BR122020022788B1

BR122020022788B1 - Polipeptídeo quimérico, composição imunogênica e uso de um polipeptídeo quimérico

Info

Publication number: BR122020022788B1
Application number: BR122020022788-5A
Authority: BR
Inventors: Frédéric Tangy; Marianne Lucas-Hourani; Erika Navarro-Sanchez; Marie-Pascale Frenkiel; Hugues Bedouelle; Chantal Combredet; Philippe Despres
Original assignee: Centre National De La Recherche Scientifique; Institut Pasteur
Priority date: 2005-06-20
Filing date: 2006-06-20
Publication date: 2021-09-21
Also published as: WO2006136697A2; CA2549086A1; BRPI0613362A8; CA2508266A1; EP1893228A2; BRPI0613362A2; CA2611924A1; US20100226924A1; US20170121375A1; US20120201825A1; BRPI0613362B1; WO2006136697A3; CN101257917B; EP1893228B1; DK1893228T3; US8337857B2; US9579375B2; MX2007015911A; CN101257917A; US20150071963A1

Abstract

a presente invenção trata da construção de um polipeptídeo quimérico útil na prevenção ou no tratamento de uma infecção por flaviviridae. a presente invenção trata também do uso do polipeptídeo quimérico na elaboração de vetores virais recombinantes, tal como o vetor viral vivo do sarampo.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção trata da construção de um polipeptídeo quimérico útil na prevenção ou no tratamento de uma infecção por Flaviviridae. A presente invenção trata também do uso do polipeptídeo quimérico na elaboração de vetores virais recombinantes, tais como um vetor viral vivo do sarampo para agir como vacina.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os flavivírus (família dos Flaviviridae) são vírus com envelope cujo genoma é uma molécula de RNA de polaridade positiva. O flavivirion é composto de três proteínas estruturais designadas C (proteína do núcleo), M (proteína de membrana) e E (proteína de envelope). A proteína E que está exposta na superfície do vírus é responsável pelas funções biológicas principais do vírion que incluem a ligação do vírus e a fusão membranar específica. A tradução do RNA genômico produz uma poliproteína precursora que é clivada simultaneamente por proteases celulares e virais para gerar as proteínas virais individuais: três proteínas estruturais C, prM (o precursor glicosilado da proteína M), E, e sete proteínas não estruturais NS1 a NS5. A replicação dos flavivírus é realizada no citoplasma das células infectadas. Os flavivírus possuem ciclos de transmissão naturais complexos que envolvem diversos hospedeiros naturais (em sua maior parte mamíferos e pássaros) e vetores, e estes últimos são artrópodes hematófagos, tais como carrapatos e mosquitos. Esses vírus são a causa principal de doenças humanas severas tais como manifestações hemorrágicas ou sintomas meningoencefalíticos. O vírus da dengue (DEN) é um dos dois principais flavírus reconhecidos como causa de doenças hemorrágicas severas no mundo inteiro.

[003] A dengue é uma doença emergente e uma preocupação de saúde pública. Há mais de 50 anos, vêm sendo desenvolvidos candidatos a vacinas vivos- atenuados contra os quatro serotipos do vírus da dengue. A busca de uma vacina é dificultada pela ausência de um modelo animal que reproduza a doença causada pelo vírus da dengue, ou seja a febre hemorrágica da dengue e a síndrome de choque associada a ela. A eficácia das vacinas pode ser avaliada no camundongo por meio de uma cepa neurovirulenta do vírun DEN adaptada ao camundongo, que mata os animais adultos após uma inoculação intracerebral. Entretanto, os estudos baseados nesse tipo de modelos murídeo não refletem a atividade dos vírus da dengue no homem. No macaco, a proteção só pode ser demonstrada pela medida da redução de viremia após uma prova infecciosa experimental. Assim, o teste final para uma vacina contra a dengue deve se basear em ensaios clínicos realizados no homem. A maior parte dos candidatos a vacinas atenuados que foram desenvolvidos nesses últimos 50 anos foram excessivamente reatogênicas ou insuficientemente imunogênicas nos ensaios clínicos. Diversos candidatos tetravalentes atenuados estão sendo hoje objeto de ensaios clínicos de fase I ou II. A dificuldade no desenvolvimento desse tipo de vacina vivos-atenuados tetravalente parece ser a obtenção uma mistura equilibrada das quatro valências a fim de gerar uma imunidade protetora contra os quatro sorotipos.

[004] Diversos candidatos a vacinas quiméricas vivas estão também em fase de desenvolvimento. Eles se baseiam na troca de genes estruturais homólogos entre diferentes flavivírus. Diversos tipos de vírus quiméricos intertípicos foram construídos e testados no camundongo ou no macaco. Vírus quiméricos foram construídos com a tecnologia Chimerivax®baseada no vírus vacinal da febre amarela (YF-17D). Misturas tetravalentes dessas quimeras YF- 17D/DEN foram testadas no macaco rhesus. Nesse caso também, o equilíbrio entre os quatro vírus quiméricos é difícil de obter para uma imunização uniforme. Um ensaio clínico de fase I/II está atualmente em preparação para testar uma vacina Chimerivax-dengue 2. Outras abordagens incluem candidatos a vacinas subunitários produzidos a partir de um vetor de expressão, e candidatos de tipo DNA nu que estão em desenvolvimento pré-clínico. Assim, o desenvolvimento de uma vacina tetravalente contra o vírus da dengue continua a ser um problema não resolvido, um dos mais importantes na lista da Organização Mundial de Saúde.

[005] Existe, portanto, a necessidade de desenvolver novos candidatos a vacina eficazes, fáceis de produzir e de formular para a prevenção ou o tratamento de uma infecção por um vírus da família dos Flaviviridae como o vírus da Dengue.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção trata de um polipeptídeo quimérico e suas aplicações na prevenção ou no tratamento de uma infecção por Flaviviridae.

[007] Mais particularmente, a presente invenção tem por objeto um polipeptídeo quimérico que compreende um peptídeo de subdomínio da proteína E de Flaviviridae ligado ao peptídeo do subdomínio da proteína de membrana M de Flaviviridae.

[008] A presente invenção tem também por objeto um polinucleotídeo isolado ou purificado que codifica para um polipeptídeo quimérico de acordo com a presente invenção.

[009] A presente invenção tem também por objeto um vetor viral recombinante do sarampo em cujo genoma está inserido um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção.

[010] A presente invenção tem também por objeto anticorpos monoclonais ou policlonais purificados que reconhecem especificamente pelo menos o polinucleotídeo definido anteriormente e/ou o polipeptídeo quimérico da presente invenção.

[011] A presente invenção trata também do uso de um vetor viral de acordo com a presente invenção para a preparação de uma composição imunogênica destinada à prevenção ou ao tratamento de uma infecção por Flaviviridae em uma espécie sensível.

