CZ295138B6 - Nukleotidové sekvence pestivirových kmenů, polypeptidy kódované těmito sekvencemi a jejich použití v diagnostice a prevenci pestivirových infekcí - Google Patents

Abstract

Řešení předkládá nukleotidovou sekvenci odpovídající genomu CSFV (Classical swine fever virus) nebo její část nebo její mutantní formu, která obsahuje alespoň část nukleotidové sekvence C-kmene CSFV, popsané v SEQ ID No. 1, nebo komplement nebo RNA ekvivalent takovéto sekvence, nebo která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující alespoň aminokyselinovou sekvenci 268-494 podle SEQ ID No. 1, nebo komplement nebo RNA ekvivalent takovéto sekvence. Dále poskytuje pestivirové polypeptidy odpovídající aminokyselinové sekvenci 690-1063 podle SEQ ID No. 1 nebo její části, která obsahuje mutaci v jednom z epitomů v aminokyselinových sekvencích 691-750 nebo 785-870, přičemž uvedené mutace pozměňují uvedené epitopy. Rovněž poskytuje metodu určení přítomnosti testované látky, schopné se specificky vázat s vazebným místem vazebního partnera, ve vzorku, způsobem kompetice dané testované látky s měřitelným množstvím referenční látky schopné se specificky vázat na stejné vazebné místo daného vazebného partnera. Tato metoda spočívá v 1) kontaktování daného vzorku s a) danou referenční látkou navázanou na pevný nosič, b) vazebným partnerem dané referenční látky, přičemž daná molekula vazebného partnera obsahuje nejméně 2 identická vazebná místa pro danou referenční látku a c) danou referenční látkou, která je označena; 2) měření stupně navázání dané značky na daný nosič.ŕ

Description

Vynález předkládá metodu pro konstrukci celkové DNA kopie genomu C-kmene, vakcinového kmene klasické prasečí horečky (Classical swine fever), a transkripci RNA, která po transfekci do buněk má za následek syntézu infekčního C-kmene viru. Vynález také popisuje pestivirové vakcíny odvozené od C-kmene a vakcíny proti pestivirům a diagnostické způsoby a metody ve vztahu k pestivirovým infekcím. Vynález dále poskytuje metody detekce imunoaktivní látky ve vzorku pomocí kompetitivního testu.

Dosavadní stav techniky

Klasická prasečí horečka (classical swine fever - CSF) nebo prasečí cholera je vysoce nakažlivá a často smrtelná choroba, která je charakterizovaná horečkou a krvácením a může mít akutní nebo chronický průběh (Van Oirschot, 1986, Hog cholera, str. 289-300, Disseases of Swine, lowa Statě University Press, Ames). Tato choroba se občasně vyskytuje v některých evropských a dalších zemích a může způsobit značné ekonomické ztráty.

Vakcinace vepřů oslabeným vakcinovým kmenem viru CSF (dále CSFV), „čínským“ kmenem (C-kmen), způsobuje ochranu proti CSF (Terpstra a Wensvoort, 1988 Vet. Microbiol. 16: 123-128). Velkou nevýhodou vakcinace klasickými vakcínami, mezi které patří také C-kmen, je fakt, že takto očkovaní vepři nemohou být sérologicky odlišeni od vepřů infikovaných CSF virem. C-kmen je však zároveň považován za jednu z nej účinnějších a nejbezpečnějších živých vakcín. Přídavek sérologického označení k C-kmenu by tuto vakcínu značně zlepšilo a zvýhodnilo. CSF virus patří do rodu Pestivirus ze s skupiny Flavidiridae (Francki, R.I.B. a spol. 1991, Flavidiviridae, 223-233, Fifth report of the International Comittee on Taxonomy ofViruses, Archiv. Virol. Suppl. 2, Springer Verlag, Vienna). Dalšími dvěma příslušníky rodu pestivirus jsou BVD virus (Bovine viral diarrhoea), postihující převážně hovězí dobytek, a BDV virus (Border disease virus), postihující převážně ovce, přičemž oba viry jsou strukturálně, antigenově a geneticky velmi blízcí CSF viru (Moenning a Plagemann, 1992, Adv. Virus Res. 41: 53-98, Moormann a spol. 1990, virology 177: 184-198, Becher a spol. 1994, Virology 198: 542-551).

Genomy pestivirů obsahuje pozitivní RNA řetězce o délce přibližně 12,5 kb (Renard a spol. 1985, DNA 4: 429-438, Moormann a Hulst 1988, Virus Res. 11: 281-291, Becher a spol. 1994, Virology 198: 542-551). Genomové pozitivní RNA řetězce některých necytopatogenních BVD kmenů mohou být podstatně větší (Meyers a spol. 1991, Virology 180: 602-616, Meyers a spol. 1992, Virology 1991: 368-386, Qi a spol. 1992, Virology 189: 285-292).

Významnou vlastností virů s genomovou pozitivní RNA je skutečnost, že jejich genomováRNA je infekční, tj. po transfekci této RNA do buněk, které zajistí virovou replikaci, je produkován infekční virus. Podle očekávání je genomová (virová) RNA pestivirů také infekční (Moenning a Plagemann 1992, Adv. Virus Res. 41: 53-98).

Již několik let dovoluje technologie rekombinantní DNA in vitro transkripci klonované DNA. Tato možnost otevírá způsob, jak syntetizovat infekční RNA in vitro z DNA kopie z genomu pozitivních RNA virů. Je dobře známo, že DNA, na rozdíl od RNA je snadno manipulovatelná pomocí cílené mutagenese. Dostupnost technik pro produkci syntetických infekčních RNA tedy značně zvýšila možnost studovat např. replikaci, virulenci, patogenitu, RNA rekombinaci, tvorbu vektorů a antivirové strategie pozitivních RNA virů. Zavedení této technologie však může také způsobit některé problémy. Podstata těchto problémů je popsána v nedávné zprávě Boyer a Haenni 1994, Virology 198: 415-426). Úspěch nebo neúspěch v konstrukci DNA kopie

- 1 CZ 295138 B6 z genomu pozitivních RNA virů a produkce syntetické infekční RNA z této DNA kopie tedy nemůže být společně předpokládán.

Podstata vynálezu

Vynález předkládá nukleotidovou sekvence genomu pestivirového kmene, ve které je vynechána a/nebo substituována nejméně jedna nukleotidová oblast odpovídající oblastem aminokyselinové sekvence 268-494, 691-718, 717-750, 785-830, 829-870, 690-870 a 690-1063 a SEQ ID No: 1, a substituce odpovídá oblasti genomu jiného pestivirového kmene, přičemž tato substituce odlišuje nukleotidovou sekvenci od sekvence divokého pestiviru, nebo komplement nebo RNA ekvivalent této nukleotidové sekvence nebo jejich mutace. Také předkládá degenerované nukleotidové sekvence, které obsahují odlišné nukleotidy, ale kódují stejné aminokyseliny. Vynález také popisuje polypeptidy kódované těmito nukleotidovými sekvencemi a vakcínové kmeny, jejichž genom obsahuje tuto nukleotidovou sekvenci, zvláště rekombinantní virus založený na transkripci DNA kopie genomu C-kmene CFSV.

Částečné nukleotidové sekvence (viz výše) jsou také vhodné, zvláště ty, které obsahují mutaci ve strukturální oblasti virového genomu, tj. v nukleotidové sekvenci kódující aminokyseliny 1-1063 podle sekvence SEQ ID No. 1. Mutace může být substituce odpovídající části genomu jiného pestiviru, substituce jedné nebo více aminokyselin, nebo delece. Mutací také může být inzerce nebo substituce heterologní nukleotidovou sekvencí, která změní translační strategii CSFV nukleotidové sekvence nebo změní způsob kódování polypeptidů vCSFV nukleotidové sekvenci. Dále mutací může být inzerce nebo substituce heterologní nukleotidové sekvence, kódující imunitu proti dalšímu patogenu, v tomto případě je CSFV sekvence používána jako vektor pro heterologní imunogeny.

Vynález se také týká nukleotidových sekvencí pestivirů obecně nebo jejich části či mutantních forem, jejichž sekvence obsahují mutaci v oblasti kódující El protein, tj. v nukleotidové sekvenci kódující aminokyseliny odpovídající aminokyselinám 691-750 nebo 785-870 podle sekvence SEQ ID No. 1, stejně jako polypeptidů kódovaných těmito nukleotidovými sekvencemi. Tyto polypeptidy jsou zvláště vhodné pro ochranu zvířat proti pestivirovým infekcím, neboť dovolují diagnostiku, která je schopná rozlišit zvíře infikované pestivirem a zvíře po vakcinaci.

Vynález se dále týká vakcín obsahujících nukleotidovou sekvenci, polypeptid nebo vakcínový kmen (uvedený výše) a diagnostických prostředků obsahujících nukleotidovou sekvenci nebo polypeptid (uvedené výše) nebo protilátku získanou proti tomuto polypeptidu.

Vynález se vztahuje k metodám a prostředkům pro diagnostiku pestivirových infekcí, zvláště k metodám a prostředkům dovolujícím rozlišit mezi infikovaným a vakcinovaným zvířetem.

Vynález také poskytuje metodu pro určení testované látky, jako např. protilátky nebo antigenu, pomocí specifického vazebného testu, kde se používá specificky vázající referenční látka v imobilizované formě a tatáž látka v označené formě.

Detailní popis vynálezu

Vynález poskytuje kompletní cDNA sekvenci RNA genomu „čínského kmenu (C-kmen, EP-A351901) CSFV. To dovoluje konstrukci celkové DNA kopie této sekvence, podle kterého může být transkribována syntetická RNA, která po transfekci do vhodných buněk, např. SK6-M (Kasza a spol. 1972, Res. Vet. Sci. 13: 46-51, EP-A-351901) dává vznik infekčnímu viru Ckmene. Použití tohoto objevu pro vývoj vakcín z modifikovaného C-kmene, např. které obsahují (sérologickou) značku, je popsán. Ačkoliv vynález je popisován pomocí jednoho kmene CSFV, je použitelný pro další pestivirové kmeny pomocí výměny specificky genomových segmentů (viz

-2CZ 295138 B6 níže) mezi pestiviry a C-kmenem CSFV, nebo pomocí konstrukce „infekční“ DNA kopie pestivirů.

Nukleotidová sekvence DNA kopie genomové RNA C-kmene je znázorněna v SEQ ID No.l. Čísla uvedená v textu se vztahují k této sekvenci a mohou se nepatrně lišit od ostatních pestivirů. Nukleotidová sekvence o délce 12 312 nukleotidů obsahuje jeden velký otevřený čtecí rámec (ORF) o délce 11 694, který kóduje polyprotein o délce 3898 aminokyselin. Velikost tohoto ORF je stejná jako u kmenu Brescia CSFV (Moormann a spol. 1990, Virology, 177: 184-198) ajako u kmenu Alfort (Meyers a spol. 1989, Virology 171: 555-567).

ORF začíná kodónem ATG v nukleotidové pozici 374 až 376 a končí TGA kodónem v nukleotidové pozici 12 068 až 12 070. 5'koncová nekódující sekvence, která předchází ORF, je o délce 373 nukleotidů. Její sekvence je vysoce konzervovaná mezi kmeny Brescia, Alfort a C (obr. 2) a předpokládaná sekundární struktura této oblasti připomíná 5' koncovou nekódující oblast viru hepatitidy C (další člen skupiny Flaviridae) (Brown a spol. 1992, Nucleic Acids Res. 20: 5041— 5045). V 5'koncové nekódující oblasti viru hepatitidy C byly popsány vnitřní místa pro vstup do ribosomu (Internal Ribosome Entry Site, IRES (Tsukiyama-Kohara a spol., 1992, J. Virol. Res. 66: 1476-1483). Tyto místa mají důležitou regulační funkci (Agol. 1991 Adv. Virus. Res. 40: 103-180). Analogie s virem hepatitidy C naznačuje, že 5'koncová nekódující oblast CSFV také obsahuje místa pro vstup do ribosomu, které jsou umístěny přibližně mezi nukleotidy 124 a 374, podle sekvence SEQ ID No.l, jako důležitý regulační prvek. Toto místo může být použito jako mutační místo pro tvorbu oslabeného viru, stejně jak pro změnu translační strategie ORF.

Druhou důležitou oblastí regulující replikaci pestivirů je 3' nekódující oblast. Po porovnání sekvence C-kmene se sekvencemi kmenů Brescia a Alfort byla nalezena unikátní sekvence o délce 13 nukleotidů v této oblasti C-kmene (obr. 2B). Tato unikátní sekvence TTTTCTTTTTTTT j_e v pozici 12 128 až 12 140 podle SEQ ID No. 1. Je to jediná inzerce větší než dva nukleotidy pozorovaná v sekvenci C-kmene ve srovnání s kmeny Brescia a Alfort. Jinak jsou sekvence 3'koncových nekódujících oblastí vysoce homologní. Homologie mezi sekvencemi v této oblasti je nižší, pokud jsou porovnávány CSFV kmeny vBVDV kmeny. Přesto je jasné, že TTTTCTTTTTTTT sekvence C-kmene je nepřítomná v 3'koncové nekódující oblasti BVDV kmenu TTTTCTTTTTTTT sekvence se zdá tedy být unikátní v genomu C-kmene a může sloužit jako výborný signál pro specifické sekvence C-kmene. Tato sekvence může být použita jako základ pro nukleotidové sondy a pro sekvenční určení k identifikaci C-kmene specifických pestivirů. Proto všechny pestivirové kmeny, které mají tuto sekvenci ve své 3'koncové nekódující oblasti (není nezbytné, aby byla ve stejné pozici jako u C-kmene) jsou považovány za příbuzné C-kmenu a jsou také součástí tohoto vynálezu.

