PT2571519T - Vacinas marcadas para a peste suína clássica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

VACINAS MARCADAS PARA A PESTE SUÍNA CLÁSSICA A invenção refere-se a uma vacina marcada para o tratamento profilático da peste suina clássica que compreende o virus da peste suina clássica modificado vivo atenuado. Numa forma de realização da invenção, a vacina marcada é caraterizada por a sequência de nucleótidos virais, que codifica o epitopo TAV, e/ou a sequência de aminoácidos do epitopo TAV, compreende uma sequência diferente daquela de um suino associadas à doença virus da peste, para que indivíduos que exibam infeção com o doença associada ao vírus da peste suína possam ser diferenciados de indivíduos vacinados com a vacina marcada da presente invenção, quer por métodos de análise genómica e/ou serológica.

Antecedentes da invenção A peste suína clássica (CSF) é uma doença animal epizoótica que ocorre em todo o mundo e tem relevância política e económica significativa (Vandeputte e Chappuis, 1999). Peste suína clássica, também conhecida como cólera suína ou praga de porco, é uma das doenças que devem ser notificadas Nacionalmente, no nível da UE, bem como com a Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) em Paris após o aparecimento em qualquer estado membro. A peste suína clássica é causada por um pequeno vírus ARN envelopado do género Pestivirus na família Flaviviridae. Os hospedeiros naturais dos vírus da peste suína são somente as espécies suínas domésticas e selvagens (por exemplo, javali Europeu).

Foram feitas tentativas no seio da União Europeia para erradicar CSF através de medidas rigorosas sem vacinação profilática, que foi proibida desde 1990. Apesar da proibição, a vacinação não representa uma opção legalmente aprovada como uma vacinação de emergência nos casos em que a peste suina aparece. Em tal caso, a vacinação deve ocorrer através de um dos planos de vacinação de emergência, que foram ratificadas pela União Europeia (ver art. 19 da diretiva Conselho 2001/89/CE). Até agora, a Roménia foi o único pais em que uma vacinação de emergência foi realizada. As razões para tal aplicação limitada assentam nas limitações técnicas das vacinas marcadas disponíveis na atualidade, tais como restrições em eficácia da vacina, além de barreiras comerciais relativas a animais convencionalmente vacinados (de limitação ao marketing nacional). A eficiência das vacinas marcadas licenciadas não pode ser comparada com as vacinas modificadas vivos, que apresentam vantagens significativas, e essas vacinas inativadas ou vacinas de subunidades de qualquer maneira não são adequadas para a vacinação de emergência devido ao início tardio da imunidade e da necessidade de revacinação.

Considerando o alargamento da União Europeia aos países da Europa Oriental e a sempre crescente globalização, novas estratégias têm sido discutidas para o potencial de vacinação de emergência que irá desempenhar um papel em evitar o abate em larga escala dos animais e perdas económicas associadas (Leifer et al., 2009). Há, portanto, uma demanda significativa por uma vacina altamente eficiente que permite a diferenciação sorológica entre animais vacinados e os animais não vacinados e, além disso, apresentam todas as vantagens de vacinas vivas modificadas tradicionais.

[0005] Uma vez que a primeira geração de vacinas marcadas, que se baseavam na glicoproteína E2 do vírus da CSF tem apenas uma disponibilidade restrita e desvantagens graves, como as condições de armazenagem, custos, eficácia, existe uma grande procura de novas vacinas marcadas. Vários candidatos para tais vacinas têm sido investigadas, tais como vacinas de ADN, os péptidos imunogénicos, as vacinas de vetor, mutantes de deleção e vírus de febre quiméricos (Beer et ai, 2007;. Dong e Chen, 2007). A maioria destas vacinas marcadas candidatas exibe a desvantagem de que eles são produzidos através de métodos modernos de modificação genética. Devido ao receio do consumidor significativa de produtos geneticamente modificados, para além dos procedimentos de admissão complicado, vacinas geneticamente modificados apresentam desvantagens significativas.

As vacinas tradicionais contra CSFV incluem vacinas vivas modificadas. Tais vacinas são altamente eficientes após uma única aplicação, mas não permitem a diferenciação entre animais vacinados e infetados com base em um perfil serológico. Muitas dessas vacinas são baseadas na estirpe virai clássica "C" ou de um seu derivado (as chamadas "vacinas de estirpe C"). Além disso, existem vacinas baseadas na estirpe virai Japonesa "cobaia exultação-negativa (GPE-)", a estirpe "Thiverval" e a estirpe "PAV Mexicana", todos os quais têm sido utilizados em ambas as configurações regionais e internacionais (Blome et ai, 2006; Greiser-Wilke & Moennig, 2004; van Oirschot, 2003). Existem dados exaustivos a respeito do uso das vacinas baseadas em estirpe C. Sabe-se que quatro dias após a aplicação da vacina, uma proteção completa dos animais contra infeção virulenta de CSFV desafio pode ser demonstrada. Além disso, sete dias após a vacinação, uma proteção completa é fornecida a partir de transmissão vertical do vírus desafio em animais portadores (de Smit et ai., 2001) . A desvantagem significativa das vacinas vivas modificadas conhecidas é a incapacidade absoluta para discriminar sorologicamente entre animais vacinados e infetados. À luz disto, uma tarefa da presente invenção é proporcionar uma vacina viva modificada que permite a discriminação entre animais vacinados e animais infetados.

No domínio das vacinas marcadas, as chamadas vacinas de subunidades são conhecidos na técnica anterior, que são baseados na glicoproteína E2 recombinante de CSFV. 0 teste de discriminação para tais vacinas é o ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), em que os anticorpos dirigidos contra o Ems glicoproteína são usados para detetar indiretamente infeções por vírus CSF. No presente momento, apenas uma vacina de subunidade E2 está disponível no mercado, no entanto, a licença foi suspensa por alguns meses (ver relatório EMA em vacinas de subunidades E2).

Independentemente da incapacidade para comercializar tais produtos, tais sistemas apresentam desvantagens graves biológicos. Um tal inconveniente é que, pelo menos, duas imunizações parentéricas são necessárias antes de uma proteção completa é transportada, o que torna essas vacinas completamente incompatíveis com "vacinação-via isco", onde os animais são alimentados numa dose única com iscos de vacina. Além disso, as campanhas de vacinação de emergência são apenas razoável quando uma proteção contra o tipo selvagem CSFV em várias experiências de utilização das vacinas de subunidades E2, uma proteção completa contra a transmissão vertical não foi alcançado. Uma outra desvantagem de tais sistemas é que os anticorpos dirigidos contra a glicoproteína Ems são usados para diferenciação serológica e a sensibilidade e a especificidade de tais sistemas de ensaio foi sempre apenas moderada (Floegel-Niesmann, 2003) .

As vacinas vivas atenuadas CSF são conhecidas na técnica mas têm até agora sido dificultada por várias desvantagens. A maioria das vacinas descritas na técnica anterior compreendem de ADN estranho e são gerados utilizando métodos de engenharia genética, de outro modo conhecidos como tecnologia de ADN recombinante, por conseguinte, associando graves problemas de avaliação de risco ambiental com o produto. Outras variantes de CSFV são conhecidas, onde os aminoácidos são ou substituído ou excluído do epitopo TAV do tipo selvagem (WO 2010/074575 A2). No entanto, os resíduos de aminoácidos e/ou nucleótidos que são modificados na presente invenção não são nem revelados nem sugeridos na técnica anterior.

Passagem múltipla também tem sido utilizada para gerar variantes de vírus, que podem ser utilizadas como vacinas, embora a pressão de anticorpos não foi previamente aplicado. A passagem em múltiplos de culturas infetadas com o vírus, a fim de gerar variantes como divulgado na técnica anterior é, por conseguinte, limitada pelo ter de realizar um grande número de passagens de cultura e também por uma falta de controlo sobre o qual epitopo é para ser modificada (Hulst et ai).

