = gmpo B

Cachorros n°s 7 a 9 = gmpo C

Cachorros n°s 10 a 12 = grupos D A figura 13 mostra células N2A transfectadas com o plasmídeo DBL-3/PVIII (Fugene, Roche Molecular Biochemicals) e fixado com Acetona (80%) por 10 minutos em gelo. A) Proteína de fusão anti DBL-3-GST de camundongo. B)anti PVII de coelho (diluição 1/400). São mostradas reatividades fundamentais observadas com o segundo anticorpo conjugado a FITC. Esta figura mostra claramente que ambas as regiões DBL-3 e PVIII foram suficientemente expressas na membrana das células transfectadas.

EXEMPLOS

Para os Exemplos, foram usados os seguintes materiais e métodos, a não ser que especificado de outro modo.

Camundongos. Camundongos fêmeas BALB/c (H-2d BALB/C), de 6 a 8 semanas de idade e Suíços (14 a 16 g) foram adquiridos do “Centre d’Elevage et de Recherche” Janvier (Legenest St. Isle, France). Células e lissavírus. Células BHK-21 usadas para a produção e titulação de lissavírus foram desenvolvidas em um meio essencial mínimo de Eagle (MEM) contendo 5% de soro bovino fetal (FBS) e 5% de soro de novilho recém-nascido (Perrin, P., 1996, “Techniques for the preparation of rabies conjugates”, em Laboratory techniques in rabies. Meslin, F-X, Kaplan, M, e Koprowiski, H. Eds., (WHO Genebra): 433-445). Células de neuroblastoma (Neuro-2 a) usadas para estudos de transfecção com plasmídeos foram crescidas em MEM contendo 8% de FBS. A linhagem de célula T citotóxica dependente de interleucina-2-(IL-2) foi preparada em cultura como previamente descrito (Perrin, P. et al., 1988, "Interleukin-2 increases protection against experimental rabies” Immunobiol. 177:199-209) em meio RPMI-1640 (Gibco: Flowbio, Courbevoie, França) contendo 10% de FBS, piruvato de sódio lmM, aminoácidos não-essenciais lmM, 2-mercaptoetanol 5 x 105 M, tampão de HEPES (Flow Laboratories, Bethesda, USA) e 5 a 10 unidades (para 1 x 104 células) de IL-2 de rato (sobrenadante de esplenócitos estimulados com concanavalina A: Com A). As células foram incubadas a 37EC em uma atmosfera umidificada contendo 7,5% de C02.

Cepas de raiva CVS, PV-Paris/BHK-21 fixas, assim como cepas de vírus relacionado à raiva (EBL lb, EBL 2b, LCMV, e Mok) foram multiplicadas (passadas) em células NHK-21 como previamente descrito por Perrin, P.,1996, supra. Os lissavírus de morcego Europeu usados foram EBL1 (número de cepa 8916FRA) derivado de um isolado de morcego da França e EBL2b (número de cepa 9007FIN; uma doação de H. Bourhy) isolado de um ser humano na Finlândia (Amengal, B. et al., 1997 "Evolution of European bat lissaviruses”, J. Gen. Virol. 78: 2319: 2328). A cepa LCMV Arm/53b foi graciosamente fornecida pelos Drs. M. Oldstone e M. McChesney (Scripps Clinic, La Jolla, CA).

Vacinas e antígenos de vírus da raiva. Lissavírus inativados e purificados (IPRV) foram preparados como descrito por Perrin, P.1996, supra. 0 vírus foi purificado a partir de sobrenadantes de célula infectada clarificados e inativados (β-propiolactona) por ultracentrifugação através de um gradiente de sacarose. A glicoproteína PV foi solubilizada a partir de IPRV e purificada (GPV) como previamente descrito por Perrin, P., 1996, supra e Perrin, P. et al. 1985, “Rabies immunosomes (vacina de subunidade) structure e immunogenicity”, Vaccine, 3: 325-332.

Os dois vírus da raiva inativados, usados para estudos de proteção comparativos, foram preparados com duas cepas diferentes: 1) PM como uma vacina comercial para uso humano; (Pasteur Vaccins Mames-la-Coquette France; Lote Y0047): 2) PV como uma vacina para uso laboratorial (IPRV).

Construção de plasmídeos que expressam gene G de lissavírus. A região (aminoácidos 253-275) que está sobreposta ao único epítopo não-conformacional (VI) (Figura 1) foi selecionada para a constmção de genes quiméricos, porque ela é presumivelmente menos restrita estruturalmente do que os dois sítios antigênicos II e III principais. Os genes G de lissavírus homogêneo e quimérico (vide Figura 1) foram introduzidos no vetor de expressão eucariótico pClneo (Promega), propagados e amplificados em DH5 (de cepa E. coli por protocolos de clonagem molecular padrões bem conhecidos do perito habilitado. Os plasmídeos pGPV-PV e pGMok-PV foram preparados como previamente descrito (Bahloul, C. et al., 1998, “DNA-based immunization for exploring the enlargement of immunological cross-reactivity against the lissaviruses” Vaccine 16: 417-425). Plasmídeos pGPV-Mok, pG-PVIII e pGEBLl-PV foram obtidos como se segue.