[012] A presente invenção visa também vetores de clonagem ou expressão que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção.

[013] De acordo com outro objeto, a presente invenção propõe uma composição imunogênica destinada à prevenção e/ou ao tratamento de uma infecção por Flaviviridae em uma espécie sensível, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um dos seguintes elementos: - um polipeptídeo quimérico tal como definido anteriormente; - um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção; - um vetor viral recombinante de acordo com a presente invenção; - um anticorpo de acordo com a presente invenção; e - um vetor de clonagem e/ou de expressão de acordo com a presente invenção.

[014] A presente invenção propõe também um método de prevenção e/ou de tratamento de uma infecção por Flaviviridae em uma espécie sensível que compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de pelo menos um dos seguintes elementos: - um polipeptídeo quimérico tal como definido anteriormente; - um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção; - um vetor viral recombinante de acordo com a presente invenção; - um anticorpo de acordo com a presente invenção; e - um vetor de clonagem e/ou de expressão de acordo com a presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[015] A Figura 1 mostra uma descrição de 384 nucleotídeos (nt) que codificam o domínio (EDIII)DV1 da cepa viral FGA/89 fundida com o dipeptídeo Arg-Ser com o peptídeo sinal de calreticulina (ssCRT) intercalada entre dois sítios BsiWI (em 5’) e BssHII (em 3’) necessários à inserção no vetor MWShew-.

[016] A Figura 2 mostra a sequência de 516 nucleotídeos (nt) que codificam a proteína de fusão [EDIII + M1-40] da cepa viral FGA/89 fundida com o dipeptídeo Arg-Ser com o peptídeo sinal de calreticulina (ssCRT) intercalada entre dois sítios BsiWI (em 5’) e BssHII (em 3’) necessários à inserção no vetor MWSchw-.

[017] A Figura 3 mostra células Vero infectadas com vetores virais recombinantes do sarampo. Multiciplicidade de infecção de 10 TCIP50 / célula para 30 h. Imunofluorescência realizadas com um anticorpo específico anti-DVI HMAF.

[018] A Figura 4 mostra a expressão e a secreção dos domínios antigênicos [EDIII]DV-1 e [EDIII+M1-40]DV-1 nos lisados citoplásmicos (C) e os sobrenadantes (S) de células Vero infectadas pelos vírus recombinados MVSchw-DV-1.

[019] A Figura 5 mostra a expressão e a secreção dos domínios antigênicos [EDIII]DV-1 e [EDIII+M1-40]DV-1 nos sobrenadantes filtrados e concentrados de células de drosófila S2 que expressam de modo indutível esses antígenos.

[020] A Figura 6 mostra uma sequência nucleotídica que codifica para um peptídeo quimérico de acordo com um modo preferido da presente invenção.

[021] A Figura 7 mostra uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo quimérico de acordo com um modo preferido da presente invenção, bem como a sequência nucleotídica que o codifica.

[022] A Figura 8 mostra uma sequência de aminoácidos de um dímero do ectodomínio III (EDIII) de acordo com um modo preferido da presente invenção, bem como a sequência nucleotídica que o codifica.

[023] A Figura 9 mostra uma sequência de aminoácidos de um dímero do ectodomínio III (EDIII) de acordo com um modo preferido da presente invenção, bem como a sequência nucleotídica que o codifica.

[024] A Figura 10 mostra uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo quimérico de acordo com um modo preferido da presente invenção, bem como a sequência nucleotídica que o codifica.

[025] A Figura 11 mostra uma sequência de aminoácidos do ectodomínio III (EDIII) de acordo com um modo preferido da presente invenção, bem como a sequência nucleotídica que o codifica.

[026] A Figura 12 mostra uma sequência de aminoácidos de um dímero do ectodomínio III (EDIII) de acordo com um modo preferido da presente invenção, bem como a sequência nucleotídica que o codifica.

[027] A Figura 13 mostra uma sequência de ácidos nucléico que codificam para um peptídeo do ectodomínio III (EDIII) de acordo com um modo preferido da presente invenção.

[028] A Figura 14 mostra uma sequência nucleotídica que codifica para um peptídeo quimérico de acordo com um modo preferido da presente invenção.

[029] As Figuras 15 a 19 mostram uma sequência de aminoácidos de peptídeos quiméricos de acordo com um modo preferido da presente invenção.

[030] As Figuras 20 a 24 mostram uma sequência nucleotídica que codifica respectivamente para os polipeptídeos quiméricos ilustrados nas figuras 15 a 19.

[031] As Figuras 25 a 29 mostram respectivamente um esquema representativo dos polipeptídeos quiméricos ilustrados nas figuras 15 a 19.

[032] A Figura 30 mostra a sequência peptídica da sequência apoptoM de quatro sorotipos do vírus da Dengue utilizados na construção de um polipeptídeo quimérico de acordo com a presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[033] A originalidade da presente invenção consiste na construção de um polipeptídeo quimérico e suas aplicações na prevenção ou no tratamento de uma infecção por Flaviviridae. Por “Flaviviridae”, entende-se um vírus selecionado no grupo constituído pelo vírus do Nilo Ocidental, da dengue, da encefalite japonesa e da febre amarela.

1. POLIPEPTÍDEO E POLINUCLEOTÍDEO

[034] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção trata de um polipeptídeo de subdomínio da proteína E Flaviviridae ligado a um peptídeo de subdomínio da proteína de membrana M de Flaviviridae. A presente invenção tem também por objeto um polipeptídeo que consiste nos referidos peptídeos.

[035] Por “polipeptídeo”, entende-se, de acordo com a presente invenção, designar indiferentemente proteínas ou peptídeos. Por “peptídeo quimérico”, entende-se qualquer proteína ou peptídeo que compreende subpartes de diferentes origens, por exemplo um polipeptídeo A proveniente de uma primeira espécie e um polipeptídeo (proteína ou peptídeo) proveniente de uma segunda espécie. Uma proteína ou um peptídeo é também considerado um polipeptídeo quimérico se compreender subpartes provenientes de diferentes proteínas ou peptídeos de uma mesma espécie, ou então de uma mesma proteína ou peptídeo de diferentes espécies.

[036] De preferência, o peptídeo do subdomínio da proteína E consiste no ectodomínio III que compreende uma sequência de aminoácidos tal como definida em qualquer uma das seguintes sequências: - aminoácidos 19 a 120 da SEQ ID NO : 1; - aminoácidos 19 a 119 da SEQ ID NO : 3; - aminoácidos 21 a 123 da SEQ ID NO : 6; - aminoácidos 21 a 121 da SEQ ID NO : 12; e - aminoácidos 21 a 123 da SEQ ID NO : 14.