Kortekaas et al descrevem um, vacina viva atenuada CSF geneticamente estável, o que permite a diferenciação sorológica de infetados de animais vacinados. Um Estirpe C mutada foi geneticamente modificadas utilizando uma abordagem orientada, segundo o qual a tecnologia de ADN recombinante foi usada para introduzir deleções na proteína E2 de CSFV, a. Outras mutações foram posteriormente adquiridas em vários locais dentro do genoma do virus através de múltiplas passagens para criar estirpes que exibem proliferação reforçada. As estirpes divulgadas em Kortekaas et ai são virus geneticamente modificadas, o que é uma desvantagem significativa, em função dos processos complicados de admissão para libertar produtos geneticamente modificados no ambiente.

Holinka et al divulgam um duplo marcador antigénico ao vivo estirpe CSFV atenuada "FlagT 4VN", que foi obtido pela combinação de dois determinantes genéticos de atenuação. FlagT4v abriga um marcador antigénico positivo, epitopo FLAG sintético, introduzida por meio de uma inserção 19mer na glicoproteina El; e um marcador negativo resultante de mutações do local de ligação do anticorpo monoclonal WH303 (mAbWH303) epitopo na glicoproteina E2. Intranasal ou administração intramuscular de FlagT4v protegida suinos contra a cepa virulenta CSFV Brescia no inicio (2 ou 3 dias) e tardia (28 dias) de tempo após a inoculação. FlagT4v resposta de anticorpos induzida em porcos reagiu fortemente contra o epitopo FLAG, mas não conseguiu inibir a ligação de mAbWH303 a um péptido sintético que representa o epitopo WH303. A vacina divulgada no Holinka diz respeito a um virus geneticamente modificado que apresenta ADN estranho dentro de seu (sequência Flag-Tag, além de sequência vetor associado e marcadores) genoma. Isto representa uma desvantagem significativa, em comparação com o presente invento, que exibe nenhum ADN estranho ou recombinante. 0 documento WO 2007/143442 A2 descreve os efeitos de mutações dentro do epitopo WH303 de CSFV E2, que alteram a sequência de aminoácidos do Brescia de CSFV virulento progressivamente para a sequência de aminoácidos homóloga da estirpe BVDV NADL. Animais infetados com virus mutantes foram protegidos quando desafiados com o virus Brescia virulenta aos 3 e 21 dias após a vacinação. A modificação neste local dentro do epitopo WH303 também permite o desenvolvimento de um teste de diagnóstico para diferenciar entre animais vacinados e infetados. Apesar destes efeitos, as mutações foram introduzidas utilizando técnicas de engenharia genética, por conseguinte, a introdução de material genético estranho para a vacina virai. 0 estado da técnica acima mencionada descreve vacinas que foram modificadas através de tecnologia genética recombinante para produzir as estirpes de virus. Como descrito acima, as vacinas geneticamente modificadas estão sujeitos a preocupações de segurança ambiental e, portanto, são prejudicadas por protocolos de admissão complicada e medo entre o público em geral, proporcionando desvantagem significativa para a sua utilização.

Sumário da invenção

Tendo em conta o estado da técnica o problema técnico subjacente à presente invenção é proporcionar uma vacina marcada para porcos domésticos e selvagens que proporciona proteção contra o virus da febre suina clássica, que permite a diferenciação entre animais vacinados e infetados, produzidos preferencialmente por tecnologias convencionais. Numa forma de realização preferida, a vacina marcada não é produzido através da tecnologia genética recombinante modificação.

Este problema é resolvido pelas caraterísticas das reivindicações independentes. Formas de realização preferidas da presente invenção são fornecidas pelas reivindicações dependentes. A invenção refere-se, por conseguinte, para uma vacina marcada para o tratamento profilático da peste suina clássica que compreende o virus da peste suina clássica modificado vivo atenuado.

Numa forma de realização preferida, a invenção refere-se ainda a uma vacina marcada para o tratamento profilático da peste suina clássica que compreende o virus da peste modificado vivo atenuado suina clássica, caraterizado por a sequência de aminoácidos viral do Epitopo TAV da proteína E2 compreende uma sequência diferente da de um tipo selvagem de vírus da peste suína clássica, no qual a sequência de aminoácidos virai exibe pelo menos uma das seguintes substituições: -substituição de aminoácidos 830 a valina, -substituição de aminoácido 833 para serina, -substituição de aminoácido 839 para glicina.

Numa forma de realização preferida, a vacina marcada da presente invenção é caraterizada pelo fato de o vírus modificado não apresentam sequências de ácidos nucleicos recombinantes.

Numa forma de realização preferida, a vacina marcada da presente invenção é caraterizado por a sequência de nucleótidos virai exibe uma ou mais das seguintes substituições: -substituição na posição nucleotídica 2862 por T, -substituição na posição nucleotídica 2870 por T, -substituição na posição nucleotídica 2889 por G.

Numa forma de realização preferida, a vacina marcada da presente invenção é caraterizada pelo fato de a sequência de aminoácidos virai exibe uma ou mais das seguintes substituições: -a substituição do aminoácido 426; na proteína E RNS; a valina, -a substituição do aminoácido 576; em proteínas Ei; a histidina, -a substituição do aminoácido 583; em proteínas Ei; para o ácido glutâmico, -substituição de aminoácido 951: a proteína E2; para isoleucina.

Numa forma de realização preferida, a vacina marcada da presente invenção é caraterizado por a sequência de nucleótidos virai exibe uma ou mais das seguintes substituições: -substituição na posição nucleotídica 1649 por G, -substituição na posição nucleotídica 2099 por C, -substituição na posição nucleotídica 2122 por G, -substituição na posição nucleotídica 3225 por T.

Numa forma de realização preferida, a vacina marcada da presente invenção é caraterizada pelo fato de a sequência de aminoácidos viral do Epitopo TAV compreende a sequência de acordo com SEQ ID NO. 3 ou SEQ ID NO. 4.

Numa forma de realização preferida, a vacina marcada da presente invenção é caraterizada por a sequência de nucleótidos que compreende a sequência virai de acordo com a SEQ ID NO. 1.

Numa outra forma de realização a vacina marcada da presente invenção é caraterizado por que os indivíduos tratados com a vacina, como aqui descrito podem ser diferenciados a partir de indivíduos infetados com o vírus da peste suína associada a doença através da análise de amostras biológicas obtidas a partir do referido indivíduos usando serológica e/ou métodos analíticos genómicos.

Numa outra forma de realização a vacina marcada da presente invenção é caraterizada pelo fato de o método de análise genómica baseia-se na reação em cadeia da polimerase (PCR), de um modo preferido PCR em tempo real, em que os iniciadores e/ou sondas que reconhecem quer o modificadas e/ou associada a doença sequência de nucleótidos virais são utilizados.

Numa outra forma de realização a vacina marcada da presente invenção é caraterizada pelo fato de o método de análise serológica é baseada num imunoensaio enzimático (EIA), de um modo preferido um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), em que os anticorpos que se ligam especificamente tanto ao Epitopo TAV modificado e/ou associado a doença são utilizadas.

Um outro aspeto da invenção refere-se a uma vacina marcada, de um modo preferido, como aqui descrito, pode ser obtido por a geração de variantes de escape virais associados à doença ou outra febre suína conhecido estirpes virais por aplicação de pressão de anticorpo.

Um outro aspeto da invenção refere-se a um método de fabrico de um suína clássica estirpe de vacina de vírus da peste atenuado vivo modificado, de um modo preferido, como aqui descrito, que compreende a geração de variantes de escape de associados à doença ou outra febre suína conhecido estirpes virais por aplicação pressão de anticorpo.