Para pGPV-Mok, a sequência de codificação da parte do sítio II de G PV (aminoácidos 1-257) foi amplificada por RT-PCR usando iniciadores degenerados: PVXbal: (SEQ IDNO:l) PVBcll: (SEQID NO: 2) O produto de PCR foi inserido no sítio Smal de pUC19, então excisado com Bell e EcoRI e ligado entre os mesmos sítios em pGMok-Mok fornecendo pGPV-Mok, contendo uma fusão em-quadro dos aminoácidos 1-257 de G PV com aminoácidos 258-503 de G Mok. O gene pG-PVIII, com uma deleção em-quadro interna entre a extremidade do peptídeo de sinal PV e o resíduo 253, foi obtido por introdução de um adaptador sintético entre os sítios de restrição EcoBJ e Bell do plasmídeo pGMok-PV. Este adaptador de PV, contendo um único sítio EcoRI, foi gerado por recozimento de 200 picomoles de cada iniciador em Tris-HCl 250 mM, pH 7,7. O pG-PVIII foi depositado em 22 de dezembro de 1998 com a Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Paris, França, e foi-lhe dado o Número de Acesso 1-2115. PVpl: (SEQ ID NO: 3) Pvp2: (SEQ IDNO: 4) Para gerar o gene pGEBLl-PV, um adaptador sintético, que corresponde aos aminoácidos 2-14 de sítios de restrição 5VEII e EcoR\ únicos de EBL-la (cepa 8615POL) (1) foram gerados do mesmo modo que para pG-PVIII, por recozimento: EBLlpl: (SEQIDNO: 5) EBLlp2: (SEQIDNO: 6) O adaptador foi ligado em-quadro no sítio EcoRI de pG-PVIII, Um fragmento correspondendo aos aminoácidos 15-253 de EBL-la (cepa 8615POL) foi então gerado por RT-PCR de RNA viral usando os iniciadores EBLp3 e EBLlp4. EBLlp3: (SEQ IDNO: 7) EBLlp4: (SEQ IDNO: 8) O produto de RT/PCR foi digerido com BstEll e EcoRI e foi ligado nos mesmos sítios, introduzidos por meio do adaptador EBL1, resultando em uma fusão em-quadro entre o peptídeo de sinal PV, a parte do sítio II de EBL 1 a e a parte do sítio III de PV. A identidade de cada construção foi confirmada por seqüenciamento automático com reação de terminador com corante em um seqüenciador ABI 377 (Perkin- Elmer). PEBL1-PV foi depositado com o CNCM em 22 de dezembro de 1988, e lhe foi atribuído o Número de Acesso 1-2114.

Inserção de epítopos de célula CD8 e B estranhas em genes G truncados ou quiméricos.

Os genes truncado (pGPVIII) e quimérico (GEBL1-PV) contendo um único sítio de clonagem EcoR\ foram usados para a inserção de epítopos de célula B e CD8 estranhas. Os genes G de lissavírus foram introduzidos no vetor de expressão eucariótico pClneo (Promega), propagados em ampliados em DH5(de cepa Eschericia coli por protocolos de clonagem molecular padrões.

Os epítopos de célula B e CD8 foram inseridos no sítio de restrição EcoRI do gene G de lissavírus truncado ou quimérico na região de articulação (aminoácidos 253 a 275) da molécula na posição 253. O epítopo da célula B (denominado *B+) correspondeu ao fragmento C3 (aminoácido 93 a 103: DNPASTTNKDK: SEQ ID NO: 9) da proteína VP1 de vírus de pólio. O epítopo de célula CD8 (denominado *CTL +) correspondeu aos aminoácidos 119-127 (PQASGVYMG: SEQ ID NO: 10) ou aminoácidos 117-132 (ERPQASGVYMGNLUAQ: SEQ ID NO: 11) da nucleoproteína de vírus de coriomeningite de linfócito. Plasmídeos p(B-CTL)2-GPVIII, pGEBLl-(B)-PV, pGEBLl- (CTL)-PV, pGEBLl-(B-CTL)-PV, p GEBL1-(B-CTL)2-PV, e pGEBl-(CTL-B) -PV foram obtidos como se segue (vide também Figura 1): O gene p(B-CTL)2- GPVIII foi gerado em uma clonagem de dois estágios de um adaptador sintético no único sítio de restrição EcoRI por rccozimcnto de 200 picomoles dc cada iniciador: *B-CTLpl+: (SEQIDNO: 12) *B-CTLp2+: (SEQIDNO: 13) Para pGEBL-l(B)-PV, pGEBLl-(CTL)-PV, os adaptadores sintéticos usados para a inserção foram respectivamente: B: *Bp3+: (SEQIDNO: 14) *BP4+: (SEQ ID NO: 15) CTL: *CTLp5+: (SEQ ID NO: 16) *CTLp6 +: (SEQIDNO: 17) Para a construção de plasmídeo pGEBLl-(B-CTL)-PV e pGEBL 1 -(CTL-B)-PV, pGEBLl-(B)-PV e p GEBL1-(CTL)-PV foram usados sob as mesmas condições a cima para inserir as seqüências CTL e B, respectivamente, nos genes quiméricos. A identidade de cada constructo foi confirmada pela seqüenciação automática com a reação de terminador de corante em um seqüenciador ABI377 (Perkin -Elmer).

Experimentos de expressão transitórios. A capacidade de plasmídeos para induzir a expressão transitória de antígenos relacionados a G foi testada após a transfecção de células Neuro 2a usando o método mediado por lipossoma catiônico DOTAP de acordo com as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim). Cada reservatório de uma microplaca de cultura celular (Falcon) foi inoculado com 3 x 104 células (em MEM, 10% FBS) e incubada por 24 horas a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 7, 5% de C02. A placa foi então lavada com MEM sem FBS e incubada, como acima, por 1 hora. O sobrenadante celular foi removido, e os reservatórios foram lavados e enchidos com um volume total de 50 μΐ de solução de transfecção, que continha 0,1 pg de plasmídeo e 6 μΐ de DOTAP ((N- (1,2,2-dioleoiloxi) propil) - Ν,Ν,Ν- trimetilamôniometil- sulfato) em solução salina tamponada com HEPES estéril (NaCl 150 mM, HEPES 20mM) previamente incubada em temperatura ambiente por 15 minutos. As placas foram incubadas por 5 horas a 37°C na presença de 7,5% de C02. Duzentos μΐ de MEM contendo 2% de FBS foram adicionados a cada reservatório e a placa foi incubada por de 24 a 140 horas, nas mesmas condições, antes de análise de expressão transitória por imunofluorescência indireta. A capacidade de plasmídeos para induzir a expressão transitória de G e de antígenos relacionados estranhos foi testada após a transfecção de células Neuro 2a, usando o reagente de transfecção FuGENE 6, de acordo com as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim). Cada reservatório de uma cultura celular Nunc câmara Labkek (Life Technologies) foi inoculada com 3 x 104 células (em MEM, 10% FBS) e incubada por 24 horas, a 37°C, em uma atmosfera umidificada contendo 7,5% de C02. As placas foram então lavadas com MEM sem FBS e os reservatórios foram enchidos com 50 μΐ de solução de transfecção: 0,1 μg de plasmídeo, 3μ1 de reagente de transfecção FuGENE 6, e 47 μΐ de Meio. A placa foi incubada por 18 horas a 37°C, na presença de 7,5% de C02. Duzentos μΐ de MEM contendo 5% de FBS foram adicionados a cada reservatório e a placa foi incubada, após 24 horas, sob as mesmas condições antes de análise de expressão transitória por imunofluorescência indireta.