Klíčovým parametrem pro infektivitu transkriptů DNA kopie genomu pestivirů je jejich aminokyselinová sekvence. Z tohoto hlediska je nutné uvažovat dva aspekty týkající se klonování a sekvencování RNA virů obecně a pestivirů zvláště. Za prvé, mutační frekvence genomu pozitivních RNA virů je vysoká (kolem 1/10⁴ nukleotidů na replikaci), a proto žádný virový zásobní roztok nebo preparace virové DNA není klonována, pokud se týká virové RNA, kterou obsahuje. Mezi těmito molekulami RNA mohou být molekuly, které jsou neinfekční. Pokud neinfekčnost byla způsobena předčasným ukončením translace ve velkém otevřeném čtecím rámci, je možné toto snadno rozpoznat. Také mutace ovlivňující aktivní místa virových enzymů nebo známých struktur proteinů mohou být rozpoznány. Avšak pokud je vztah mezi aminokyselinovou sekvencí a funkcí a strukturou proteinu neznámá, což je případ mnohých pestivirových proteinů, je nemožné určit, která aminokyselina je platná a která není. Za druhé, mutace mohou vznikat v průběhu cDNA syntézy. Proto genom C-kmene byl klonován a sekvencován nezávisle dvakrát. Oblasti s nesrovnalostmi mezi sekvencemi byly klonovány a sekvencovány neméně třikrát (srovnej obr. 1). Sekvence, které se shodovaly dvakrát v určité pozici, byly považovány za správné. Nutnost tohoto přístupu pro tvorbu infekčních transkriptů DNA kopie genomu C-kmene je demonstrována na následujícím příkladu. Celková DNA kopie pPRKflc-113, určená po druhém kole

-3 CZ 295138 B6 klonování a sekvencování (obr. 3), se zdála být neinfekční. Po klonování a sekvencování oblastí s nesrovnalostmi mezi sekvencemi cDNA klonů v prvním a druhém kole se objevily 5 aminokyselin, kterými se lišila celková DNA kopie po druhém kole a sekvence C-kmene, která byla považována za správnou. Po opravě těchto 5 aminokyselin vpPRFflc-113 byl získán klon pPRKflc-133, který tvořil infekční transkripty (obr. 4). Pět rozdílů se nachází v aminokyselinových pozicích 1414 (Val->Ala); 2718 (Gly->Asp); 2877 (Val->Met); 3228 (Leu^Met); 3278 (Tyr—>Glu). Aminokyseliny kódované v těchto pozicích cDNA sekvencí,která je neinfekční, jsou zobrazeny za šipkou (SEQ ID No. 1). Zde každá ze změn aminokyselin individuálně zruší infekčnost transkriptů musí být určeno analýzou infekčnosti transkriptů s jednotlivými mutacemi pro každou z pěti aminokyselin. Tyto objevy ukazují, že malé rozdíly v aminokyselinové sekvenci mohou být klíčové pro infekčnost transkriptů DNA kopie genomu C-kmene. Je také naznačeno, že příprava transkriptů kopie sekvence pestiviru se může v praxi zdát nemožná kvůli malým změnám v sekvenci (dokonce v jedné aminokyselině), které mohou být neodhaleny.

Mutanty odvozené od C-kmene, které jsou vhodné pro vývoj (signálních) vakcín, jsou součásti tohoto vynálezu. Mohou obsahovat mutace jako delece, inzerce, (násobné) nukleotidové mutace a vložené nebo vyměněné genomové fragmenty pocházející zjiných pestivirových kmenů, podle nukleotidové sekvence SEQ ID No. 1.

Sekvence C-kmene může být rozdělena do čtyř oblastí vhodných pro mutaci a/nebo výměnu. Oblast jedna je 5'koncová nekódující oblast v pozici 1 až 373. Oblast dvě kóduje strukturní proteiny N^pro-C-E2-E3-El a nalézá se v pozici 374 až 3563. Oblast tři kóduje nestruktumí proteiny a nalézá se v pozici 3564 až 12 068. Oblast čtyři je 3'koncová nekódující oblast v pozici 12 069 až 12 311.

Oblast, která je zvláště vhodná pro tvorbu signálních vakcín, odvozených od C-kmene, obsahuje genomovou oblast kódující strukturní proteiny N^pro-C-E2-E3-El. Tato oblast se nachází mezi aminokyselinami 1 a 1063 podle sekvence SEQ ID No. 1. Preferované podoblasti této části genomu jsou specifikovány následujícími aminokyselinovými sekvencemi: 1-168 (N^pro), 169-267 (C), 268—494 (E2), 495-689 (E3) a 690-1063 (El), nebo jejich částmi. Jako příklad, N-koncová antigenní část oblasti kódující El C-kmene, nalézající se v pozici 690 až 877 byla zaměněna za odpovídají oblast El kmene Brescia (Obr. 4 pPRKflc-h6). Nově vytvořený derivát C-kmene je infekční a může být rozlišen od kmene divokého typu a od kmen Brescia díky reakci specifické monoklonální protilátky s kmeny C a Brescia, určené proti El a E2. Výsledný C-kmen reaguje s monoklonální protilátkou specifickou pro El kmene Brescia (tabulka 1). Antigenní vlastnosti tohoto nového mutantu se změnily vzhledem k rodičovskému viru, demonstrujícím, že výměna N-koncové poloviny El C-kmene se úsek z jiného CSFV kmene je jedním z možných přístupů pro vývoj signálních vakcín odvozených od C-kmene. Tento vynález se však neomezuje pouze na výměnu N-koncových polovin El mezi C-kmenem a dalšími kmeny. N-koncové poloviny El z dalších pestivirů mohou být zaměněny za odpovídající části El z C-kmene. Z tohoto hlediska El sekvence pestivirových kmenů, které jsou izolovány z prasat, ale patří do antigenních skupin jiných než C-kmen, jsou zvláště vhodné. Příklady takovýchto kmenů, které byly vybrány na základě křížové neutralizace, jsou např. kmeny Van EE, Stam, SF UK 87, Wisman a 5250 (Wensvoort a spol. 1989 Vet Microbiol. 20: 291-306, Wesvoort 1992, Report on meeting of national swine laboratories within the European Community, 16.-17.6. 192, VI/4059/92-EN(PVET/En/1479) 1992, 59-62).

N-koncová polovina El obsahuje tři antigenní domény, A, B a C, nalézající se na různých místech El proteinu a reagující silně s neutralizujícími monoklonálními protilátkami (Wensvoort 1989, J. gen. Virol 70: 2865-2876, Van Rinj a spol. 1992, Vet Microbiol. 33: 221-230, Van Rinj a spol. 1993, J. Gen Virol. 74: 2053-2060). Epitopy konzervované mezi 94 CSFV testovanými kmeny se nalézají v doméně A, zatímco epitopy domén B a C nejsou konzervované (Wensvoort 1989, J. Gen. Virol 70: 2865-2876). Mapování epitopů s hybridy El genů kmenů Brescia a C (Van Rinj a spol. 1993, Vet. Microbiol. 33: 221-230) a s delečními mutanty El kmene Brescia naznačilo, že domény A a B+C tvoří dvě odlišné antigenní jednotky v N-koncové polovině El

-4CZ 295138 B6 (Van Rinj a spol. 1993, J. Gen. Virol. 74: 2053-2060). Tento poznatek byl podpořen nálezem, že šest cysteinových zbytků nalézajících se v pozicích 693, 737, 792, 818, 828 a 856 a N-koncové polovině El je nezbytných pro správné prostorové poskládání El. Nejméně Cys 792 není klíčový pro infekčnost kmene Brescia, protože mutant tohoto viru rezistentní vůči monoklonální protilátce byl izolován s mutací Cys—>Art v této pozici (Van Rinj a spol. 1993, Presentation a abstract at the 9^th Internation Congress of Virology, 8.-13.4., Glasgow, Scotland).

Zatímco malé změny v aminokyselinové sekvenci mohou zrušit infekčnost RNA C-kmene (viz příklad 2), změna cysteinu v pozici 792 ukazuje, že aminokyselinová změna v pozici, o která se předpokládá, že je méně vhodná pro modifikace bez ztráty funkce, může mít za následek tvorbu životaschopného virového mutantu. Efekt určitých aminokyselinových změn na vlastnosti viru bude tedy nutno určit empiricky pro každou aminokyselinu v sekvenci C-kmene. To znovu ukazuje, že žádná zřejmá cílová sekvence pro modifikaci C-kmene, např. pro vývoj signálních vakcín, nemůže být identifikována na základě dříve publikovaných informací.

Podstatná pro vývoj signálních vakcín odvozených od C-kmene je možnost sérologicky rozlišit mezi vakcinovaným a infikovaným vepřen. Již dříve bylo ukázáno, že vektor odvozený od živého oslabeného viru pseudorabies, který exprimoval El, nebo imunoafinitně čištěný El, exprimovaný v hmyzích buňkách pomocí baculovirových vektorů, indukují obrannou imunitní odpověď u prasat proti prasečí choleře (WO 91/00352, Van Zijn a spol. 1991, J. Virol. 65: 2761-2765, Hulst a spol., 1993. J. Virol. 67: 5435-5442). Překvapivě bylo zjištěno, že mutanty El s deletovanou A doménou nebo s deletovanou B+C doménou (obr. 5) také indukují obrannou imunitní odpověď u prasat proti prasečí choleře (tabulka 2). Tato ukazuje, že obranná imunita indukovaná vakcínou nezávisí na neutralizačních protilátkách proti doménám A a B+C. Pestivirové mutované kmeny se nezaměněnou nebo mutovanou pouze doménou A, nebo pouze doménou B+C, nebo jejich částmi, s odpovídající oblastí jiného pestiviru, s výhodou pestiviru izolovaného z prasat a náležející do odlišné antigenní skupiny než C-kmen (např. viz výše), jsou proto také součástí vynálezu. Oblast El obsahují A doménu a vhodná pro záměnu nebo mutaci je umístěna mezi aminokyselinami 785 až 870. Části této oblasti mohou být vhodně zaměňovány nebo mutovány, např. podoblasti nalézající se mezi aminokyselinami 785 a 830 a mezi aminokyselinami 829 a 870. Oblast El obsahující domény B+C a vhodná pro záměnu nebo mutaci je umístěna mezi aminokyselinami 691 a 750. Části této oblasti mohou být vhodně zaměňovány a mutovány, např. podoblasti nalézající se mezi aminokyselinami 691 a 718 a mezi aminokyselinami 717 a 750.

Zvířata infikovaná pestiviry tvoří protilátky proti E2 (Kwang a spol. 1992, Vet. Microbiol. 32: 281-292, Wensvoord, nepublikované pozorování). Proto druhou vhodnou oblastí pro vývoj signálních vakcín mutační cestou (delecemi, inzercemi, bodovými mutacemi), záměnou genetického materiálu s antigenně odlišnými pestiviry nebo pestiviry náležejícími do odlišné antigenní skupiny, je oblast kódující E2.

C-kmen také může být použit jako vektor pro inzerci a expresi heterologního genetického materiálu (sekvencí). Heterologní genetický materiál vložený do C-kmene slouží ke změně translační strategie velkého ORF a zpracování polyproteinu kódovaného tímto ORF. Jako příklad sekvence vhodné pro změnu translační strategie velkého ORF je sekvence určená jako vnitřní místo pro vstup ribosomu (IRES) (Duke a spol. 1992, J. Virol. 68: 1602-1609). Příklad sekvence vhodné pro změnu zpracování polyproteinu je signální sekvence odpovědná ze translokaci proteinů exportovaných z buňky nebo ukládaných do membrány, přes membránu endoplasmatického retikula (Blobel 1980., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 1496-1500, Kreil 1981, Annu. Rev. Biochem. 50. 317-348). Signální sekvence jsou odštěpeny buněčnými signálními proteázami. Sekvence kódující štěpící místa pro virové proteázy mohou být také použita pro změnu zpracování polyproteinu.

Sekvence vložená do C-kmene a jím exprimovaná může sloužit jako signál k identifikaci vakcinovaných prasat nebo může být použita k ochraně proti patogenům, z kterých tato sekvence původně pochází. Signální sekvence jsou s výhodou vysoce antigenní a pocházejí z mikroorga

-5CZ 295138 B6 nismů, k jejichž replikaci u prasat dochází. Mohou kódovat známé kompletní genové produkty (např. kapsidové nebo obalové proteiny) nebo antigenní části těchto genových produktů (tj. epitopy). S výhodou signální sekvence pocházejí z virů náležejících do skupin: Adenoviridae, Arenaviridae, Arteriviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Flaviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Orghomyxoviridae, Paramyxovirida, Papovaviridae, Rhabdoviridae, Parvoviridae, poxviridae, Picornaviridae, Roeviridae a Togaviridae. Signální sekvence však také mohou kódovat arteficiální antigeny, které se normálně neobjevují v přírodě, či histochemické signály, jako např. β-galaktosidáza Escheriche coli, alkohol dehydrogenáza (Drosophila), lidská placentální alkalická fosfatáza, luciferáza a chloramfenikol acetyltransferáza.

Heterologní genetický materiál kódující jeden nebo více proteinů indukujících obrannou imunitu proti chorobám vyvolaných patogeny, z nichž pochází daný heterologní genetický materiál, může být odvozen od dalších pestivirových kmenů, včetně sekvencí kmenů specifikovaných výše, prasečího parvoviru, prasečího respiračního koronaviru, gastro-enteritického viru, viru Aujeszkyho choroby (pseudorabies), viru prasečí endemické diarrhoery, prasečího chřipkového viru a od bakterií, jako např. Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis, Treponema hyodysenteria, Eschemichia coli, Leptospira a od mykoplasem, jako např. Mycoplasma hyopneumoniae a Mycoplasma lyorhinis.

Vhodná místa pro vložení heterologních sekvencí do C-kmene se nalézají mezi aminokyselinovými zbytky 170 až 171, 690 a 691, 691 a 692 a jsou označeny v sekvenci SEQ ID No. 1.