[037] Mais particularmente, o peptídeo de subdomínio da proteína E consiste em um dímero do ectodomínio III dos vírus da Dengue 1, 2, 3 ou 4 que compreende uma sequência de aminoácidos tal como definida em qualquer uma das seguintes sequências: - aminoácidos 21 a 262 da SEQ ID NO : 8; - aminoácidos 21 a 262 da SEQ ID NO : 10; e - ou um tetrâmero do ectodomínio III dos vírus da Dengue 1, 2, 3 e 4 que compreendem uma sequência que vai do aminoácido 21 a 494 da SEQ ID NO : 16 ou que vai do aminoácido 18 a 429 da SEQ ID NO : 24.

[038] No que diz respeito ao peptídeo do subdomínio da proteína M, ele consiste em particular no ectodomínio 1-40 que compreende uma sequência de aminoácidos que vai da posição 123 a 170 da SEQ ID NO : 3 ou na sequência apoptoM que compreende uma sequência de aminoácidos que vai da posição 154 à 170 da SEQ ID NO : 3 ou que vai da posição 122 a 132 da SEQ ID NO 12.

[039] De acordo com um modo preferido, o polipeptídeo quimérico da presente invenção compreende ainda um segmento de ligação que liga o peptídeo de subdomínio da proteína E ao peptídeo de subdomínio da proteína M. O referido segmento de ligação é de preferência um pentapeptídeo que tem por sequência: RRDKR ou RREKR.

[040] De modo particularmente preferido, o polipeptídeo quimérico de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos tal como definida em qualquer uma das seguintes sequências: a) - aminoácidos 19 a 172 da SEQ ID NO : 3; b) - aminoácidos 21 a 168 da SEQ ID NO : 6; c) - aminoácidos 21 a 132 da SEQ ID NO : 12; d) - aminoácidos 18 a 624 da SEQ ID NO : 20; e) - aminoácidos 18 a 609 da SEQ ID NO : 21 f) - aminoácidos 18 a 624 da SEQ ID NO : 22; g) - aminoácidos 18 a 489 da SEQ ID NO : 23; e h) - aminoácidos 21 a 474 da SEQ ID NO : 24.

[041] A presente invenção trata também dos polipeptídeo (e os fragmentos desses polipeptídeos) que são codificados pelas sequências nucleotídicas mencionadas a seguir.

[042] De modo particularmente preferido, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção apresenta uma porcentagem de identidade de pelo menos 80% depois do alinhamento ótico com uma sequência tal como definida em qualquer uma das sequências de ácidos aminados a) a h) definidas acima, de preferência, de pelo menos 90% , mais preferencialmente de pelo menos 98% e mais preferencialmente ainda de pelo menos 100%.

[043] De acordo com um aspecto conexo, a presente invenção trata de um polinucleotídeo isolado ou purificado que codifica para um polipeptídeo quimérico tal como definido anteriormente.

[044] Por “isolado ou purificado”, entendem as moléculas cujo estado natural foi modificado pelo homem, ou seja, se essas moléculas existem na natureza, elas foram mudadas e/ou retiradas de seu ambiente inicial. Por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo naturalmente presente e que se encontra no ambiente biológico do organismo vivo que o expressa não é, nesse contexto, “isolado”. Todavia, o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo quando separado de seu ambiente natural e/ou obtido por clonagem, amplificação e/ou síntese química é considerado de acordo com a presente invenção como “isolado”. Por outro lado, um polinucleotídeo ou polipeptídeo que é introduzido em um organismo por transformação, manipulação genética ou por qualquer outro método de recombinação é “isolado” mesmo que esteja presente no referido organismo.

[045] Por sequência nucleotídica, ácido nucléico, sequência nucléica ou de ácido nucléico, polinucleotídeo, oligonucleotídeo, sequência de polinucleotídeo, termos que serão utilizados indiferentemente na presente invenção descrição, designa-se um encadeamento preciso de nucleotídeos, modificados ou não, que permite definir um fragmento ou uma região de um ácido nucléico, que comporta ou não nucleotídeos não naturais, e que pode corresponder tanto a um DNA de filamento duplo, um DNA de filamento simples como produtos de transcrição dos referidos DNAs. Assim, as sequências nucléicas de acordo com a presente invenção englobam igualmente os PNA (Peptid Nucleic Acid), ou análogos. Os fragmentos dos polinucleotídeos da presente invenção compreendem pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos. De preferência, eles compreendem pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos e mais preferencialmente ainda, eles compreendem pelo menos 30 nucleotídeos consecutivos.

[046] A presente invenção tem também por objeto fragmentos de polinucleotídeos que consistem em fragmentos de 15, 20 ou 30 nucleotídeos sucessivos.

[047] Todo polinucleotídeo que foi modificado química, enzima ou metabolicamente, mas que conservou as propriedades bioquímicas do polipeptídeo quimérico de origem pertence ao âmbito da presente invenção.

[048] De acordo com um modo de realização preferencial, o polinucleotídeo da presente invenção, quando codifica para um polipeptídeo quimérico de acordo com a presente invenção, compreende vantajosamente uma sequência nucleotídica tal como definida em qualquer uma das seguintes sequências: a) nucleotídeos 7 a 492 da SEQ ID NO : 4; b) SEQ ID NO : 5; c) nucleotídeos 7 a 504 da SEQ ID NO : 7; d) nucleotídeos 7 a 504 da SEQ ID NO : 13; e e) SEQ ID NOS : 25 a 29.

[049] De modo particularmente preferido, o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção apresenta uma porcentagem de identidade de pelo menos 80% depois do alinhamento ótimo com uma sequência tal como definida em qualquer das sequências nucleotídicas a) a e) definidas acima, de preferência de pelo menos 90%, mais particularmente de pelo menos 98% e de modo mais particularmente preferido ainda de pelo menos 100%.

[050] Por porcentagem de identidade entre duas sequências de ácidos nucléicos ou de ácidos aminados de acordo com a presente invenção, designa- se uma porcentagem de nucleotídeos ou de resíduos de ácidos aminados idênticos entre as duas sequências que vão ser comparadas, obtida após o melhor alinhamento, porcentagem essa que é puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências está distribuída ao acaso e em todo seu comprimento. Designa-se por “melhor alinhamento” ou “alinhamento ótimo”, o alinhamento para o qual a porcentagem de identidade determinada do modo indicado a seguir é mais elevada. As comparações de sequências entre duas sequências de ácidos nucléicos ou de aminoácidos são tradicionalmente realizadas pela comparação dessas sequências depois de alinhá-las de modo ótimo, comparação essa que é realizada por segmento ou por janela de comparação para identificar e comparar as regiões locais de similaridade de sequência. O alinhamento ótimo das sequências para a comparação pode ser realizado manualmente e também por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981), por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch (1970), por meio do método de pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman (1988), por meio de programas informáticos que utilizam esses algoritmos (GAP, BESTFIT, BLASP P, BLAST N, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetica Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). A fim de obter o alinhamento ótimo, utiliza-se de preferência o programa BLAST, com a matriz BLOSUM 62. Pode-se também usar as matrizes PAM ou PAM250.

