ES2745431T3 - Composiciones para vacunas contra el virus del dengue y su uso - Google Patents

Composiciones para vacunas contra el virus del dengue y su uso Download PDF

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Abstract

Una glicoproteína E del virus del dengue quimérico que comprende una cadena principal de la glicoproteína E del virus del dengue que comprende sustituciones de aminoácidos que introducen un epítopo reconocido por un anticuerpo que es reactivo con un serotipo del virus del dengue diferente del serotipo del virus del dengue de la cadena principal de la glicoproteína E; en donde la glicoproteína E del virus del dengue quimérico comprende la secuencia de aminoácidos:**Fórmula** o la secuencia de aminoácidos:**Fórmula**

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones para vacunas contra el virus del dengue y su uso.
Declaración de apoyo gubernamental
Esta invención se realizó con apoyo del gobierno bajo la Subvención No. U54 AI057157 otorgada por el Instituto Nacional de Salud. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención.
Campo de la invención
La presente invención se dirige a vacunas contra el virus del dengue que inducen anticuerpos neutralizantes contra más de un serotipo del virus del dengue de un solo origen.
Antecedentes de la invención
El dengue es un flavivirus transmitido por mosquitos que se está propagando a una velocidad sin precedentes y se ha convertido en una carga económica y para la salud importante en más de 50 países. Las vacunas actuales de DENV que protegen contra los cuatro serotipos, deben administrarse como una formulación "tetravalente" de cuatro virus o cuatro proteínas recombinantes, cada una de las cuales tiene la intención de conferir protección contra ese serotipo. Se desconoce la combinación correcta de serotipos en la formulación tetravalente para lograr una respuesta de anticuerpos equilibrada, lo que se destaca por el reciente fracaso del virus quimérico vivo atenuado tetravalente más avanzado para proporcionar protección clínicamente significativa en un gran ensayo de fase 2B en Tailandia (Sabchareon A, y otros, 2012). Se cree que la interferencia viral contribuye al fracaso ya que uno o más serotipos del virus son más competitivos que los otros. Los virus quiméricos DENV-1/3 y DENV-3/1 son virus individuales que presentan epítopos reconocidos por anticuerpos neutralizantes de los individuos inmunes a DENV-1 y DENV-3. Esto indica que los virus individuales deberían ser capaces de inducir anticuerpos neutralizantes dirigidos a dos serotipos a la vez, reemplazando dos virus (DENV-1 y 3) con un virus (DENV-1/3 o DENV-3/1).
K. Raviprakash y otros, (Virology 353 (2006) páginas 166-173) se refieren a una vacuna quimérica tetravalente de ADN contra el dengue que induce anticuerpos neutralizantes para los cuatro serotipos del virus en macacos rhesus. H. Bielefeldt-Ohmann y otros, (Journal of General Virology (1997) volumen 78, páginas 2723-2733) se refieren al análisis de una proteína de envoltura híbrida recombinante del virus dengue-2-virus degue-3 expresada en un sistema secretor de baculovirus. El documento WO 2013/151764 se refiere a composiciones y métodos de uso de una glicoproteína E del virus del dengue quimérico que comprende la cadena principal de la glicoproteína E del virus del dengue, la cual comprende sustituciones de aminoácidos que introducen una bisagra en los dominios I y II de la glicoproteína E de un serotipo del virus del dengue que es diferente del serotipo de la cadena principal de la glicoproteína E.
Breve descripción de las figuras
Figuras 1A-B. Para el mutante DENV-1/3, la bisagra EDI-II de DENV3 se trasplantó en un fondo DENV-1, WestPac'74, creando un mutante de bisagra DENV-3/1. La bisagra EDI-II se definió usando el mAb 5J7 específico de humano contra DENV3. A) El virus resultante, rDENV-1/3, se probó contra el anticuerpo monoclonal 5J7. Esta figura muestra que DENV-1 no se neutraliza por 5J7, a diferencia de DENV-3. El virus rDENV-1/3, que solo contiene la bisagra EDI/II de DENV-3 se neutraliza con 5J7 a concentraciones equivalentes a las concentraciones neutralizantes de DENV-3. Esto demuestra un trasplante exitoso del epítopo 5J7 en DENV-1. B) Este panel muestra que DENV-3 no se neutraliza por mAb 1F4, DENV-1 se neutraliza por 1F4 y rDENV-1/3 también, lo que indica que 1F4 todavía puede unirse y neutralizar el virus quimérico.
Figuras 2A-B. Estas figuras muestran los sueros inmunes humanos primarios a DENV-1 y DENV-3 probados contra DENV-1, DENV-3 y la bisagra WestPac-3001 del virus quimérico de bisagra (rDENV-1/3). El eje Y muestra una dilución doble de los sueros inmunes necesarios para neutralizar el 50 % de la entrada del virus en el cultivo de tejidos. Los valores más altos indican un suero más potente. A) Los sueros primarios inmunes a DENV-1 neutralizan potentemente el DENV-1 pero no el DENV-3. El virus rDENV-1/3 es sensible a la neutralización de los sueros inmunes a DENV-1 a concentraciones similares a la de DENV-1, lo que indica que, a diferencia del virus DENV-3 parental, el virus quimérico muestra epítopos reconocidos por los sueros inmunes a DENV-1. B) Los sueros primarios inmunes a DENV-3 no neutralizan el DENV-1 pero neutralizan el DENV-3. El virus rDENV-1/3 se neutraliza por los sueros inmunes primarios a DENV-3 a concentraciones similares a las de DENV-3, lo que indica que el virus quimérico rDENV-1/3 conserva los epítopos críticos de DENV-3 que son dianas de los anticuerpos a DENV-3 en sueros humanos inmunes a DENV-3 . * indica no neutralizado.
Figura 3. Esta figura muestra que la bisagra WestPac'74 3001 induce anticuerpos ampliamente neutralizantes cruzados a los 28, 60, 90, 120 y 180 días después de la infección en macacos rhesus. El eje Y muestra un título de anticuerpos neutralizantes como el anterior. El eje X muestra cada serotipo del virus. Cada punto trazado es el título neutralizante para un solo macaco rhesus contra un serotipo dado. La línea central a través de cada grupo de puntos es el título neutralizante de la media geométrica para cada grupo de macacos contra cada serotipo. Los bigotes muestran el error estándar de la media. Cada punto de tiempo (28, 30, 60, 90, 120, 180 días) muestra la respuesta de anticuerpos ampliamente neutralizantes cruzados contra los cuatro serotipos.
Figuras 4A-B. Para los mutantes DENV-3/1, la bisagra EDI-II definida por la marca del anticuerpo monoclonal 1F4 de DENV1 (WestPac '74) se trasplantó en un contexto de DENV-3 (3001) creando un mutante de bisagra DENV-1/3. Este trasplante se ejecutó para tres virus diferentes (1F4S, 1F4R y 1F4E), y cada variante representa una región de epítopo más grande. La bisagra EDI-II de rDENV-3 se colocó en un virus rDENV-1 recombinante. Esta figura muestra los datos del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) con la unión relativa del anticuerpo por la densidad óptica (OD) en el eje Y y el aumento de la concentración de anticuerpos en el eje X. A) Unión del mAb 1F4 a 3001-1F4S, R y E. La curva ascendente contra el virus quimérico muestra la unión del anticuerpo, en contraste con el 3001 parental, que no se une al mAb 1F4. B) Unión de mAb 5J7 a los parentales 3001, 3001-1F4S, R y E. La unión de 5J7 se conserva en estos virus, mientras que el donante de epítopos icWestPac '74 no se une a 5J7.
Figuras 5A-B. Estas figuras muestran los sueros primarios humanos inmunes a DENV-1 y DENV-3 probados contra DENV-1, DENV-3 y el virus quimérico de bisagra 3001-1F4E. El eje Y muestra una dilución doble de los sueros inmunes necesarios para neutralizar el 50 % de la entrada del virus en el cultivo de tejidos. Los valores más altos indican un suero más potente. A) Los sueros primarios inmunes a DENV-1 neutralizan potentemente el DENV-1 pero no el DENV-3. El virus 3001 1F4E es sensible a la neutralización de los sueros inmunes a DENV-1 a concentraciones similares a las de DENV-1, lo que indica que, a diferencia del virus DENV-3 parental, el virus quimérico muestra epítopos reconocidos por los sueros inmunes a d EnV-1. B) Los sueros primarios inmunes a DENV-3 no neutralizan DENV-1 pero neutralizan De Nv -3. El virus 3001 1F4E se neutraliza por los sueros primarios inmunes a DENV-3 a concentraciones similares a las de DENV-3, lo que indica que el virus quimérico 3001-1F4E conserva los epítopos críticos de DENV-3 que son dianas de los anticuerpos a DENV-3 en los sueros humanos inmunes a DENV-3.
Figura 6. Inmunogenicidad del virus 3001-1F4E en macacos rhesus. Solo se proporciona un punto de tiempo, que muestra anticuerpos ampliamente neutralizantes cruzados, consistente con lo que se encontró para la bisagra WestPac-3001.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona una glicoproteína E del virus del dengue quimérico que comprende una cadena principal de la glicoproteína E del virus del dengue que comprende sustituciones de aminoácidos que introducen un epítopo que es reconocido por un anticuerpo reactivo a un serotipo del virus del dengue que es diferente del serotipo de la cadena principal de la glicoproteína E; en donde la glicoproteína E del virus del dengue quimérico comprende la secuencia de aminoácidos:
MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGSCVTTMAKDKPTLDIELLKTEATQLATLRKLC IEAKISNTTTDSRCPTQGEATLVEEQDTNFVCRRTFVDRGWGNGCGLFGKGSLITCAKFK CVTKIEGKWQYENLKYSVIVTVHTGDQHQVGNETTEHGTIATITPQAPTSEIQLTDYGA LTLDCSPRTGLDFNEMILLTMKNKAWMVHRQWFLDLPLPWTSGASTSQETWNRQDLLVTF KTAHAKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQNSGGTSIFAGHLKCRLKMDKLTLKGMSYV
MCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSSQDEKGVTQNGRLITANPIVTD KEKPVNIEAEPPFGESYIVVGAGEKALKLSWFKKG
o la secuencia de aminoácidos:
MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELFKTEVTNPAVLRKLCIEGK ITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVCKHTYVDRGWGNGCGLFGKGSLVTCAKFQCLEPIEGK VVQYENLKYSVIVTVHTGDQHQVGNETTEHGTIATITPQAPTSEIQLTDYGALGLECSPRTGLD FNEMILLTMKNKAWMVHRQWFFDLPLPWTSGATTETPTWNRKELLVTFKNAHAKKQEWVLGSQ EGAMHTALTGATEIQTSGTTTIFAGHLKCRLKMDKLELKGMSYAMCTNTFVLKKEVSETQHGTI LIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQGKAHNGRLITANPVVTKKEEPVNIEAEPPFGESNIVIGIGD NALKINWYKKG
Además, en la presente descripción se proporciona una partícula de flavivirus o una partícula similar a virus (VLP) que comprende la glicoproteína E de esta invención.