Vynález dále popisuje diagnostické testy, které mohou být použity pro odlišení prasat očkovaných značenou vakcínou, nebo vakcínou obsahující mutovaný El a/nebo mutovaný E2 od prasat infikovaných pestivirovými kmeny. Vhodné typy takovýchto testů jsou popsány v příkladech 4 a 5. V konvenčním ELISA testu pro CSFV je El použit jako antigen ve vazebném komplexu (CTB) (CTB-ELISA test je popsán v Wesvoort a spol. 1988, Vet. Microbiol 17: 129-140). Tento CTB-ELISA test nebo ELISA využívající dvě protilátky (tzv. sendvičová ELISA), používají dvě monoklonální protilátky (Mab), které byly získány proti El proteinu kmene Brescia CSFV. Epitop pro Mab b3, který se nachází uvnitř domény A, je konzervován mezi CSFV, zatímco epitop pro Mab B8, který se nachází uvnitř domény C, není konzervován (Wensvoort 1989, J. Gen. Virol. 70. 2865-2876). Výše uvedený test CTB-ELISA je citlivý, spolehlivý a specificky detekuje specifické protilátky proti CSFV u prasat infikovaných pestiviry. Tento test je schopen rozlišit prasata infikované kmeny CSFV a prasata infikované BVDV kmeny. Nedokáže však rozlišit infikovaná zvířata od zvířat očkovaných vakcínou odvozeno od C-kmene. Tento test také není vhodný společně s El vakcínou, ať živou nebo mrtvou.

Jedním z testů podle předloženého vynálezu je modifikovaný CTB-ELISA test, založený pouze na jedné protilátce, např. Mab b3. Tento CTB-ELISA test, založený na pouze jedné protilátce, tuto protilátku využívá jedna jako antigen navázaný na povrch ELISA testovacích destiček a jednak jako kompetici pro kmenové sérum, dosud nebyl popsán a je podstatnou složkou tohoto vynálezu. Nyní byl princip tohoto testu popsán a může být využit k vývoji diagnostických testů pro detekci dalších protilátek, včetně protilátek proti jiným virům a jiným chorobám. Nález je použitelný pro všechny CTB-ELISA nebo pro ELISA založené na stejném principu jako CTBELISA, které jsou vyvinuty na základě jednoduché protilátky a dimenzovaného nebo multimerizovaného antigenů. Tato metoda je také vhodná pro určení další molekuly v párech specificky se vázajících molekul jako např. aktivátor/receptor, enzym/inhibitor apod., kde jeden z partnerů má nejméně dvě identická vazebná místa.

Vynález dále obsahuje metodu k určení přítomnosti testované látky (tj. protilátka), schopné vázat se vazebným místem s vazebným partnerem (tj. antigen), ve vzorku, způsobem založeným na kompetici dané testované látky s měřitelný množstvím referenční látky (protilátka), schopné specifické vazby s tímtéž vazebným místem daného vazebného partnera. Tato metoda spočívá v

-6CZ 295138 B6

1) kontaktu daného vzorku s a) danou referenční látkou (protilátka) navázanou na pevný nosič, b) s vazebným partnerem (antigen) dané referenční látky, přičemž molekula vazebného partnera obsahuje nejméně dvě identická vazebná místo pro danou referenční látku, a c) s danou referenční látkou (protilátka) s navázanou značkou;

2) v měření stupně oddělné značky od pevného nosiče.

Jako příklad daný vazebný partner (antigen) k dané referenční látce (protilátka) obsahující nejméně dvě identická vazebná místa, je dimer vazebného partnera (antigen) kdané referenční látce.

Za použití téhož principu vynálezu obsahuje metodu určení přítomnosti testované látky (antigen), obsahující nejméně dvě identická vazebná místa na molekulu pro specifickou vazbu s vazebným partnerem (protilátka), spočívající v

1) kontaktu daného vzorku s a) daným vazebným partnerem (protilátka) navázaným na pevný nosič a b) s daným vazebným partnerem s navázanou značkou;

2) měření stupně vazby dané značky na nosič.

V těchto metodách jsou protilátky a antigeny uvedeny pouze jako jeden z možných příkladů a mohou být nahrazeny jinými specificky se vázajícími partnerskými molekulami.

Dále vynález předkládá diagnostický test obsahující: (a) referenční monoklonální protilátku navázanou na pevný nosič, (b) danou referenční monoklonální protilátku s navázanou značkou, a volitelně (c) antigen k dané referenční protilátce obsahující nejméně dvě identická vazebná místa pro danou protilátku; nebo komplex mezi danými složkami (a) a/nebo (b) a (c); stejně jako další složky pro provedení kompetitivního imunologického testu.

Tato metoda je vhodná jako rozlišovací diagnostický test společně s El vakcínou, která má deleci v jednom nebo ve více epitopech El, tj. v doméně A. Test je také vhodný pro El vakcíny, které mají mutovanou doménu A tak, že protilátky vytvořené proti této mutované doméně nekompetují sMab b3 pro epitop Mab B3. Dále je test vhodný pro vakcíny odvozené od modifikovaného C-kmene a od dalších CSFV kmenů s delecí v doméně a, pro vakcíny, v kterých byla doména A zaměněna za pestivirový úsek náležející do jiné antigenní skupiny, nebo v kterých byla doména A mutována tak, že protilátky namířené proti této doméně nekompetují s Mab b3 pro epitop Mab b3. Ačkoliv je test popisován a specifikován pro doménu A El, podobný test může být založen na Mab b8 a použit pro vakcíny s delecemi v doménách B+C nebo C, pro vakcíny, v kterých byly domény B+C nebo C zaměněny za pestivirové úseky náležející do jiné antigenní skupiny, a pro vakcíny, v kterých jsou domény B+C nebo C mutovány tak, že protilátky namířené proti těmto doménám nekompetují s Mab b8 pro epitop Mab B8. Test je opsán pro Mab b3 nebo Mab b8 kmene Brescia. Test může být ale také vytvořen pro další protilátky namířené proti doméně A nebo doménám B+C El kmene Brescia, nebo proti doménám A a B+C kteréhokoliv dalšího kmen CSFV, nebo pro protilátky proti analogním doménám El jiných pestivirových kmenů. Test může být založen na epitopu E2 (viz příklad 5). Antigeny vhodné pro modifikovaný test CTBELISA podle předkládaného vynálezu jsou s výhodou dimery nebo multimery El (plus nebo minus 3-TMR) nebo E2 (viz příklad 5) CSFV kmenů reagující s Mab b3 nebo Mab b8 nebo podobnými Mab namířenými proti E2 epitopům. V případě vakcín s mutovanou doménou A, dimery nebo multimery antigenum užité pro diagnostické testy mohou být syntetizovány pomocí delečního B+C konstruktu (viz příklad 5), nebo v případě vakcín s mutovanou doménou B+C, dimery nebo multimery antigenu užité pro diagnostické testy mohou být syntetizovány pomocí delečního A konstruktu (srovnej konstrukty obr. 5, srovnej příklad 4 a 5). Dimenzovaná (nebo multimerizovaná) forma El antigenu je založena na tvorbě disulfídických můstků mezi cystainovými zbytky v C-koncové části El. To dovoluje velmi citlivý imunotest, neboť dimerizovaná antigenní molekula obsahuje dvě kopie epitopu jedné Mab. Tato jediná Mab může být použita pro imobilizaci dimenzovaného antigenu díky jednou epitopu a pro označení dimenzovaného

-7CZ 295138 B6 antigenu díky druhého epitopu. Kompetice sérovými protilátkami získanými kmenovou infekcí inhibuje navázání označené protilátky na antigen a z toho vyplývá citlivý test pro přítomnost takových protilátek. Vynález se také týká diagnostických testů založených na tomto základě, které obsahují El- nebo E2-antigeny, (enzymově) značené a imobilizované protilátky téhož typu určené proti El a E2 epitopům, stejně jako další konvenční složky (rozpouštědla, enzymové substráty, barevné složky atd) pro provedení imunotestu kompetitivního typu.

Vakcína podle vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci popsanou výše, buď jako takovou, nebo jako vakcínový kmen, nebo ve vektoru, nebo hostitelském organismu, nebo jako polypeptid popsaný výše, v množství účinném pro vytvoření obrany proti pestivirovým infekcím. Vakcína může být také multiúčelová vakcína obsahující další imunogeny nebo nukleotidy, které je kódují. Vakcíny mohou dále obsahovat konvenční nosiče, adjuvancia, emulgátory, solubilizující složky, ochranné látky atd. Vakcíny podle předloženého vynálezu se připravují podle konvenčních metod.

Metoda podle předloženého vynálezu pro produkci infekčních transkriptů DNA kopie genomu C-kmene CSFV, je použitelný pro další odvozené C-kmeny nebo další pestivirové kmeny. Metoda, popsaná zde pro živou oslabenou CSFV vakcínu, může být s výhodou použita pro in vitro modifikaci C-kmene nebo dalších CSFV nebo jiných pestivirových kmenů pro vývoj vakcín.

Vakcína odvozená od C-kmene podle předloženého vynálezu dovoluje sérologické odlišení vakcínových prasat od infikovaných zvířat CSFV kmeny. Signální vakcíny z dalších CSFV a jiných pestivirových kmenů mohou být získány stejným způsobme podle metody podle předloženého vynálezu. Tyto signální vakcíny mohou být vyvinuty například pomocí mutací (delece, bodové mutace, inzerce) v oblasti kódující El nebo v N-koncové polovině El nebo v doménách A nebo B+C, nebo v oblasti kódující E2 C-kmene, nebo v analogních oblastech genomů odvozených C-kmenů nebo v dalších pestivirových kmenech, nebo výměnou těchto oblastí s odpovídajícími úseky antigenně odlišných pestivirů nebo pestivirů náležejících do odlišných antigenních skupin.

Alternativním přístupem pro vývoj značených vakcín odvozených od C-kmene je možnost přidání heterologního genetického materiálu exprimující vysoce antigenní protein nebo epitop(y) mikroorganismu (který se nereplikuje v hostitelském organismu (prase)), nebo je arteficiálního původu a normálně se u prasat nevyskytuje.

Tento heterologní genetický materiál může kódovat antigeny indukují obrannou imunitu proti chorobám způsobených mikroorganismy patogenními pro prasata. Proto přihláška C-kmene nebo kmenů odvozených od C-kmene nebo od dalších pestivirových kmenů jako vektoru pro expresi heterologních antigenů indukujících obranu proti určitým chorobám v hostitelském organismu (přičemž hostitelský organismus je savec) je také součástí vynálezu. Konstrukce rekombinantních virů C-kmene exprimujících heterologní sekvence a vhodná místa pro vkládání těchto heterologních sekvencí jsou popsány výše. Analogní rekombinantní viry mohou být vytvořeny z kmenů odvozených od C-kmene a z dalších pestivirů. Tyto viry jsou také součástí vynálezu.

Podstatná část vynálezu se týká imunogenní vlastnosti podjednotky El s delecí v doméně A nebo v doménách B+C. Jak je shrnuto v tabulce 2, obě tyto mutantní formy El jsou schopné indukovat obrannou imunitu u prasat proti letální dávce vysoce virulentního kmene Brescia. Použití mutantních forem El obsahující delecí nebo jiné mutace v doménách A a B+C jako mrtvé nebo jako živé vakcíny exprimované vektorovým systémem ve vakcinovaném zvířeti je také součástí předloženého vynálezu. Také mutované formy El společně s dalšími antigenními CSFV proteiny, např. E2 nebo mutovanými formami E2, jsou vhodné jako mrtvé nebo živé vakcíny (viz výše).

Vynález dále popisuje diagnostické testy, které lze použít pro rozlišení mezi zvířaty očkovanými signální CSFV vakcínou, nebo vakcínou obsahující (mutovanou) El a/nebo (mutovanou) E2, a mezi zvířaty infikovanými pestivirovými kmeny. Tyto diagnostické testy mohou být založeny na sérologické, antigenní detekci nebo na detekci nukleových kyselin. Volba testu vhodného pro

-8CZ 295138 B6 daný případ mezi jiným závisí na specifítě použitého signálu. Jednou z vhodných forem sérologického diagnostického testu je modifikovaný CTB-ELISA, popsaný v příkladu 4. Podle předloženého vynálezu tato metoda, založená na CTB-ELISA za použití jedné protilátky, není omezena podle kontextu pouze na CSFV či další pestiviry, ale je také použitelná pro určení dalších protilátek pro další diagnostické účely v lidské a veterinární medicíně, stejně jako pro určení dalších specificky vázajících se látek.

Příkladem vhodného antigenního detekčního testuje test detekující El CSFV kmene a nikoliv El vakcíny v krvi vepřů. Pokud A doména C-kmene byla modifikována např. výměnou za odpovídající úsek pestivirových kmenů náležející od odlišné antigenní skupiny než CSFV, tento test může být založen na monoklonální protilátce rozeznávající konzervované epitopy domény A CSFV.

Pokud je však E2 oblast C-kmene modifikována pro vývoj signální vakcíny, sérologický nebo antigenní diagnostický test doprovázející tuto vakcínu detekuje rozdíly mezi vakcínovými a infikovanými zvířaty, podle modifikované E2 oblasti. Takový diagnostický test tak užívá E2 specifickou sekvenci jako antigen. Tyto E2 specifické sekvence mohou pocházet z rodičovského C-kmene (viz příklad 5) nebo z pestivirů náležejících od odlišné antigenní skupiny než CSFV. Avšak tyto E2 specifické sekvence mohou být získány díky mutacím (delece, inzerce, bodové mutace) nativního E2 jakéhokoliv pestivirů nebo mohou obsahovat (mutovanou) část E2 jakéhokoliv pestivirů. Dimerické nebo multimerické E2 mohou být použity jako antigeny v diagnostickém testu (viz příklad 5). Také E2 společně s jednou monoklonální protilátkou (srovnej příklad 4 a 5) mohou být použity v CTB-ELISA testu, jehož princip byl popsán výše. Diagnostický test založený na E2 je popsán v příkladu 5. V případě, že detekční systém má detekovat pestivirový E2 a je založen na jedné Mab, s výhodou pak obsahuje protilátku rozeznávající konzervovaný epitop na E2. Tyto testy jsou také součástí vynálezu.

Diagnostické testy mohou být konečně založeny na specifické detekci oblasti CSFV kmenů, která je modifikována v C-kmeni. Mezi vhodné techniky pro tyto testy patří hybridizace nukleových kyselin, např. se specifickými sondami a/nebo amplifikace, např. pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Alternativně sekvence C-kmene mohou být odlišeny od sekvencí CSFV kmenů PCR amplifíkaci 3'koncové nekódující oblasti (nebo její části) obsahující TTTTCTTTTTTTT sekvenci, která je unikátní pro genom C-kmene.