Anticorpos. Anticorpos policlonais (PAb) dirigidos contra PV e Mok G foram obtidos como descrito por Perrin, P., 1996, "Techniques for the preparation of rabies conjugates”, em Laboratorv techniques in rabies. Meslin, F-X., Kaplan M. and Koprowski, H. Eds. (WHO genebra): 433-445, por imunização de coelho com glicoproteína de vírus purificada. Vírus EBL-lb contra PAb foi obtido por imunização de camundongo com vírus inativado e purificado.

Três anticorpos monoclonais (MAb) dirigidos contra PV G foram também usados. O PVE 12 MAb (um Mab desenvolvido por M-Lafon et al., 1985, “Use of a monoclonal antibody for quantitation of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay”, J. Biol. Standard 13: 295-301) reconhece o sítio II de G nativo. Dl MAb (isótipo IgC L), produzido em nosso laboratório reconhece o sítio III de nativo, mas não G tratado com SDS. O 6 Al MAb (um MAb relatado em 18 de 2) reconhece proteína G desnaturada com SDS e mais precisamente dois peptídeos localizados a jusante do sítio III, próximo à parte terminal COOH do ectodomínio G (aminoácidos 342-433 e 397-450).

Microscopia por Imunofluorescência. A expressão de antígenos G em células transfectadas foi avaliada com e sem permeabilização (30 minutos de incubação com 80% de acetona em gelo, seguido por secagem a ar). Células transfectadas foram incubadas por 1 hora, a 37°C, com PAb ou MAb. Elas foram lavadas com PBS e incubadas por 1 hora a 37°C com anticorpo secundário conjugado com FITC anti-camundongo ou anti-coelho de cabra (Nordic Immunol. Labs, The Netherlands). As células foram lavadas, montadas em glicerol, e examinadas em um microscópio de fluorescência invertida Leica.

Dois anticorpos monoclonais de camundongo dirigidos contra PV G (isótipo Dl MAb IgG 1) e vírus de pólio (C3 MAb) foram usados para manchamento de antígeno por imunofluorescência indireta (IIF). Dl MAb reconhece o sítio III de nativo, mas não G tratado com SDS e C3 Mab reconhece a região 93-103 da proteína VP1 de capsídeo PV-1. Um anticorpo policlonal neutralizante de coelho dirigido contra o vírus de pólio nativo tipo 1 foi também usado. A expressão transitória foi também avaliada após fixação com 3% de paraformaldéido (Sigma) (20 minutos de incubação em temperatura ambiente) sem permeabilização. As células fixadas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente com MAb. Elas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado com FITC anti-coelho ou anti-camundongo de cabra (Nordic Immunol.Labs, The Netherlands). As células foram lavadas, montadas em Mowiol (Sigma) e examinadas em um microscópio de fluorescência invertida.

Análise de seqüência PEST putativa. As seqüências PEST de polipeptídeo envolvidas na rápida degradação da proteína foram analisadas com o programa de computador “find-PEST”, desenvolvido de acordo com Rogers, S. et al., 1986, "Amino Acid sequences common to rapidly degraded proteins; the PEST Hypothesis”, Science 234: 364-369.

Injeção de plasmídeos em camundongos. Para estudos imunológicos, os camundongos BAB/c foram anestesiados com pentobarbital (30 mg/ kg) e 20-50 pg de plasmídeo (diluído em PBS) foi injetado em cada músculo tibial anterior. Isto foi mais efetivo do que a injeção por meio de via quadríceps (observação pessoal). Foi coletado sangue para o ensaio de anticorpo de soro em vários dias por perfuração retro-orbital.

Para estudos de proteção contra LCMV, os camundongos receberam 3, 5 pg de cardiotoxina (latoxan A.P., Les Ulis, França) em cada perna por quatro dias antes da anestesia e imunização para degenerar o músculo.

Ensaio de liberação de Interleucina-2. Catorze dias após a injeção, os baços foram removidos a partir de camundongos BALB/c injetados com plasmídeo, simples. Esplenócitos (alíquotas de 1 ml contendo 6 x 106) foram estimulados com 0,5 pg de antígeno de lissavírus (por exemplo, IPLV-PV e IPLV-EBL1) ou 5 pg de concavalina A (Miles) em placas de 24 reservatórios (Nuclon-Delta, Nunc) e preparados em cultura de acordo com procedimentos padrões em meio RPMI-1640 (Gibco) contendo 10% de FBS, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não-essenciais 1 mM, 2-mercaptoetanol 5 x 10"5, tampão de HEPES 10 mM (Flow Laboratories). As células foram incubadas por 24 horas, a 37°C, em uma atmosfera umidificada contendo 7% de CO2. Sob estas condições, células que produziam IL-2 são principalmente células CD4+. O IL-2 produzido em sobrenadantes de culturas de esplenócito foram titulados por bioensaio usando células CTLL, previamente descritas por Perrin, P. et al., 1996, "The antigen-spccific cell-mediated immune response in mice is supressed by infection with pathogenic lissavírus”, Res. Virol., 147: 289-299. A proliferação celular foi determinada em triplicata, com base na captação de H-timidina (New England Nuclear). A concentração de IL-2 foi determinada como unidades por ml (U/ml) usando IL-2 recombinante de camundongo (Genzyme Corporation, Cambridge, MA, USA) como a referência. Células CTLL foram desenvolvidas na presença de anticorpos IL-2 e IL-4 de camundongo, mas não na presença de IL-4 (até 10 U/ ml) e na ausência de IL-2. Deste modo, IL-2 foi detectado predominantemente por esta técnica.