También se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para la glicoproteína E de esta invención, así como una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para la partícula de flavivirus o la VLP de esta invención.
La presente invención también proporciona una composición que comprende la glicoproteína E de esta invención en un portador farmacéuticamente aceptable, y proporciona una composición que comprende la molécula de ácido nucleico de esta invención en un portador farmacéuticamente aceptable.
Además, la presente invención proporciona la glicoproteína E, la partícula de flavivirus, la molécula de ácido nucleico y/o la composición de esta invención y cualquier combinación de las mismas para su uso en la producción de una respuesta inmunitaria al virus del dengue en un sujeto.
La presente invención también proporciona la glicoproteína E, la partícula de flavivirus, la molécula de ácido nucleico y/o la composición de esta invención y cualquier combinación de las mismas para su uso en el tratamiento de una infección por el virus del dengue en un sujeto.
Además, en la presente invención se proporciona la glicoproteína E, la partícula de flavivirus, la molécula de ácido nucleico y/o la composición de esta invención y cualquier combinación de las mismas para su uso en la prevención de una infección por el virus del dengue en un sujeto (por ejemplo, un sujeto que lo necesite).
En la presente descripción también se proporciona la glicoproteína E, la partícula de flavivirus, la molécula de ácido nucleico y/o la composición de esta invención y cualquier combinación de las mismas para su uso en la protección de un sujeto (por ejemplo, un sujeto que lo necesite) de los efectos de una infección por el virus del dengue.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que las regiones del epítopo que definen un serotipo de DENV pueden transferirse a una cadena principal de proteínas de un serotipo de DENV diferente para crear una molécula quimérica que contiene dianas de anticuerpos para ambos serotipos, funcionando así como una vacuna bivalente que puede inducir anticuerpos neutralizantes contra dos serotipos de DENV diferentes de una sola fuente. Por lo tanto, en la presente invención se describe una plataforma para la construcción de una cadena principal de glicoproteína E del virus del dengue quimérico que comprende sustituciones de aminoácidos que introducen epítopos reconocidos por un anticuerpo reactivo a un serotipo del virus del dengue diferente del serotipo de la cadena principal de la glicoproteína E.
En algunas modalidades, esa cadena principal de la glicoproteína E del virus del dengue es del serotipo 1 del virus del dengue. En algunas modalidades, la cadena principal de la glicoproteína E puede ser del serotipo 2, del serotipo 3 o del serotipo 4 del virus del dengue.
En algunas modalidades, el anticuerpo que es reactivo a un serotipo del virus del dengue diferente del serotipo de la cadena principal de la glicoproteína E, es un anticuerpo reactivo al serotipo 3 del virus del dengue. Un ejemplo no limitante de dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 5J7.
En otras modalidades, el anticuerpo que es reactivo con un serotipo del virus del dengue diferente del serotipo de la cadena principal de la glicoproteína E, es un anticuerpo reactivo al serotipo 1, al serotipo 2 o al serotipo 4 del virus del dengue .
Debe entenderse que cualquier combinación de un primer serotipo del virus del dengue para la cadena principal de la glicoproteína E y un segundo serotipo que es la diana del anticuerpo que reconoce el epítopo introducido en el cadena principal de la glicoproteína E puede usarse, siempre que el primer y el segundo serotipo del virus del dengue sean diferentes (es decir, no sean el mismo serotipo).
En algunas modalidades, la glicoproteína E del virus del dengue quimérico de esta invención puede comprender, consistir esencialmente o consistir en la secuencia de aminoácidos:
Bisagra WestPac74-3001 (rDENV-1/3)
MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGSCVTTMAKDKPTLDIELLKTEATQLATLRKLC IEAKISNTTTDSRCPTQGEATLVEEQDTNFVCRRTFVDRGWGNGCGLFGKGSLITCAKFK CVTKIEGKWQYENLKYSVIVTVHTGDQHQVGNETTEHGTIATITPQAPTSEIQLTDYGA LTLDCSPRTGLDFNEMILLTMKNKAWMVHRQWFLDLPLPWTSGASTSQETWNRQDLLVTF KTAHAKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQNSGGTSIFAGHLKCRLKMDKLTLKGMSYV MCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSSQDEKGVTQNGRLITANPIVTD KEKPVNIEAEPPFGESYIVVGAGEKALKLSWFKKG.
En algunas modalidades, la glicoproteína E del virus del dengue quimérico de esta invención puede comprender, consistir esencialmente o consistir en la secuencia de aminoácidos:
3001-1F4E (rDENV-3/1)
MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELFKTEVTNPAVLRKLCIEGK ITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVCKHTYVDRGWGNGCGLFGKGSLVTCAKFQCLEPIEGK VVQYENLKYSVIVTVHTGDQHQVGNETTEHGTIATITPQAPTSEIQLTDYGALGLECSPRTGLD FNEMILLTMKNKAWMVHRQWFFDLPLPWTSGATTETPTWNRKELLVTFKNAHAKKQEVVVLGSQ EGAMHTALTGATEIQTSGTTTIFAGHLKCRLKMDKLELKGMSYAMCTNTFVLKKEVSETQHGTI LIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQGKAHNGRLITANPVVTKKEEPVNIEAEPPFGESNIVIGIGD NALKINWYKKG
La presente invención también proporciona una partícula de flavivirus o una partícula similar a virus (VLP) que comprende la glicoproteína E quimérica de esta invención.
La producción de las proteínas quiméricas se puede llevar a cabo introduciendo algunas (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, etc.) o todas las sustituciones de aminoácidos identificadas en la Tabla 1 en una cadena principal de glicoproteína E del virus del dengue o una cadena principal de la glicoproteína E de flavivirus. Para producir una proteína quimérica no se requiere que todos los aminoácidos identificados en la Tabla 1 sean sustituidos. Por ejemplo, en algunas modalidades, se pueden incluir en la producción sustituciones adicionales y/u omisión de sustituciones de aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos en cualquier extremo de las secuencias de aminoácidos contiguas identificadas en la Tabla 1 como las regiones de epítopos respectivos de una proteína quimérica. El número de sustituciones necesarias para producir el epítopo conformacional deseado puede determinarlo fácilmente un experto en la técnica de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención y con protocolos bien conocidos en la técnica. La numeración de la posición de aminoácidos en la Tabla 1 se basa en la secuencia de aminoácidos de WestPac74 (DENV-1), o la secuencia de aminoácidos de UNC 3001 (DENV-3), como se proporciona en la presente invención. Sin embargo, un experto en la técnica entenderá fácilmente que las posiciones de aminoácidos equivalentes en otras secuencias de aminoácidos de la glicoproteína E del virus del dengue u otras secuencias de aminoácidos de la glicoproteína E de flavivirus pueden identificarse fácilmente y emplearse en la producción de las proteínas quiméricas de esta invención.
La Tabla 2 muestra un ejemplo de modificaciones que se pueden hacer a la secuencia de nucleótidos que codifica para la glicoproteína E de DENV-1 para introducir el epítopo que reconoce el anticuerpo monoclonal 5J7, que es reactivo a DENV-3. La secuencia de aminoácidos que resulta de la traducción de una secuencia de nucleótidos que comprende estas sustituciones es:
MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGSCVTTMAKDKPTLDIELLKTEATQLATLRKLC IEAKISNTTTDSRCPTQGEATLVEEQDTNFVCRRTFVDRGWGNGCGLFGKGSLITCAKFK CVTKIEGKWQYENLKYSVIVTVHTGDQHQVGNETTEHGTIATITPQAPTSEIQLTDYGA LTLDCSPRTGLDFNEMILLTMKNKAWMVHRQWFLDLPLPWTSGASTSQETWNRQDLLVTF KTAHAKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQNSGGTSIFAGHLKCRLKMDKLTLKGMSYV
MCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSSQDEKGVTQNGRLITANPIVTD KEKPVNIEAEPPFGESYIVVGAGEKALKLSWFKKG.
Se entenderá que las modificaciones proporcionadas en la Tabla 2 proporcionan un ejemplo de cómo se puede obtener la secuencia de aminoácidos anterior y que, debido a la degeneración de los codones de aminoácidos, se pueden realizar otras numerosas modificaciones a la secuencia de nucleótidos que codifica para la glicoproteína el E del DENV-3 para obtener esta secuencia de aminoácidos.
La Tabla 3 muestra que la bisagra WestPac'743001 es infecciosa en macacos rhesus infectados por vía subcutánea con 500,000 unidades infecciosas de virus. Los valores que se informan para cada día son los logaritmos de los títulos virales en sueros de monos transformados, cuantificado por ensayos de inmunofoco.
Tabla 4. Atenuación de 3001-1F4E en macacos rhesus. Esta tabla muestra que 3001-1F4E es infecciosa en macacos rhesus infectados por vía subcutánea con 500,000 unidades infecciosas de virus. Sin embargo, este virus estaba por debajo del nivel de detección cuantitativo (50 virus infecciosos/ml de suero). Un ensayo más sensible, el ensayo de foco retardado, es capaz de detectar virus <50 unidades infecciosas/ml, pero no es capaz de cuantificar el nivel bajo de virus presente. En consecuencia, los días para los que se detectó el virus mediante nuestro ensayo más sensible se anotan como positivos con "+". El número total de días infectados se muestra en la columna izquierda. El nivel bajo de viremia y el número medio bajo de días infectados (2.25 días) son consistentes con la atenuación del virus en macacos.
Tabla 5. Para caracterizar aún más el virus quimérico DENV 1/3, se marcó con el anticuerpo monoclonal 1F4, específico a DENV-1. El anticuerpo monoclonal 1F4 es específico a un serotipo y su epítopo diana está en la bisagra EDI-II. Si la bisagra EDI-II de DENV-3 trasplantada altera el epítopo 1F4, éste ya no debería neutralizar el virus quimérico WestPac74/3001.
En algunas modalidades, la presente descripción proporciona una glicoproteína E quimérica de flavivirus en la que se realizan sustituciones de aminoácidos para introducir un epítopo del virus del dengue en una glicoproteína E de un flavivirus diferente al virus del dengue. Por lo tanto, en algunas modalidades, la presente descripción proporciona una glicoproteína E de flavivirus que comprende una glicoproteína E quimérica con una cadena principal de glicoproteína E de flavivirus diferente a la cadena principal de la glicoproteína E del virus del dengue, en la que la cadena principal de glicoproteína E de flavivirus comprende sustitutos de aminoácidos que introducen un epítopo reconocido por un anticuerpo reactivo con un virus del dengue.
Los ejemplos no limitantes de flavivirus que se pueden usar incluyen el virus de la fiebre amarilla (YFV) (por ejemplo, Acceso a la Base de Datos del GenBank® No. JX503529), virus de la encefalitis japonesa (JEV) (por ejemplo, Acceso a la Base de Datos del GenBank® No. U14163), virus del Nilo Occidental (WNV) (por ejemplo, Acceso a la Base de Datos del GenBank® No. DQ211652) y cualquier otro flavivirus que se conozca en la actualidad o que se identifique posteriormente.