Pokud je C-kmen modifikován vložením heterologní signální sekvence, jakákoliv forma diagnostického testu založená na této sekvenci, např. založená na antigenu, epitopu(epitopech) nebo na histochemickém produktu kódovaném touto sekvencí, nebo založená na detekci heterologní genetické informace pomocí hybridizačních technik, např. pomocí specifických sond a/nebo pomocí amplifikačních technik, jako např. PCR, je také součástí tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Molekulární klonování a sekvencování genomu C-kmene

Buňky a viry: Prasečí ledvinové buňky (SK6-M, EP-A-351901) byly pěstovány na Eagle základním médiu obsahujícím 5% fetální hovězí sérum (FBS) a antibiotika. FBS bylo testováno na přítomnost BVDV a BVDV protilátek podle opsaných technik (Moormann a spol. 1990, Virology 17: 184-198). Dále se používaly nové FBS, která neobsahovala BVDV a BVDV protilátky.

C-kmen („Chinese“ vakcínový kmen) byl použit pro SK6T-M buňky, jak je popsáno v EP-A351901. Kmen označený „Cedipest“ je necytopatogenní a byl klonován v trojnásobném konečném ředění. Po třech amplifikačních krocích byl produkován klonovací virový roztok s titrem 3,5.1O⁶TCID₅o/ml.

-9CZ 295138 B6

Izolace cytoplasmatické RNA z SK6-M buněk infikovaných C-kmenem

Intracelulární RNA z buněk infikovaných C-kmenem byla izolována podle popsaných technik (Moorman a spol. 1990, Virology, 177: 184-198).

Buňky SK6-M v 162 cm² baňkách (Costar) byly infikovány kmenem Cedipest při multiplicitě infekce (m.o.i.) 5 TCID₅₀ na buňku. Buňky byly infikovány po dobu 1,5 hodiny při teplotě 37 °C a čerstvé médium bylo přidáno na konečný objem 40 ml. Po 7 hodinách byl přidán actinomycin D v konečné koncentraci 1 pg/ml. Po 24 hodinách byly buňky dvakrát promyty vychlazeným fosfátovým solným pufrem (PBS) a lyžovány ve vychlazeném lyzačním pufru (50 mM Tris-HCL pH 8,2; 0,14 M NaCL; 2 mM MgCl₂; 5 mM DTT; 0,5% (v/v) NP-40; 0,5% (w/v) Na-deoxycholát a 10 mM vanadyl ribonukleázový komplex (New England Biolabs)). Lyžované buňky byly centrifugovány (4 °C, 5 min, 4000 g) a supematant byl ošetřen proteinázou K (250 pg/ml konečná koncentrace) po dobu 30 minut ve 37 °C, dvakrát extrahován fenolem, chloroformem a izoamylalkoholem (49:49:2) a jednou extrahován chloroformem a izoamylalkoholem (24:1). RNA byla uchovávána v etanolu.

Syntéza a amplifikace cDNA

Jeden ze dvou pg cytoplasmatické RNA z buněk infikovaných C-kmenem a 20 pmol (-) primerů byly indukovány s 1 pg mM methylrtuťnatého hydroxidu po dobu 10 min při teplotě místnosti. Denaturovaná RNA byla pal inkubována s lpi 286 mM β-merkaptoetanolu po dobu 5 min při teplotě místnosti. Následovala reversní transkripce RNA s 200-400 jednotkami M-MLV reversní transkriptázy deficientní v RNase-H (Promega) po dobu 45 min při teplotě 42 °C v lx M-MLV pufru pro reversní transkriptázu (50 mM Tris-HCl PH 8,3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl₂ 10 mM DTT), s 40 U rRNasin (Promega) a s 80 pM dATP, dGTP, dCTP a dTTP. Konečný reakční objem byl 25pl. Vzorky byly převrstveny 30 pl minerálního oleje (Sigma).

Po reversní transkripci (RT) byly vzorky denaturovány po dobu 10 minut při 94 °C. 2,5 pl z každé RT-reakce se amplifikovalo PCR v 39 cyklech (cyklus: 94 °C, 60 s, 55 °C, 60 s, 72 °C, 1 až 2 min) ve 100 pl pufru pro Taq polymerázu (dodáván s Taq polymerázou) obsahující lpM (+) a (-) primerů, 200 pM každého ze čtyř nukleotidů a 2,5 U Taq DNA polymerázy (Boehringer Mannheim). Vzorky byly převrstveny 75 pl minerálního oleje (Sigma).

Klonování cDNA kompletního genomu C-kmene

Genom C-kmene byl klonován nezávisle dvakrát. Během prvního kola klonování (obr. 1A), primery pro syntézu prvního řetězce cDNA a pro PCR byly voleny na základě homologie mezi sekvencemi CSFV kmenů Brescia (Moormenn a spol. 1990, Virology 177: 184-198) a Alfort (Meyers a spol. 1989, Virology 171:555-567) a mezi BVDV kmeny Oslos (Renard a spol. EP 0208672) a Nadi (Collett a spol. 1988, Virology 165: 191-199). Velikost cDNA fragmentů byly voleny mezi 0,5 až 2,5 kb, aby bylo možné zajistit optimální amplifikaci. Amplifíkační produkt po gelové purifikaci byl ošetřen T4 DNA polymerázou a Kenow DNA polymerázou I a fosforylován T4 polynukleotidylkinázou. Poté byly cDNA fragmenty ligovány T4 ligázou do Smál místa plasmidu pGEM4z-blue.

V druhém kolem klonování (obr. IB) byly primery voleny ze sekvencí cDNA získaných po prvním kole klonování. Pokud to bylo možné, primery obsahovaly restrikční místa vhodná pro klonování amplifíkovaných cDNA fragmentů. Po RT a PCR amplifikaci (viz výše) byly cDNA fragmenty buď štěpeny dvěmi různými restrikčními enzymy, nebo byl vytvořen tupý konec a fosforylován (viz výše) na tomto konci fragmentu a štěpen pouze jedním restrikčním enzymem na druhém konci fragmentu. Pokud nebylo možné použít restrikční místa vložená pomocí PCR (umístěná na primerů), bylo pro klonování vybráno vhodné místo uvnitř amplifikované cDNA fragmentu. Po gelové purifikaci byly PCR produkty ligovány do pGEM4z-blue (také gelově

- 10CZ 295138 B6 purifíkován) (Promega) nebo do pGEM5zf(+) (Promega), které byly štěpeny restrikčními enzymy, které vytvářejí konce kompatibilní skonči PCR produktů.

Aby bylo možné získat cDNA klony obsahující 5' a 3' koncové úseky genomu C-kmene, použili jsme 3-5' ligační metodu (Mandl a spol. 1991, Joumal ofVirology 65: 4070-4077). Cytoplasmatická RNA byla izolována z buněk infikovaných C-kmenem, jak bylo popsáno výše, a byla dále puriflkována v 5,7 CsCl grafíentu (Moormann a Hulst 1988, Virus Res 11: 281-291). Na základě poznatků, že na 5' konci BVDV genomu se nevyskytuje žádná čepičková (Cap) struktura (Brock a spol., 1992, J Virol. Meth. 38:39—46), byla RNA C-kmene ligována bez předchozí ošetření pyrofosfatázou. 8 pg RNA bylo ligováno v reakční směsi obsahující 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 20 U rRNasin (Promega, 10 pg/ml BSA (neobsahující RNasy) a 1 mM ATP za použití 10 U T4 RNA ligázy (New England Biolabs). Směs byla inkubována po dobu 4 hodin při teplotě 37 °C. RNA byla extrahována fenol/chloroformem, precipitována etanolem a resuspendována ve vodě, která neobsahovala Rnasy. Vzorky RNA o hmotnosti 2 pg byly reverzně transkribovány a amplifikovány podle postupu popsaného výše. 2 pg z každé PCR reakce byly znovu amplifikovány za použití sady primerů. Pro reversní transkripci byl (-) primer hybridizován s 5'koncovou nekódující oblastí. Pro dva PCR amplifikační kroky jsme použily (+) primery hybridizující k 3'koncové nekódující oblasti a (-) primery hybridizující k 5' koncové nekódující oblasti. Po extrakci fenol/chloroformem a etanolové precipitaci byly PCR produktu štěpena Ncol (toto restrikční místo obsahoval (+) primer) a Eagl (nukleotid 81 v sekvenci SEQ ID No. 1) a ligovány do Ncol-Eagl míst plasmidu pUC21 (Vieira a Messing 1991, Gene 100: 189-194).

Všechny modifikace a klonovací postupy použité v příkladu 1 byly prováděny v podstatě podle popsaných technik (Sambrook a spol. 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Restrikční enzymy DNA modifikační enzymy jsou komerčně dostupné a používané podle nároků doporučovaných dodavateli. Plasmidy byly transformovány a udržovány v bakterii Escherichia coli, kmen DN5a (Hanahan 1985, DNA cloning 1: 109-135).

Sekvencování cDNA klonů

Plasmidová DNA použitá pro sekvencování byla extrahována a puriflkována buď alkalickou lyží a LiCl precipitaci, nebo centrifugací v CsCl gradientu (Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y.). Sekvenční kit založený na použití T7 polymerázy (Pharmacia) byl použit pro přímé sekvencování dvouřetězcové plasmidové DNA. Kromě SP6, T7 a universálních pUC/M13 přímých a reverzních primerů byly použity oligonukleotidové primery založené na sekvenci CSFV kmene Brescia (Mooormann a spol. 1990 Virology 177: 184-198). Primery byly syntetizovány na Cyclona DNA syntetizéru (new Brunswick Scientific) nebo na 392 DNA/RNA syntetizéru (Applied Biosystems). Sekvenční reakce byly analyzovány v 5% akrylamidovém gelu obsahujícím 8 M močovinu. Údaje získané sekvenací byly analyzovány Compag 368 za použití Speedreader hardware a Pcgene software (Intelligenetics lne. Applied Imaging Corp. Ženeva) a Apple Macintosh za použití programu MacMollytetra.

Vzhledem k možnosti sekvenčních chyb a změn způsobených Taq polymerázou nebo kheterogenitě RNA C-kmene byla celková genomová sekvence cDNA klonů C-kmene určována sekvencováním minimálně dvou cDNA klonů, získaných po nezávislých PCR reakcích. Pokud byly zjištěny rozdíly mezi nukleotidovými sekvencemi mezi těmito dvěma klony v určitých oblastech, byla konsensus nukleotidová sekvence určena sekvencováním třetího CcDNA klonu po dalším nezávislém PCR (Obr. 1A).

- 11 CZ 295138 B6

Příklad 2

Vznik infekčních transkriptů z celkové DNA kopie genomu C-kmene

Konstrukce cDNA klonu pPRKflc-113

Celková DNA kopie genové RNA C-kmene byla vytvořena podle schématu naznačeného na obr. 3. Byla konstruovány dva subklony, z nichž jeden (pRPc64) obsahuje cDNA sekvenci 5' koncové poloviny genomu (nukleotidy 1-5560) a druhý (pPRclll) obsahuje cDNA sekvenci 3' koncové poloviny genomu (nukleotidy 5463-12311). Nejprve byla snaha klonovat celkovou cDNA do pGEM4z-blue. Tento přístup však selhal pro nedostatečnou stabilitu celkové DNA v tomto vektoru. Pro zvýšení stability klonů byly inzerty 5' a 3' koncových polovin klonů reklonovány do nízkokopiového vektoru pOK12 (Vieira a Messing 1991, GENE 100: 189-194) za vzniku plasmidů pPRclO8 a pPRcl23. pOK12 byl modifikován deleci většiny restrikčních míst v násobném klonovacím místě (MCS) a T7 promotorové sekvence. Výsledky vektor pPRP, který byl použit pro všechna klonování celkové DNA stále obsahoval unikátní restrikční místa Spěl, Notl, Eagl, GamHI, EcoRV, EcoRI a Xbal v MCS.

Konstrukce klonu celkové DNA pPRKflc-113 probíhala podle obr. 3. Inzerty plasmidů pPRc45 a pRPc46 byly spojeny vHpal místě, nacházejícím se v nukleotidové pozici 1249 v sekvenci C-kmene (SEQ ID No. 1) za vzniku plasmidů pPRc49. Inzert plasmidů pPRc49 byl následně spojen s inzertem plasmidů pRPc44 a Nsil místě, nacházejícím se v nukleotidové pozici 3241 (SEQ ID No. 1) za vzniku plasmidů pPRc63. Klon 5' koncové poloviny genomu pPRc64 (nukleotidy 1-5560, SEQ ID No. 1) byl konstruován spojením inzertu z plasmidů pPRc63 s amplifíkovaným cDNA fragmentem 5' koncové oblasti genomové RNA C-kmen (viz níže). 5'koncový (+) primer byl syntetizován tak, aby obsahoval EcoRI a Sáli místa následované promotorovou sekvencí pro T7 RNA polymerázu a prvními 23 nukleotidy genomové RNA C-kmen. Tento primer a (-) primer z druhého kola klonování byly použity pro amplifikaci cDNA fragmentu, který byl štěpen EcoRI a Xhol a klonován do EcoRI-Xhol (nukleotid 216 SEQ ID No. 1) štěpeného pPRc63. Inzert vpPRc64 byl na závěr předklonován do EcoRI-Xbal místa v pPRK za vzniku pPRclO8.