[051] A porcentagem de identidade entre duas sequências de ácidos nucléicos ou de aminoácidos é determinada pela comparação entre essas duas sequências alinhadas de modo ótimo, e a sequência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos que vai ser comparada pode compreender adições ou deleções em relação à sequência de referência para um alinhamento ótimo entre essas duas sequências. A porcentagem de identidade é calculada determinando-se o número de posições idênticas para as quais o nucleotídeo ou o resíduo de aminoácido é idêntico entre as duas sequências, dividindo esse número de posições idênticas pelo número total de posições comparadas e multiplicando o resultado obtido por 100 para obter a porcentagem de identidade entre essas duas sequências.

[052] Por sequências nucléicas que apresentam uma porcentagem de idêntico de pelo menos 80%, de preferência de pelo menos 90%, mais preferencialmente ainda de pelo menos 98% após alinhamento ótimo com uma sequência de referência, designam-se as sequências nucléicas que apresentam, em relação à sequência nucléica de referência, certas modificações como em particular uma deleção, uma truncação, um alongamento, uma fusão quimérica, e/ou uma substituição, em particular pontual, e cuja sequência nucléica apresenta pelo menos 80%, de preferência 90%, e mais preferencialmente ainda pelo menos 98%, de identidade depois do alinhamento ótimo com a sequência nucléica de referência. De preferência, as condições de hibridação específicas ou de alta estringência serão tais que asseguram pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, e mais preferencialmente ainda pelo menos 98% de identidade depois do alinhamento ótimo entre uma das duas sequências e a sequência complementar da outra.

[053] Uma hibridação em condições de alta estringência significa que as condições de temperatura e de força iônica são escolhidas de modo a permitir a manutenção da hibridação entre dois fragmentos de ácidos nucléicos complementares. A título ilustrativo, condições de alta estringência da etapa de hibridação, para fins de definir as sequências nucleotídicas descritas acima, são vantajosamente as seguintes.

[054] A hibridação DNA-DNA ou DNA-RNA é realizada em duas etapas: (1) pré-hibridação a 42°C durante 3 horas em tampão fosfato (20 mM, pH 7, 5) que contém 5 x SSC (1 x SSC corresponde a uma solução 0,15 M NaCl + 0,015 M citrato de sódio), 50% de formamida, 7 % de sódio dodecil sulfato (SDS), 10 x Denhardt’s, 5% de dextrano sulfato e 1% de DNA de esperma de salmão; (2) hibridação propriamente dita durante 20 horas a uma temperatura que depende do tamanho da sonda (ou seja: 42°C, para uma sonda de tamanho > 100 nucleotídeos), seguida de 2 lavagens de 20 minutos a 20°C em 0,1 x SSC x 0,1% SDS. A última lavagem é realizada em 0,1 x SSC + 0,1% SDS durante 30 minutos a 60°C para uma sonda de tamanho > 100 nucleotídeos. As condições de hibridação de alta estringência descritas acima para um polinucleotídeo de tamanho definido podem ser adaptadas pelo técnico no assunto para oligonucleotídeos de maior ou menor tamanho, de acordo com os ensinamentos de Sambrook et al. 1989.

[055] Os polipeptídeos e polinucleotídeos de acordo com a presente invenção podem ser preparados por qualquer processo apropriado. Eles podem em particular ser obtidos por síntese química, mas é também possível obtê-los por via biológica utilizando em particular diferentes vetores nas culturas celulares apropriadas. Os peptídeos de acordo com a presente invenção podem se apresentar em forma desglicosilada, ou glicosilada, se isso for necessário. Uma pessoa versada no campo da presente invenção saberá obter diferentes polinucleotídeos/polipeptídeos e saberá determinar quais são, entre os polinucleotídeos/polipeptídeos obtidos, aqueles que possuem uma atividade biológica adequada.

2. VETORES VIRAIS RECOMBINANTES

[056] De acordo com outro aspecto, a presente invenção trata de um vetor viral recombinante do sarampo em cujo genoma está inserido um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção. Esses vetores são preparados pelos métodos habitualmente utilizados pelo técnico no assunto, e os clones que deles resultam podem ser introduzidos em um hospedeiro apropriado por métodos padrão conhecidos do técnico no assunto.

[057] De acordo com um modo privilegiado, o vetor viral recombinante de acordo com a presente invenção é vantajosamente um vetor viral vivo do sarampo cepa Schwarz, como os selecionados no grupo de vetores virais constituído pelos que foram depositados na “Collection Nationale de Culture de Microorganismes” - CNCM (Acervo Nacional de Cultura de Microorganismos) sob os números I-3440, I-3442, I-3452, I-3453, I-3454, I-3455, I-3619, I-3620, I3621, I-3622 e I-3623. A sequência do antigenoma completo do vírus do sarampo cepa Schwarz pode ser obtido por exemplo a partir dos plasmídeos pTM das cepas depositadas sob os números CNCM I-3440 e I-3442.

[058] O vetor pTM-MVSchm2-[EDIII+M1-40)WNV(IS-98-ST!) foi depositado na CMCM (Paris, França) em 26 de maio de 2005 sob o número I-3440.

[059] Esse vetor é um plasmídeo PTM que contém o antigenoma completo do vírus do sarampo, cepa Schwarz, e uma unidade adicional de expressão situada entre os genes P e M que contêm a sequência do domínio III da proteína de envelope do Nilo ocidental (WNV IS-98-ST1) fundida com a sequência 1-40 da proteína de membrana.

[060] O vetor pode ser cultivado em meio LB ampi 100 μ/ml após inoculação por pequenas colônias.

[061] Ele é conservado a longo prazo por congelamento a -80°C.

[062] O vetor PTM-MVSchw2-[EDIII]+ApoptoM]DV1(FGA89) foi depositado na CNCN (Paris, França) em 26 de maio de 2005 sob o número I-3442.

[063] Esse vetor é um plasmídeo pTM que contém o antigenoma completo do vírus do sarampo, cepa Schwarz, e uma unidade adicional de expressão modificada situada entre os genes P e M que contém a sequência do domínio III da proteína de envelope do vírus da dengue 1, cepa FGA89, fundida com a sequência apoptótica da proteína da membrana M.

[064] O vetor pode ser cultivado em meio LB amp 100 μ/ml depois da inoculação por pequenas colônias.

[065] Ele é conservado a longo prazo por congelamento a -80°C.

[066] O vetor pTRE2-ssCRT-ApoptoMden1/DIII-Hα1-2 foi depositado na CNCN (Paris, França) em 16 de junho de 2006 sob o número I-3452.