Se sabe en la técnica que muchos intentos de producir vacunas contra el virus del dengue dan como resultado la producción de anticuerpos no neutralizantes, lo que puede aumentar la probabilidad de patología tras la exposición posterior a la infección natural o la vacuna. Otro enfoque para proporcionar un epítopo diseñado es administrar la totalidad o una parte de la proteína E del virus del dengue incorporada en otra partícula de flavivirus o VLP. En modalidades representativas de esta descripción, los flavivirus heterólogos son el virus del Nilo Occidental o el virus de la fiebre amarilla. Algunas porciones de la proteína E pueden injertarse en la proteína E de la cadena principal de los flavivirus heterólogos, por ejemplo, para reducir la generación de anticuerpos no neutralizantes contra el virus del dengue a epítopos no neutralizantes presentes en la proteína E del virus del dengue y/u otras proteínas estructurales del virus del dengue.
Por lo tanto, un flavivirus quimérico o un VLP de flavivirus quimérico puede presentar el epítopo del virus del dengue cuaternario en una conformación adecuada mientras reduce la generación de anticuerpos no neutralizantes a otras porciones de la proteína E del virus del dengue y/u otras proteínas estructurales que están presentes en el flavivirus quimérico o el v Lp de flavivirus quimérico.
En algunas modalidades, los epítopos individuales y conformacionales de la glicoproteína E del flavivirus E o la glicoproteína E del virus del dengue pueden presentarse en una estructura principal o estructura de soporte sintética para que los epítopos dentro de la estructura principal o estructura de soporte imiten la conformación y disposición de los epítopos dentro del estructura de la glicoproteína E, partícula viral o v Lp .
En otras modalidades adicionales, la presente descripción proporciona mimitopos de péptidos (ver, Meloen y otros. (2000) J. Mol. Recognit. 13, 352-359) que imitan los epítopos individuales y conformacionales de las glicoproteínas E de la invención. Los mimitopos se pueden identificar usando cualquier método conocido en la técnica, tales como la estimulación de superficie, las bibliotecas de péptidos aleatorios o las bibliotecas de presentación en fagos, usando un anticuerpo o anticuerpos para los epítopos individuales y conformacionales de las glicoproteínas E de la invención.
La descripción proporciona además un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico aislado) que codifica un epítopo del virus del dengue o un polipéptido de la invención.
La descripción proporciona además un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico aislado) que codifica un VLP de flavivirus quimérico o una partícula de flavivirus quimérico (por ejemplo, una envoltura viral de la partícula de flavivirus) de la invención.
También se proporcionan vectores que codifican los ácidos nucleicos de la invención.
También se proporcionan células que comprenden los vectores, ácidos nucleicos, epítopos del virus del dengue, polipéptidos, VLP de flavivirus quiméricos o partículas de flavivirus quiméricos de la invención.
La invención proporciona además composiciones inmunogénicas que comprenden las células, vectores, ácidos nucleicos, epítopos del virus del dengue, polipéptidos, VLP de flavivirus quimérico o partículas de flavivirus quimérico de la invención. En modalidades, la composición inmunogénica es monovalente. En modalidades, la composición inmunogénica es multivalente (por ejemplo, tetravalente) para los serotipos DEN1, DEN2, DEN 3 y/o DEN4 del virus del dengue.
En la presente descripción se describen los métodos para producir una respuesta inmunitaria a un virus del dengue en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un epítopo del virus del dengue, un polipéptido, un VLP de flavivirus quimérico o una partícula de flavivirus quimérico, ácido nucleico, vector, célula o inmunogénico .
Además, la presente invención proporciona la glicoproteína E de la invención, la partícula de flavivirus de la invención, el ácido nucleico de la invención y/o la composición de la invención para su uso en la producción de una respuesta inmunitaria a un virus del dengue en un sujeto. La respuesta inmunitaria puede ser contra uno, dos, tres o los cuatro DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4. Se conoce bien en la técnica que las vacunas contra el dengue multivalentes eficaces y seguras han sido un desafío en su diseño debido al problema de la interferencia entre los serotipos. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria puede estar dirigida principalmente contra algunos de los serotipos diana. Se requieren múltiples vacunas para tratar de lograr una respuesta contra todos los serotipos; sin embargo, en el caso del virus del dengue, este enfoque puede ser peligroso porque las administraciones repetidas a un sujeto con anticuerpos preexistentes pueden provocar la fiebre hemorrágica del dengue.
Un aspecto adicional de la invención es una glicoproteína E de la invención, la glicoproteína E de la invención, la partícula de flavivirus de la invención, el ácido nucleico de la invención y/o la composición de la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección por el virus del dengue en un sujeto o para proteger a un sujeto de los efectos de la infección por el virus del dengue.
Existen cuatro serotipos del virus del dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4). Dentro de cada serotipo hay varias cepas o genotipos diferentes. Los antígenos y epítopos del virus del dengue pueden derivarse de cualquier virus del dengue, incluidos todos los serotipos, cepas y genotipos que se conocen en la actualidad o los que se identifiquen posteriormente.
En modalidades de la descripción, el virus del dengue es la cepa UNC1017 (DEN1), la cepa West Pacific 74 (DEN1), la cepa S16803 (DEN2), la cepa UNC2005 (DEN2), la cepa UNC3001 (DEN3), UNC3043 (cepa de DEN3 059.AP-2 de Filipinas, 1984), la cepa UNC3009 (DEN3, D2863, Sri Lanka 1989), UNC3066 (DEN3, cepa 1342 de Puerto Rico 1977), la cepa CH53489 (DEN3), la cepa UNC4019 (DEN4) o TVP-360 (DEN4).
En modalidades de la descripción, un "fragmento inmunogénicamente activo" de un polipéptido del virus del dengue (por ejemplo, la proteína E) comprende, consiste esencialmente en o consiste en al menos aproximadamente 6, 8, 10, 12, 15, 20, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o más aminoácidos, opcionalmente aminoácidos contiguos, y/o menos de aproximadamente 495, 475, 450, 425, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75 o 50 aminoácidos, opcionalmente aminoácidos contiguos, incluyendo cualquier combinación de lo anterior siempre que el límite inferior sea menor que el límite superior, y el "fragmento inmunogénicamente activo" induzca una respuesta inmunitaria (por ejemplo,IgG y/o IgA que reaccione con el antígeno nativo), opcionalmente una respuesta inmunitaria protectora, contra el virus del dengue en un hospedero e induzca la producción de anticuerpos que se unan específicamente al epítopo del virus del dengue cuaternario recientemente identificado por los inventores.
El término "epítopo" como se usa en la presente descripción significa una secuencia de aminoácidos específica que, cuando está presente en la conformación adecuada, proporciona un sitio reactivo para un anticuerpo (por ejemplo, un epítopo de células B) o un receptor de células T (por ejemplo,un epítopo de células T).
Las porciones de un polipéptido dado que incluyen un epítopo de células B pueden identificarse mediante el uso de cualquiera de las técnicas de mapeo de epítopos que se conocen en la técnica. (Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed., 1996, Humana Press, Totowa, N.J.). Por ejemplo, se pueden determinar epítopos lineales mediante, por ejemplo, la síntesis simultánea de grandes números de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula de proteína, y mediante la reacción de los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos todavía están unidos a los soportes. Dichas técnicas se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No 4,708,871; Geysen y otros. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen y otros, (1986) Molec. Immunol. 23:709-715.
De manera similar, los epítopos se identifican fácilmente mediante la determinación de la conformación espacial de aminoácidos tales como, por ejemplo,, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Las regiones antigénicas de las proteínas también pueden identificarse mediante el uso de gráficos estándares de antigenicidad e hidropatía, por ejemplo, la versión 1.0 del software Omiga comercializado por Oxford Molecular Group. Este programa de ordenador emplea el método Hopp/Woods (Hopp y otros., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828) para determinar los perfiles de antigenicidad y la técnica Kyte-Doolittle (Kyte y otros., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132) para los gráficos de hidropatía.
Generalmente, los epítopos de células T que participan en la estimulación del grupo celular del sistema inmune de un sujeto son péptidos cortos de aproximadamente 8-25 aminoácidos. Una forma común de identificar los epítopos de células T es usar péptidos sintéticos superpuestos y analizar grupos de estos péptidos, o los individuales, que se reconocen por las células T de animales inmunes al antígeno de interés, mediante el uso, por ejemplo, de un ensayo de Inmunospot ligado a enzimas (ELISPOT). Estos péptidos superpuestos también pueden usarse en otros ensayos, como la estimulación de la liberación o secreción de citoquinas, o evaluarse mediante la construcción de tetrámeros de histocompatibilidad mayor (MHC) que contienen el péptido. Estos fragmentos inmunogénicamente activos también pueden identificarse en función de su capacidad para estimular la proliferación de linfocitos en respuesta a la estimulación por diversos fragmentos del antígeno de interés.
La presente descripción se puede poner en práctica con fines profilácticos, terapéuticos y/o diagnósticos. Además, la descripción se puede poner en práctica para producir anticuerpos para cualquier propósito, como el diagnóstico o la investigación, o para la inmunización pasiva mediante transferencia a otro sujeto.
La presente invención proporciona además un estuche que comprende una o más composiciones de esta invención. Un experto en la técnica entenderá bien que el estuche de esta invención puede comprender uno o más recipientes y/o receptáculos para contener los reactivos (por ejemplo, anticuerpos, antígenos, ácidos nucleicos) del estuche, junto con tampones y/o diluyentes y/u otras soluciones e instrucciones para usar el estuche, como se conoce bien en la técnica. Estos estuches pueden comprender además adyuvantes y/u otros agentes inmunoestimuladores o inmunomoduladores, como se conoce bien en la técnica.
Las composiciones y estuches de la presente invención también pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, portadores, diluyentes, citocinas inmunoestimuladoras, etc. Los métodos actuales para preparar esas formas de dosificación se conocen, o resultarán evidentes, para los expertos en esta técnica.
La administración a un sujeto puede ser por cualquier ruta conocida en la técnica. Como ejemplos no limitantes, la ruta de administración puede ser por inhalación (por ejemplo, inhalación oral y/o nasal), oral, bucal (por ejemplo, sublingual), rectal, vaginal, tópica (incluida la administración en las vías respiratorias), intraocular, transdérmica, por vía parenteral (por ejemplo, intramuscular [por ejemplo, la administración al músculo esquelético], vías intravenosa, intraarterial, intraperitoneal y similares), subcutánea (incluida la administración en la planta del pie), vías intradérmica, intrapleural, intracerebral y/o intratecal.
Los epítopos, polipéptidos, VLP y vectores virales de la invención pueden administrarse per se o suministrando un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifica lo mismo.
Los compuestos inmunomoduladores, tales como quimiocinas y citocinas inmunomoduladoras (preferentemente, citocinas inductoras de CTL) pueden administrarse simultáneamente a un sujeto.
Las citocinas pueden administrarse por cualquier método conocido en la técnica. Las citocinas exógenas pueden administrarse al sujeto, o alternativamente, una secuencia de ácido nucleico que codifica una citocina puede suministrarse al sujeto usando un vector adecuado, y la citocina producida in vivo. En modalidades particulares, un adyuvante viral expresa la citocina.