Numa forma de realização preferida, o método de fabrico, como aqui descrito é caraterizado por o processo compreender: - passagens múltiplas de células, de um modo preferido células de rim embrionário leitão, infetadas com o doença associada ao vírus da peste suína em cultura de células, e - aplicação simultânea de anticorpos dirigidos contra o TAV-epítopo da proteína E2 do vírus da peste suína associada à patologia e/ou soro de coelho policlonal péptido imunizado CTAVSPTTLRTEVVK. A invenção refere-se ainda a uma composição farmacêutica que compreende o marcador de vacina, como aqui descrito em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. m outro aspeto da invenção refere-se a uma vacina marcada, tal como aqui descrita, para utilização como um medicamento no tratamento profilático (vacinação), de preferência por meio de injeção intramuscular ou administração oral, de febre suína clássica.

Um outro aspeto da invenção refere-se a um método para o tratamento profilático (vacinação) da peste suína clássica que compreende a administração da vacina marcada, tal como aqui descrito a um sujeito, preferivelmente um porco, de preferência através de injeção intramuscular ou administração oral.

Uma outra situação comum em que a peste suína clássica requer vacinação é em resposta à deteção da infeção pelo vírus de campo em populações de porcos. Quando a infeção dos suínos ocorre, de modo que o vírus da peste suína clássica está presente nos suínos quer domésticos ou selvagens, é necessária uma vacinação de emergência das populações de suínos circundantes e/ou vizinhos. As vacinas são então realizadas para até 1 a 2 anos de todos os suínos na região circundante, quer domésticos ou selvagens, a fim de evitar o surto ou infeção em grande escala de o vírus da peste suína. A vacina marcada da presente invenção é ideal para uma vacinação de emergência no caso de deteção de peste suína ou surto. A vacina marcada facilita a administração rápida e eficaz através de vias oral, além de por meio de injeção, e permite a discriminação entre animais infetados com o vírus de campo (associada a febre) e da vacina.

Descrição detalhada da invenção 0 desenvolvimento da vacina de acordo com a presente invenção não se baseia em métodos de modificação genética, mas sim o princípio de que um vírus irá modificar-se de um modo adaptativo, quando colocada sob pressão seletiva de anticorpos. A presente invenção refere-se portanto a uma vacina viva não geneticamente modificado que fornece proteção contra CSFV virulento, o qual exibe todos os requisitos para uma vacina marcada (serologicamente e geneticamente distintos). A vacina marcada foi manipulada através da aplicação de pressão seletiva anticorpo para diferentes estirpes de C em cultura de células. As variantes possuem de preferência gerados três trocas de aminoácidos no epitopo TAV E2 e duas bolsas de compensação na proteína El. Estabilidade dessas variantes foi comprovada por mais de dez passagens de cultura celular em tambores de rolo e por exemplo, a vacinação intramuscular de suínos levaram para completar a proteção contra uma estirpe altamente virulenta desafio. Além disso, DIVA direta é ativada por serológico e/ou técnicas genéticas, por exemplo, sistemas de coloração de imunofluorescência distinta e rRT-PCR em tempo real (rRT-PCR). Além disso, DIVA indireto pode ser alcançado por meio da otimização comercial E2-ELISAs (por exemplo, alterando os valores cortadas) ou o desenvolvimento de sistemas de peptídeo-ELISA específico do TAV. Assim, uma vacina marcada viva não geneticamente modificada contra CSFV é apresentada. A produção de vacina de acordo com a presente invenção ocorre como se segue:

Naturalmente aparecendo estirpe C "Riems" escapa a variantes que são selecionados num sistema de cultura celular (células leitão renais IFN-embrionário) via passagem fo vírus estirpe C durante a aplicação de anticorpos específicos E2-TAV e soro de coelho policlonal péptido imunizado CTAVSPTTLRTEVVK.

Os anticorpos aplicados, para além dos anticorpos contidos no soro policlonal de coelho tratado com péptido, reconhecer o TAV-epítopo na proteína E2 do vírus da CSF especificamente, e através da ligação a esta epítopo neutralizar o CSF (Estirpe C) vírus. 0 CSFV exibe uma elevada taxa de mutação, devido à sua natureza de ARN. Sob a pressão de seleção de fornecimento de anticorpos neutralizantes, vírus, que são sujeitos a mutação no epitopo ao qual os anticorpos se ligam (neste caso, o epitopo TAV) são selecionados, por meio de que os vírus do tipo selvagem inalterado são neutralizados. Via múltipla passagem sob várias concentrações de anticorpos e coelho de soro e misturas, vários isolados de virus mutantes podem ser selecionados.

Os virus com uma substituição no Epitopo TAV foram selecionados em primeiro lugar. Através de mais passagem destes virus sob várias formas de pressão um anticorpo isolado foi selecionado, que exibiu duas substituições na Epitopo TAV e uma única substituição compensatório na proteína EI (a interação entre El e E2 é importante para a estrutura de vírus). Estes vírus foram colocados sob uma pressão adicional de anticorpo, que conduziu ao isolamento de vírus com três substituições no epitopo TAV, além de duas substituições de compensação na proteína El. Os vírus resultantes (estirpe C "Riems" Q7, estirpe C "Riems" S10 e estirpe C "Riems" 011) apresentaram substituições na proteína E2 nas posições 2862, 2870 e 2889, 3225, além de mudanças na proteína El nas posições 2099 e 2122, para além de uma substituição na proteína ERNS na posição 1649.

Tabela 1: Informações adicionais sobre as variantes de

escape TAV

As alterações na sequência de nucleótidos permitir que um sistema de tempo real de RT-PCR, que podem diferenciar entre as variantes (Q7, S10, Oil) e a isolados de campo.

As alterações na sequência de aminoácidos permitir a diferenciação entre as variantes (Q7, S10, Oil) e a isolados de campo na base da ligação do anticorpo, em que os anticorpos utilizados para a neutralização (A18 anticorpos) não se ligam às variantes mas fazer prender a todos os isolados de campo devido ao epitopo TAV altamente conservada em CSFV. Os anticorpos gerados contra a sequências peptídicas TAV modificadas (exibindo mutações da presente invenção) podem também ser utilizadas para a diferenciação entre o vírus infecioso e vacina, em que os anticorpos dirigidos contra as variantes irão ligar-se a vacina de vírus modificado da presente invenção e proporcionar uma identificação positiva de animais vacinados, mas não vinculará a isolados de campo.

Tabela 2: Sequências da presente invenção:

A presente invenção refere-se a um vírus da peste suína modificado que pode ser composta de qualquer ou de todas as possíveis combinações de mutações e substituições aqui divulgados. Os exemplos e suporte experimental aqui proporcionados demonstram que as estirpes virais foram geradas que exibem apenas um subconjunto de todas as substituições indicadas na Tabela 1. Estas estirpes virais exibem um efeito protetor para além de serem capazes de ser utilizados como marcadores, por conseguinte, o cumprimento objetivo da presente invenção. As estirpes preferidas da presente invenção dizem respeito a estirpes que compreendem subconjuntos das substituições descritas, para além das estirpes que exibem todas as substituições reveladas.