Ensaios de Anticorpo. Para ensaio de anticorpo do soro, foi coletado sangue em vários dias por perfuração retro-orbital. IgG de raiva foram titulados por ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) usando microplacas revestidas com glicoproteína de raiva purificada. A titulação correspondeu à diluição recíproca da amostra de soro fornecendo densidade óptica equivalente a duas vezes àquela fornecida pelo soro (diluído a 1/20) de camundongos injetados com PBS. Os isótipos IgG ou IgGl, IgG2 e IgG3 de anti-raiva totais foram analisados por ELISA usando microplacas revestidas com IPRV, como previamente descrito por Perrin, P. et al., 1986. “The influence of the type of immunosorbent on rabies antibody EIA; advantages os purified glycoprotein over whole virus”, J. Biol. Standard 14: 95, com soro de isótipo IgG anti-camundongo de coelho como o anticorpo secundário (Nordic Immunol. Labs, The Netherlands) e um conjugado de peroxidase de IgG anti-coelho de cabra (Nordic Immunol. Labs, The Netherlands) como o anticorpo terciário.

Anticorpos neutralizantes de lissavírus foram titulados pelo teste de inibição de foco fluorescente rápido (RFFIT) (descrito por Smith, J. et al, 1996, “A rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) para determinar o anticorpo neutralizante de vírus”, em Laboratorv techniques in rabies. Quarta edição (Eds. Meslin, F-X; Kaplan, M. and Koprowski, H) WHO, Genebra: 181-189) com as modificações previamente descritas de Perrin, P. et al., 1986, J. Biol. Standard, 14: 95.

Sobrenadantes celulares infectados (vírus PV, CVS e EML2) e vírus purificados (vírus Mok e EBL 1) foram usados. Titulações de anticorpo anti-PV ou CVS são expressas em unidades internacionais por ml (IU/ml) usando o segundo International Standard (Statens Seruminstitut, Copenhagen, Denmark) como a referência. Para a determinação da titulação de anticorpo contra outros lissavírus, a diluição de soro causando 50% de inibição da taxa de foco fluorescente foi definida como tendo a mesma titulação de VNAb que para a referência analisada contra CVS.

Anticorpos para PV-1 foram analisados por ELISA, como previamente descrito, usando microplacas revestidas com um peptídeo sintético, constituído por um trímero de aminoácidos 93-103 de VP1. A produção de IgG anti-LCM foi também testada por ELISA.

Teste de Proteção. A atividade protetora de vacinas e plasmídeos foi determinada de acordo com o teste de potência NIH. Diluições de vacina foram injetadas intraperitonialmente (i.p.) em camundongos nos dias 0 e 7, enquanto que plasmídeos (40 pg) foram injetados em cada músculo tibial anterior apenas no dia 0. Os camundongos foram então desafiados intracerebralmente (i.c.) no dia 21 com cerca de 30 LD50 de vários lissavírus (CVS, LCMV, EBLlb, ou EBL2b). Os animais foram observados por 28 dias ou altemativamente sacrificados no dia 21 pós-desafio e amostras de sangue coletadas de modo a controlar a liberação do vírus e a produção de IgG anti-LCMV.

Exemplo 1 Expressão transitória de gene G de lissavírus Plasmídeos contendo genes G de lissavírus homogêneo (pGPV-PV), truncado (pG-PVIII), e quimérico (pGEBLl-PV, pGMOk-PV e pGPV-Mok) foram usados para transfectar células Neuro 2a. O manchamento celular por imunofluorescência indireta é relatado na Figura 2 e pode ser sumariado como se segue.

Após transfecção com pGPV-PV, o antígeno foi detectado com PV PAb (Figura 2a), PV Dl MAb (Figura 2B), ou PV E12 MAb (não mostrado), principalmente na membrana celular (resultados similares com células não-permeabilizadas, dados não-mostrados), principalmente na membrana celular (resultados similares com células não-permeabilizadas, dados não-mostrados) e muito poucos detectados com 6A IMab (Figura 2C). Células transfectadas com pG-PVIII tinham forma arredondada e completamente manchada (ambos o citoplasma e a membrana) com PV PAb (Figura 2D) ou 6A1 MAB (Figura 2F), mas não com PV Dl Mab (Figura 2E). As células transfectadas com pGEBLl-PV foram manchadas principalmente na membrana celular com PV PAb (Figura 2 G), PV Dl MAb (Figura 2 H) ou EBL-1 PAb (Figura 21). As células transfectadas com pGMok-PV foram manchadas (principalmente na membrana) com PV PAb (Figura 2J), PV Dl MAb (Figura 2K), Mok PAb (Figura 2L) e muito poucas manchadas com 6A1 MAb (Figura 2M) ou Mok PAb e de forma arredondada (Figura 2N). A transfecção celular distingue dois tipos de antígenos G: 1) manchado principalmente na membrana de células de forma normal, em particular usando MAb neutralizante dirigido para o sítio II (PV El2) e III (PV Dl); e 2) e manchadas tanto no citoplasma e na membrana de células de forma arredondada, em particular usando MAb (Al), que reconhece a molécula G desnaturada. A cinética de expressão da proteína G foi estudada mediante transfecção das células com três plasmídeos representativos: pGPV-PV (homogêneo), pGEBLl-PV (quimérico), e pG-PVIII (truncado). pGPV-PV produziram antígenos G em cerca de 60% de células quando manchadas com PV Pab, enquanto que muito poucas células foram manchadas com PV 6A1 MAb em qualquer ponto (Figura 3a). Cerca de 55% das células transfectadas com pGEBLl-PV foram manchadas com PV PAb e até 15% com 6A1 MAb (figura 3b) indicando que algumas moléculas G foram desnaturadas. Dez a vinte por cento das células transfectadas com pG-PVIII eram de forma arredondada e manchadas com PV PAb, enquanto que 5 a 10% eram positivas com 6A1 MAb, indicando que as moléculas G foram desnaturadas (Figura 3c).