En modalidades, dosis múltiples (por ejemplo, dos, tres o más) de una composición de la invención pueden administrarse sin patogenicidad detectable (por ejemplo, Síndrome de Choque por Dengue/Fiebre Hemorrágica del Dengue).
En modalidades de la invención, las vacunas multivalentes de la invención no dan como resultado interferencia inmune, por ejemplo, se induce una respuesta inmunitaria equilibrada contra todos los antígenos presentados. En modalidades de la invención, la respuesta equilibrada resulta en una inmunidad protectora contra DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4.
En modalidades de la invención, la vacuna multivalente puede formularse para la administración a un sujeto que tiene presente anticuerpos maternos contra el dengue.
Debe apreciarse que esta invención puede realizarse de formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las modalidades expuestas en la presente descripción. Estas modalidades más bien se proporcionan para que la descripción sea exhaustiva y completa, y refleje completamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. La terminología que se usa en la descripción de la invención en la presente descripción es con el propósito de describir modalidades particulares y no se pretende que sean limitantes de la invención.
Como se usa en la presente descripción, "un", "una", "el" o "la" pueden significar uno o más de uno. Por ejemplo, "una" célula puede significar una sola célula o una multiplicidad de células.
Además, como se usa en la presente descripción, "y/o" se refiere y abarca a todas y cada una de las combinaciones posibles de uno o más de los elementos enumerados asociados, así como la falta de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o").
El término “aproximadamente”, como se usa en la presente descripción cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad de dosis (por ejemplo, una cantidad de ácido graso) y similares, se entiende que abarca variaciones de ± 20 %, ± 10 %, ± 5 %, ± 1 %, ± 0.5 %, o incluso ± 0,1 % de la cantidad especificada.
Como se usa en la presente descripción, la frase de transición "que consiste esencialmente en" significa que el alcance de una reivindicación debe interpretarse para que abarque los materiales o etapas especificadas en la reivindicación, "y aquellos que no afectan materialmente la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s)" de la invención reivindicada. Ver, In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (énfasis en el original); ver además MPEP § 2111,03. Por lo tanto, el término "que consiste esencialmente en" cuando se usa en una reivindicación de esta invención no pretende interpretarse como equivalente a "que comprende".
Como se usa en la presente descripción, el término "ácido nucleico" abarca tanto ARN como ADN, incluyendo ADNc, ADN genómico, sintético (por ejemplo, ADN sintetizado químicamente) y ARN y ADN quiméricos. El ácido nucleico puede ser bicatenario o monocatenario. El ácido nucleico puede sintetizarse usando análogos de nuclétidos o derivados (por ejemplo, nucleótidos de inosina o fosforotioato). Tales nucleótidos se pueden usar, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen la capacidad de emparejamiento de bases alteradas o mayor resistencia a las nucleasas.
Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptido" abarca los péptidos y proteínas, (incluyendo las proteínas de fusión) a menos que se indique lo contrario.
Una "proteína de fusión" es un polipéptido producido cuando dos secuencias de nucleótidos heterólogas o fragmentos de las mismas que codifican para dos (o más) polipéptidos diferentes que no se encuentran fusionados en la naturaleza, se fusionan en el marco de lectura correcto de la traducción.
Un ácido nucleico "recombinante", polinucleótido o secuencia de nucleótidos es uno producido por técnicas de ingeniería genética.
Un polipéptido "recombinante" se produce a partir de un ácido nucleico, polipéptido o secuencia de nucleótidos recombinante.
Como se usa en la presente descripción, un polinucleótido "aislado" (por ejemplo, un "ácido nucleico aislado" o una "secuencia de nucleótidos aislada") significa un polinucleótido al menos parcialmente separado de al menos algunos de los otros componentes del organismo o virus natural, por ejemplo, los componentes estructurales celulares o virales u otros polipéptidos o ácidos nucleicos comúnmente encontrados asociados con el polinucleótido. Opcionalmente, pero no necesariamente, el polinucleótido "aislado" está presente en una concentración mayor (es decir, está enriquecido) en comparación con el material de partida (por ejemplo, al menos aproximadamente dos veces, tres veces, cuatro veces, diez veces, veinte veces, cincuenta veces, cien veces, quinientos veces, mil veces, diez mil veces o una mayor concentración). En modalidades representativas, el polinucleótido aislado es al menos aproximadamente 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más puro.
Un polipéptido "aislado" significa un polipéptido que está al menos parcialmente separado de al menos algunos de los otros componentes del organismo o virus natural, por ejemplo, los componentes estructurales celulares o virales u otros polipéptidos o ácidos nucleicos comúnmente encontrados asociados con el polipéptido. Opcionalmente, pero no necesariamente, el polipéptido "aislado" está presente en una concentración mayor (es decir, está enriquecido) en comparación con el material de partida (por ejemplo, al menos aproximadamente dos veces, tres veces, cuatro veces, diez veces, veinte veces, cincuenta veces, cien veces, quinientos veces, mil veces, diez mil veces o una mayor concentración). En modalidades representativas, el polipéptido aislado es al menos aproximadamente 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más puro.
Además, una célula "aislada" es aquella que se ha separado parcial o completamente de otros componentes con los que normalmente se asocia en la naturaleza. Por ejemplo, una célula aislada puede ser una célula en un medio de cultivo y/o una célula en un portador farmacéuticamente aceptable.
Los términos "inmunógeno" y "antígeno" se usan indistintamente en la presente descripción y significan cualquier compuesto (incluidos los polipéptidos) a los que se puede dirigir una respuesta inmunitaria celular y/o humoral. En modalidades particulares, un inmunógeno o antígeno puede inducir una respuesta inmunitaria protectora contra los efectos de la infección por el virus del dengue.
Una "cantidad efectiva" como se usa en la presente descripción se refiere a una cantidad de un vector, ácido nucleico, epítopo, polipéptido, célula, partícula, VLP, composición o formulación de la invención que es suficiente para producir un efecto deseado, que puede ser un efecto terapéutico y/o beneficioso. La cantidad efectiva variará con la edad, la condición general del sujeto, la gravedad de la afección a tratar, el agente particular administrado, la duración del tratamiento, la naturaleza de cualquier tratamiento concurrente, el portador farmacéuticamente aceptable usado y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia de los expertos en la técnica. Una "cantidad efectiva" apropiada en cualquier caso individual puede determinarse por un experto en la técnica por referencia a los textos y la literatura pertinentes y/o mediante el uso en experimentación de rutina.
El término "cantidad inmunogénica" o "dosis inmunizante efectiva", como se usa en la presente descripción, a menos que se indique lo contrario, significa una cantidad o dosis suficiente para inducir una respuesta inmunitaria (que opcionalmente puede ser una respuesta protectora) en el sujeto tratado, que es mayor que la inmunidad inherente de los sujetos no inmunizados. Una cantidad inmunogénica o una dosis inmunizante efectiva en cualquier contexto particular puede determinarse rutinariamente usando métodos conocidos en la técnica.
Los términos "vacuna", "vacunación" e "inmunización" se conocen bien en la técnica, y se usan indistintamente en la presente descripción. Por ejemplo, los términos vacuna, vacunación o inmunización pueden entenderse como un proceso o composición que aumenta la reacción inmune de un sujeto a un inmunógeno (por ejemplo, proporcionando una respuesta inmunitaria activa) y, por lo tanto, su capacidad para resistir, superar y/o recuperarse de una infección (es decir,una respuesta inmunitaria protectora).
Por los términos "tratar", o "tratamiento de" (y las variaciones gramaticales de los mismos) se entiende que la gravedad de la afección del sujeto se reduce, al menos mejora o se alivia parcialmente, y/o que se logra algún alivio, mitigación o disminución en al menos un síntoma clínico y/o hay un retraso en la progresión de la enfermedad o el trastorno. En modalidades representativas, los términos "tratar", o "tratamiento de" (y las variaciones gramaticales de los mismos) se refieren a una reducción en la gravedad de la viremia y/o un retraso en la progresión de la viremia, con o sin otros signos de enfermedad clínica.
Una cantidad "efectiva para el tratamiento" como se usa en la presente descripción es una cantidad suficiente para tratar (como se define en la presente descripción) al sujeto. Aquellos con experiencia en la técnica apreciarán que los efectos terapéuticos no necesitan ser completos o curativos, siempre y cuando algún beneficio se proporciona al sujeto.
El término "prevenir", o "prevención de" (y las variaciones gramaticales de los mismos) se refieren a la prevención y/o el retraso del inicio y/o la progresión de una enfermedad, trastorno y/o los síntomas clínicos en un sujeto y/o una reducción en la severidad del inicio y/o la progresión de la enfermedad, trastorno y/o síntoma(s) clínico(s) en relación con lo que ocurriría en ausencia de los métodos de la invención. En modalidades representativas, los términos "prevenir", o "prevención de" (y las variaciones gramaticales de los mismos) se refieren a la prevención y/o retraso del inicio y/o la progresión de la viremia en el sujeto, con o sin otros signos de enfermedad clínica. La prevención puede ser completa, por ejemplo, la ausencia total de la enfermedad, trastorno y/o síntoma(s) clínico(s). La prevención también puede ser parcial, de manera que la aparición de la enfermedad, trastorno y/o los síntomas clínicos en el sujeto y/o la gravedad del inicio y/o la progresión es menor de lo que ocurriría en ausencia de la presente invención.
Una cantidad "efectiva de prevención" como se usa en la presente descripción es una cantidad suficiente para prevenir (como se define en la presente descripción) la enfermedad, trastorno y/o síntoma clínico en el sujeto. Aquellos con experiencia en la técnica apreciarán que los niveles de prevención no necesitan ser completos o curativos, siempre y cuando algún beneficio se proporciona al sujeto.
La eficacia del tratamiento y/o la prevención de la infección por el virus del dengue por los métodos de la presente invención se puede determinar mediante la detección de una mejoría clínica como lo indica un cambio en los síntomas y/o parámetros clínicos del sujeto (por ejemplo, viremia), como bien sabría un experto en la técnica.
A menos que se indique lo contrario, los términos "proteger", "protegiendo", "protección" y "protector" (y sus variaciones gramaticales) abarcan los métodos para prevenir y tratar la infección por el virus del dengue en un sujeto, ya sea contra una o múltiples cepas, genotipos o serotipos del virus del dengue.
Los términos respuesta inmunitaria "protectora" o inmunidad "protectora" tal como se usan en la presente descripción indican que la respuesta inmunitaria confiere algún beneficio al sujeto en el sentido de que previene o reduce la incidencia y/o gravedad y/o la duración de la enfermedad o cualquier otra manifestación de infección. Por ejemplo, en modalidades representativas, una respuesta inmunitaria protectora o inmunidad protectora da como resultado una viremia reducida, acompañada o no de enfermedad clínica. Alternativamente, una respuesta inmunitaria protectora o inmunidad protectora puede ser útil en el tratamiento terapéutico de la enfermedad existente.