Foi completamente surpreendente que as combinações de uma ou mais das modificações genéticas específicas (derivado através de processos naturais como um resultado da pressão anticorpo) levariam a que as propriedades benéficas da vacina marcada, tal como aqui descrito. A técnica anterior revela algumas modificações semelhantes, mas nada se sabe na técnica iria sugerir que os resíduos particulares modificados na presente invenção iriam proporcionar uma proteção particularmente eficaz contra a infeção de CSFV. As combinações únicas para levar o conjunto de propriedades descritas que permitem que o invento atue como uma vacina capaz de diferenciar entre animais infetados e animais vacinados. Não se sabe que tal pressão seletiva, tal como aplicado no presente pedido por meio de tratamento com anticorpo levaria à modificação precisa aqui descrita. As combinações de modificações genéticas, tal como aqui descritos funcionam em conjunto, fornecendo o efeito sinergético de mutações de compensação que mantêm a estrutura da proteína, enquanto permitindo que os resíduos de TAV de mutação e, assim, proporcionar as caraterísticas necessárias de marcador pela tarefa da presente invenção. 0 termo engenharia genética refere-se a modificação genética ou de manipulação do genoma de um organismo, por exemplo através da introdução de material de ácido nucleico estranho, tal como ADN ou ARN, ou sequências de ácidos nucleicos sintéticos no genoma do hospedeiro. Esta tecnologia também é conhecida como tecnologia de ADN recombinante. 0 termo vírus atenuado refere-se a vírus que tenha sido modificado, em qualquer forma de maneiras, de modo que o vírus é menos inofensivos e/ou menos virulentas, em comparação com o tipo selvagem de vírus (associada a doença). Por exemplo menos sintomas de doença associados aparecem em indivíduos infetados com o vírus atenuado em comparação com o vírus de tipo selvagem. A pressão termo anticorpo ou anticorpo pressão seletiva em termos da presente invenção refere-se à aplicação de anticorpos durante a cultura de células, de um modo preferido através de múltiplas passagens, que são dirigidas a um ou mais epítopos específicos do vírus. Tais anticorpos podem ser de qualquer tipo de anticorpo conhecido na técnica, mono ou policlonal, ou pode estar contido no soro de animais tratados com um péptido de interesse, por exemplo, o epitopo alvo. Tais anticorpos são muitas vezes denominados anticorpos neutralizantes. Sob a pressão de seleção de fornecimento de anticorpos neutralizantes, os vírus, os quais se submetem a mutação no epitopo ao qual os anticorpos se ligam (neste caso, o epitopo TAV) são selecionados devido à sua vantagem de crescimento, como os anticorpos não se ligam ao referido epitopo e por conseguinte, deixa de proporcionar um efeito de limitar ou neutralizar, pelo qual os vírus de tipo selvagem inalterada é neutralizada pelos anticorpos são subsequentemente desvantagem seletiva em cultura.

Os vírus, que se submetem a mutação no epitopo ao qual os anticorpos se ligam (neste caso, o epitopo TAV), são comummente referidos como variantes de escape. Estas variantes são objeto da presente invenção, e estão geneticamente e serologicamente distinto do vírus de tipo selvagem. 0 termo passagens múltiplas refere-se à prática de cultura de células de passagem (também conhecidas como células de subcultura ou de divisão), durante um número de vezes, em que um pequeno número de células é transferido para um novo recipiente, de preferência com meio fresco, ou por diluição de culturas de células em novos meios, ao longo de um número de vezes de modo a que as culturas de células sejam autorizadas a continuar em crescimento sem os efeitos associados de alta densidade de células em culturas.

Em função da vacina marcada, a invenção pode igualmente dizer respeito a um grupo unificada das invenções que são combinados por um único conceito inventivo. A vacina marcada, o próprio vírus e composições farmacêuticas dos mesmos, a sua utilização no tratamento de animais para a vacinação e métodos para a produção do vírus caem todos no âmbito de um conceito inventivo geral. A nova e inventiva vacina marcada aqui descrito permite tanto unifica e todos os aspetos da presente invenção, de modo que as várias formas de realização aqui descritos caem dentro de uma única invenção unificador.

Quando são fornecidas sequências de nucleótidos no presente pedido, as listagens de sequências destinam-se a englobar tanto o ARN correspondente e sequências de ADN. Embora algumas sequências de nucleótidos sejam fornecidas como sequências de ADN, as sequências de ARN correspondentes (por exemplo, onde o genoma do virus exibe uma molécula de ARN) se destinam a ser englobadas no presente invento. As sequências de nucleótidos da presente invenção abrange também as sequências complementares daqueles listados, por exemplo, a sequência complementar que poderia através de Watson-Crick se ligam à sequência listada. As sequências correspondentes complementares, ARN e/ou ADN não requer nenhum esforço inventivo para converter um do outro e são facilmente ao alcance de um perito na técnica. 0 procedimento de administração da vacina virai da presente invenção, as composições da invenção, tais como produtos farmacêuticos, imunológica, composições antigénicas ou de vacina ou composições terapêuticas, pode ser administrada por vias parentéricas, tais como intradérmica, intramuscular ou métodos de aplicação subcutânea. Tal administração permite uma resposta imune sistémica, ou respostas imunitárias humorais ou mediadas por células. A vacina de acordo com a presente invenção também pode ser administrada por vias orais, tais como serem incorporadas na alimentação animal, permitindo a imunização simples e eficaz de grandes populações, por exemplo, javali Europeia.

Os métodos preferidos de aplicação referem-se a qualquer uma das aplicações de subcutânea ou a aplicação por via intramuscular, de preferência por injeção, e a aplicação oral.

De modo mais geral, as composições de vacina virai inventivos ou composições terapêuticas podem ser preparados de acordo com técnicas padrão bem conhecidas dos peritos na técnica farmacêutica ou veterinária.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de tais composições podem ser administradas em dosagens e por técnicas bem conhecidas dos especialistas na técnica médica ou veterinária, tomando em consideração fatores tais como a idade, sexo, peso, espécie e condição do sujeito em particular, e a via de administração. As composições podem ser administradas isoladamente, ou podem ser co-administrada ou sequencialmente administrada com as composições, por exemplo, com o "outro" imunológica, antigénica ou de vacina ou composições terapêuticas proporcionando assim composições multivalentes, ou "cocktail", ou de combinação do invento e métodos que os empregam. Novamente, os ingredientes e forma (co-sequencial ou) de administração, bem como dosagens pode ser determinada tendo em conta fatores como a idade, sexo, peso, espécie e condição do sujeito particular, e, via de administração.

Exemplos de composições do invento incluem preparações liquidas para orifícios, por exemplo, oral, nasal, anal, vaginal, perorai, intragástrica, etc., de administração, tais como suspensões, xaropes ou elixires; e, preparações para administração parentérica, subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intravenosa (por exemplo, administração injetável), tais como suspensões ou emulsões estéreis.

Em tais composições, as variantes de CSFV podem estar em mistura com um veiculo farmaceuticamente aceitável, diluente, ou excipiente, tal como água estéril, solução salina fisiológica, glucose ou semelhantes. As composições podem também ser liofilizadas. As composições podem conter substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponantes do pH, adjuvantes, aditivos gelificantes ou intensificador da viscosidade, conservantes, agentes aromatizantes, cores, e semelhantes, dependendo da via de administração e da preparação pretendida.

Breve descrição das figuras

Figura 1: A comparação de sequências

Figura 2: Análise de imunofluorescência indireta

Figura 3: VNT com a estirpe CSFV Rõsrath

Figura 4: Idexx E2-ELISA com soro de suinos a partir do estudo 06/10 animais

Descrição detalhada das figuras

Figura 1: A comparação de sequências. A) Comparação de sequência Nucelotidica da região de Epitopo TAV entre o Q7, S10, 011 variantes e o domínio isolado estirpe C. B) Amino comparação de sequências de ácido da região do Epitopo TAV entre o Q7, S10, 011 variantes e o campo isolado estirpe C.

Figura 2: análise de imunofluorescência indireta. A) Análise de mutantes de escape do E2, B5/2 Passagem 2 (vírus precursor para Q7, S10 e 011, que exibe apenas duas substituições-no-TAV epitopo). B) Análise do vírus estirpe C.

Figura 3: Três semanas após a imunização, todos os animais, com exceção de um animal no grupo de S10 e de um animal do grupo 011, mostrou anticorpos neutralizantes. 7 dias após a infeção os animais imunizados demonstraram uma VNT titulação de 640 ou maior. 0 menor titulação foi de 320, mostrado por um animal no grupo imunizado TAV mutante. Os animais do grupo de controlo não-imunizados não exibiram titulação na VNT contra Rõsrath.