Klon 3' koncové polymery genomu pPRclll (nukleotidy 5463-12311, SEQ ID No. 1) byl konstruován spojením čtyř klonů po druhém kole klonování (pPRc67, 53, 58 a 55) a jednomu klonu po prvním kole (pPRcl4). Inzerty zpPRc67 a pPRc53 byly spojeny vNhel místě, nacházejícím se v nukleotidové pozici 7778 za vzniku plasmidů pPRc71. Inzerty zpPRc55 a pPRc58 byly spojeny vApal místě v nukleotidové pozici 10 387 za vzniku plasmidů pPRc65. Inzerty z pPRc65 a pPRcl4 byly následně spojeny v AflII místě v nukleotidové pozici 11 717 za vzniku plasmidů pPRc73. Inzert z pPRc73 byl spojen s inzertem z pPRc71 v Pstl místě, nacházejícím se v nukleotidové pozici 8675 za vzniku plasmidů pPRc79. Poté byl inzert z pPRc79, který obsahuje kompletní 3' koncovou sekvenci cDNA C-kmene, modifikován tak, aby obsahoval Srfl místo, v němž po štěpení vzniklo přesné 3' konce cDNA sekvence C-kmene (pro přesné doběhnutí RNA transkripce). Aby bylo možné tohoto dosáhnout, byl 3' koncový (-) primer syntetizován tak, že obsahoval Srfl a Xbal místa a 18 nukleotidů komplementárních k 3' koncové sekvenci genomové RNA C-kmene. Tento primer a (+) primer z prvního kola klonování byly použity pro amplifikaci cDNA fragmentu. Tento fragment byl štěpen Spěl (nukleotidová pozice 11 866, SEQ ID No. 1) a Xbal a klonován do SpelXbal místa v pPRc79 za vzniku pPRcl 11.

Klon celkové cDNA vpPRKflc-113 byl konečně konstruován inzercí specifického fragmentu NcoI⁵⁵³²-XbaI^mcsC-krnene z pPRcl 11 do Ncol⁵⁵³²-Xbal^mcs místa plasmidů pPRcl08.

Konstrukce klonu celkové DNA pPRKfc-133

Klon celkové cDNA pPRKflc-113 měl, kromě tichých nukleotidových mutací, 5 bodových mutací vedoucích k aminokyselinovým změnám vzhledem k aminokyselinové sekvenci, získané po sekvencování a nejméně dvou prvních kolech cDNA klonování. Těchto 5 bodových mutací

- 12CZ 295138 B6 v pPRKflc-113 bylo změněno v převládající sekvenci díky výměně postižených DNA fragmentů s odpovídajícími DNA fragmenty obsahujícími převládající sekvenci.

Klony cDNA 5' koncové poloviny vpPRcl08, s bodovou mutací v nukleotidové pozici 4516, byly změněny výměnou Scal³⁴¹³-Ncol⁵⁵³² fragmentu zpPRcl08 za tentýž fragment zpPRcl24. Klon pPRcl24 byl vytvořen výměnou PvuII⁴⁴⁸⁵-NheI⁵⁰⁶⁵ fragmentu zpPRc44 za odpovídající fragment zpPRc32 (srovnej obr. 1). Nový klon 5' koncové poloviny genomu byl označen pPRcl29.

Pro klonovací účely byly klony 3' koncové poloviny konstruovány delecí části 5' koncové sekvence C-kmene z pPRKflc-113 od Sáli místa ve vektoru (srovnej obr. 3) až po Hpal místo v nukleotidové pozici 5509 (SEQ ID No. 1) za vzniku plasmidu pPRcl23. V plasmidu pPRcl23 měly být změněny mutace v nukleotidových pozicích 8526, 9002, 10055 a 10205. Mutace v nukleotidové pozici 8526 byla opravena ve dvou krocích. Za prvé. ApaI⁸⁵⁰⁶-PstI⁸⁶⁷⁵ fragment plasmidu pPRc53 byl zaměněn za odpovídající fragment z plasmidu pPRc90 za vzniku plasmidu pPRcl25. Za druhé, Nhel -Pstl fragment plasmidu pPRcl23 byl zaměněn za odpovídající fragment z plasmidu pPRc 125 za vzniku pPRc 127.

Aby bylo možné opravit tři mutace v pozicích 9002, 10055 a 10205, nejprve jsme modifikovali pPRc58 tak, aby bylo deletováno restrikční místo FspI ve vektoru. Pro tento účel byl deletován EcoRI^mcs-NdeI fragment z plasmidu pPRc58 (Ndel štěpí v pGEM4z-blue) za vzniku pPRcl26. Plasmid pPRcl26 byl použit pro opravu mutací a pozicích 10055 a 10205 výměnou jeho fragmentu Sacl⁹⁹⁷⁵-Apal¹⁰³⁸⁷ za odpovídající fragment z plasmidu pPRc96 za vzniku plasmidu pPRc 128.Mutace v pozici 9002 byla opravena výměnou Aatl-FspI⁹⁰¹⁶ (Aatl štěpí vpGEM4zblue) z plasmidu pPRcl2 za Aatl-FspI⁹⁰¹⁶ fragment z plasmidu pPRc90 za vzniku plasmidu pPRcl30. Pstl -Apal fragment byl zaměněn za odpovídající fragment z plasmidu pPRcl30 za vzniku plasmidu pPRcl32. Všechny subklonovací kroky, kterých byly měněny jednotlivé mutace, byly ověřeny sekvencováním.

Klon celkové cDNA pPRKflc-133 byl konstruován inzercí Neol⁵⁵³²-Xbal^mcs fragmentu z plasmidu pPRcl32 do Neol⁵⁵³²-Xval^mcs místa v plasmidu pPRcl29.

Konstrukce hybridního klonu celkového DNA pPRKflc-h6

Antigenně odlišný, ale životaschopný mutant C-kmene byl připraven z klonu pPRKflc-133 výměnou části El genu z tohoto konstruktu za odpovídající úsek z genomu CSF viru kmene Brescia. Pro tento účel NheI²⁴⁴³-AflIII²⁹⁹⁹ fragment z plasmidu pPRcl29 byl zaměřen za odpovídající fragment zpPEhó (van Rinj a spol 1992) za vzniku hybridního klonu 5' koncové poloviny genomu pPRcl39. Hybridní klon celkové DNA pPRKflc-h6 byl konstruován inzercí Neol⁵⁵³²-Xbal^mcs z plasmidu pPRcl32 do plasmidupPRcl39. Tento klon nyní obsahoval antigenní oblast El z CSF viru kmene Brescia včetně unikátního restrikčního místa BlglII.

Všechny modifikace a klonovací postupy používané v příkladu 2 byly prováděny podstatně podle popsaných technik (Sambrook a spol. 1989, Molecular Clonin: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Restrikční enzymy a DNA modifíkační enzymy byly komerčně dostupné a používané pro doporučení dodavatelů. Plasmidy byly transformovány a udržovány v bakterii Escherichia coli kmen DH5cc (Hanahan 1985, DNA cloning 1: 109-135).

In vitro RNA transkripce

Plasmidová DNA použitá pro in vitro RNA transkripci byla purifikována na Qiagen kolonách (Westburg). Po linearizaci s Xbal nebo Srfl byla plasmidová DNA extrahována fenolem a chloroformem, precipitována etanolem, vysušena a rozpuštěna v odpovídajícím objemu vody, která neobsahovala Rnasy.

- 13 CZ 295138 B6 pg iinearizované plasmidové DNA byl použit jako matrice pro in vitro transkripci. RNA byla syntetizována ve 37 °C po dobu 1 hodiny ve 100 μΐ reakční směsi obsahující 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 6 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin, 10 mM DTT, 100 U rRNasin (Promega), 0,5 mM ATP, GTP, CTP a UTP, 170 U RNA polymerázy (Pharmacia). Matricová DNA byla odstraněna pomocí DNasy I (Pharmacia, bez RNas) po dobu 15 minut ve 37 °C s následnou extrakcí fenolem a chloroformem a etanolem precipitací. RNA byla rozpuštěna ve 20 μΐ vody (neobsahující Rnasy) a její koncentrace změřena spektrofotometricky při 260 nm.

RNA transfekce

RNA transfekční směs byla vytvořena opatrným smícháním 50 μΐ lipofektinu (Gibco BRL) (10 pg lipofektinu ve vodě neobsahující Rnasy) a 50 μΐ RNA roztoku (1 pg RNA ve vodě neobsahující Rnasy) a inkubací této směsi při teplotě místnosti po dobu 15 minut. Pro RNA transfekci byly použity SK6 buňky pěstované na šestijamkových miskách pro tkáňové kultury (průměr 35 mm). Buňky byly dvakrát promyty Dulbeccovým modifikovaným Eagle médiem (DMEM). Poté byl k buňkám přidán 1 ml DMEM, následovaný RNA transfekční směsí. Po 16 hodinách inkubaci při teplotě 37 °C bylo médium zaměněno za 2 ml DMEM doplněné o 5% FBS. Inkubace pokračovala další 3 dny v teplotě 37 °C. Buňky pak byly inkubovány se CSFV specifickou monoklonální protilátkou a navázanou křenovou peroxidázou a byla vyvolávána specifická barevná reakce podle popsaných technik (IPMA immunoperoxidase monolayer assay) (Wensvoort a spol. Vet. Microbiol 1986 12: 101-108).

Charakterizace rekombinantních virů C-kmene

Supernatant transfekovaných buněk byl přenesen na konfluentní vrstvu SK6-buněk v testovacích jamkách o průměru 35 mm a inkubován po dobu 5 dnů při teplotě 37 °C. Transfektované buňky byly trypsinovány a ředěny 7,5xDMEM a rostly po dobu dalších 7 dnů při teplotě 37 °C v 75 cm² baňkách (Costar). Virový roztok byl dále připravován opakovaným (2 krát) zamražením a rozmražením buněk a přečištěním buněčné suprese centrifugací při 5000 g po dobu 10 min při teplotě 4 °C a následným odebráním supematantů.

Virus byl charakterizován pomocí IMPA a pomocí restrikční analýzy RT-PCR amplifikováných virových fragment. Po infekci SK6-buněk virem Flc-h6 a Fic—133 byly buňky inkubovány po dobu 4 dnů při teplotě 37 °C. Následně byly buňky imunobarveny za pomocí monoklonálních protilátek proti konzervovaným (Mab b3, doména A) a nekonzervovaným (Mab b5 a b6, domény B+C) epitopům na části El kmenu Brescia a za pomoci protilátek specifických pro C-kmen a namířených proti El (Mab c2) nebo E2 (Mab c5) (Wensvoort, G. 1989, Thesis, 99-113, Utrecht, Nizozemí). Buňky SK6 infikované nativním virem Brescia nebo nativním virem C-kmen byly použité jako kontrolní v tomto pokusu. Výsledky jsou předloženy v tabulce 1. Podle očekávání Mab b3 rozeznává epitop na El konzervovaný u CSFV kmenů a tudíž rozeznává všechny kmeny v tabulce 1. Mab b5 a b6 nerozeznávají El C-kmene a tudíž reagují pouze s kmenem Brescia a Flc-h6. Mab c2 nerozeznává El kmene Brescia a reaguje pouze s C-kmenem a Fic—133. Mab c5 nerozeznává E2 kmene Brescia, a proto reaguje se všemi viry uvedenými v tabulce s výjimkou kmene Brescia.

Genomová RNA viru Flc-h6 byl měla obsahovat unikátní BglII restrikční místo, které je umístěné v El genu (viz výše). Aby bylo možné ověřit přítomnost tohoto restrikčního místa, byla cytoplazmatická RNA izolována z SK6-buněk infikovaných rekombinantním virem Flc-h6 nebo Fic—133, amplifikována pomocí PCR (podle postupu popsaného výše, za použití primerů popsaných v Vav Rinj a spol., 1993, J. gen. Virol. 74: 2053-2060) a štěpeny BglII. Amplifikovaný fragment o délce 1 091 bp pocházející z Flc-h6 byl skutečně štěpen BglII za vzniku fragmentů o délce 590 a 501 bp, zatímco amplifikovaný fragment pocházející Fic—133 zůstal intaktní.

-14CZ 295138 B6

Příklad 3

Imunizace prasat delečními mutanty El

Konstrukce a exprese delečních mutant El CSFV kmene Brescia

Jak již bylo ukázáno, El, neobsahující TMR z virového kmen Brescia, exprimovaný v hmyzích buňkách, vyvolává obrannou imunitní odpověď u prasat proti CSF (Hulst a spol. 1993, J. Virol. 67: 5435-5442). Dvě odlišné antigenní jednotky, A a B+C, vN-koncové polovině El, které indukují tvorbu neutralizačních protilátek proti CSFV, byly také definovány (Wensvoort, 1989, J. Gen. Virol. 70: 2865-2876, Van Rijn a spol. 1992, Vet. Microbiol. 33:221-230, Van Rijn a spol. 1993, J. Gen. Virol. 74: 2053-2060). Dále neutralizační protilátky proti doménám A a B+C fungují synergicky v neutralizaci CSFV (Wensvoort, 1989, J. Gen Virol. 70: 2865-2876). Pro vyhodnocení imunogenicity mutantních forem El s delečemi v doméně A nebo v doménách B+C, byly vytvořeny odpovídající konstrukty v bakulovirových vektorech a exprimované mutantní proteiny byly testovány u prasat.

Bakuloviry exprimující mutantní El byly konstruovány překrývající se rekombinací DNA z divokého typu AcNPV (Aztographa califomica nuclear polyhedrosis virus) a DNA z vektoru pAcMo8 obsahující sekvenci kódující určitou mutantní formu El. Vektor pAcMo8 byl odvozen od pAcAs3 (Vlak s pol. 1990 Virology 179:312-320) inzercí T přímo na 5' koncovou první bázi (G) unikátního místa BamHI z druhého vektoru. Tímto způsobem byl vytvořen startovací kodón ATG překrývající první G s BamHI místem. Mediátorová RNA je transkribována z heterologních sekvencí vložených do BamHI místa za plO promotor AcNPV.