Una "respuesta inmunitaria activa" o "inmunidad activa" se caracteriza por la "participación de células y tejidos del huésped después de un encuentro con el inmunógeno. Implica la diferenciación y proliferación de células inmunocompetentes en los tejidos linforreticulares, lo que conduce a la síntesis de anticuerpos o al desarrollo de reactividad mediada por células, o ambas". Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, en IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985). Alternativamente, el huésped desarrolla una respuesta inmunitaria activa después de la exposición a inmunógenos por infección o por vacunación. La inmunidad activa puede contrastarse con la inmunidad pasiva, la cual se adquiere a través de la "transferencia de sustancias preformadas (anticuerpo, factor de transferencia, injerto tímico, interleucina-2) de un hospedero inmunizado activamente a un huésped no inmune". Id.
Un "sujeto" de la invención incluye cualquier animal susceptible a la infección por el virus del dengue. Este sujeto es generalmente un mamífero (por ejemplo, un animal de laboratorio como una rata, ratón, conejillo de indias, conejo, primates, etc..), un animal de granja o comercial (por ejemplo, una vaca, caballo, cabra, burro, oveja, etc..), o un animal doméstico (por ejemplo, gato, perro, hurón, etc..). En modalidades particulares, el sujeto es un primate, un primate no humano (porejemplo, un chimpancé, babuino, mono, gorila, etc..) o un humano. Los sujetos de la invención puede ser un sujeto que se conozca o se crea que está en riesgo de infección por el virus del dengue. Alternativamente, un sujeto de acuerdo con la invención también puede incluir un sujeto que no se no se conozca previamente o se sospeche de estar infectado por el virus del dengue, o que necesite tratamiento para la infección por el virus del dengue.
Los sujetos pueden tratarse para cualquier propósito, tal como para provocar una respuesta inmunitaria protectora o para provocar la producción de anticuerpos en ese sujeto, los cuales se pueden recolectar y usar para otros fines, como puede ser fines de investigación o diagnóstico o para administrar a otros sujetos y producir inmunidad pasiva en los mismos, etc.
Los sujetos incluyen hombres y/o mujeres de cualquier edad, incluidos los recién nacidos, jóvenes, maduros y geriátricos. Con respecto a sujetos humanos, en modalidades representativas, el sujeto puede ser un bebé (por ejemplo, menos de aproximadamente 12 meses, 10 meses, 9 meses, 8 meses, 7 meses, 6 meses o menos), un niño pequeño (por ejemplo, al menos aproximadamente 12, 18 o 24 meses y/o menos aproximadamente 36, 30 o 24 meses), o un niño (por ejemplo,de al menos 1, 2, 3, 4 o 5 años de edad aproximadamente y/o menos aproximadamente 14, 12, 10, 8, 7, 6, 5 o 4 años de edad). En las modalidades de la invención, el sujeto es un humano que tiene aproximadamente de 0 a 3, 4, 5, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48 o 60 meses de edad, o de aproximadamente 3 a los 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48 o 60 meses de edad, o de aproximadamente 6 a 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48 o 60 meses de edad, de aproximadamente 9 a 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48 o 60 meses de edad, o de aproximadamente 12 a 18, 24, 36, 48 o 60 meses de edad, o de aproximadamente 18 a 24, 30, 36, 48 o 60 meses de edad, o de aproximadamente 24 a 30, 36, 48 o 60 meses de edad.
En modalidades de la invención, el sujeto tiene anticuerpos maternos contra el virus del dengue.
Un "sujeto necesitado" de los métodos de la invención puede ser un sujeto que se conozca o se sospeche que está infectado o en riesgo de infectarse con el virus del dengue.
También se proporcionan formulaciones farmacéuticas (por ejemplo, una formulación inmunogénica) que comprende los epítopos del virus del dengue, polipéptidos, VLP de flavivirus quimérico o partículas de flavivirus quiméricas, ácidos nucleicos, vectores, células o composiciones de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable, y puede formularse para la administración en un portador farmacéutico de acuerdo con las técnicas conocidas. Ver, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (última edición). En la fabricación de una composición farmacéutica de acuerdo con las modalidades de la presente invención, la composición de la invención se mezcla típicamente con, entre otros, un portador farmacéuticamente aceptable. Por "portador farmacéuticamente aceptable" se entiende un portador que es compatible con otros ingredientes en la composición farmacéutica y que no es perjudicial o nocivo para el sujeto. El portador puede ser un sólido o un líquido, o ambos, y puede formularse preferentemente con la composición de la invención como una formulación de dosis unitaria, por ejemplo, una tableta, la cual puede contener de aproximadamente 0.01 a 0.5 % a aproximadamente de 95 % a 99% en peso de la composición. Las composiciones farmacéuticas se preparan por cualquiera de las técnicas de farmacia bien conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a, la mezcla de los componentes, incluyendo opcionalmente uno o más ingredientes secundarios. En ciertas modalidades, el portador farmacéuticamente aceptable es estéril y se consideraría adecuado para la administración a sujetos humanos de acuerdo con las directrices reguladoras para composiciones farmacéuticas que comprende el portador.
Además, un componente "farmacéuticamente aceptable" tal como una sal, portador, excipiente o diluyente de una composición de acuerdo con la presente invención es un componente que (i) es compatible con los otros ingredientes de la composición ya que puede combinarse con las composiciones de la presente invención sin hacer que la composición sea inadecuada para su propósito pretendido, y (ii) es adecuada para su uso con sujetos como se proporciona en la presente descripción sin efectos secundarios adversos excesivos (tales como toxicidad, irritación y respuesta alérgica). Los efectos secundarios son "excesivos" cuando su riesgo supera el beneficio proporcionado por la composición. Los ejemplos no limitantes de componentes farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera de los portadores farmacéuticos estándares tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua, microemulsiones, y varios tipos de agentes humectantes.
En algunas modalidades, las composiciones de la invención pueden comprender además uno o más de un adyuvante. Los adyuvantes de la presente invención pueden estar en forma de una secuencia de aminoácidos y/o en forma de un ácido nucleico que codifica para un adyuvante. Cuando está en forma de un ácido nucleico, el adyuvante puede ser un componente de un ácido nucleico que codifica el(los) polipéptido(s) o fragmento(s) o epítopo(s) y/o un componente separado de la composición que comprende el ácido nucleico que codifica para el(los) polipéptido(s) o fragmento(s) o epítopo(s) de la invención. De acuerdo con la presente invención, el adyuvante también puede ser una secuencia de aminoácidos que es un péptido, un fragmento de proteína o una proteína completa que funciona como un adyuvante, y/o el adyuvante puede ser un ácido nucleico que codifica para un péptido, fragmento de proteína o proteína completa que funciona como un adyuvante. Como se usa en la presente descripción, "adyuvante" describe una sustancia, que puede ser cualquier sustancia inmunomoduladora capaz de combinarse con una composición de la invención para potenciar, mejorar o de otra manera modular una respuesta inmunitaria en un sujeto.
En modalidades adicionales, el adyuvante puede ser, pero sin limitarse a, una citocina inmunoestimuladora (que incluye, pero sin limitarse a, GM/CSF, interleucina-2, interleucina-12, interferón-gamma, interleucina-4, factor de necrosis tumoralalfa, interleucina-1, factor hematopoyético flt3L, CD40L, moléculas coestimuladoras B7.1 y B7.2), formulación adyuvante SYNTEX 1 (SAF-1) compuesta de 5 por ciento (peso/volumen) de escualeno (DASF , Parsippany, N.J.), 2.5 por ciento de Pluronic, el polímero L121 (Aldrich Chemical, Milwaukee) y 0.2 por ciento de polisorbato (Tween 80, Sigma) en solución salina tamponada con fosfato. Los adyuvantes adecuados también incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alum), fosfato de aluminio o algannmulin, pero también puede ser una sal de calcio, hierro o zinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada o azúcares acilados catiónicamente o polisacáridos aniónicamente derivados, o polifosfacenos.
Otros adyuvantes adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen sin limitación MF 59, LT-K63, LT-R72 (Pal y otros., Vaccine 24(6):766-75 (2005)), QS-21, adyuvante de Freund (completo e incompleto), hidróxido de aluminio, N-acetilomuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetilo-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, mencionado como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-e-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, mencionado como MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacteria, monofosforil lípido A, trealosa dimicolato y la cadena principal de la pared celular (MPL+TDM+CWS) en 2 % de emulsión de escualeno/Tween 80.
Los adyuvantes adicionales pueden incluir, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferentemente monofosforil 3-de-O-acilado lípido A (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. Un sistema adyuvante mejorado implica la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en la publicación PCT número WO 94/00153, o una composición menos reactogénica donde el QS21 se inactiva con el colesterol como se describe en la publicación PCT número WO 96/33739. Una formulación adyuvante particularmente potente que involucra QS21 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en la publicación PCT número WO 95/17210. Además, las composiciones de ácido nucleico de la invención pueden incluir un adyuvante al comprender una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno y una secuencia de nucleótidos que proporciona una función adyuvante, tal como las secuencias de CpG. Estas secuencias de CpG, o motivos, se conocen bien en la técnica.
Un adyuvante para su uso con la presente invención, tal como, por ejemplo, una citocina inmunoestimuladora, se puede administrar antes, simultáneamente con y/o dentro de unas pocas horas, varias horas, y/o 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9 y/o 10 días antes y/o después de la administración de una composición de la invención a un sujeto.
Además, cualquier combinación de adyuvantes, tales como las citocinas inmunoestimuladoras, se pueden administrar conjuntamente al sujeto antes, después y/o simultáneamente con la administración de una composición inmunogénica de la invención. Por ejemplo, las combinaciones de citocinas inmunoestimuladoras pueden consistir en dos o más citocinas inmunoestimuladoras, comoGM/CSF, interleucina-2, interleucina-12, interferón-gamma, interleucina-4, factor de necrosis tumoral-alfa, interleucina-1, factor hematopoyético flt3L, CD40L, y moléculas coestimuladoras B7.1 y B7.2. La efectividad de un adyuvante o combinación de adyuvantes puede determinarse midiendo la respuesta inmunitaria producida en respuesta a la administración de una composición de esta invención a un sujeto con y sin el adyuvante o una combinación de adyuvantes, usando procedimientos estándares, como se describe en la presente descripción y como se conoce en la técnica.
En modalidades de la invención, el adyuvante comprende un adyuvante de alfavirus como se describe, por ejemplo en el documento US 7,862,829.
Las dosis de refuerzo pueden administrarse adicionalmente a lo largo de días, semanas, meses o años. En la infección crónica, las dosis altas iniciales seguidas de dosis de refuerzo pueden ser ventajosas.
Las formulaciones farmacéuticas de la invención pueden comprender opcionalmente otros agentes medicinales, farmacéuticos, agentes estabilizadores, tampones, portadores, diluyentes, sales, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.
Para una inyección, el portador será típicamente un líquido. Para otros métodos de administración, el portador puede ser sólido o líquido. Para la administración por inhalación, el portador será respirable, y típicamente está en forma de partículas sólidas o líquidas.