[067] Esse vetor é um plasmídeo pTRE2 que contém a sequência do peptídeo sinal da calbreticulina humana fundida com as sequências proapoptóticas da proteína M e com os ectodomínios III da proteína E com as sequências hélice α dos vírus da dengue 1 e 2.

[068] A sequência do inserto contido no plasmídeo e que constitui um polinucleotídeo da presente invenção, é a SEQ ID NO: 9 representada na figura 8.

[069] O vetor pode ser cultivado em meio LB ampi 100 μ/ml.

[070] Ele é conservado a longo prazo por congelamento a -80°C.

[071] O vetor pTRE2-ssCRT-ApoptoMden1/DIII-Hα3-4 foi depositado na CNCN (Paris, França) em 16 de junho de 2005 sob o número I-3453.

[072] Esse vetor é um plasmídeo pTRE2 que contém a sequência do peptídeo sinal da calbreticulina humana fundida com as sequências proapoptóticas da proteína M do vírus da dengue 1 e com as sequências dos ectodomínios III da proteína E e Hα dos vírus da dengue 3 e 4.

[073] A sequência do inserto contido no plasmídeo e que constitui um polinucleotídeo da presente invenção, é a SEQ ID NO: 11 representada na figura 9.

[074] O vetor pode ser cultivado em meio LB ampi 100 μ/ml.

[075] Ele é conservado a longo prazo por congelamento a -80°C.

[076] O vetor pTRE2-ssCRT-ApoptoMden1/DIII-Hα1-2-3-4 foi depositado na CNCN (Paris, França) em 16 de junho de 2005 sob o número I-3454.

[077] Esse vetor é um plasmídeo pTRE2 que contém a sequência do peptídeo sinal da calbreticulina humana fundida com as sequências proapoptóticas da proteína M do vírus da dengue 1 e com as sequências dos ectodomínios III com hélices α(Hα) das proteínas E dos vírus da dengue 1, 2, 3 e 4.

[078] A sequência do inserto contido no plasmídeo e que constitui um polinucleotídeo da presente invenção, é a SEQ ID NO: 4 representada na figura 2.

[079] O vetor pode ser cultivado em meio LB ampi 100 μ/ml.

[080] Ele é conservado a longo prazo por congelamento a -80°C.

[081] O vetor pTRE2-ssCRT-EctoM40den1/DIII-Ha1-2-3-4 foi depositado na CNCN (Paris, França) em 16 de junho de 2005 sob o número I-3455.

[082] Esse vetor é um plasmídeo pTRE2 que contém a sequência do peptídeo sinal da calbreticulina humana fundida com as sequências do ectodomínio 1-40 da proteína M do vírus da dengue 1 e com as sequências dos ectodomínio 1-40 da proteína M do vírus e das sequências dos ectodomínios III com hélices α(Hα) das proteínas E da dengue 1,2, 3 e 4.

[083] A sequência do inserto contido no plasmídeo e que constitui um polinucleotídeo da presente invenção, é a SEQ ID NO: 17 representada na figura 12.

[084] O vetor pode ser cultivado em meio LB ampi 100 μ/ml.

[085] Ele é conservado à longo prazo por congelamento a -80°C.

[086] O vetor pUC57-TetraDVA (introduzido na cepa E. coli) foi depositado na CNCM (Paris-França) em 14 de julho de 2006 sob o número I-3619.

[087] Esse vetor é um plasmídeo pUC que contém uma sequência nucleotídica otimizada para a expressão em células mamíferas de uma construção tetramérica dos ectodomínios III da proteína de envelope E dos 4 sorotipos (1, 2, 3, 4) do vírus da dengue, fundida com o ectodomínio da proteína de membrana M.

[088] O inserto contido no plasmídeo vetor está representado na figura 25.

[089] A cepa que contém o vetor pode ser cultivada em meio LB ampi 100 μ/ml.

[090] O vetor pUC57-TetraDVB (introduzido na cepa E. coli) foi depositado na CNCM (Paris-França) em 14 de julho de 2006 sob o número I-3620.

[091] Esse vetor é um plasmídeo pUC que contém uma sequência nucleotídica otimizada para a expressão em células mamíferas de uma construção tetramérica dos ectodomínios III da proteína de envelope E dos 4 sorotipos (1, 2, 3, 4) do vírus da dengue, fundida com o ectodomínio da proteína de membrana M.

[092] O inserto contido no plasmídeo vetor está representado na figura 26.

[093] A cepa que contém o vetor pode ser cultivada em meio LB ampi 100 μ/ml.

[094] O vetor pUC57-TetraDVC (introduzido na cepa E. coli) foi depositado na CNCM (Paris-França) em 14 de julho de 2006 sob o número I-3621.

[095] Esse vetor é um plasmídeo pUC que contém uma sequência nucleotídica otimizada para a expressão em células mamíferas de uma construção tetramérica dos ectodomínios III da proteína de envelope E dos 4 sorotipos (1, 2, 3, 4) do vírus da dengue, fundida com o ectodomínio da proteína de membrana M.

[096] O inserto contido no plasmídeo vetor está representado na figura 27.

[097] A cepa que contém o vetor pode ser cultivada em meio LB ampi 100 μ/ml.

[098] O vetor pUC57-TetraDVD (introduzido na cepa E. coli) foi depositado na CNCM (Paris-França) em 14 de julho de 2006 sob o número I-3622.

[099] Esse vetor é um plasmídeo pUC que contém uma sequência nucleotídica otimizada para a expressão em células mamíferas de uma construção tetramérica dos ectodomínios III da proteína de envelope E dos 4 sorotipos (1, 2, 3, 4) do vírus da dengue, fundida com o ectodomínio da proteína de membrana M.

[100] O inserto contido no plasmídeo vetor está representado na figura 28.

[101] A cepa que contém o vetor pode ser cultivada em meio LB ampi 100 μ/ml.

[102] O vetor pUC57-TetraDVE (introduzido na cepa E. coli) foi depositado na CNCM (Paris-França) em 14 de julho de 2006 sob o número I-3623.

[103] Esse vetor é um plasmídeo pUC que contém uma sequência nucleotídica otimizada para a expressão em células mamíferas de uma construção tetramérica dos ectodomínios III da proteína de envelope E dos 4 sorotipos (1, 2, 3, 4) do vírus da dengue, fundida com o ectodomínio da proteína de membrana M.

[104] O inserto contido no plasmídeo vetor está representado na figura 29.

[105] A cepa que contém o vetor pode ser cultivada em meio LB ampi 100 μ/ml.

3.VETORES DE CLONAGEM E/OU DE EXPRESSÃO E ANTICORPOS

[106] De acordo com outro aspecto, a presente invenção trata de qualquer vetor de clonagem e/ou de expressão e de qualquer hospedeiro celular (procarionte ou eucarionte) transformado por esse vetor, e que compreende os elementos de regulação que permitem a expressão da sequência de nucleotídeos que codificam para um polipeptídeo quimérico de acordo com a presente invenção. Esses vetores são preparados pelos métodos habitualmente utilizados pelo técnico no assunto, e os clones que deles resultam podem ser introduzidos em um hospedeiro apropriado por métodos padrão, tais como, por exemplo, a lipofecção, a eletroporação, o choque térmico, a transformação após permeabilização química da membrana, a fusão celular.