Sekvence kódující mutantní formy El byly odvozeny z El inzertů vpPRb2 (Van Rijn a spol. 1992, Vet. Microbiol. 33: 221-230) pomocí PCR amplifikace. Pro tento účel byly zkonstruovány dva primery obsahující BamHI místo ve svých sekvencích. 5'koncový primer (+) má sekvenci 5'- AGA TTG GAT CCT AAA GTA TTA AGA GGA CAG GT-3' (SEQ ID No. 2). Podtržená sekvence v tomto primeru je identická s nukleotidovou sekvencí 2362-2381 v sekvenci kmene Brescia (Moornann a spol. 1990, Virology 177: 184-198), sekvence popsaná tučně znázorňuje místo BamHI. 3'koncový primer (-) obsahuje stop kodón sousedící s BamHI místem. Má sekvenci 5'- TA GTC GGA TCC TTA GAA TTC TGC GAA GTA ATC TGA - 3' (SEQ ID No. 3). Podtržená sekvence je komplementární k nukleotidům 3433-3453 v sekvenci kmene Brescia (Mourmann a spol. 1990, Virology 177: 184-198), sekvence označená tučně znázorňuje místo BamHI a Sekvence označená kurzívou znázorňuje stop kodón.

Amplifikované sekvence byly klonovány do BamHI místa pAcMo8 a jejich správná orientace ve vektoru byla ověřena restrikční analýzou. Správný vektor byl označen jako pPAbl 1. Překrývající rekombinace mezi AcNPV DNA a DNA plasmidu pPAbl 1, selekce a purifikace bakulovirových vektorů exprimujících El byly prováděny podle Hulst a spol. 1993, J. Virol. 67: 5435-5442. Další charakterizace El v radioimunoprecipitačních testech s El specifickými monoklonálními protilátkami byla také popsána Hulstem a spol. 1993, J. Virol. 67: 5435-5442. Výsledný rekombinantní bakulovirus exprimuje El divokého kmene Brescia bez TMR (srovnej 2. úsek (od shora) na obr. 3). Tento El bez TMR je sekvetován z buněk (Hulst a spol., 1993, J. Virol. 67: 5435-5442).

Delece oblasti kódující domény B+C z El genu v pPAbl 1 bylo dosaženo výměnou Nhel-BglII fragmentu tohoto konstruktu za odpovídající fragment pPEhl4 (Van Rinj a spol. 1993, J. Gen. Virol. 74: 2053-2060). Výsledný vektor byl označen pPAbló. Obsahuje deleci v El genu od kodónu 693 do 746. Podobně byla deletována doména A zpPAbll výměnou Nhel-BglII fragmentu za odpovídající fragment pPEhl8 (Van Rijn a spol. 1993, J. Gel. Virol. 74: 2053— 2060) za vzniku vektoru pPAbl2.pPAbl2 obsahuje deleci v El genu od kodónu 800 do 864.

Rekombinantní bakuloviry exprimující deletované El byly konstruovány, selektovány a charakterizovány (pokud se týče jejich El expresních produktů) podle postupů uvedených výše.

-15CZ 295138 B6

Imunizace a infekce prasat

Skupina 4 (nebo 2) prasat ve věku 6 až 8 týdnů (SPF- specific-pathogen-free) byly vakcinovány intramuskulámě 1 ml vodní-olejové emulze obsahující 4 pg (mutantní formy) El (den 0) a znovu vakcinovány 28. den 1 ml vodní-olejové emulze obsahující 15 pg (mutantní formy) El (tabulka 2). Konstrukce mutantní formy El obsahující deleci v doméně A nebo deleci v doméně B/C a divoké formy El je popsána výše a konstrukty jsou znázorněny na obr. 5. Pro první vakcinaci ve dni 0 byl použit supernatant hmyzích buněk infikovaných s vhodným množstvím rekombinantního bakuloviru. Množství El v supematantu bylo vyhodnoceno podle dříve popsaného postupu (Holst a spol. 1993, J. Virol. 67: 5435-5442). Pro opakovanou vakcinaci (28. den) byl El imunoafínitně čištěn ze supematantu infikovaných hmyzích buněk (Hulst s spol. 1993, J. Virol. 67: 5435-5442). Prasata ze všech vakcinovaných skupin a z nevakcinované kontrolní skupiny (dvě SPF zvířata) byly infikovány intranasálně se 1OOLD₅o CSFV kmene Brescia 456610 (Terpstra a Wensvoort, 1988, Vet. Microbiol. 16, 123-128). Tato dávka vede k akutnímu onemocnění u nechtěných prasat, které je charakterizováno vysokou horečkou a trombocytopenií začínající 3. až 5. den a končící smrtí 7. až 11. den. Heparizované (EDTA) krevní vzorky byly odebírány 40., 42., 45., 47., 49., 51., 53. a 55. den po vakcinaci a byly analyzovány na přítomnost trombocytů a CSFV podle popsaných metod (Holst a spol. 1993). Sérové krevní vzorky byly odebírány také 0., 21., 28., 42. a 56. den a testovány vCTB-ELISA (Wensvoort a spol. 1988, Vet. Microbio. 17: 129-140) a v neutralizačním peroxidázovém testu (NPLA, Terpstra a spol. 1984, Vet. Microbiol. 9: 113-120), aby bylo možno detekovat (neutralizační) protilátky proti CSFV. Výsledky testů CTB-ELISA jsou vyjádřeny v procentech inhibice standardního signálu; <30% inhibice je negativní, 30 až 50% inhibice je sporná, >50% inhibice je pozitivní. NPLA titry jsou vyjádřeny jako reciprokální k sérovému ředění, které neutralizuje 100 TCID₅₀ kmene Brescia v 50% replikujících kultur.

Všechna zvířata byla denně sledována na všechny příznaky choroby a také jim byla denně měřena tělesná teplota. Klinické příznaky choroby jsou: horečka, anorexie, leukopenie, trombocytopenie a paralýza.

Příklad 4

Vývoj CTB-ELISA (CTB-DIF) pro CSFV, založené na monoklonální protilátce

Popis diagnostického testu

Tento příklad popisuje CTB-ELISA (CTB-DIF), která je modifikací již existující CTB-ELISA (Wensvoort a spol. 1988, Vet. Microbiol. 17: 129-140) pro detekci CSFV specifických protilátek.

CTB-DIF je založena na poznatku, že SF21 buňky infikované rekombinantním bakulovirem exprimujícím El-TMR účinně sekretují dimerizovaný El do média. Tento dimenzovaný El byl detekován při analýze média z buněk infikovaných bakulovirem na western blotu po elektroforéze SDS PAGE za neredukujících podmínek. Pro El specifické Mab dimer El předkládá dvě kopie epitopu (každý na jednom monomeru). Společně s dimenzovaným antigenem může být určitá El specifická protilátka použita jako vázající protilátka, navázaná na stěnu mikrotitračních destiček, stejně jako detekční protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou (HRPO).

Ukazuje se, že CTB-DIF je výhodná společně sEl subjetkovou vakcínou, která má deleci v doméně A (viz obr. 5) a rozlišuje mezi CSFV specifickými protilátkami indukovanými u prasat vakcínových El s deletovanou doménou A a mezi CSFV specifickými protilátkami indukovanými u prasat infikovaných slabě virulentními kmeny CSFV (Henken, Zoelen, Bergen, 331 a Cedipest (EP-A-351901).

-16CZ 295138 B6

Čtyři SPF prasata, označená čísly 766, 786, 789 a 770, byla vakcinována s mutantní formou El virulentním CSFV kmenem Brescia 44. den po vakcinaci. Séra odebíraná 28., 42. a 56. den po vakcinaci byly také testovány.

Séra proti slabě virulentním CSFV kmenům byly také připravovány ve skupině čtyř SPF prasat. Séra prasat infikovaných kmeny Henken, Zoelen, Bergen a 331 byly testovány 0., 21., 28. a 42. den po infekci. Séra prasat vakcinovaných Cedipest vakcínou byly testovány 0., 44., 72. a 170. den po vakcinaci.

Tři rozdílné sérologické testy byly připraveny pro výše uvedená séra. Test 1 je neutralizační peroxidázový test (NPLA- neutralizing peroidase-linked assay) popsaný Terpstra a spol. 1984 (Vet. Microbiol. 9: 113-120) pro detekci neutralizačních protilátek proti CSFV. Test 2 je CTBELISA (Wensvoort a spol. 1988, Vet., Microbiol. 17: 129-140) pro rutinní detekci protilátek proti CSFV.

CTB-DIF používá protilátku Mab b3 (také známou jako CVI-HCV-39,5) (Wensvoort 1989, J. Gen. Virol. 70: 2865-2876), která rozeznává epitop v doméně Al proteinu El CSFV. Na mikrotitrační destičky pro ELISA byla navázána Mab b3 (ředění 1:2000) (vázající protilátka). Po promytí destiček byla přidána Mab b3 konjugovaná s křenovou peroxidázou (ředění 1:4000) (detekční protilátka). Média z SF21 buněk infikovaných bakulovirem produkujícím El-TMR a obsahující dimenzovaný El do koncentrace 20 pg/ml je ředěno 1:5000 a preinkubováno s testovaným sérem (ředění 1:2,5). Směs sérum-antigen je pak přidána do jamek ke konjugátu v mikrotitračních ELISA destičkách. Po inkubaci byly destičky opět promyty a poté do nich byl přidán roztok chromogen-substrátu. Pokud vázající i konjugovaná protilátka se navázaly na antigen, křenová peroxidáza pak indukuje chromogenní reakci, naznačující, že testované sérum je negativní na CSFV protilátky. Pokud je epitop na antigenu blokován protilátkami z testovaného séra, HRPO-konjugát bude odmyt a jamky zůstanou čisté, což naznačuje, že testované sérum obsahuje protilátka proti CSFV doméně A. Výsledky těchto tří odlišných sérologických testů jsou shrnuty v tabulce 3.

Séra prasat vakcinovaných El s deleci v doméně A reagují v NPLA a CTB-ELISA a nikoliv v CTB-DIF ve 42. dni po vakcinaci. Po infekci virulentním CSFV kmenem Brescia tatáž zvířata reagují pozitivně ve všech třech testech v 56. dni po vakcinaci (12. den po infekci), což naznačuje, že vzestupní odpověď také nastala po infekci. Počínaje 21. dnem po infekci, séra prasat vakcinovaných kmeny Henken, Zolen, Bergen a 331 reagují pozitivně v NPLA, CTB-ELISA a CTB-DIF. Počínaje 44. dnem po vakcinaci totéž platí pro prasata vakcinované Cedipest vakcínou.

CTB-DIF tedy přesně provádí požadované hodnocení a je vhodný, aby doprovázel CSFV signální vakcínu s mutovanou doménou A proteinu El, protože protilátky určené proti této mutované doméně A nekompetují s Mab b3 pro epitop Mab b3.

Antigen použitý vTB-DIF je dimenzovaný El neobsahující TMR z divokého kmene Brescia (viz Obr. 5). Dimerizovaný El syntetizovaný konstruktem sdelečními doménami B+C (viz obr.5) je také vhodný jako antigen v tomto testu.

Příklad 5

Srovnání testů CTB-ELISA pro CSFV založených na El a E2

Popis diagnostického testu

- 17CZ 295138 B6

Tento příklad popisuje modifikaci CTB-DIF, uvedenou v příkladu 4, a CTB-ELISA založený na E2 proteinu CSFV a srovnává citlivost těchto testů s třemi dalšími CTB-ELISA testy, které detekují protilátky proti El, a NPLA (Terpstra a spol. 1984, Vet. Microbiol. 9: 113-120).

CTB-DIF podle příkladu 4, nazývaný El-Bac-DIF v tabulkách 4 až 8, používá intaktní El neobsahující TMR (El-TMR) syntetizovaný v hmyzích buňkách (SF21 buňky) jako antigen. Modifikace El-Bac-DIF, nazývaná El-Bac-dBC-DIF, užívá El neobsahující TMR (El-TMR) syntetizovaný v hmyzích buňkách (SF21 buňky) sdeletovanou doménou B+C (srovnej obr. 5) jako antigen. Jak bylo potvrzeno pomocí western blotů, je El-TMR s deletovanou doménou B+C sekretován z buněk ve formě dimeru (výsledky nejsou uvedeny). El-bac-dBC-DIF je prováděn následovně. Do jamek mikrotitrační destičky je navázána Mab b3 (ředění 1:4000) (vázající protilátka) po dobu 16 h při teplotě 37 °C a jamky jsou poté promyty. Médium obsahující dimenzovaný antigen El-dBC do koncentrace 20 pg/ml je ředěno 1:50 a preinkubováno s testovaným sérem (ředění 1:2,5) (0,5 h při 37 °C). Směs sérum-antigen je pak nanesena na mikrotitrační destičku. Po inkubaci (1 h při 37 °C) jsou jamky mikrotitrační destičky promyty a je nanesena Mab b3 konjugovaná s křenovou peroxidázou (ředění 1:1000) (detekční protilátka). Po inkubaci (1 h při 37 °C) jsou jamky znovu promyty a je přidán roztok chromogenního substrátu. Chromogenní reakce se provádí po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Interpretace výsledků chromogenní reakce je shodná s příkladem 4.

Další CTB-ELISA testy detekující protilátky namířené proti El CSFV, popisované v tabulkách 4 až 8, jsou El-CSFV-ELISA, používající nativní El z CSFV infikovaných buněk jako antigen (Wensvoort a spol. 1988, Vet. Microbiol. 17: 129-140); El-Bac a El-Bac-DIF ELISA testy používají El-TMR syntetizovaný v hmyzích buňkách jako antigen. El-CSFV a El-Bac-ELISA testy užívají CSFV Mab b3 a b8 (Wensvoort 1989, J. Gen. Virol. 70: 2865-2876) jako vázající a detekční protilátku, zatímco El-Bac-DIF ELISA test používá pouze Mab b3 jak pro vázající, tak pro detekční protilátku. El-CSFV ELISA test je prováděn přesně podle postupu popsaného Wensvoortem 1988 (Vet. Microbiol. 17: 129-140). El-Bac a El-Bac-DIF ELISA testy jsou prováděny podle postupu pro El-Bac-dBF-DIf s následující modifikací, v El-Bac ELISA testu je užívaným antigenem dimerizovaný El (ředění 1:400) přítomný v médiu SF21 buněk, infikovaných relevantním El bakulovirovým konstruktem (srovnej obr. 5) v koncentraci 20 pg/ml. Mab b8, která je konjugovaná s HRPO je detekční protilátkou v tomto ELISA testu je používána v ředění 1:1000. El-Bac-DIF ELISA test používá tentýž antigen jako El-Bac-ELISA, ale v ředění 1:200. Mab b3 konjugovaná sHRPO je používaná jako detekční protilátka v ředění 1:1000.