Las composiciones de la invención se pueden formular para su administración en un portador farmacéutico de acuerdo con técnicas conocidas. Ver, por ejemplo,Remington, The Science and Practice of Pharmacy (9na Ed. 1995). En la preparación de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, las VLP se mezclan típicamente con, entre otros, un portador aceptable. El portador puede ser un sólido o un líquido, o ambos, y se formula opcionalmente con el compuesto como una formulación de dosis unitaria, por ejemplo, una tableta. Se puede usar una variedad de portadores acuosos farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0.9 %, glicina al 0.3 %, ácido hialurónico, agua libre de pirógenos, solución salina tamponada con fosfato libre de pirógenos, agua bacteriostática o Cremophor EL[R] (BASF, Parsippany, N.J.), y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas convencionales. Las formulaciones de la invención pueden prepararse mediante cualquiera de las técnicas de farmacia bien conocidas.
Las formulaciones farmacéuticas pueden envasarse para su uso tal cual, o liofilizarse, la preparación liofilizada generalmente se combina con una solución acuosa estéril antes de la administración. Las composiciones pueden envasarse además en envases de dosis únicas o multidosis, por ejemplo, en ampollas y viales sellados.
Las formulaciones farmacéuticas pueden formularse para la administración por cualquier método conocido en la técnica de acuerdo con técnicas convencionales de farmacia. Por ejemplo, las composiciones pueden formularse para administrarse por vía intranasal, por inhalación (por ejemplo, inhalación oral), oral, bucal (por ejemplo, por vía sublingual), rectal, vaginal, tópica, intratecal, intraocular, transdérmica, por administración parenteral (por ejemplo, intramuscular [por ejemplo, músculo esquelético], intravenoso, subcutáneo, intradérmico, intrapleural, intracerebral e intraarterial, intratecal) o tópicamente (por ejemplo, tanto en la piel como en las superficies mucosas, incluidas las superficies de las vías respiratorias).
Para la administración intranasal o por inhalación, la formulación farmacéutica puede formularse como un aerosol (este término incluye tanto aerosoles líquidos como polvo seco). Por ejemplo, la formulación farmacéutica puede proporcionarse en una forma finamente dividida junto con un surfactante y un propulsor. Los porcentajes típicos de la composición son 0.01-20 % en peso, preferentemente 1-10 %. El surfactante es generalmente no tóxico y soluble en el propulsor. Los compuestos representativos de estos agentes son los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, como los ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico, con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Se pueden emplear ésteres mixtos, tales como glicéridos mixtos o naturales. El surfactante puede constituir 0.1-20 % en peso de la composición, preferentemente 0.25-5 %. El equilibrio de la composición es normalmente el propulsor. Si se desea, también se puede incluir un portador, tal como con lecitina para administración intranasal. Los aerosoles de partículas líquidas pueden producirse por cualquier medio adecuado, tal como con un nebulizador de aerosol impulsado por presión o un nebulizador ultrasónico, como conocen los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4,501,729. Los aerosoles de partículas sólidas pueden producirse igualmente con cualquier generador de aerosol de medicamento particulado sólido, por técnicas conocidas en la industria farmacéutica. La administración intranasal también puede ser por la administración de gotas en una superficie nasal.
Las formulaciones inyectables pueden prepararse en formas convencionales como soluciones líquidas o suspensiones, como formas sólidas adecuadas para una solución o suspensión en el líquido previo a la inyección, o como emulsiones. Alternativamente, las formulaciones farmacéuticas pueden administrarse de manera local en lugar de una manera sistémica, por ejemplo, en una formulación de liberación sostenida o de depósito.
Las soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas pueden prepararse a partir de polvos, gránulos y tabletas estériles del tipo descrito anteriormente. Por ejemplo, puede proporcionarse una formulación estéril inyectable, estable de la invención en una forma de dosificación unitaria en un recipiente sellado. La formulación puede proporcionarse en forma de un liofilizado, el cual es capaz de reconstituirse con un portador adecuado farmacéuticamente aceptable para formar una composición líquida adecuada para inyectar en un sujeto. La forma de dosificación unitaria puede ser de aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 10 gramos de la formulación. Cuando la formulación es sustancialmente insoluble en agua, se puede incluir un agente emulsionante, que es farmacéuticamente aceptable, en una cantidad suficiente para emulsionar la formulación en un portador acuoso. Uno de los agentes emulsionantes útiles es la fosfatidilcolina.
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración por vía oral pueden presentarse en unidades discretas, tales como cápsulas, sellos para medicamentos, pastillas, o tabletas, en forma de polvo o gránulos; como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite. El suministro oral se puede realizar formando un complejo de uno o más compuestos de la presente invención en un portador capaz de resistir la degradación por enzimas digestivas en el intestino de un animal. Los ejemplos de estos portadores incluyen las cápsulas o tabletas de plástico, como se conoce en la técnica. Estas formulaciones pueden prepararse por cualquier método adecuado de farmacia que incluya la etapa de asociar las proteínas y un portador adecuado (que puede contener uno o más ingredientes auxiliares como se señaló anteriormente). En general, las formulaicones farmacéuticas se preparan mediante un mezclado uniforme e intrínseco del(los) compuesto(s) con un portador líquido o sólido finamente dividido, o ambos, y después si es necesario, la conformación de la mezcla resultante. Por ejemplo, una tableta puede prepararse mediante compresión o moldeo de un polvo o gránulos, opcionalmente con uno o más ingredientes auxiliares. Las tabletas comprimidas se preparan por compresión, en una máquina adecuada, la formulación en una forma de flujo libre, tal como un polvo o gránulos mezclados opcionalmente con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, y/o agente(s) activo(s) de superficie/dispersantes. Las tabletas moldeadas se fabrican mediante moldeo, en una máquina adecuada, de la proteína en polvo humedecida con un aglutinante líquido inerte.
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración bucal (sublingual) incluyen pastillas que comprenden el(los) compuesto(s) en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; y pastillas en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia.
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral comprenden soluciones para inyección acuosas y no acuosas estériles, cuyas preparaciones son preferentemente isotónicas con la sangre del receptor indicado. Estas preparaciones pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos, las cuales hacen la composición isotónica con la sangre del receptor indicado. Las suspensiones, soluciones y emulsiones estériles acuosas y no acuosas pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Los ejemplos de solventes no acuosos son el propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, que incluyen una solución salina y medios tamponados. Los portadores parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, lactato de Ringer y aceites fijos. Los portadores intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes y similares.
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración rectal se presentan opcionalmente como supositorios de dosis unitaria. Estas pueden prepararse mediante la mezcla del agente activo con uno o más portadores sólidos convencionales, tal como por ejemplo, manteca de cacao, y después conformar la mezcla resultante.
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la aplicación tópica en la piel tienen preferentemente la forma de un ungüento, crema, loción, pasta, gel, atomizador, aerosol, o aceite. Los portadores que pueden usarse incluyen, entre otros, vaselina, lanolina, polietilenglicoles, alcoholes, potenciadores transdérmicos, y las combinaciones de dos o más de estos. En algunas modalidades, por ejemplo, la administración tópica se puede realizar mezclando una formulación farmacéutica de la presente invención con un reactivo lipofílico (por ejemplo, DMSO) que es capaz de atravesar la piel.
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración transdérmica pueden presentarse en forma de parches discretos que se adaptan para mantenerse en contacto estrecho con la epidermis del sujeto durante un período de tiempo prolongado. Las formulaciones adecuadas para la administración transdérmica pueden suministrarse, además, por iontoforesis (ver, por ejemplo, Pharmaceutical Research 3:318 (1986)) y adoptarán típicamente la forma de una solución acuosa tamponada del (los) compuesto(s). Las formulaciones adecuadas pueden comprender tampón de citrato 0 bis/tris (pH 6) o etanol/agua y contienen de 0.1 a 0.2M de ingrediente activo.
En modalidades de la invención, la dosificación de una partícula viral de esta invención puede estar en el intervalo de aproximadamente 104 a aproximadamente 107 unidades formadoras de placas (PFU). En modalidades de esta invención, la dosificación de una VLP de esta invención puede estar en un intervalo de 500 microgramos a aproximadamente 5 miligramos. En modalidades de esta invención, la dosificación de una proteína de esta invención puede estar en el intervalo de 100 a aproximadamente 104 microgramos /- adyuvante.
Además, la composición puede formularse como una formulación liposomal. La capa lipídica empleada puede ser de cualquier composición convencional y puede contener o no colesterol. Los liposomas que se producen pueden reducirse en tamaño, por ejemplo, mediante el uso de técnicas estándares de sonicación y homogeneización.
Las formulaciones liposomales pueden liofilizarse para producir un liofilizado que puede reconstituirse con un portador farmacéuticamente aceptable, como agua, para regenerar una suspensión liposomal.
Las formulaciones inmunogénicas de la invención pueden ser opcionalmente estériles, y pueden proporcionarse además en un recipiente cerrado impermeable a los patógenos.
EJEMPLOS
La biología sintética ofrece un control genético incomparable sobre la estructura del genoma, la expresión y la organización de los genomas virales. El complejo del virus del dengue (DENV) consta de cuatro virus estrechamente relacionados designados como serotipos de DENV 1-4, que son antigénicamente similares pero inducen patrones complejos de neutralización reactiva cruzada y potencian las respuestas de anticuerpos en poblaciones humanas. Para estudiar las relaciones antigénicas entre los serotipos de DENV, se describe la construcción y caracterización de un panel de clones moleculares de DENV1-4 estables y virus recombinantes basados en aislamientos clínicos de bajo pase. Los virus recombinantes se replicaron como los virus de tipo salvaje y se codificaron para mutaciones marcadoras apropiadas. Para evaluar el papel de la variación natural en DENV3, se realizaron cuatro construcciones isogénicas diseñadas sintéticamente reemplazando el gen de la glicoproteína (E) de la envoltura original por genes E basados en los cuatro genotipos genética y geográficamente distintos de DENV-3. Los virus recombinantes fueron viables, evaluados para el crecimiento en insectos y mamíferos huésped, y las pruebas de neutralización monoclonal y policlonal demostraron que la microvariación natural entre la neutralización de DEN3 influye en los patrones de susceptibilidad de neutralización cruzada. Para evaluar el uso de la tecnología de ADN recombinante para mapear epítopos definidos, se usaron mutaciones de escape y mapeo de epítopos para mapear las coordenadas de varios epítopos. Luego, se intercambiaron estos epítopos entre las cepas. Los virus recombinantes fueron viables y los ensayos de ganancia y pérdida de función con sueros monoclonales y policlonales revelaron patrones antigénicos que revelan consideraciones importantes en el diseño de la vacuna.
El anticuerpo monoclonal humano (mAb) 5J7 contra el virus dengue (DENV) neutraliza potentemente el serotipo 3 de DENV (DENV-3) uniéndose a un epítopo en la glicoproteína de la envoltura (E) de DENV-3. Este epítopo abarca la región E conocida como la bisagra del dominio E I-II (EDI-II). Al usar una plataforma de clones de infección por DENV, el epítopo de DENV-3 5J7 se trasplantó en una glicoproteína E del serotipo 1 de DENV (DENV-1). Este trasplante hace que el virus DENV-1/3 recombinante sea sensible a la neutralización por mAb 5J7. Significativamente, el trasplante no interrumpe la estructura antigénica nativa de DENV-1, y el virus recombinante es sensible a los sueros policlonales humanos de d En V-1 y DENV-3. Esta sensibilidad indica que la glicoproteína E quimérica de DENV-1/3 puede funcionar como una vacuna bivalente capaz de inducir anticuerpos neutralizantes contra dos serotipos de virus: DENV-1 y DENV-3.