[107] A presente invenção compreende ainda as células hospedeiras, em particular as células eucariotes e procariotes, transformadas pelos vetores de acordo com a presente invenção bem como os animais transgênicos, de preferência os mamíferos, com exceção do homem, que compreendem as referidas células transformadas de acordo com a presente invenção. Esses animais podem ser utilizados como modelos, para o estudo da etiologia de doenças inflamatórias e/ou imunes, e em particular das doenças inflamatórias do tubo digestivo, ou para o estudo de cânceres.

[108] Entre as células que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção, pode-se citar as células bacterianas (Olins et Lee (1993), Curr. Op. Biotechnology 4; 520), e também as células de levedura (Buckholz, (1993), Curr. Op. Biotechnology 4,538, bem como as células animais, em particular as culturas de células de mamíferos (Edwards et Aruffo (1993), Curr. Op. Biotechnology, 4,558).

[109] De acordo com a presente invenção, o termo “vetor de clonagem e/ou de expressão” se refere a uma construção polinucleotídica concebida para ser transfectada em diferentes tipos celulares. Por isso, esses vetores visam os vetores de expressão concebidos para a expressão de uma sequência nucleotídica na célula hospedeira: os vetores de clonagem concebidos para o isolamento, a propagação e a replicação de nucleotídeos inseridos ou dos vetores ponte que compreendem atributos de mais de um vetor.

4. ANTICORPOS POLICLONAIS OU MONOCLONAIS

[110] Os polipeptídeos e polinucleotídeos da presente invenção podem também ser utilizados para preparar anticorpos policlonais ou monoclonais capazes de se fixar (de preferência de modo específico) em pelo menos um polipeptídeo quimérico/polinucleotídeo objeto da presente invenção. A presente invenção visa, portanto, igualmente esses anticorpos purificados que podem ser obtidos por técnicas bem conhecidas como, por exemplo, a técnica descrita por Kolher et Milstein (Continuos cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature (1975), 263:495-497). De acordo com um modo de realização preferido da presente invenção, os anticorpos são do tipo “humanizado”. Uma pessoa versada na área por seus conhecimentos gerais saberá preparar esses tipos de anticorpos.

5. MÉTODOS E PROCESSO DE USO

[111] De acordo com outro aspecto, a presente invenção trata da prevenção e/ou do tratamento de uma infecção por Flaviviridae em uma espécie sensível. Mais particularmente, a presente invenção trata do uso de um vetor viral recombinante de acordo com a presente invenção para a preparação de uma composição imunogênica destinada à prevenção ou ao tratamento de uma infecção por Flaviviridae em uma espécie sensível. Por “espécie sensível”, entende-se qualquer animal suscetível a uma infecção por Flaviviridae, como por exemplo um ser humano.

[112] A presente invenção trata também de um método de prevenção e/ou de tratamento de uma infecção por Flaviviridae em uma espécie sensível, que compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de pelo menos um dos seguintes elementos: - um polipeptídeo quimérico de acordo com a presente invenção; - um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção; - um vetor viral recombinante de acordo com a presente invenção; - um anticorpo de acordo com a presente invenção; e - um vetor de clonagem e/ou de expressão de acordo com a presente invenção.

[113] Por “infecção por Flaviviridae”, entende-se por exemplo flaviviroses tais como a dengue, a febre amarela, a encefalite japonesa e da fibra do Nilo Ocidental. Os meios de preparação e de administração dos elementos da presente invenção não serão descritos com mais detalhes pois já são conhecidos do técnico no assunto.

6. COMPOSIÇÕES

[114] A presente invenção trata também das composições imunogênicas úteis na prevenção e/ou no tratamento e/ou no tratamento de uma infecção por Flaviviridae. Por “composição imunogênica”, entende-se uma composição que contém elementos que possuem a capacidade de induzir in vivo ou in vitro, uma resposta imune de tipo celular e/ou humoral.

[115] Em um modo de realização preferido, a composição da presente invenção contém ainda um veículo farmaceuticamente aceitável, e um elemento escolhido no grupo constituído por: - um polipeptídeo de acordo com a presente invenção; - um polinucleotídeo quimérico de acordo com a presente invenção; - um vetor viral recombinante de acordo com a presente invenção; - um anticorpo de acordo com a presente invenção; e - um vetor de clonagem e/ou de expressão de acordo com a presente invenção.

[116] As composições de acordo com a presente invenção podem se apresentar em uma forma sólida ou líquida qualquer habitual para a administração farmacêutica, ou seja, por exemplo formas de administração líquida, em gel, ou qualquer outro suporte que permita por exemplo uma liberação controlada. Entre as composições utilizáveis, pode-se citar em particular as composições injetáveis no ser humano.

[117] As composições da presente invenção podem comportar ainda componentes que aumentam ou podem aumentar a imunogenicidade dos polipeptídeos quiméricos da presente invenção, em particular de outros peptídeos imunogênicos, adjuvantes de imunidade específicos ou não, tais como o alun, o QS21, o adjuvante de Freund, o adjuvante SBA, a montanida, polissacarídeos ou compostos equivalentes.

[118] Uma pessoa versada na área saberá preparar composições farmaceuticamente aceitáveis e determinar, em função de vários fatores, o modo de administração privilegiado e a quantidade que deve ser administrada. Entre os fatores que podem influir nessas escolhas pode-se citar: a composição; o estágio da doença; a condição; a idade e o peso do paciente, etc.

EXEMPLOS

[119] Os exemplos a seguir permitirão ressaltar outras características e vantagens da presente invenção, e servem para ilustrar a extensão do uso da presente invenção e não a limitar seu alcance. Pode-se introduzir modificações e variações nela sem fugir ao âmbito desta invenção. Embora possam ser utilizados outros métodos ou produtos equivalentes aos encontrados a seguir para testar ou realizar a presente invenção, o material e os métodos preferidos estão descritos.