Figura 4: A estirpe C animais imunizados apresentaram resultados positivos nos E2-ELISA 21 dias após a imunização. 7 dias após a infeção todos os animais imunizados apresentaram resultados claramente positivos no ELISA. O grupo de controlo não-imunizado não mostrou anticorpos detetáveis após a infeção.

EXEMPLOS

Projeto Experimental e Métodos

A imunização de coelhos utilizando o péptido TAV

Dois coelhos idade de 8-10 semanas (etiquetas de orelha 304 e 305) foram imunizados de acordo com o esquema seguinte, usando um péptido hemocianino de lapa (KLH)-conjugado CTAVSPTTLRTEWK, a fim de gerar soro neutralizante policlonal estirpe C. A imunização foi realizada seguido de 6 impulsos, cada um ocorrendo a intervalos de aproximadamente mês.

Isolamento de E2 escapar variantes de FHE Estirpe C do vírus "Riems" A fim de criar a pressão com a qual o anticorpo para gerar mutações da estirpe C do virus "Riems" na glicoproteina E2, o virus foi tratada com vários anticorpos dirigidos contra o Epitopo TAV da proteína E2, utilizando várias concentrações. As células infetadas foram subsequentemente incubadas e passadas várias vezes. Os anticorpos que foram aplicados nas presentes experiências são anticorpos monoclonais específicos de E2, que são comercialmente disponíveis para o ensaio de ELISA específico de CSFV E2.

Os anticorpos: AI 81 (IDEXX) A18B (Bommeli) A18C (Ceditest) HC34 (CRL, Hannover) WH303 und WH 211 (Weybridge, Grã-Bretanha) A incubação das culturas virais foi levada a cabo de acordo com o seguinte. Várias concentrações de anticorpos e as misturas foram aplicadas com várias quantidades de vírus. A incubação ocorreu durante 2-6 horas à temperatura ambiente. A suspensão de vírus-anticorpos foi fornecida para placas de cultura celular com crescimento celular confluente e subsequentemente incubadas. Durante este tempo, o vírus foi absorvido para dentro das células (PK15-células) durante 1-2 horas a 37 ° C. Finalmente foi adicionado o meio de cultura de células e as placas foram incubadas durante 72 horas a 37 0 C e 5% de COT.

Após 72 horas os sobrenadantes de cultura celular foram separados e armazenados individualmente. As placas foram então fixados e corados utilizando a coloração de imunofluorescência e um anticorpo-C16 (específico para a proteína NS3 de CSFV). Os sobrenadantes de cultura de células fracos cavidades positivas foram então passados sob uma pressão adicional de anticorpo tal como descrito acima. Os sobrenadantes de cultura celular de poços com células positivas individuais ou placas de células coradas individuais foram então passadas sob pressão anticorpo muito fraco ou sem, a fim de aumentar o titulação do vírus durante 1-2 passagens. Vários sobrenadantes de cultura celular foram selecionados para sequenciação das regiões EI e E2 . 0 controlo de vírus variante de escape foi realizado utilizando a coloração de imunofluorescência com um anticorpo ou o anticorpo C16 A18 usado para produzir as variantes de escape. Variantes do vírus que exibem uma alteração na Epitopo TAV não podem ser coradas utilizando o anticorpo AI8.

História passagem

Tabela 3: histórias passagem do estirpe C "Riems" escapar vírus

Caraterizaçao do escape de variantes B5/2, 116, Q7, S10 e 011

As variantes de escapes isolados foram sequenciadas na região das proteínas El e E2. Várias colorações de imunofluorescência foram realizadas utilizando os anticorpos A18-IDEXX, A18-Bommeli, A18-ceditest e o anticorpo C16. As variantes de escape foram passadas em ambos os frascos de cultura de células (todos) em adição a culturas de rolos (Q7, S10, 011) e subsequentemente foram sequenciados, corados diferencialmente e titulado.

Q7 em tempo real específico de RT-PCR A fim de testar as caraterísticas genéticas do vírus, e, assim, testar uma das propriedades do marcador de vacina, a deteção de RNA virai após imunização com as variantes de escape foi realizada utilizando iniciadores e uma sonda, que foram capazes de distinguir o escape a variantes do original estirpe C "Riems" e campo de CSFV isola.

Estudo animal 27/09 - para testar a resposta imune dos mutantes de estirpe C de Riems B5/2-P6 e I16-P2

Nos presentes estudos em animais, três leitões imunizados foram, cada um com 2 ml de suspensão de virus (células de cultura sobrenadante) por meio de aplicação por via intramuscular. O agrupamento dos animais foi realizado como se segue: Grupo A (B5/2), grupo B (116) e o grupo de controlo Estirpe C Riems (RIEMSER vacina contra a febre suina). Teste serológico da resposta imune foram realizadas para cada grupo.

Estudo animal 10/06 - Testando o escape a variantes Q7, S10 e 011

Os seguintes estudos em animais foram realizados a fim de testar variantes de escape que eram os mais promissores em porcos recetores em relação à ausência de um efeito perigoso e eficácia após a aplicação por via intramuscular. 21 leitões com 8-9 semanas de idade (aprox. 15-20 kg) foram utilizados no estudo. Cada leitão foi imunizado com 2 x 105·0 KID5o/ml, i.m. 5 grupos foram testados:

Grupo 1 (5 porcos): mutantes da variante da estirpe C Q7-P7 (105-0 KIDso/ml)

Grupo 2 (5 porcos): mutantes da variante da estirpe C S10-P8 (105-0 KIDso/ml)

Grupo 3 (5 porcos): mutantes da variante de estirpe 0-011 -P8 (105-0 KIDso/ml)

Grupo 4 (3 porcos): vacina contra a febre suína Riemser (vírus bruto)

Grupo 5 (3 porcos): não imunizados grupo controlo imunização e amostragem de sangue:

Odpv amostragem de sangue (EDTA e soro), a imunização 7dpv amostragem de sangue (EDTA) 14dpv amostragem de sangue (EDTA e soro) 21dpv amostragem de sangue (EDTA e soro)

Os dados sobre a temperatura do corpo e os sintomas clínicos foram obtidos diariamente.

Desafio: 28dpv amostragem de sangue (EDTA e soro),

Esfregaço do nariz

Desafio-Infeção com a estirpe KSPV altamente virulenta Koslov (lx 106-5KID5o) 4dpi amostragem de sangue (EDTA e soro),

Esfregaço do nariz 7dpi amostragem de sangue (EDTA e soro),

Esfreganço Nariz 10dpi amostragem sangue (EDTA e soro), Esfregaço do nariz 14dpi amostragem sangue (EDTA e soro), Esfregaço do nariz 21dpi amostragem sangue (EDTA e soro), Esfregaço do nariz 28dpi amostragem de sangue (EDTA e soro) ,

Esfregaço do nariz

Estudo animal 24/10 - Testando o escape a variantes S10 e 011; proteção após imunização oral A fim de testar a eficácia da aplicação oral, o seguinte estudo realizado em animais foi realizada. 15 leitões foram utilizados como animais de teste, que foram 8-10 semanas de idade (aprox. 15-20 kg) .

Grupo 1 (6 porcos): mutantes A variante Estirpe C S10

Grupo 2 (6 porcos): mutantes B Variante Estirpe C 011

Grupo 3 (3 porcos): controlo infecioso (não vacinado)

Imunização e sangue de amostragem: 0 dpv amostragem de sangue (EDTA e soro), Nariz cotonete 14 dpv amostras de sangue 28 dpv amostragem de sangue (EDTA e soro), Esfregaço do nariz 4 dpi amostras de sangue (EDTA e soro), Esfregaço do nariz 7 dpi amostras de sangue (EDTA e soro), Esfregaço do nariz 10 dpi amostras de sangue (EDTA e soro), Nariz cotonete 14 dpi amostragem sangue (EDTA e soro), Nariz cotonete 21 dpi sangue de amostragem 28 dpi sangue de amostragem

Dados sobre a temperatura do corpo e os sintomas clínicos foram obtidos diariamente.