Exemplo 2 Indução de células que produzem IL-2 A capacidade dos plasmídeos, pGPV-PV, pG-PVIII, pGEBL-1-PV, pGMOk-PV e pGPV-Mok para induzir células que produzem IL-2 foi analisada e os resultados estão apresentados na Figura 4. Plasmídeos com a parte do sítio III de PV, ou não-fundidos (pG-PVIII) ou com qualquer parte de sítio II de lissavírus (pGPC-PV, pGEBLl-PV e pGMok-PV) induziram eficientemente células que produzem IL-2 (240 a 550 um/ ml). Isto foi válido mesmo para PG-PVIII, que, entretanto, tinha apenas baixa eficiência tanto para a transfecção celular (vide acima) como para a indução de anticorpo (vide abaixo). Para os plasmídeos quiméricos EBL1-PV e Mok-PV, a resposta da célula T foi maior após a estimulação com PV inativado e purificado do que com os vírus EBL-lb ou Mok. Isto não se deve à qualidade dos antígenos purificados, porque a imunização de camundongos BALB/c com o vírus inativado e purificado PV, EBL-lb ou Mok, seguida por estimulação in viíro com o mesmo antígeno, induziu níveis similares de produção de IL-2 (PV: 250 um/ ml, EBL-lb: 350 um/ ml e Mok: 400 um/ ml). Em contraste, o plasmídeo pGPV-Mok induziu apenas uma fraca resposta de célula T (titulação de IL-1: 50 um/ml), que foi similarmente produzida in vitro após a estimulação com qualquer um dos vírus PV ou Mok inativados e purificados.

Exemplo 3 Ensaios Sorológicos O plasmídeo pG-PVIII truncado não induziu a produção de anticorpos contra a raiva, quando analisado por RFFIT e ELISA. Entretanto, quando IL-2 foi injetado junto com pG-PVIII, e então isoladamente 7 dias após, anticorpos foram detectados no dia 21 apenas por ELISA (dados não mostrados). Deste modo, a parte do sítio III foi expressa in vivo e induziu uma fraca produção de anticorpos não-neutralizantes, que foi reforçada por IL-2 exógeno.

Em contraste, quando a parte do sítio III de PV foi ligada com a parte do sítio II homóloga, como em pGPV-PV, ela exibiu forte imunogenicidade. Uma única injeção de plasmídeo GPV-PV nos camundongos resultou em altos níveis de VNAb, medido 27 dias após contra tanto os vírus PV e CVS homólogos como contra o víms heterólogo EBL-2b (figura 5 a). O isótopo do anticorpo induzido foi principalmente IgG 2a, mas uma fraca resposta de IgG 1 foi também observada (dados não mostrados). Entretanto, a correlação entre titulações de VNAb contra PV foi mais forte com a titulação de IgG 2a (r = 0, 974) do que com IgG 1 (r= 0, 71), indicando que VNAb induzido por imunização à base de DNA foram principalmente IgG 2a. A titulação de VNAb contra os vírus PV e CVS homólogos aumentaram quando os camundongos receberam uma injeção de reforço no dia 30 e os seus soros foram verificados no dia 40, mas não as titulações de VNAb contra o vírus EBL- 2b heterólogo, que permaneceu inalterada (Figura 5 a). Nestas condições, foi também demonstrada uma relação entre o nível de VNAb induzido por pGPV-PV e a proteção de camundongos contra um desafio i.c. com CVS; todos os animais com uma titulação de VNAb (no dia 20) acima de 1,5 IU/ml sobreviveram ao desafio no dia 21 (não mostrado). Em contraste, nenhuma quantidade significativa de VNAb contra EBL- lb foi produzida após uma injeção única ou após um reforço.

Deste modo, investigamos a capacidade da parte do sítio III de PV para portar a parte do sítio II de EBL 1 heterólogo, seguindo a nossa observação prévia de que o plasmídeo quimérico pGMOk-PV induziu VNAb contra os vírus PV e Mok. Uma única injeção do plasmídeo quimérico pGEBL-1 induziu similarmente VNAb contra ambos os vírus PV e EBL -lb (figura 5b). Catorze dias após a injeção, as titulações foram de 2 IU/ ml e elas aumentaram para 17 IU/ ml após 80 dias. O nível de produção de VNAb contra EBL-lb foi sempre mais alto do que aquele contra PV, mas a diferença não foi significativa.

Tomados conjuntamente, estes resultados demonstram claramente que os genes G quiméricos, que codificam a parte de sítio III de PV e a parte de sítio II de G, ou de outros lissavírus, tais que EBL-1 ou Mok, são indutores muito potentes de VNAb contra ambos os vírus de origem. Em contraste, o constructo GPV-Mok simétrico não induziu VNAb contra os vírus PV ou Mok (não mostrado).