E2-Bac ELISA test používá E2 CSFV antigen syntetizovaný v SF21 buňkách infikovaných baculovirovým CE2 konstruktem (Hulst a spol. 1994, Virology 200: 558-565). Jelikož E2 není sekretován z buněk, používá se lyzát z těchto buněk. Podobně jako El, E2 je nalézán jako dimerizovaná molekula, pokud je lyzát infikovaných buněk analyzován za neredukujících podmínek v SDS-PAGE (výsledky nejsou uvedeny). CTB-ELISA testy založené na tomto E2 antigenu se optimálně provádějí společně sMab C5 a C12 (Wensvoort 1989, Thesis, 99-113, Utrecht). Také E2 společně pouze s Mab C5 nebo C12 může být použit. V kompetitivním testu Mab C5 a C12 se inkubují navzájem ve vazbě na E2 (výsledky nejsou uvedeny). E2-Bac-ELISA test se provádí následovně. Mab C12 je ředěna 1:1000 a navázána na jamky mikrotitrační destičky (16 hodin při 37 °C). Následuje promytí jamek. Lyzáty SF21 buněk infikovaných bakulovirem CE2, ředěné 1:1250, jsou preinkubovány s testovaným sérem (1:1) po dobu 0,5 hodiny při 37 °C. Směs sérum-antigen se pak přidá do jamek mikrotitrační destičky a inkubuje po dobu 1 hodiny při 37 °C. Následovně jsou jamky promyty a inkubovány s Mab C5 konjugovanou s HRPO (ředění 1:2000). Po 1 hodině v 37 °C jsou jamky znovu promyty a je přidán roztok chromogenního substrátu. Chromogenní reakce se provádí 10 minut při teplotě místnosti. Interpretace výsledků chromogenní reakce je shodné s příkladem 4. Všechna popisovaná ředění jsou prováděna v NPLA pufru+ 4% PS (Terpstra a spol. Vet. Microbiol. 9: 113-120).

- 18CZ 295138 B6

Tabulka 4 ukazuje výsledky analýzy sér 3 SPF prasat vakcinovaných Cedipest vakcínou výše uvedenými testy CTB-ELISA a NPLA. Séra byla analyzována v 0., 16., 23., 30., 37., 44., 50., 72., 113., 141. a 170. dnu po vakcinaci. Tabulka 5 až 8 ukazuje výsledky analýzy sér skupiny 5 SPF prasat infikovaných slabě virulentními kmeny CSFV (331, Bergen, Henken a Zoelen) výše uvedenými testy CTB-ELISA a NPLA. Séra byla analyzována v 0., 10., 14., 17., 24., 28., 35. a 42. den po infekci. Počínaje 16. dnem po vakcinaci, séra z prasat vakcinovaných Cedipest kmenem reagují v každém z 5 CTB-ELISA testů, stejně jako v NPLA. V tomto časovém bodu je citlivost E2-Bac-ELISA a El-Bac-dBC-DIF stejně dobrá, ne-li lepší, než u ostatních 3 CTBELISA testů. Od 37. dne po vakcinaci do 170. dne, všechna séra reagují shodně (pozitivně) v 5 CTB-ELISA testech, stejně jako ve všech 5 CTB-ELISA testech, stejně jako v NPLA. Shoda v reakci séra (pouze s náhodnou výjimkou) v 5 CTB-ELISA testech a NPLA je pozorováno od 21. dne po infekci do 42. dne. U zvířat infikovaných slabě virulentními kmeny je nutné analyzovat větší množství séra, aby bylo možné rozhodnout, zda existují signifikantní rozdíly mezi citlivostí jednotlivých 5 CTB-ELISA testů časně po infekci (do 17. dne).

Může být uzavřeno, že E2-Bac-ELISA a El-Bac-CTB-DIF ELISA testy pracují tak, jak je požadováno. Proto je E2-Bac-ELISA vhodná pro spojení s CSFV signální vakcínou (např. subjednotka El, mutovaná či nemutovaná, C-kmenová signální vakcína modifikovaná v E2 oblasti), která neindikuje tvorbu protilátek, které kompetují s monoklonálními protilátkami používaných v ELISA testu. El-Bac-dBC-DIF ELISA test je vhodný jako El-Bac-DIF ELISA (CTB-DIF ELISA test v příkladu 4) pro spojení s CSFV signální vakcínou s mutovanou doménou A v El, tak že protilátky namířené proti této mutované doméněnekompetují s Mab b3 pro epitop Mab b3.

Popis obrázků

Obr. 1

Schematické znázornění cDNA klonů použitých pro určení nukleotidové sekvence C-kmene. Obr. 1A ukazuje první kolo cDNA klonů (viz text). cDNA klony číslo 32, 90 a 96 byly použity pro změnu pPRKflc-113 na pPRKflc-133 (viz příklad 2). Klon 14 byl použit pouze v prvním kole cDNA klonů pro konstrukci pPRKflc-133 (viz obr. 3). Obr. 1B ukazuje druhé kolo cDNA klonů (viz text).Očíslované cDNA klony z druhého kola byly použity pro konstrukci pPRKflc113 (viz SEQ ID No. 1). Pozice cDNA vzhledem k nukleotidové sekvenci genomu C-kmene jsou naznačeny pomocí měřítkové úsečky (kilobázích) ve spodní části obrázku. Schematické znázornění v současné době známých genů CSFV a jejich uspořádání v genomu CSFV je zobrazeno v horní části obrázku.

Neexistuje žádná dohoda o nomenklatuře pestivirových proteinů. E2 protein zde popisovaný je také nazýván gp42 (Tamura a spol. Virology 193: 1-10), gp44/48 (Thiel a spol. 191, J. Virol. 65: 4705—4712) nebo EO (Rumenapf a spol. 1993, J. Virol. 76: 3288-3294). E3 protein je také nazýván gp25 (Tamura a spol. 1993, Virology 193: 1-10), gp33 (Thiel a spol. 1991, J. Virol 65: 4705-4712) nebo El (Rumenapf a spol. 1993, J. Virol. 67: 3288-3294). El protein podle tohoto vynálezu je také nazýván gp53 (Tamura a spol. 1993, Virology 193: 1-10), gp55 (Thiel a spol. 1991, J. Virol. 65: 4705-4712), gp51—54 (Moormann a spol. 1990, Virology 177: 184-198) a E2 (Rumenapf a spol. 1993, J. Virol. 67: 3288-3294). N-koncová autoproteáza N^pra CSFV (p20 BVDV, Wiskerchen a spol. 1991, J. Virol. 64: 4508-4514), také nazývaná p23, byla identifikována Thielem a spol. 1991 (J. Virol. 65: 4705-4712). Štěpení rozpoznávané sekvence, která je konzervována u pestivirů, touto proteázou má za následek vznik N-konce C-kmene (Stark a spol. 1993, J. Virol. 67: 7088-7095).

Obr. 2

Nukleotidové sekvence 5' (A) a 3' (B) nekódující oblasti CSFV kmenů Brescia, Alort a C. Kromě prvních 12 nukleotidů, 5' nekódující sekvence kmene Brescia byla popsána Moormannem a spol. (1990, Virology 177: 184-198). Prvních 12 nukleotidů 5' nekódující oblasti kmene Brescia dosud

-19CZ 295138 B6 nebylo publikováno. Jako poslední 5' a 3' sekvence genomu C—kmene, byly určeny s 3'-5' RNA ligační metodou popsanou v příkladu 1 této patentové přihlášky. Kromě prvních 9 nukleotidů, 5' nekódující sekvence kmene Alfort byla popsána Meyersem a spol. (1989, Virology 171: 555567). Prvních 9 nukleotidů genomu kmene Alfort bylo publikováno Meyersem (Thesis - „Virus der Klassischen Schweinepest: Genomanalyse und Vergleich mit dem Virus der Bovine Viralen Diarrhoe“, 1990, Tubingen, Německo). Sekvence 3' nekódujících oblastí kmenů Brescia a Alfort byly také popsány Moormanem a spol. (1990, Virology 177: 184-198) a Meyersem a spol. (1988, Virology 171:55-567). ATG startovní kodón a TGA stop kodón velkého ORF (srovnej SEQ ID No. 1) jsou podtrženy.

Obr. 3

Schéma konstrukce celkového cDNA klonu pPRKflc-133. Čísla klonů byla vysvětlena v legendě obr. 1. Fúzní místa inzertů klonů jsou označeny vertikálními úsečkami. Místa odpovídající těmto úsečkám jsou naznačeny v spodní části obrázku. Podtržená čísla klonů označují cDNA klony, které mají sekvenci odvozenou od vektoru pOK12 (Viera a Messing, 1991, Gene 100: 189-194) (viz obr. 4). 5' a 3' konce pPRKflc-113 byly upraveny pomocí PCR amplifikace cDNA fragmentů (viz text příklad 2). Amplifikované fragmenty jsou označeny PCR. Měřítková úsečka ve spodní části obrázku a schematické znázornění genomové organizace CSFV je popsáno v legendě obr. 1.

Obr. 4

Schematické znázornění vektorových sekvencí a celkových cDNA inzertů v klonech pPRKflc113, pPRKflc-133 a pPRK-flc-h6. Konstrukce vektoru pPRK, derivátu pOK12 (Viera a Messing, 1991, Gene 100: 189-194) byla popsána v příkladu 2. Kan® (gen pro kanamycinovou rezistenci), ORI (replikační počátek), i (gen kódující represor β-galaktosidázového genu), PO (promotor/operátorová oblast β-galaktosidázového genu), lacZ (část β-galaktosidázového genu kódující a podjednotku β-galaktosidázy). Několik restrikčních míst vektoru a sekvence přímo ohraničující inzerty ve vektoru jsou naznačeny. Významná místa byla popsána vtextu příkladu 2. Místa označená čísly v pPRKflc-113 odpovídají nukleotidům pěti kodónů, které byly změněny v tomto konstrukci za vzniku pPRKflc-133. Tento druhý konstrukt má sekvenci naznačenou v SEQ ID No. 1.

Černě označená oblast v pPRKflc-h6 označuje oblast El z pPRKflc-133, která byla zaměněna za odpovídající oblast z kmene Brescia. Infekčnost transkriptů odvozených z určitých konstruktů je naznačena vpravo ((+) - infekční, (-) - neinfekční). Inzerty celkových konstruktů jsou naznačeny vzhledem k měřítkové úsečce (v kilobázích) reprezentující nukleotidovou sekvenci C-kmene (viz SEQ ID No. 1).

Obr. 5

Schematické znázornění mutantních El proteinů exprimovaných v hmyzích buňkách baculovirovými vektory. Všechny El proteiny jsou kódovány nukleotidovou sekvencí kmene Brescia (Moormann a spol. 1990, Virology 177: 184-198) a začínají na svých N-koncích Lys v kodónové pozici 688 ve velkém ORF této sekvence. C-konec nativního El končí Leu v kodónové pozici 1063 ve velkém ORF, zatímco C-konce ostatních tří El proteinů se nalézají v aminokyselinové pozici 1031. Oblasti označené tečkované reprezentují N-koncové signální sekvence, od aminokyselinové pozice 668 do 689, vnitřní hydrofobní sekvence, od aminokyselinové pozice 806 do 826, a C-koncové transmembránové úseky, od aminokyselinové pozice 1032 do 1063 proteinu El. Deletované aminokyselinové sekvence vmutantních formách El s deletovanou B+C nebo A doménou jsou znázorněny přerušením v úsečkách označující tyto proteiny. Umístění těchto deleci ve vztahu k aminokyselinové sekvenci El může být určeno z měřítkové úsečky na spodní části obrázku. Měřítková úsečka naznačuje umístění El v aminokyselinové sekvenci kódované velkým ORF kmene Brescia.

-20CZ 295138 B6

Průmyslová využitelnost

Vynález popisuje konstrukci DNA kopie genomu C-kmene CSFV a přípravu vakcín odvozených od této sekvence. Vynález dále předkládá použití těchto vakcín a diagnostické způsoby pro identifikaci pestivirových infekcí.

Tabulka 1. Charakterizace rekombinantních virů C-kmene

Protilátky specifické pro CSFV

určené proti El	určené proti E2
virus	konzervovaný epitop	Brescia specifické epitopy	C“ j»'specifické epitopy	C“ specifické epitopy
C“ „v	+	-	+	+
Brescia	+	+	-	-
FLc-133	+	-	+	+
Flc-h6	+	+	-	+

Tabulka 2. Vakcinace prasat s delečními mutanty El % inhibice v testu CTB-ELISA ve dnech: Neutralizační protilátkovv titr ve dnech: Výsledky infekce CSFV:

Prase č.	Použitý konstrukt	0	21	28	42	56	0	21	28	42	56	Choroba	Vitrémie	Smrt
766	Delece	0	12	0	78	99	<12.5	<25	<25	3,200	>3,200			-
768	domény	0	0	0	74	99	<12.5	<25	<25	2,400	>3,200		-
769	A	0	16	0	99	99	<12.5	<25	<25	2,400	>3,200		-	-
770		0	14	0	83	99	<12.5	<25	<25	400	>3,200		-	-
771	Delece	0	36	25	100	99	<12.5	<25	<25	300	>3,200		-	-
772	domén	0	25	29	100	99	<12.5	<25	<25	1,200	>3,200		-	-
773	B + C	0	7	0	100	99	<12.5	<25	<25	200	150		-	-
774		0	49	52	99	99	<12.5	<25	<25	300	>3,200		-	-
792	Divoký	0	35	31	98	100	<12.5	2,000	1,200	>3,200	>3,200	+----	-	-
	typ
794	Brescia El	0	48	40	98	100	<12.5	<25	<25	1,600	>3,200	+----	-	-
775	Žádný	0	2	0	0		<12.5	<25	<25	<25		+++++	+	+
795		0	0	0	0		<12.5	<25	<25	<25		+++++	+	+

Skupiny čtyř (nebo dvou) prasat byly inokulovány intramuskulárně ve dni 0 se 4 pg a ve dni 28 s 15 pg modifikovaného El proteinu. 42. den byla prasata infikována intranasálně se 100 LD50 kmene Brescia CSF 456610. Všechna zvířata byla denně sledována na příznaky choroby. Krevní vzorky byly odebírány ve dnech 0, 21, 28, 42 a 56 a testovány pomocí CTB-ELISA a neutralizačními testy na detekci protilátek proti CSFV (Terpstra a spol. 1984, Vet Microbiol. 9: 113-120). Klinické příznaky choroby byly: horečka, nechutenství, leukopenie, trombocytopenie a paralýza. Přítomnost nebo nepřítomnost těchto příznaků je naznačena (+) nebo (-) v tabulce ve sloupci Choroba.