Resultados experimentais

Imunização de coelhos com o TAV -péptido

Ambos os soros de coelho (304 e 305) foram positivos no teste de E2-ELISA comercialmente obteníveis após o terceiro tratamento impulso (aprox. 12 semanas após a primeira imunização). No teste de neutralização de vírus ambos os soros positivos testados cerca de três semanas após o terceiro reforço. Os titulaçãos no teste de neutralização foram baixos e reduzida ainda mais após o 4°-6° impulso.

Tabela 4: Caracterização do soro de coelho 304 e 305 após a imunização TAX-peptídeo

Isolamento de variantes de escape E2 do vírus de estirpe C Reims A incubação da estirpe C Riems com anticorpos específicos de E2 conduziu, depois de apenas algumas passagens, para o isolamento de variantes de escape gue exibiram uma substituição na região E2 na posição 2870. Foi importante para o isolamento de outras variantes que uma mudança compensatória na proteína EI na posição 2122 também ocorreu, por exemplo, como em 16P1 isolado. Se ambas as alterações ocorreram ao mesmo tempo, em seguida, foram necessárias apenas algumas passagens sob a pressão anticorpo e soro, a fim de isolar outras variantes que exibiram adicionalmente uma substituição na posição 2889 na proteína E2. Algumas destas variantes de escape demonstrado adicionalmente uma mudança na posição 3225 na proteína E2. Um exemplo de uma tal variante de fuga é o isolado B5/2.

Representação esquemática do TAV-epítopo da variante B5/2:

Wildtyp C-Stamm: CTAVSPTTLRTEVVK

Mutante B5/2: CTAVSSTTLRTGVVK

Além disso passagem do B5/2 isolado sob pressão anticorpo conduziu ao isolamento do CB32 isolar. Este isolado exibiram adicionalmente uma substituição adicional na proteína E2 (nucleótido 2862), em adição a uma substituição compensatório na proteína EI na posição 2899. O CB32 isolado resultou a partir de uma mistura de variantes B5/2 e uma nova variante com a adicional substituição. A fim de isolar as novas variantes, que exibiram as substituições adicionais, o isolado foi passado CB32 para múltiplas passagens sob pressão anticorpo. A partir de uma subsequente e juntou-se H15 passagem do Q7 isolados, S10 e 011 foram isolados.

Ver Figura 1 para uma comparação de sequências de Epitopo TAV do S10, Oil e mutante Q7. Ver Tabela 1 para uma revisão das substituições de nucleótidos e de aminoácidos nas variantes de escape isolados.

Caraterização das variantes de escape B5/2, 116, Q7, S10 e 011 0 teste das variantes de escape em relação a ligação de vários anticorpos específicos de E2 foi realizado utilizando imunofluorescência.

Tabela 5: coloração de imunofluorescência indireta do escape a E2 selecionados variantes com uma substituição na proteína E2

Na maior parte dos casos, uma única substituição de aminoácidos no epitopo TAV-era suficiente para proporcionar um sinal negativo quando utilizando imunofluorescência com anticorpo A18Bommeli. Escapar variantes com duas mutações (tais como TAV B5/2) também apresentaram resultados negativos com ambos os anticorpos e A18C A18Bommeli (Figura 2) .

Tabela 7: coloração por imunofluorescência de passagens em particular, de diversas variantes de escape, E2 que exibem três substituições no epitopo TAV

Todos os testados isolados demonstraram sinais negativos para as passagens selecionadas para A18 colorações. No entanto, no 8thpassage do S10 isolar, uma pequena colónia foi tingivel usando o WH303 anticorpo. Isto suporta uma elevada estabilidade de substituições na TAV-epítopo. Outros testes de estabilidade foram realizados para o Q7, S10 e 011 isolados, utilizando culturas de rolos ao longo de 10 passagens adicionais.

Tabela 8: coloração diferencial de passagens selecionadas com os anticorpos A18 (IDEXX e Bommeli e WH303 (VLA) 0 anticorpo especifico da NS3 C16 (EURL) foi utilizado para fins de controlo

À 10a passagem, não havia nenhuma variante do vírus que demonstraram a reversão, de modo que a coloração era possível apenas com C16. o Q7 variante foi negativo para todos os colorações até o 14a passagem, segundo o qual na a 16a também foi incapaz de ser detetado com o anticorpo C16. Estas conclusões foram confirmadas por meio de RT-PCR em adição aos protocolos de PCR a sequenciação. assim, é claro que nenhum vírus está presente no 16thpassage, de modo que um erro passagem também podem ser excluídas. Algumas células poderiam, contudo, ser manchadas na 14a e 16a passagens do isolado S10 utilizando o anticorpo A18 (IDEXX) . Para o mutante 011, 16 passagens foram realizadas antes algumas células individuais podem ser coradas utilizando os anticorpos AI 8 (Bommeli) e WH303. Estes resultados demonstram a elevada estabilidade das caraterísticas serológicas das vacinas virais, como aqui descrito.

Caraterização das variantes de escape através de sequenciação de El e E2 A Tabela 9: Sequenciação de isolados anteriores exibem um substituto no Epitopo TAV da proteína E2

A substituição na posição 2870 foi mantida em todos os isolados após 10 passagens, o que parece ser muito estável. Isto apoia a conclusão de que esta substituição particular, não tem grande efeito sobre a estrutura da proteína, de forma que a reversão para a sequência de tipo selvagem não fornece nenhuma vantagem.

Tabela 10: Sequenciação de isolados com 3 substituições na E2 Epitopo TAV

As mudanças na sequência dos isolados Oil, S10 e Q7 foram estáveis por todas as passagens testadas (14-17).

Tabela 11: Sequenciação dos isolados Q7, S10 e 011 depois de várias passagens em culturas de rolos

Todas as passagens de virus sequenciados das três variantes continham as substituições nas proteínas El e E2, que foi induzida por pressão imunológica. A 16a passagem de Q7 não pôde ser sequenciada, provavelmente porque nenhum vírus foi remanescente no sobrenadante da cultura celular (ver acima). No caso em que revertentes vírus aparecem, que com base nas diversas colorações na Figura 2 não podem ser excluídos, eles só são detetáveis através de sequenciação a partir de uma determinada percentagem. A enorme maioria dos vírus, contudo, não são revertidos e restos substituído. Vírus único indivíduo revertido não pôde ser detetado por sequenciação.

Q7 específica em tempo real de RT-PCR A fim de diferenciar entre animais vacinados e infetados, foi aplicado um sistema de RT-PCR. Uma vez que o TAV-epitopo é altamente conservado em todos os virus de CSF, as substituições na Epitopo TAV foram usadas como uma base para os iniciadores e sondas na PCR em tempo real de ensaio.

Tabela 13: em tempo real de RT-PCR foi utilizada para controlo a carga de virus. Os seguintes sistemas de PCR foram aplicados: CSF mistura de 1 (CSFV específicos, reconhece todas as estirpes), Q7-TAV (específico para as variantes) e mistura Estirpe C de TAV (Estirpe C do tipo selvagem, com uma sensibilidade muito baixa, também podem ser detetou). Os resultados são apresentados como valores Ct (limiar de ciclo).