Exemplo 4 Ensaios de proteção contra lissavírus Europeus Testamos a capacidade de ambos o plasmídeo pGPV-PV homogêneo e o pGEBLl-PV quimérico para induzir proteção contra um desafio i.c. com vírus, que representam os genótipos de lissavírus envolvidos na transmissão de encefalomielite na Europa (CVS para GT1, EBLlb para GT5, e EBL2b para GT6). Comparamos a sua eficiência com aquela de uma vacina comercialmente disponível (cepa PM: GT1) e uma preparação laboratorial (cepa PV: GT1) (Figura 6). A espinha dorsal do plasmídeo (pClneo) não induziu proteção contra qualquer vírus (Figura 6d, e e f). Em contraste, pGPV-PV protegeu 70% dos camundongos BALB/c (e 85% dos Suíços) contra CVS (Figura 6d), 30% contra EBL lb (Figura 6e), e 72% contra EBL2b (Figura 6 f). Nas mesmas condições, pGEBLl-PV protegeu 60% dos camundongos BALB/c contra CVS (Figura 6d), 75% contra EBLlb (Figura 6e) e 80% contra EBL2b (figura 6f). Deste modo, se a imunização com qualquer dos plasmídeos não apresentasse diferença significativa na proteção contra CVS (GT1) e EBL2b (GT6), o pGEBLl-PV quimérico era muito mais eficiente contra EBLlb (GT5) e é evidentemente o melhor candidato para a proteção com imunização à base de DNA contra os genótipos de lissavírus Europeus.

No que se refere à proteção induzida por vacinas de cultura celular inativadas usando as cepas PM e PV contra os mesmos desafios: uma dose humana de vacina de PM diluída a 1/ 10 protegeu 80% dos camundongos contra CVS (Figura 6 a), 36% contra EBL1 b (Figura 6b), e 80% contra EBL 2b (Figura 6c), Sob as mesmas condições, 2 pg de PV IPRV protegeu 100% dos camundongos tanto contra CVS (Figura 6 a), como contra EBL lb (Figura 6b) e 85% contra EBL2b((Figura 6c). Parece que para uma dose de vacina, que protegeu 80 a 85% dos animais contra EBL2b, a cepa PV protegeu 100% e a cepa PM apenas 36% contra EBL lb. Deste modo, a cepa PM é menos eficaz do que a cepa PV contra EBL lb.

Exemplo 5 Proteção transitória de genes G de lissavírus Plasmídeos contendo o antígeno estranho, que codifica as seqüências associadas com os genes de lissavírus truncado (pG-PVIII) ou quimérico (pGEBLl-PV) foram testados quanto à sua capacidade para transfectar transitoriamente células Neuro 2a. Exceto quanto a pG(B-CTL)2-PVIII, que induziu um manchamento IIF (no citoplasma) apenas após a permeabilização, todos os plasmídeos induziram a expressão de antígenos relacionados a lissavírus e a vírus de pólio na membrana celular de células não-permeabilizadas, como previamente relatado para alguns plasmídeos sem epítopos estranhos.

Para ilustração, os resultados de transfecção obtidos com pGEBLl-(B-CTL)2-PV são relatados na Figura 7. Ambas a parte G de vírus da raiva reconhecida por PV Dl MAb (Figura 7A) e a inserção de vírus de pólio reconhecida ou pelo C3 MAb(Figura 7B) ou pelo vírus antipólio tipo 1 PAb (Figura 7C) foram evidenciadas, enquanto que não foi observado manchamento com os mesmos MAb ou PAb em células transfectadas com Pclneo (Figura 7D). Isto indica claramente que, exceto quanto a pG(B-CTL)2-PVIII, a glicoproteína quimérica pGEBLl-PV permitiu a expressão do epítopo da célula B de vírus de pólio isoladamente ou em associação com o epítopo de célula LCMV CTL na membrana da superfície celular sob uma forma nativa, enquanto que a expressão do lissavírus G foi mantida.

Exemplo 6 Imunogenicidade de epítopos estranhos portados pela glicoproteína truncada O gene pGPVIII truncado foi usado para portar e expressou a célula C3 VP1 B e os epítopos LCMV CD8* CTL em camundongos após imunização à base de DNA.

Enquanto o gene pGPVIII induziu célula que produziam IL-2, que podem ser estimuladas in vitro por IPRV 21 dias após a injeção, não foi observada produção após 14 dias (Figura 8 A). Entretanto, uma produção significativa foi observada com pG(B-CTL)2-GPVIII após 14 dias (Figura 8 A). Isto indica que a fusão de epítopos estranhos com GPVIII aumenta significativamente a produção de células Th dirigidas à parte do sítio III de G de raiva.

Embora pGPVIII não tenham induzido anticorpo anti-raiva na ausência de IL-2 exógeno (Figura 9), o estudo cinético do anticorpo induzido por pG (B-CTL)2-GPVIII demonstrou que ocorreu produção significativa de anticoipo contra ambos o peptídeo de vírus de pólio e G de raiva (Figura 9). isto também indica que a fusão de epítopos estranhos com GPVIII aumenta significativamente a produção de anticorpo dirigido à parte do sítio III de G de raiva PV. Além disso, o GPVIII truncado foi capaz de portar e permitir a expressão do epítopo de célula B de vírus de pólio in vivo com produção de anticorpo. A produção de anticorpos induzida por p(B-CTL)2-GPVIII contra um peptídeo de vírus de pólio foi também testada após iniciação ou com pGPVIII ou com p(B-CTL)2-GPVIII em si mesmo (Figura 10). Quando p(B-CTL)2-GPVIII foi injetado sem iniciação e controlado 13 dias (PBS/ p (B-CTL)2-GPVIII-D26) ou 39 dias após (p-(BCTL)2- GPVIII-DO-), a titulação de anticorpo de peptídeo foi de 65 e 80, respectivamente. Entretanto, se fosse efetuada uma iniciação com pGPVIII ou p (B-CTL)2-GPVIIK a titulação era de 200 e 600, respectivamente. Isto demonstra claramente, que os dois tipos de iniciação aumentaram a produção de anticorpo contra um peptídeo de vírus de pólio.