Lo anterior es ilustrativo de la presente invención, y no debe interpretarse como una limitante de esta. La invención se define mediante las siguientes reivindicaciones
Tabla 2. Sustituciones de nucleótidos en DCS de WestPac'74 (DENV-1) para producir la bisagra DENV 1-3
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Tabla 3.
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Tabla 4.
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Tabla 5.
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Secuencias
Secuencia de aminoácidos de UNC 3001 (DENV-3)
MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVCKHTYVDRGWGNGCGLFGKGSLVTCAKFQ CLEPIEGKVVQYENLKYTVIITVHTGDQHQVGNETQGVTAIIT--PQASTTEAILPEYGT LGLECSPRTGLDFNEMILLTMKNKAWMVHRQWFFDLPLPWTSGATTETPTWNRKELLVTF KNAHAKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQNSGGTSIFAGHLKCRLKMDKLELKGMSYA MCTNTFVLKKEVSETQHGTILIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQGKAHNGRLITANPVVTK KEEPVNIEAEPPFGESNIVIGIGDNALKINWYKKG
Secuencia de aminoácidos de WestPac74 (DENV-1)
MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGSCVTTMAKDKPTLDIELLKTEVTNPAVLRKLC IEAKISNTTTDSRCPTQGEATLVEEQDTNFVCRRTFVDRGWGNGCGLFGKGSLITCAKFK CVTKLEGKIVQYENLKYSVIVTVHTGDQHQVGNETTEHGTTATITPQAPTSEIQLTDYGA LTLDCSPRTGLDFNEMVLLTMEKKSWLVHKQWFLDLPLPWTSGASTSQETWNRQDLLVTF KTAHAKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQTSGTTTIFAGHLKCRLKMDKLTLKGMSYV MCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSSQDEKGVTQNGRLITANPIVTD KEKPVNIEAEPPFGESYIVVGAGEKALKLSWFKKG
Secuencia de aminoácidos de la bisagra de WestPac74 (DENV 1/3)
MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGSCVTTMAKDKPTLDIELLKTEATQLATLRKLC IEAKISNTTTDSRCPTQGEATLVEEQDTNFVCRRTFVDRGWGNGCGLFGKGSLITCAKFK CVTKIEGKVVQYENLKYSVIVTVHTGDQHQVGNETTEHGTIATITPQAPTSEIQLTDYGA LTLDCSPRTGLDFNEMILLTMKNKAWMVHRQWFLDLPLPWTSGASTSQETWNRQDLLVTF KTAHAKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQNSGGTSIFAGHLKCRLKMDKLTLKGMSYV MCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSSQDEKGVTQNGRLITANPIVTD KEKPVNIEAEPPFGESYIVVGAGEKALKLSWFKKG
Secuencia de aminoácidos de 3001-1F4E (DENV 3/1)
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icDengueIII UNC 3001
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aagaaggagc aatgcacact gcgttgactg gagcgacaga 1740 aatccaaacg tctggaacga caacaatttt tgcaggacac ctgaaatgca gactaaaaat 1800 ggataaactg actttaaaag ggatgtcata tgtaatgtgc acagggtcat tcaagttaga 1860 gaaggaagtg gctgagaccc agcatggaac tgttctagtg caggttaaat acgaaggaac 1920 agatgcacca tgcaagatcc ccttctcgtc ccaagatgag aagggagtaa cccagaatgg 1980 gagattgata acagccaacc ccatagtcac tgacaaagaa aaaccagtca acattgaagc 2040 ggagccacct tttggtgaga gctacattgt ggtaggagca ggtgaaaaag ctttgaaact 2100 aagctggttc aagaagggaa gcagtatagg gaaaatgttt gaagcaactg cccgtggagc 2160 acgaaggatg gccatcctgg gagacactgc atgggacttc ggttctatag gaggggtgtt 2220 cacgtctgtg ggaaaactga tacaccagat ttttgggact gcgtatggag ttttgttcag 2280 cggtgtttct tggaccatga agataggaat agggattctg ctgacatggc taggattaaa 2340 ctcaaggagc acgtcccttt caatgacgtg tatcgcagtt ggcatggtca cgctgtacct 2400 aggagtcatg gttcaggcgg actcgggatg tgtaatcaac tggaaaggca gagaactcaa 2460 atgtggaagc ggcatttttg tcaccaatga agtccacacc tggacagagc aatataaatt 2520 ccaggccgac tcccctaaga 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tacgtttcaa aggagaagac gggtgctggt acggcatgga 3420 aatcagacca gtcaaggaga aggaagagaa cctagttaag tcaatggtct ctgcagggtc 3480 aggagaagtg gacagttttt cactaggact gctatgcata tcaataatga tcgaagaggt 3540 aatgagatcc agatggagca gaaaaatgct gatgactgga acattggctg tgttcctcct 3600 tcttacaatg ggacaattga catggaatga tctgatcagg ctatgtatca tggttggagc 3660 caacgcttca gacaagatgg ggatgggaac aacgtaccta gctttgatgg ccactttcag 3720 aatgagacca atgttcgcag tcgggctact gtttcgcaga ttaacatcta gagaagttct 3780 tcttcttaca gttggattga gtctggtggc atctgtagaa ctaccaaatt ccttagagga 3840 gctaggggat ggacttgcaa tgggcatcat gatgttgaaa ttactgactg attttcagtc 3900 acatcagcta tgggctacct tgctgtcttt aacatttgtc aaaacaactt tttcattgca 3960 ctatgcatgg aagacaatgg ctatgatact gtcaattgta tctctcttcc ctttatgcct 4020 gtccacgact tctcaaaaaa caacatggct tccggtgttg ctgggatctc ttggatgcaa 4080 accactaacc atgtttctta taacagaaaa caaaatctgg ggaaggaaaa gctggcctct 4140 caatgaagga attatggctg ttggaatagt tagcattctt ctaagttcac ttctcaagaa 4200 tgatgtgcca ctagctggcc cactaatagc tggaggcatg ctaatagcat gttatgtcat 4260 atctggaagc tcggccgatt tatcactgga gaaagcggct gaggtctcct gggaagaaga 4320 agcagaacac tctggtgcct cacacaacat actagtggag gtccaagatg atggaaccat 4380 gaagataaag gatgaagaga gagatgacac actcaccatt ctcctcaaag caactctgct 4440 agcaatctca ggggtatacc caatgtcaat accggcgacc ctctttgtgt ggtatttttg 4500 gcagaaaaag aaacagagat caggagtgct atgggacaca cccagccctc cagaagtgga 4560 aagagcagtc cttgatgatg gcatttatag aattctccaa agaggattgt tgggcaggtc 4620 tcaagtagga gtaggagttt ttcaagaagg cgtgttccac acaatgtggc acgtcaccag 4680 gggagctgtc ctcatgtacc aagggaagag actggaacca agttgggcca gtgtcaaaaa 4740 agacttgatc tcatatggag gaggttggag gtttcaagga tcctggaacg cgggagaaga 4800 agtgcaggtg attgctgttg aaccggggaa gaaccccaaa aatgtacaga cagcgccggg 4860 taccttcaag acccctgaag gcgaagttgg agccatagct ctagacttta aacccggcac 4920 atctggatct cctatcgtga acagagaggg aaaaatagta ggtctttatg gaaatggagt 4980 ggtgacaaca agtggtacct acgtcagtgc catagctcaa gctaaagcat cacaagaagg 5040 gcctctacca gagattgagg acgaggtgtt taggaaaaga aacttaacaa taatggacct 5100 acatccagga tcgggaaaaa caagaagata ccttccagcc atagtccgtg aggccataaa 5160 aagaaagctg cgcacgctag tcttagctcc cacaagagtt gtcgcttctg aaatggcaga 5220 ggcgctcaag ggaatgccaa taaggtatca gacaacagca gtgaagagtg aacacacggg 5280 aaaggagata gttgacctta tgtgtcacgc cactttcact atgcgtctcc tgtctcctgt 5340 gagagttccc aattataata tgattatcat ggatgaagca catttcaccg atccagccag 5400 catagcagcc agagggtata tctcaacccg agtgggtatg ggtgaagcag ctgcgatttt 5460 catgacagcc actccccccg gatcggtgga ggcctttcca cagagcaatg cagttatcca 5520 agatgaggaa agagacattc ctgaaagatc atggaactca ggctatgact ggatcactga 5580 tttcccaggt aaaacagtct ggtttgttcc aagcatcaaa tcaggaaatg acattgccaa 5640 ctgtttaaga aagaatggga aacgggtggt ccaattgagc agaaaaactt ttgacactga 5700 gtaccagaaa acaaaaaata acgactggga ctatgttgtc acaacagaca tatccgaaat 5760 gggagcaaac ttccgagccg acagggtaat agacccgagg cggtgcctga aaccggtaat 5820 actaaaagat ggcccagagc gtgtcattct agccggaccg atgccagtga ctgtggctag 5880 cgccgcccag aggagaggaa gaattggaag gaaccaaaat aaggaaggcg atcagtatat 5940 ttacatggga cagcctctaa acaatgatga ggaccacgcc cattggacag aagcaaaaat 6000 gctccttgac aacataaaca caccagaagg gattatccca gccctctttg agccggagag 6060 agaaaagagt gcagcaatag acggggaata cagactacgg ggtgaagcga ggaaaacgtt 6120 cgtggagctc atgagaagag gagatttacc tgtctggcta tcctacaaag ttgcctcaga 6180 aggcttccag tactccgaca gaaggtggtg ctttgatggg gaaaggaaca accaggtgtt 6240 ggaggagaac atggacgtgg agatctggac aaaagaagga gaaagaaaga aactacgacc 6300 ccgctggctg gatgccagaa catactctga cccactggct ctgcgcgaat tcaaagagtt 6360 cgcagcagga agaagaagcg tctcaggtga cctaatatta gaaataggga aacttccaca 6420 acatttaacg caaagggccc agaacgcctt ggacaatctg gttatgttgc acaactctga 6480 acaaggagga aaagcctata gacacgccat ggaagaacta ccagacacca tagagacgtt 6540 aatgctccta gctttgatag ctgtgctgac tggtggagtg acgttgttct tcctatcagg 6600 aaggggtcta ggaaaaacat ccattggcct actctgcgtg attgcctcaa gtgcactgtt 6660 atggatggcc agtgtggaac cccattggat agcggcctct atcatactgg agttctttct 6720 gatggtgttg cttattccag agccggacag acagcgcact ccacaagaca accagctagc 6780 atacgtggtg ataggtctgt tattcatgat attgacagtg gcagccaatg agatgggatt 6840 actggaaacc acaaagaagg acctggggat tggtcatgca gctgctgaaa accaccatca 6900 tgctgcaatg ctggacgtag acctacatcc agcttcagcc tggactctct atgcagtggc 6960 cacaacaatt atcactccca tgatgagaca cacaattgaa aacacaacgg cgaatatttc 7020 cctgacagct attgcaaacc aggcagctat attgatggga cttgacaagg gatggccaat 7080 atcaaagatg gacataggag ttccacttct cgccttgggg tgctattctc aggtgaaccc 7140 gctgacgctg acagcggcgg tatttatgct agtggctcat tatgccataa ttggacccgg 7200 actgcaagca aaagctacta gagaagctca aaaaaggaca gcagccggaa taatgaaaaa 7260 cccaactgtc gacgggatcg ttgcaataga tttggaccct gtggtttacg atgcaaaatt 7320 tgaaaaacag ctaggccaaa taatgttgtt gatactttgc acatcacaga tcctcctgat 7380 gcggaccaca tgggccttgt gtgaatccat