A carga virai foi determinada utilizando real tempo de RT-PCR. 0 sistema CSF-Mist. 1 reconheceu todas as estirpes de CSFV e não diferenciar entre o tipo selvagem estirpe C e as novas variantes de fuga. 0 sistema Q7-TAV reconheceu todas as três variantes de escape especificamente. 0 sistema

estirpe C TAV só reconheceu o tipo selvagem estirpe C (nenhuma das variantes de escape) , com um valor de t de aproximadamente 14. A redução muito pequena na diferença nos valores Ct entre o sistema Q7-TAV RT-PCR e o sistema Estirpe C de TAV com o aumento do número de passagens proporciona forte evidência para uma quantidade muito pequena de revertentes após elevado número de passagens. Em geral, a diferença entre os dois sistemas de 14 valores de Ct representam uma proporção de mutantes de revertentes de aprox. 1: 8000, em que um valor de Ct de 10 representa uma razão de 1: 1000.

Estudo animal 27/09 - Análise da resposta imunitária de mutantes estirpe C Riems B5/2-P6 e I16-P2

Intramuscular imunização foi realizada com 3 leitões, segundo o qual cada leitão receberam 2 ml de suspensão de virus (células de sobrenadante de cultura) . O grupo A foi tratado com B5/2, o grupo B foi tratado com 116 e o grupo de controlo foi tratado com a vacina de febre suina RIEMSER. Estes estudos proporcionam a análise da resposta imunitária após a imunização, testar as propriedades do marcador de vacinação depois modificado resposta imune (ELISA) e testar as propriedades do virus em animais vacinados (estabilidade genética e propriedades de replicação) .

Uma titulação de retorno dos virus aplicados mostrou os seguintes resultados: B5/2-P6: Titulação do virus 104·25 virus/ml I16-P2: Titulação do virus 104·75 virus/ml

Tolerância dos animais à vacina

Os porcos tratados demonstrou sem sintomas evidentes após a imunização (sem febre ou sintomas de doença) . 0 número de leucócitos não foi aumentado acima do normal durante os primeiros 7 dias após a imunização. 0 vírus não pode ser isolado a partir de sangue. ARN isolado a partir das amostras de sangue 4 e 7 dias após a imunização foi utilizado para a análise de RT-PCR. 0 produto de PCR foi no entanto inadequado para uma sequenciação subsequente. Isto demonstra uma taxa muito baixa de replicação do vírus nos animais.

Estudo animal 06/10 - Testando as variantes de escape Q7, S10 e Oil

Voltar à titulação revelou as seguintes concentrações de vírus, que foram usadas nas experiências: Q7-P8 10 4-° KIDso/ml S10- P8 10 4·25 KIDso/ml 011-P7 10 4·25 KIDso/ml vacina contra a febre suína estirpe C 10 2·25 KIDso/ml

Após a imunização, havia nem mudanças de temperatura nem doença do corpo sintomas típicos da peste suína para ser encontrado.

Análise clínica após desafio à infeção A febre foi definida como a temperatura do corpo retal de>40 °C durante pelo menos dois dias sucessivos. 5 grupos foram testados:

Grupo 1 (5 porcos) : mutantes do Variante Estirpe Cs Q7-P7 (1050 KIDso/mL)

Grupo 2 (5 porcos): mutantes do Variante Estirpe Cs S10-P8 (105-0 KIDso/mL)

Grupo 3 (5 porcos) : mutantes do Variante Estirpe Cs 011-P8 (10 5·0 KIDso/ml)

Grupo 4 (3 porcos) : RIEMSER vacina contra a febre suína (vírus bruto)

Grupo 5 (3 porcos): grupo de controlo não imunizados

No grupo 1 esporádico aumento medições de temperatura entre o 3o e 13° depois infeção por desafio, o que no entanto não estavam ligadas a qualquer outra perturbação visível no bem-estar dos sujeitos animais. Apenas o animal n° 4 demonstrou febre superior a 4 dias.

Grupos 2 exibiram aumentos na temperatura esporádicos em 3 animais tratados, em que nenhuns dos animais n° 9 demonstraram temperaturas elevadas significativas.

No grupo 3 o único animal n° 14 demonstrou um aumento da temperatura corporal com febre no 5o, 4o dia após infeção por desafio.

Os animais do grupo 4 não demonstraram febre, através do qual o aumento da temperatura esporádica foi medida em 2 animais tratados.

Todos os animais do grupo 5 demonstraram febre entre os 2o e 7o dia após a infeção. Devido a sintomas de peste suína significativos todos os animais do grupo 5 foram sacrificados 7 dias após a infeção. Os sintomas mais comuns foram os efeitos no sistema nervoso central (paresias perna traseira e ataxia, diarreia, conjuntivite e sonolência). Um animal demonstrou hematoma da pele. 0 vírus era incapaz de ser isolado a partir de animais imunizados a partir de esfregaços nasais, em que os animais de controlo não vacinados apresentaram resultado positivo 7 dias após a infeção.

Os resultados de RT-PCR com amostras de soro

Os resultados de RT-PCR demonstrou que depois de 14 dias pós-infeção, apenas sinais muito fracos poderia ser obtido a partir de animais imunizados quando o teste para a presença do vírus associado à doença virulenta. No entanto, os animais de controlo não vacinados demonstraram sinais positivos fortes com valores positivos da Ct de 30 ou menos 3 dias após a infeção. Os valores de Ct de animais não vacinados caíram para 17 após 7 dias.

Os resultados de RT-PCR a partir de esfregaços nasais

Os resultados de RT-PCR de animais imunizados foram unicamente negativo. Os animais de controlo não vacinados no entanto demonstrado um forte sinal positivo com valores de Ct entre 25 e 28 7 dias após a infeção.

Teste de neutralização de vírus com CSFV Alfort O teste de neutralização do vírus refere-se à determinação de se os animais (vacinados ou não qualquer vacinado) os anticorpos exibem que são capazes de neutralizar o vírus virulento. Todos os grupos imunizados mostraram anticorpos neutralizantes de 21 dias após a imunização. 7 dias após a infeção do vírus de teste de neutralização titulação contra Alfort era 640 ND50 ou mais, em todos os grupos imunizados. Um animal do grupo imunizado Oil e um animal no grupo de controlo Estirpe C exibiu uma titulação de 480. Os animais de controlo não imunizados não exibiram titulação do vírus contra Alfort na VNT.

Teste de neutralização do virus (VNT) com CSFV Rõsrath Ver Figura 3 para VNT com o Rõsrath estirpe CSFV.

Três semanas após a imunização, todos os animais, com exceção de um animal no grupo de S10 e de um animal do grupo Oil, mostrou anticorpos neutralizantes. 7 dias após a infeção os animais imunizados demonstraram, em geral, um titulação VNT de 640 ou maior. O menor titulação foi de 320, mostrado por um animal no grupo imunizado TAV mutante. Os animais não imunizados de controlo não exibiram titulação na VNT contra Rõsrath. E2-ELISA (IDEXX) O E2-ELISA é um ELISA-kit disponível no mercado para testar a presença de peste suína clássica. Em média, os animais estirpe C imunizados apresentaram resultados positivos nos E2-ELISA 21 dias após a imunização. Os animais imunizados com os mutantes TAV também mostraram resultados positivos após 7 dias no IDEXX E2-ELISA. O grupo de controlo não-imunizado não mostrou anticorpos detetáveis após a infeção.

Ver Figura 4 para o Idexx E2-ELISA com soro de porco.

No E2-ELISA, os resultados para os mutantes TAV antes da infeção foram positivos, mas não forte, enquanto após a infeção os resultados se tornaram fortemente positiva, o que sugere um efeito impulsionador forte. A estirpe C imunizada animal de controlo foi fortemente positiva na E2-ELISA antes da infeção.

Os resultados dos animais imunizados com os mutantes TAV são comparáveis com os animais imunizados com o grupo de controlo estirpe C. Isolamento do vírus após a infeção foi negativo e os resultados de RT-PCR foram questionável ou fracamente positiva, que também foi demonstrado no grupo de controlo estirpe C. Todos os animais exibiram titulações elevados no teste de neutralização de vírus contra Alfort além de Rõsrath. Todos os animais imunizados demonstraram proteção completa contra a estirpe do vírus infecioso Koslov quatro semanas após a imunização intramuscular.