Exemplo 7 Imunogenicidade de epítopos estranhos portados pela glicoproteína quimérica A imunogenicidade de ambos os epítopos de célula T B e CD8 e a conseqüência de sua inserção sobre a imunogenicidade da proteína quimérica foram analisados de acordo com as respostas imunes medidas por célula e humoral após imunização à base de DNA. Quando os epítopos foram inseridos no plasmídeo pGEBLl-PV quimérico, a indução de células que produzem IL-2, capazes de serem estimuladas por IPLV dependeu dos epítopos inseridos. Dois tipos de resultados foram obtidos, e são apresentados na Figura 8B: i) produção de IL-2 induzida por pGEBLl-(B-CTL)2-PV, pGEBLl-(CTL-B)-PV, e p GEBL1- (CTL)-PV foi similar àquela induzida por pGEBLl-PV; e ii) a produção de IL-2 induzida por pGEBLl-(B-CTL)-PV (dados não mostrados) e pGEBLl-(B)-PV foi inibida. Conseqüentemente, parece que o G EBL1-PV quimérico por portar epítopos de célula T B e CD8 estranhos, sem efeitos negativos sobre a sua capacidade para induzir células que produzem IL-2. Entretanto, no que se refere ao epítopo de célula B, um efeito de posição foi observado, pois a sua inserção imediatamente atrás da sequência EBL1 foi deletéria para a introdução de células auxiliares T estimuladas pelo lissavírus G. Entretanto, este fenômeno não foi evidenciado com pGEBL-1 -(B-CTL)rPV. ί A inserção de epítopos estranhos em pGEBL 1-PV foi também estudada quanto à sua conseqüência sobre a indução de anticorpos contra o peptídeo de vírus de pólio e VNAb contra ambos os lissavírus PV e EBL1 (Tabela 1). Os quatro plasmídeos contendo epítopo de célula B (pGEBL 1-(B)-PV, p GEBL1 -(CTL_B)-PV, pGEBLl(B-CTL)rPV, e pGEBL 1-(B-CTL)-PV) induziram anticorpo contra o peptídeo de vírus de pólio. Entretanto, quando o epítopo de célula B seguiu a sequência de EBL1 (pGEBL 1-(B-CTL)-PV e pGEBL l-(B)-PV), a produção de anticorpo foi mais fraca do que quando o epítopo B foi separado pelo epítopo de célula CDS (p GEBLl-(CTL-B)-PV). Os resultados para p GEBL1-(B-CTL)2-PV foram intermediários. A inserção de epítopos estranhos induziu um decréscimo de produção de VNAb de anti-lissavírus, mas foi mantido em um alto nível quando os animais foram injetados compGEBLl-(CTL)-PV ou pGEBLl-(CTL-B)-PV. Entretanto, quando o epítopo de célula B foi inserido imediatamente atrás da sequência EBL1, não foi observada uma produção tão grande de VNAb de anti-lissavírus.

Em resumo, o EBL1-PV de G quimérico pode portar e permitir a expressão in vivo de ambos os epítopos de célula B de neutralização de lissavírus de vírus de pólio, mas a presença do epítopo de célula de célula B de vírus de pólio imediatamente atrás da seqüência EBL1 (exceto quanto à inserção de (B-CTL)2 é deletéria para a imunogenicidade de ambas a parte de sítio II e de sítio III da glicoproteína quimérica. Por outro lado, quando epítopos estranhos foram fundidos com G PVIII truncado, ambas a produção de anticorpo não-neutralizante e de auxiliador T podem ser induzidas.

Exemplo 8 Proteção contra uma dose letal de LCMV

Como o epítopo de célula T CD8 está envolvido na proteção contra LCMV, o G truncado e quimérico, que porta o epítopo de célula T LCMV CD8* foi testado quanto à sua atividade protetora (Tabela 2). O p(B-CTL)2-GPVIII truncado induziu apenas uma proteção parcial. Quando os epítopos de célula T B e CD8 foram inseridos no GEBL1-PV quimérico, uma proteção significativa foi observada com o pGEBLl-(CTL-B)-PV contra um desafio letal com LCMV (70% dos camundongos sobreviveram). Sob estas condições, os animais sobreviventes eliminaram completamente o vírus quando controlados por RT-PCR 21 dias pós-infecção (dados não mostrados). Isto indica que o G quimérico é muito potente para portar um epítopo de célula CD8 protetor. Entretanto, como para as respostas imunes de anti-lissavírus e vírus de pólio, a inserção do epítopo de célula B de vírus de pólio imediatamente atrás da sequência EBL1 induziu uma inibição da atividade protetora do seguinte epítopo de célula CD8.

Exemplo 9 Seqüência PEST Putativa Como um efeito de posição deletério foi claramente observado quanto à posição d inserção do epítopo de célula B antes ou após o epítopo de célula CTL, a presença de seqüências PEST putativas nos diferentes plasmídeos foi analisada (Figura ld). Apenas dois plasmídeos (pGEBLl-(B)-PV e pGEBLl-(B-CTL)2-PV) continham seqüências PEST putativas devido à junção da extremidade das seqüências de epítopo de células B e EBL1. Entretanto, a substituição da serina (S) em pGEBLl-(B-CTL)2-PV por uma leucina (L) empGEBLl(B)-pV reduziu o valor PEST de + 8,38 para + 4, 20. Exemplo 10 Desafio e imunização de cachorro Cachorros da raça Beagle na idade de 4 a 8 anos foram designados a quatro grupos experimentais (Tabela 3). Eles foram mantidos em gaiolas isoladas e alimentados com ração comercial (400 g cada dia). Foi-lhes injetado intramuscularmente na coxa ou 100pg de plasmídeo (grupo A, B e C) ou PBS (grupo D). O plasmídeo foi injetado em um lado no dia 0, 21, 42 e 175 (grupo A) ou no dia 0 e 175 (grupo C). Foi-lhes também injetado em três sítios (3 x 33 pg) nos dias 0, 21, 42, e 175 (grupo B). Foram coletadas amostras de sangue (de perfuração de veia) nos dias 0, 28, 49, 70, 120, 175 e 189.