EXEMPLO 1 O VÍRUS DO SARAMPO RECOMBINADO MVSCHW-[EDIII + M1-40]DV-ICOMO PROTÓTIPO DE UMA CANDIDATO A VACINA CONTRA A DENGUE(PTR156)

[120] Descritas nas Figuras 1 e 2, duas construções imunogênicas baseadas, de um lado, na capacidade do domínio II da glicoproteína de invólucro E do vírus da dengue a induzir anticorpos neutralizantes e, de outro lado, na implicação do ectodomínio da proteína de membrana M (M1-40) na patogenicidade viral (apoptose) foram inseridas no genoma da cepa viral atenuada Schwarz do vírus do sarampo (MVSchw). As sequências virais estão na dependência do peptídeo sinal da calreticulina para permitir seu endereçamento na via de secreção. A expressão das sequências [EDIII]Dv-1, e [EDIII-M1-40]DV-1 pelos vírus recombinados MVSchw foi verificada nas células Vero infectadas por imunofluorescência indireta por meio de um soro policlonal da cepa HMAF dirigido contra o DV-1 (Fig. 3). A secreção dos domínios antigênicos EDII e EDII fundidos na sequência M1-40(com o pentapeptídeo intercalante RRDKR) do vírus dengue, tipo-1 (DV-1) da cepa FGA/89 (Holmes E.C. et al, Mol. Biol. Evol. 16(3): 405-409, 1999 e Desprès P. et al., Virology 196:209-219) foi observada por análise em Western blot nos sobrenadantes de células infectadas pelos vírus MVSchw-[EDIII]DV-1 e MVSchw- [EDIII+M1-40]Dv-1, respectivamente (Fig. 4). Da mesma forma, a produção e a secreção nos sobrenadantes de cultura de uma cepa de células de drosófila S2[EDIII+M1-40]Dv-1 induzidas para a expressão dessas proteínas foram demonstradas (Fig. 5).

[121] Dois grupos de 4 camundongos CD46/IFNAR adultos foram imunizados com 104TCID50 de cada um dos vírus MVSchw recombinados (Tabelas 1 e 2). O vírus vazio MVSchw foi utilizado como um controle negativo. Determinamos a produção de anticorpos dirigidos contra o vírus MVSchw (MV Ag) e o vírus DV-1(DV-1 Ag) inclusive os que são específicos de EDIII (Thullier, P. et al. 2001, J. Gen. Virol. 82 : 1885-1892) e neutralizantes (Anti-DV1 FRNT75) nos camundongos imunizados (Tabelas 1 e 2). Observamos que o vírus MVSchw- [EDIII]DV-1é pouco eficaz para produzir anticorpos específicos do DV-1 ou do EDIII sozinho após duas inoculações com um intervalo de um mês (Tabela 1). De acordo com o mesmo protocolo de imunização, observamos que o vírus MVSchw-[EDIII]+M1- 40] DV-1 induz títulos significativos de anticorpos dirigidos contra o DV-1 e contra o EDIII sozinho (Tabela 2). Anticorpos anti-DV1 entre os quais os que são neutralizantes são ainda detectados quatro meses após o fim da imunização.

[122] Quando os camundongos imunizados por mais de 6 meses com MVschw-[EDIII]+M1-40] DV-1 são submetidos a um reforço com uma dose única de 5 μg de proteínas totais de um concentrado de sobrenadante de células de drosófila S2- [EDIII]+M1-40] DV-1 induzidas para a expressão da proteína de fusão -[EDIII]+M1-40] DV- 1 e em presença de Alugel como adjuvante, são observadas taxas elevadas de anticorpos anti DV-1, anti-EDIII e neutralizantes do DV-1, que traduzem uma resposta humoral memória bem estabelecida nesses animais vacinados (Tabela 2). Os anticorpos anti DV-1 estão ainda presentes diversos meses após o reforço antigênico (Tabela 2).

[123] Três meses depois do reforço com r[EDIII]+M1-40]DV-1, os camundongos imunizados com MVSchw-[EDIII]+M1-40] DV-1 foram inoculados com 107 UFF do DV-1 camundongo FGA/NA d1d por via intraperitoneal (o DV-1 é responsável por uma infecção assintomática no camundongo IFNAR). Títulos importantes de anticorpos anti-DV-1 (dirigidos sobretudo contra o EDIII) entre os quais os que neutralizam o DV-1 cepa Havaí (título neutralizante 4000) são observados após 3 semanas de prova viral (Quadro 2). Deve-se notar que os camundongos imunizados por 9 meses com o vírus com MVSchw-[EDIII]+M1-40] DV-1 (essa construção não induz anticorpos anti-EDIII ou neutralizantes do DV1) e testados com 107UFF do DV-1 cepa FGA/NA d1d pela via intraperitoneal, produzem títulos de anticorpos DV1-, anti-EDIII e neutralizantes de 20000, 5000 e 80, respectivamente; são valores equivalentes aos observados nos camundongos BALB/c ou IFNAR testados nas mesmas condições experimentais.

[124] Concluindo, a sequência de fusão -[EDIII]+M1-40] DV-1 secretada pelo vírus MVSchw-[EDIII]+M1-40] DV-1 é capaz de gerar anticorpos neutralizantes anti-DV-1 e de induzir uma resposta humoral memória a longo prazo que é estimulada eficazmente, de um lado, pelo antígeno solúvel r[EDIII]+M1-40]DV-1 e, de outro lado, em resposta a uma infecção viral. Inversamente, apenas o domínio antigênico EDIII secretado pelo vírus MVSchw-[EDIII]DV-1 é pouco imunogênico no camundongo CD46+-IFNAR. Nossos trabalhos complementares demonstram que o peptídeo pro- apoptótico ApoptoM (M32-40) na extremidade C-terminal da M é determinante no poder imunogênico da sequência de fusão -[EDIII]+M1-40] DV-1, uma vez que o vírus MVSchw-[EDIII+M1-30] DV-1, sem ApoptoM induz uma produção de anticorpos DV-1 equivalente à que é obtida após imunização com o vírus MVSchw-[EDIII]DV-1.

[125] Como metodologia geral de vacinação pediátrica contra a dengue, propomos imunizar indivíduos jovens com o vírus MVSchw-[EDIII+M1-40] DV-1, por uma inoculação dupla com um intervalo de um mês, e depois de tornar a estimulá-los tardiamente com o antígeno solúvel r[EDIII]+M1-40]DV-1 com uma finalidade de reforço vacinal ou de profilaxia contra o risco de uma infecção pelo vírus da dengue. Essa estratégia de imunização está em fase de validação para os quatro serotipos da dengue com base em um antígeno composto pelo tetrâmero dos 4 domínios EDIII dos DV-1, -2, -3 e 4 fundido com a sequência citotóxica ApoptoM.

[126] Nossos primeiros resultados experimentais assinalam a importância de um imunógeno de tamanho reduzido derivado da proteína de envelope do vírus DV1 em combinação com as capacidades imunoestimuladoras do vetor sarampo vivo, uma estratégia que permite a indução de uma resposta humoral neutralizante que é eficaz contra o vírus da dengue. Eles definem uma prova de conceito para o design das construções tetraméricas dos domínios antigênicos do DV que permitirão imunizar simultaneamente e a longo prazo contra os quatro sorotipos da dengue.