cacactagcc actggacctc tgactacgct 7440 ttgggaggga tctccaggaa aattctggaa caccacgata gcggtgtcca tggcaaacat 7500 ttttagggga agttatctag caggagcagg tctggccttt tcattaatga aatctctagg 7560 aggaggtagg agaggcacgg gagcccaagg ggaaacactg ggagaaaaat ggaaaagaca 7620 gctaaaccaa ttgagcaagt cagaattcaa cacttacaaa aggagtggga ttatagaggt 7680 ggatagatct gaagccaaag aggggttaaa aagaggagaa acgactaaac acgcagtgtc 7740 gagaggaacg gccaaactga ggtggtttgt ggagaggaac cttgtgaaac cagaagggaa 7800 agtcatagac ctcggttgtg gaagaggtgg ctggtcatat tattgcgctg ggctgaagaa 7860 agtcacagaa gtgaaaggat acacgaaagg aggacctgga catgaggaac caatcccaat 7920 ggcaacctat ggatggaacc tagtaaagct atactccggg aaagatgtat tctttacacc 7980 acctgagaaa tgtgacaccc tcttgtgtga tattggtgag tcctctccga acccaactat 8040 agaagaagga agaacgttac gtgttctaaa gatggtggaa ccatggctca gaggaaacca 8100 attttgcata aaaattctaa atccctatat gccgagtgtg gtagaaactt tggagcaaat 8160 gcaaagaaaa catggaggaa tgctagtgcg aaatccactc tcaagaaact ccactcatga 8220 aatgtactgg gtttcatgtg gaacaggaaa cattgtgtca gcagtaaaca tgacatctag 8280 aatgctgcta aatcgattca caatggctca caggaagcca acatatgaaa gagacgtgga 8340 cttaggcgct ggaacaagac atgtggcagt agaaccagag gtggccaacc tagatatcat 8400 tggccagagg atagagaata taaaaaatga acacaaatca acatggcatt atgatgagga 8460 caatccatac aaaacatggg cctatcatgg atcatatgag gtcaagccat caggatcagc 8520 ctcatccatg gtcaatggtg tggtgagact gctaaccaaa ccatgggatg tcattcccat 8580 ggtcacacaa atagccatga ctgacaccac accctttgga caacagaggg tgtttaaaga 8640 gaaagttgac acgcgtacac caaaagcgaa acgaggcaca gcacaaatta tggaggtgac 8700 agccaggtgg ttatggggtt ttctctctag aaacaaaaaa cccagaatct gcacaagaga 8760 ggagttcaca agaaaagtca ggtcaaacgc agctattgga gcagtgttcg tcgatgaaaa 8820 tcaatggaac tcagcaaaag aggcagtgga agatgaacgg ttctgggacc ttgtgcacag 8880 agagagggag cttcataaac aaggaaaatg tgccacgtgt gtctacaaca tgatgggaaa 8940 gagagagaaa aaattaggag agttcggaaa ggcaaaagga agtcgcgcaa tatggtacat 9000 gtggttggga gcgcgctttt tagagtttga agcccttggt ttcatgaatg aagatcactg 9060 gttcagcaga gagaattcac tcagtggagt ggaaggagaa ggactccaca aacttggata 9120 catactcaga gacatatcaa agattccagg gggaaatatg tatgcagatg acacagccgg 9180 atgggacaca agaataacag aggatgatct tcagaatgag gccaaaatca ctgacatcat 9240 ggaacctgaa catgccctat tggccacgtc aatctttaag ctaacctacc aaaacaaggt 9300 agtaagggtg cagagaccag cgaaaaatgg aaccgtgatg gatgtcatat ccagacgtga 9360 ccagagagga agtggacagg ttggaaccta tggcttaaac accttcacca acatggaggc 9420 ccaactaata agacaaatgg agtctgaggg aatcttttca cccagcgaat tggaaacccc 9480 aaatctagcc gaaagagtcc tcgactggtt gaaaaaacat ggcaccgaga ggctgaaaag 9540 aatggcaatc agtggagatg actgtgtggt gaaaccaatt gatgacagat ttgcaacagc 9600 cttaacagct ttgaatgaca tgggaaaggt aagaaaagac ataccgcaat gggaaccttc 9660 aaaaggatgg aatgattggc aacaagtgcc tttctgttca caccatttcc accagctgat 9720 tatgaaggat gggagggaga tagtggtgcc atgccgcaac caagatgaac ttgtaggtag 9780 ggccagagta tcacaaggcg ccggatggag cttgagagaa actgcatgcc taggcaagtc 9840 atatgcacaa atgtggcagc tgatgtactt ccacaggaga gacttgagat tagcggctaa 9900 tgctatctgt tcagccgttc cagttgattg ggtcccaacc agccgtacca cctggtcgat 9960 ccatgcccac catcaatgga tgacaacaga agacatgttg tcagtgtgga atagggtttg 10020 gatagaggaa aacccatgga tggaggacaa gactcatgtg tccagttggg aagacgttcc 10080 atacctagga aaaagggaag atcaatggtg tggatcccta ataggcttaa cagcacgagc 10140 cacctgggcc accaacatac aagtggccat aaaccaagtg agaaggctca ttgggaatga 10200 gaattatcta gacttcatga catcaatgaa gagattcaaa aacgagagtg atcccgaagg 10260 ggcactctgg taagccaact cattcacaaa ataaaggaaa ataaaaaatc aaacaaggca 10320 agaagtcagg ccggattaag ccatagcacg gtaagagcta tgctgcctgt gagccccgtc 10380 caaggacgta aaatgaagtc aggccgaaag ccacggttcg agcaagccgt gctgcctgta 10440 gctccatcgt ggggatgtaa aaacccggga ggctgcaaac catggaagct gtacgcatgg 10500 ggtagcagac tagtggttag aggagacccc tcccaagaca caacgcagca gcggggccca 10560 acaccagggg aagctgtacc ctggtggtaa ggactagagg ttagaggaga ccccccgcac 10620 aacaacaaac agcatattga cgctgggaga gaccagagat cctgctgtct ctacagcatc 10680 attccaggca cagaacgcca gaaaatggaa tggtgctgtt gaatcaacag gttctaaacg 10740 aagagc 10746

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Una glicoproteína E del virus del dengue quimérico que comprende una cadena principal de la glicoproteína E del virus del dengue que comprende sustituciones de aminoácidos que introducen un epítopo reconocido por un anticuerpo que es reactivo con un serotipo del virus del dengue diferente del serotipo del virus del dengue de la cadena principal de la glicoproteína E; en donde la glicoproteína E del virus del dengue quimérico comprende la secuencia de aminoácidos:
    MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGSCVTTMAKDKPTLDIELLKTEATQLATLRKLC IEAKISNTTTDSRCPTQGEATLVEEQDTNFVCRRTFVDRGWGNGCGLFGKGSLITCAKFK CVTKIEGKWQYENLKYSVIVTVHTGDQHQVGNETTEHGTIATITPQAPTSEIQLTDYGA LTLDCSPRTGLDFNEMILLTMKNKAWMVHRQWFLDLPLPWTSGASTSQETWNRQDLLVTF KTAHAKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQNSGGTSIFAGHLKCRLKMDKLTLKGMSYV MCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSSQDEKGVTQNGRLITANPIVTD KEKPVNIEAEPPFGESYIVVGAGEKALKLSWFKKG
    o la secuencia de aminoácidos:
    MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELFKTEVTNPAVLRKLCI EGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVCKHTYVDRGWGNGCGLFGKGSLVTCAKFQCL EPIEGKVVQYENLKYSVIVTVHTGDQHQVGNETTEHGTIATITPQAPTSEIQLTDYGALGL ECSPRTGLDFNEMILLTMKNKAWMVHRQWFFDLPLPWTSGATTETPTWNRKELLVTFKNAH AKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQTSGTTTIFAGHLKCRLKMDKLELKGMSYAMCTNT FVLKKEVSETQHGTILIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQGKAHNGRLITANPVVTKKEEPVN IEAEPPFGESNIVIGIGDNALKINWYKKG.
  2. 2. La glicoproteína E del virus del dengue quimérico de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos:
    MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGSCVTTMAKDKPTLDIELLKTEATQLATLRKLC
    IEAKISNTTTDSRCPTQGEATLVEEQDTNFVCRRTFVDRGWGNGCGLFGKGSLITCAKFK
    CVTKIEGKWQYENLKYSVIVTVHTGDQHQVGNETTEHGTIATITPQAPTSEIQLTDYGA
    LTLDCSPRTGLDFNEMILLTMKNKAWMVHRQWFLDLPLPWTSGASTSQETWNRQDLLVTF KTAHAKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQNSGGTSIFAGHLKCRLKMDKLTLKGMSYV MCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSSQDEKGVTQNGRLITANPIVTD KEKPVNIEAEPPFGESYIVVGAGEKALKLSWFKKG
  3. 3. La glicoproteína E del virus del dengue quimérico de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos:
    MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELFKTEVTNPAVLRKLCI EGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVCKHTYVDRGWGNGCGLFGKGSLVTCAKFQCL EPIEGKVVQYENLKYSVIVTVHTGDQHQVGNETTEHGTIATITPQAPTSEIQLTDYGALGL ECSPRTGLDFNEMILLTMKNKAWMVHRQWFFDLPLPWTSGATTETPTWNRKELLVTFKNAH AKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQTSGTTTIFAGHLKCRLKMDKLELKGMSYAMCTNT FVLKKEVSETQHGTILIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQGKAHNGRLITANPVVTKKEEPVN IEAEPPFGESNIVIGIGDNALKINWYKKG
  4. 4. Una partícula de flavivirus o una partícula similar a virus (VLP) que comprende la glicoproteína E de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
  5. 5. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la glicoproteína E de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
  6. 6. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la partícula de flavivirus o VLP de la reivindicación 4.
  7. 7. Una composición que comprende la glicoproteína E de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un portador farmacéuticamente aceptable.
  8. 8. Una composición que comprende la molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 5 o 6 en un portador farmacéuticamente aceptable.
  9. 9. La glicoproteína E de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, la partícula de flavivirus de la reivindicación 4, la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 5-6 y/o la composición de cualquiera de las reivindicaciones 7-8 y cualquier combinación de las mismas para su uso para producir un respuesta inmunitaria a un virus del dengue en un sujeto o tratar o prevenir una infección por el virus del dengue en un sujeto o para proteger a un sujeto de los efectos de la infección por el virus del dengue.
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