Anticorpos de neutralização de lissavírus foram titulados pelo teste de inibição de foco fluorescente rápido (RFFIT) com as modificações previamente descritas de (28 dos cachorros) usando célula de víms PV, CVS ou FWR. Titulações de anticorpo neutralizante Anti-PV, CVS, ou FWR são expressas em unidades internacionais por ml (IU/ ml) usando o 2o Padrão Internacional (Statens Seruminstitut, Copenhagen, Dinamarca) como a referência ou como a diluição de soro recíproca, que inibe 50% do foco fluorescente. Sob estas condições, uma titulação de 40, 70 ou 60 (diluição de soro recíproca) foi equivalente a 0,5 IU/ ml contra PV, CVS ou FWR, respectivamente.

Como mostrado na Figura 11, um anticorpo neutralizante de vírus (VNAb) pode ser induzido pelo plasmídeo contendo o gene que codifica os grupos de proteína G (A, B, e D), enquanto que não foi detectado anticorpo em animais injetados com PBS (grupo D), seja qual for o protocolo de injeção. Níveis aumentados de VNAb foram obtidos após uma injeção e um reforço no dia 21 (grupo A) e no dia 175 (grupo C). Como a soroconversão ocorre para 0,5 IU/ml, pode ser concluído que todos os animais foram soroconvertidos. Além disso, de acordo com a literatura, pode ser também concluído que todos os cachorros injetados com plasmídeo estão protegidos contra um desafio de vírus da raiva.

Estes resultados são representativos e a dosagem pode ser extrapolada para outros animais suscetíveis à raiva, incluindo humanos. Exemplo 11 PG-PVIII como um portador para proteína estranha: domínio P. falciparum mediando a adesão a sulfato de condroitina A: um receptor para infecção placentária humana. A malária durante a gravidez causa uma alta taxa de morte fetal e neonatal. A suscetibilidade decrescente durante as gestações subseqüentes está correlacionada à aquisição de anticorpos, que bloqueiam a ligação de células vermelhas infectadas a sulfato de condroitina A (CSA), um receptor para parasitas na placenta. Recentemente, os inventores identificaram um domínio dentro de uma proteína de membrana-1 de eritrócito de Plasmodium falciparum (PfEMP-1), que liga CSA (Buffet et al. P. falciparum domain mediating adhesion to chondroitin sulfate A: A receptor for human placental infection (1999) P. N. A. S. 96: 12743-12748). Os inventores clonaram um gene var expresso em células sanguíneas vermelhas parasitadas com ligação de CSA (PRBCs). O gene possuía oito domínios tipo receptor, e os inventores demonstraram que o domínio tipo ligação de Duffy (DBL) denominado CSA ligado por DBL-3 exibe a mesma especificidade de ligação que os PRBCs.

Como os anticorpos protetores presentes após a gravidez bloqueiam a ligação a CSA de parasitas de diferentes partes do mundo, o DBL-3, embora variante, pode induzir imunidade reativa cruzada, que irá proteger a mulher grávida e os seus fetos. Deste modo, o domínio DBL-3 se toma um candidato como uma vacina para mulheres grávidas na África. O domínio DBL-3 contém um número de cisteínas, que parecem ser cruciais para a dobra correta da região de ligação de CSA. Esta dobra pode, mais provavelmente, não ser alcançada em sistemas de expressão bacterianos (dados não-publicados). Uma abordagem importante para induzir anticorpos capazes de interferir com a ligação de CSA de eritrócitos infectados é o de aplicar uma estratégia de vacina de DNA usando o domínio DBL-3 fundido à parte PV III da raiva. A parte PVIII da glicoproteína da raiva foi demonstrada como promovendo uma função auxiliadora eficiente. A invenção foi descrita em detalhe acima com referência a modalidades preferidas. Entretanto, será entendido pelo perito ordinário que várias modificações e variações podem ser introduzidas na prática da presente invenção, sem que haja afastamento do escopo ou espírito da invenção. Todas as referências aqui citadas são aqui incorporadas, a título referencial, em sua totalidade. TABELA 1. Produção de anticorpo induzida pelo plasmídeo pGEBL-lPV quimérico, que porta várias combinações de epítopos estranhos de célula T B e CD8* A TABELA 1 mostra a produção de anticorpo induzida pelo plasmídeo pGEBLl-PV quimérico, que porta vários epítopos estranhos. Camundongos BALB/c (três para cada plasmídeo) foram injetados com 50pg de vários plasmídeos em cada músculo tibial. Os soros foram analisados no dia 21 quanto à raiva ou anticorpo neutralizantes de vírus EBL1 pelo método RFFIT (titulação expressa em IU/ml) e quanto a anticorpo anti-peptídeo de vírus de pólio por ELISA. Os resultados são expressos como a titulação média, e os desvios padrões estão relacionados entre parênteses. TABELA 2. Proteção induzida pelo pGPVIII truncado e pelo plasmídeo pGEBLl-PV quimérico, que codifica o epítopo LCMV CD8+.

Plasmídeo Injetado/ Animais Sobreviventes (%) A TABELA 2 mostra a proteção induzida pelo plasmídeo pGEBLl-PV quimérico, que porta os epítopos LCMV CD8+. Camundongos BALB/c (três para cada plasmídeo) foram injetados com 40 pg de vários plasmídeo e desafiados i.c. no dia 21. O percentual de animais sobreviventes está relacionado entre parênteses. TABELA 3: Características do cachorro e protocolo de injeção * M: macho; F: fêmea ** Descartado no dia 160 (doente) REIVINDICAÇÕES

Claims (3)

1. Molécula de veículo, caracterizada pelo fato de conter uma seqüência de polinucleotídeo quimérica, em que a referida seqüência de polinucleotídeo quimérica é um plasmídeo pG-PVIII compreendendo uma seqüência que codifica uma parte de uma glicoproteína de lissavírus, que contém, pelo menos, o sítio III da glicoproteína de lissavírus, mas não contém o sítio II, e que compreende ainda uma seqüência que codifica um ou mais determinantes antigênicos heterólogos diferente de um determinante antigênico de um lissavírus inserido(s) na região de articulação.

2. Molécula de veículo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito determinante antigênico é um antígeno tumoral, ou um seu epítopo.

3. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de veículo como definida na reivindicação 1 ou 2.