EXEMPLO 2 CONSTRUÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS QUIMÉRICOS OTIMIZADOS PARA UMA EXPRESSÃO EM MAMÍFERO

[127] No presente exemplo, os inventores desenvolveram novas construções antigênicas úteis contra uma infecção por Flaviviridae.

[128] Esses novos polipeptídeos quiméricos se baseiam em um antígeno composto de um tetrâmero dos quatro domínios EDIII dos quatro sorotipos do vírus da Dengue, fundidos entre si e com uma ou outra das sequências citotóxicas apoptoM mostradas na Figura 30.

[129] A seguir, esses polipeptídeo quiméricos otimizados para uma expressão em mamífero foram inseridos no genoma da cepa viral atenuada Schwarz do vírus do sarampo (MVSchw). As figuras 15 a 29 mostram as sequências de aminoácidos de cinco polipeptídeos quiméricos preferidos e os polinucleotídeos que os codificam.

[130] Esses polipeptídeos quiméricos foram construídos de acordo com as seguintes condições de otimização: - Informações de otimização dessas sequências: - (No Cai=0,806, %GC médio = 53,46, distribuição em GC: homogêneo aproximadamente 50%); - eliminação das sequências “TATA box” interna, porção rica em AT ou GC, os elementos de sequências ARE, INS e CRS, sequências repetidas, sequências de estrutura de RNA secundária, sequência de splicing críptico: - eliminação dos sítios de restrição indicados a seguir: Nhel, BamHl, Xhol, EcoRl, KPnl, Sall, BspEI, BgIII, Notl, BssHll e BsiWI, com exceção para BsiWI em primeira posição e BssHll em última posição; e - eliminação dos motivos TTTT, TTTAA, AAAGGG, AAAAGG, GGGAAA, GGGGAA e seus complementares TTCCCC, TTTCCC, CCTTTT, CCCTTT. TABELAI RESPOSTA DE ANTICORPOS DIRIGIDA CONTRA O VÍRUS MVSCHW NOS CAMUNDONGOSCD46*/IFNAR INOCULADOSI.P, POR MVSCHW-[EDIII]DVI

a. 104TCIP50 de MV-DV1[EDIII+M1-40] foram dados i.p. a quatro camundongos adultos. b. Os indivíduos receberam uma injeção de reforço com 104 TCIP50 de MV-DV1[EDIII+M1-40]. c. Determinado por ELISA (Trinity Biotech) em soros agrupados (pooled) e inativados pelo calor. d. Determinado por ELISA em soros agrupados (pooled) e inativados pelo calor. Placas de microtitulação foram recobertas de 5 x 105FFU de sucrose purificada, FGA/NA d1d como antígeno viral. e. Determinado por ELISA em soros agrupados (pooled) e inativados pelo calor. Placas de microtitulação foram recobertas de 50 ng de EDIII recombinante altamente purificado do DV1 como antígeno viral. f. Os anticorpos de neutralização anti-DV1 foram detectados pelo uso do teste de soroneutralização por redução das placas (ou “Focus Reduction Neutralization Test” (FRNT). Soros agrupados (pooled) e inativados pelo calor foram incubados com a cepa HAvaí DV1 e a titulação de vírus foi realizada sobre células Vero pelo teste de imunodetecção das placas. FRNT75, a diluição do soro mais elevado testada que reduziu o número de FFU em pelo menos 75%. TABELA II RESPOSTA DE ANTICORPOS DIRIGIDA CONTRA O VÍRUS MVSCHW NOS CAMUNDONGOSCD46*/IFNAR INOCULADOSI.P, POR MVSCHW-[EDIII+M1-40]DVI

a. 104TCIP50 de MV-DV1[EDIII+M1-40] foram dados i.p. a quatro camundongos adultos. b. Os indivíduos receberam uma injeção de reforço com 104 TCIP50 de MV-DV1[EDIII+M1-40]. c. Os camundongos imunizados receberam uma injeção de reforço de 5 μg de proteínas secretadas totais provenientes do sobrenadante de células S2 que expressam rDV1[EDIII+M1-40] em presença do adjuvante Alugel. d. Os camundongos imunizados foram inoculados i.p. com 107 FFU de FGA/NA d1d da cepa DV1 por três semanas. e. Determinado por ELISA (Trinity Biotech) em soros agrupados (pooled) e inativados pelo calor. f. Determinado por ELISA em soros agrupados (pooled) e inativados pelo calor. Placas de microtitulação foram recobertas de 5 x 105FFU de sucrose purificada, FGA/NA d1d como antígeno viral. g. Determinado por ELISA em soros agrupados (pooled) e inativados pelo calor. Placas de microtitulação foram recobertas de 50 ng de EDIII recombinante altamente purificado do DV1 como antígeno viral. h. Os anticorpos de neutralização anti-DV1 foram detectados pelo uso do FNRT. Soros agrupados (pooled) e inativados pelo calor foram incubados com a cepa Havaí DV1 e a titulação de vírus foi realizada sobre células Vero pelo teste de imunodetecção das placas. FRNT75, a diluição do soro mais elevado testada que reduziu o número de FFU em pelo menos 75%.

Claims

1. POLIPEPTÍDEO QUIMÉRICO, caracterizado por compreender um peptídeo de subdomínio da proteína E de um Flavivirus ligado a um peptídeo do subdomínio da proteína de membrana M de Flavivirus, em que o subdomínio da proteína E consiste em um dímero do ectodomínio III dos vírus da Dengue 1, 2, 3 ou 4, em que o dímero consiste em: - aminoácidos 21 a 262 da SEQ ID NO: 8; e - aminoácidos 21 a 262 da SEQ ID NO: 10; e em que o subdomínio da proteína de membrana M consiste em: - sequência de aminoácidos 1 a 40 contidos na posição 123 a 170 da SEQ ID NO: 3, ou - sequência apoptoM que consiste na sequência de aminoácidos contido na posição 154 a 170 da SEQ ID NO: 3 ; ou - sequência de aminoácidos contidos na posição 122 a 132 da SEQ ID NO: 12.

2. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda um segmento de ligação que liga o peptídeo de subdomínio da proteína E ao peptídeo de subdomínio da proteína M, em que o segmento de ligação consiste em um pentapeptídeo de sequência RRDKR (SEQ ID NO: 33) ou RREKR (SEQ ID NO: 34).

3. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, destinada à prevenção e/ou ao tratamento de uma infecção por Flavivirus em uma espécie sensível, caracterizada por compreender o polipeptídeo quimérico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

4. USO DE UM POLIPEPTÍDEO QUIMÉRICO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção por Flavivirus em uma espécie sensível.

5. USO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo medicamento compreender ainda um adjuvante.

6. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 5, caracterizado pela infecção por Flavivirus ser selecionada a partir do grupo constituído pelo vírus da dengue, o vírus da febre amarela, o vírus da encefalite japonesa e o vírus da febre do Nilo Ocidental.