Estudo animal 24/10- O teste de variantes de escape S10 e 011; proteção após imunização oral A fim de testar a eficácia da aplicação oral, o seguinte estudo realizado em animais foi realizada. 15 leitões foram utilizados como animais de teste, que foram 8-10 semanas de idade (aproximadamente 15-20 kg.).

Dose de vacina e desenho experimental:

Grupo 1 (6 porcos): variante de mutantes A estirpe C S10(105 KIDso/ml)

Grupo 2 (6 porcos): variante de mutantes B estirpe C Oil (104 KIDso/ml)

Grupo 3 (3 porcos): controlo infeciosa (não vacinados)

Grupo 1: Todos os animais deste grupo foram completamente protegidos antes da infeção por desafio. Ausência de sintomas associados à doença foi detetada. Todos os animais apresentaram anticorpos, que eram detetáveis por ambos a VNT e os testes de ELISA de neutralização.

Grupo 2: Os animais no grupo 2 demonstraram uma mistura de proteção e infeção. 2 animais demonstraram sintomas da doença, tais como febre alta e outros sintomas típicos da peste suína. Os animais afetados foram eutanasiados. Os animais protegidos apresentaram anticorpos, que eram detetáveis por ambos a VNT e os testes de ELISA de neutralização.

Grupo 3: Todos os animais foram infetados e apresentaram sintomas da doença. Os animais afetados foram eutanasiados. 0 estudo imunização oral demonstra que a imunização oral, especialmente utilizando o mutante S10, leva a uma proteção eficaz contra a infeção. 0 isolado 011 também demonstrou resultados benéficos, considerando-se a dose de vacina foi reduzida em comparação com o vírus administrada S10.

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Hulst et al, Passage of Classical Swine Fever Virus in Cultured Swine Kidney Cells Selects Virus Variants That Bind to Heparan Sulfate due to a Single Amino Acid Change in Envelope Protein Erns, Journal of Virology, Oct. 2000, p. 9553-9561 Vol. 74, No. 20.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> RIEMSER ARZNEIMITTEL AG Martin, BEER Immanuel, LEIFER Sandra, BLOME <120> vacinas marcadas para a peste suína clássica <130> XII 76/11 <150> DE 10 2010 017 006.2 <151> 2010-05-18 <150> EP 10075207.0 <151> 2010-05-18 <150> EP 10075205.4 <151> 2010-05-18 <150> EP 10075206.2 <151> 2010-05-18 <150> EP 10075759.0 <151> 2010-12-17 <150> EP 10075760.8 <151> 2010-12-17 <150> EP 11159207.7 <151> 2011-03-22 <160> 5 <170> Patentln version 3.3

< 210 > 1 <211> 60 <212> ADN <213> Flavivirus sp. <400> 1

cgggtgtcat agagtgcaca gtagtgagt caacgatt gagaacagga gtggtaaaga 60 <210> 2 <211> 60 <212> ADN <213> Flavivirus sp. <400> 2 cgggtgtcat agagtgcaca gcagtgagcc caacgatt gagaacagaa gtggtaaaga 60

<210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Flavivirus sp. <400> 3

Thr Ala Val Ser Ser Thr Thr Leu Arg Thr Gly Val Val Lys 15 10

<210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Flavivirus sp. <400> 4

Thr Val Val Ser Ser Thr Thr Leu Arg Thr Gly Val Val Lys 15 10

<210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Flavivirus sp. <400> 5

Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys 15 10

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. vacina marcada para o tratamento profilático da peste suina clássica compreendendo um virus vivo atenuado modificado da peste suina clássica, caraterizado por a sequência de aminoácidos virai do Epitopo TAV da proteína E2 compreender uma sequência diferente da de um virus da peste suína clássica de tipo selvagem, através do qual a sequência de aminoácidos virai exibe pelo menos uma das seguintes substituições com referência ao "Riems" da estirpe C vírus: - substituição de aminoácidos 830 por valina, - substituição de aminoácido 833 por serina, - substituição de aminoácido 839 por glicina.
2. 2. Vacina marcada de acordo com a reivindicação anterior, caraterizado por o vírus modificado não apresentar sequências de ácidos nucleicos recombinantes.
3. 3. Vacina marcada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caraterizado por a sequência de nucleótidos virai exibir uma ou mais das seguintes substituições com referência ao vírus "Riems" de Estirpe C: - substituição na posição nucleotídica 2862 por T, - substituição na posição do nucleótido 2870 por T, - substituição na posição nucleotídica 2889 por G.
4. 4. Vacina marcada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caraterizado por a sequência de aminoácidos viral exibe uma ou mais das seguintes substituições com referência ao virus "Riems" da estirpe C: substituição de aminoácido 426; na proteína erns; por valina, substituição do aminoácido 576; em proteínas El; por histidina, - substituição do aminoácido 583; em proteínas El; por ácido glutâmico, substituição de aminoácido 951: a proteína E2; por isoleucina.
5. 5. Vacina marcada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caraterizado por a sequência de nucleótidos virai exibe uma ou mais das seguintes substituições com referência ao Estirpe C "Riems" vírus: - substituição na posição nucleotídica 1649 por G, - substituição na posição nucleotídica 2099 por C, - substituição na posição nucleotídica 2122 por G, - substituição na posição nucleotídica 3225 por T.
6. 6. Vacina marcada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caraterizado por a sequência de aminoácidos viral do Epitopo TAV compreender a sequência de acordo com SEQ ID NO. 3 ou SEQ ID NO. 4.
7. 7. Vacina marcada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caraterizado por a sequência de nucleótidos compreender a sequência virai de acordo com a SEQ ID NO. 1.
8. 8. Vacina marcada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caraterizado por que os indivíduos tratados com a vacina poderem ser diferenciados de indivíduos infetados com o vírus da peste suína associada a doença através da análise de amostras biológicas obtidas a partir dos referidos sujeitos usando métodos analíticos sorológicos e/ou genómicos.
9. 9. Vacina marcada de acordo com a reivindicação anterior, caraterizada por o método de análise genómica basear-se na reação em cadeia da polimerase (PCR), de um modo preferido PCR em tempo real, em que os iniciadores e/ou sondas que reconhecem quer a sequência de nucleótidos virais modificada e/ou associadas à doença são utilizados.
10. 10. Vacina marcada de acordo com a reivindicação 8, caraterizado por o método de análise serológica basear-se num imunoensaio enzimático (EIA), de um modo preferido uma dosagem de imunossorvente enzimática (ELISA), em que os anticorpos que se ligam especificamente tanto ao epitopo TAV modificado e/ou associado à doença são utilizados.
11. 11. Vacina marcada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que pode ser obtido através da geração de variantes de evasão virai de doença associada ou outras estirpes virais de febre suína conhecidas por aplicação de pressão de anticorpo.
12. 12. Método de fabrico de uma estirpe de vacina de vírus da febre suína clássica de um modo preferido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, que compreende a geração de variantes de escape ou de outras estirpes virais de febre suína clássica conhecida por aplicação de pressão de anticorpos associados a doenças.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, caraterizado por o método compreender: - a passagem de múltiplas células, de preferência células de rim de leitão embrionárias, infetadas com vírus do suíno associadas à doença da febre em cultura de células, e aplicação simultânea de anticorpos dirigidos contra o epitopo TAV da proteína E2 do vírus da peste suína associada à patologia e/ou soro de coelho imunizado conforme péptido policlonal CTAVSPTTLRTEVVK.
14. 14 Composição farmacêutica que compreende o marcador de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 com um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. 15. Vacina marcada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 para utilização como um medicamento no tratamento profilático (vacinação), de preferência por meio de injeção intramuscular ou administração oral, da febre suína clássica.