-21 CZ 295138 B6

Tabulka 3. Diferenciální ELISA testy pro CSFV

Sérum	DPVorDPI3	NPLAb	CTB-ELISA0	CTB-DIF0
766	28	<25	9	27
768	28	<25	0	27
769	28	<25	17	0
770	28	<25	11	0
766	42	3200	61	0
768	42	2400	52	0
769	42	2400	99	26
770	42	400	65	0
766	56	>3200	99	65
768	56	>3200	100	104
769	56	>3200	101	105
770	56	>3200	101	104
Henken	0	<12.5	5	18
Henken	21	50	76	47
Henken	28	75	92	88
Henken	42	300	100	102
Zoelen	0	<12.5	0	0
Zoelen	17	37.5	85	71
Zoelen	21	150	90	80
Zoelen	42	400	100	108
Bergen	0	<12.5	1	49
Bergen	21	25	96	100
Bergen	28	100	99	95
Bergen	42	300	100	103
331	0	18.75	4	15
331	21	100	92	90
331	28	300	99	99
331	42	300	100	105
Cedipest	0	<12.5	0	19
Cedipest	44	75	85	93
Cedipest	72	50	89	102
Cedipest	170	150	98	106

^a) DVP: dny po vakcinaci, DPI: dny po infekci ^b) NLPA titry jsou vyjádřeny jako reciproké hodnoty ředění séra pro neutralizaci 100 TCID₅₀ HCV kmene Brescia v 50 % replikujících kultur (Terpstra a spol. 1984, Vet Microbiol, 9: 113-120) ^{10 0)} komplex blokačních testů ELISA, CTB-ELISA nebo diferenčních CTB-ELISA, CTB-DIF.

Výsledky testů jsou vyjádřeny jako procento inhibice standardního signálu, <30% inhibice je negativní, 30-50% inhibice je sporná, >50% inhibice je pozitivní.

-22CZ 295138 B6

Tabulka 4. Srovnání testů CTB-ELISA se sérem kmene Cedipest CSFV

Kmen	Prase	DPVa or DPI	NPLAb	CTB-ELISAC
El CSFV	El-Bac	El-Bac El-Bac	E2-Bac
DIF	dBC-DIF
Cedipest	1	0	<12.5	21	ND	ND	ND	0
	2	0	<12.5	28	8	0	0	0
	3	0	<12.5	25	0	0	0	0
	1	16	25	60	0	56	62	79
	2	16	25	66	51	26	76	79
	3	16	19	11	15	0	11	62
	1	23	25	54	66	60	68	79
	2	23	50	81	57	54	75	74
	3	23	25	25	37	32	54	74
	1	30	50	76	87	80	81	75
	2	30	75	87	ND	ND	ND	ND
	3	30	19	60	40	28	57	82
	1	37	50	82	90	80	87	85
	2	37	50	87	84	61	85	85
	3	37	19	49	62	63	79	77
	1	44	75	84	94	99	92	88
	2	44	75	90	89	74	93	92
	3	44	25	66	68	79	93	90
	1	50	75	86	93	92	98	89
	2	50	150	91	95	96	97	91
	3	50	19	74	67	58	95	88
	1	72	50	86	92	94	99	81
	2	72	200	94	96	93	100	89
	3	72	25	53	76	66	99	73
	1	113	75	94	99	100	100	92
	2	113	200	94	98	100	99	89
	3	113	75	93	99	100	96	84
	1	141	75	91	100	91	100	89
	2	141	150	76	100	95	100	85
	3	141	50	87	94	95	100	85
	1	190	150	92	97	100	100	94
	2	170	150	85	97	100	100	86
	3	170	150	74	88	84	98	88

a,b: viz poznámky u tab. 3 c: CTB-ELISA testy s El CSFV, El-Bac, El-Bac-DIF, El-Bac-dBC-DIF a E2-Bac jsou vysvětleny v příkladu 5. Výsledky testů jsou vyjádřeny v procentech inhibice standardního signálu, <30% inhibice je negativní, 30-50% inhibice je sporná, >50% inhibice je pozitivní.

-23 CZ 295138 B6

Tabulka 5. Srovnání testů CTB-ELISA se sérem kmene 331 CSFV

Kmen	Prase	DPIa	NPLAb	CTB-ELISAC
El CSFV	El-Bac	El-Bac DIF	El-Bac dBC-DIF	E2-Bac
331	1	0	<12.5	0	0	0	8	0
	2	0	<12.5	4	5	0	0	0
	3	0	<19	4	13	0	0	0
	4	0	<12.5	0	14	0	0	0
	5	0	<12.5	5	11	11	0	0
	1	10	<12.5	0	13	0	14	13
	2	10	<12.5	0	11	0	0	13
	3	10	<12.5	0	20	16	24	31
	4	10	<12.5	0	29	0	9	26
	5	10	<12.5	0	24	7	38	18
	1	14	<12.5	0	34	9	34	8
	2	14	<12.5	2	18	0	0	36
	3	14	19	28	67	22	60	60
	4	14	19	35	77	37	60	10
	5	14	25	32	99	74	90	23
	1	17	19	7	84	53	69	0
	2	17	<12.5	23	0	0	0	4
	3	17	25	63	93	62	87	54
	4	17	37	55	82	36	80	0
	5	17	37	69	100	84	94	3
	1	21	37	57	84	100	50	39
	2	21	37	29	52	0	26	3
	3	21	100	76	93	100	96	96
	4	21	50	76	90	100	91	63
	5	21	75	65	ND	ND	ND	72
	1	28	75	73	95	100	96	96
	2	28	25	59	89	100	79	58
	3	28	300	78	100	100	100	100
	4	28	150	74	93	100	80	82
	5	28	100	72	98	100	100	91
	1	35	75	83	95	100	97	98
	2	35	150	80	98	100	100	96
	3	35	300	80	99	100	100	100
	4	35	200	81	ND	ND	ND	ND
	5	35	150	82	98	100	100	90
	1	42	150	81	98	100	96	99
	2	42	200	80	100	94	100	98
	3	42	300	79	94	100	100	100
	4	42	200	79	97	100	99	100
	5	42	150	80	99	100	100	90

a, b, c: viz poznámky u tab. 4.

-24CZ 295138 B6

Tabulka 6. Srovnání testů CTB-ELISA se sérem kmene Bergen CSFV

Kmen	Prase	DPIa	NPLAb	CTB-ELISAC
El CSFV	El-Bac	El-Bac DIF	El-Bac dBC-DIF	E2-Bac
Bergen	1	0	<12.5	0	2	0	0	0
	2	0	<12.5	0	0	0	0	0
	3	0	<12.5	0	2	0	0	0
	4	0	<12.5	0	7	0	0	0
	5	0	<12.5	0	4	0	2	0
	1	10	<12.5	0	0	6	0	27
	2	10	<12.5	0	5	0	0	4
	3	10	12.5	0	25	0	27	21
	4	10	<12.5	0	15	0	13	29
	5	10	12.5	0	14	0	6	21
	1	14	<12.5	0	51	32	18	12
	2	14	<12.5	8	12	9	10	4
	3	14	37	20	76	53	72	11
	4	14	12.5	0	55	8	77	18
	5	14	<12.5	0	17	9	10	0
	1	17	25	57	93	84	73	3
	2	17	<12.5	28	45	0	51	29
	3	17	75	75	100	78	90	0
	4	17	37	47	88	57	85	16
	5	17	12.5	23	54	11	55	0
	1	21	25	76	96	100	100	96
	2	21	19	62	78	54	72	67
	3	21	50	77	ND	ND	ND	63
	4	21	50	72	95	100	93	96
	5	21	50	51	80	97	88	0
	1	28	100	81	100	100	100	96
	2	28	37	80	97	100	100	81
	3	28	100	80	96	100	100	72
	4	28	50	81	100	100	100	100
	5	28	150	79	98	100	99	3
	1	35	150	84	98	100	100	100
	2	35	50	82	95	100	100	49
	3	35	100	79	100	100	100	66
	4	35	200	79	100	100	100	82
	5	35	200	79	98	100	100	21
	1	42	300	82	100	97	89	74
	2	42	300	81	98	100	100	49
	3	42	300	82	100	65	100	65
	4	42	200	81	98	92	100	74
	5	42	600	81	98	100	98	0

a, b, c: viz poznámky u tab. 4

-25CZ 295138 B6

Tabulka 7. Srovnání testů CTB-ELISA se sérem kmene Henken CSFV

Kmen	Prase	DPIa	NPLAb	CTB-ELISAC
El CSFV	El-Bac	El-Bac DIF	El-Bac dBC-DIF	E2-Bac
Henken	1	0	<12.5	0	0	0	0	0
	2	0	<12.5	0	0	0	0	0
	3	0	<12.5	1	0	0	0	0
	4	0	<12.5	0	2	0	0	0
	5	0	<12.5	0	0	0	0	0
	1	10	<12.5	0	0	0	0	0
	2	10	<12.5	3	6	1	1	25
	3	10	<12.5	0	5	12	0	52
	4	10	<12.5	0	6	0	4	27
	5	10	<12.5	0	12	0	0	8
	1	14	<12.5	0	0	6	1	0
	2	14	<12.5	0	54	22	29	10
	3	14	50	5	57	67	100	20
	4	14	<12.5	0	7	0	34	0
	5	14	<12.5	0	12	10	9	0
	1	17	<12.5	0	0	0	7	0
	2	17	12.5	48	73	26	63	53
	3	17	75	75	100	94	100	35
	4	17	19	7	56	0	60	23
	5	17	12.5	0	29	0	16	15
	1	21	<12.5	29	0	0	0	0
	2	21	50	75	ND	ND	ND	ND
	3	21	300	84	ND	ND	ND	ND
	4	21	19	36	68	76	78	34
	5	21	50	63	83	61	82	32
	1	28	<12.5	0	0	0	0	0
	2	28	75	80	92	100	100	92
	3	28	600	80	99	100	100	82
	4	28	50	58	93	100	100	100
	5	28	50	79	99	100	100	100
	1	35	<12.5	22	13	13	0	1
	2	35	200	78	95	100	100	82
	3	35	300	78	100	100	100	75
	4	35	75	75	98	100	100	100
	5	35	150	80	98	100	100	97
	1	42	<12.5	17	12	9	0	0
	2	42	400	79	ND	ND	ND	ND
	3	42	400	79	ND	ND	ND	ND
	4	42	400	79	98	100	100	100
	5	42	300	82	98	100	100	90

a, b, c: viz poznámky u tab. 4

-26CZ 295138 B6

Tabulka 8. Srovnání testů CTB-ELISA se sérem kmene Zoelen

Kmen	Prase	DPIa	NPLAb	CTB-ELISA0
El CSFV	El-Bac	El-Bac DIF	El-Bac dBC-DIF	E2-Bac
Zoelen	1	0	<12.5	0	0	0	0	0
	2	0	<12.5	0	5	0	0	0
	3	0	<12.5	14	4	0	0	0
	4	0	19	6	0	0	0	0
	5	0	<12.5	16	35	0	19	0
	1	10	<12.5	0	16	8	3	31
	2	10	<12.5	0	14	0	0	15
	3	10	<12.5	0	10	2	8	24
	4	10	19	12	8	0	0	22
	5	10	<12.5	0	27	27	12	24
	1	14	19	19	60	18	75	41
	2	14	<12.5	4	36	4	34	10
	3	14	<12.5	19	26	14	23	12
	4	14	25	26	91	40	92	39
	5	14	12.5	0	50	16	41	0
	1	17	37	61	96	76	91	64
	2	17	19	29	94	62	73	0
	3	17	12.5	23	41	16	45	4
	4	17	37	65	97	82	95	0
	5	17	37	48	90	60	75	0
	1	21	150	78	95	100	99	84
	2	21	19	68	89	100	94	58
	3	21	37	60	73	99	77	0
	4	21	75	75	92	100	95	46
	5	21	37	54	ND	ND	ND	57
	1	28	200	75	100	100	100	100
	2	28	150	76	100	100	100	89
	3	28	75	77	97	100	100	56
	4	28	300	79	97	100	100	84
	5	28	100	67	100	100	100	80
	1	35	400	82	100	100	100	100
	2	35	150	72	100	100	100	91
	3	35	200	81	98	100	100	60
	4	35	150	80	94	100	100	77
	5	35	100	79	99	100	100	89
	1	42	400	82	93	100	100	100
	2	42	200	67	99	100	100	78
	3	42	400	83	94	100	100	84
	4	42	300	82	99	100	100	86
	5	42	150	82	94	100	100	32

a, b, c: viz poznámky u tab. 4

Claims (18)

1. Nukleotidové sekvence genomu pestivirového kmene, ve které je vynechána a/nebo substituována nejméně jedna nukleotidové oblast odpovídající oblastem aminokyselinové sekvence 268-494, 691-718, 717-750, 785-830, 829-870, 690-870 a 690-1063 ze SEQ ID No. 1, a substituce odpovídá oblasti genomu jiného pestivirového kmene, přičemž tato substituce odlišuje nukleotidovou sekvenci od sekvence divokého pestiviru.

2. Nukleotidová sekvence podle nároku 1, ve které pestivirus je virus klasického moru prasat, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující alespoň aminokyselinovou sekvenci 268-494 aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID No. 1, nebo komplement nebo RNA ekvivalent této nukleotidové sekvence.

3. Nukleotidová sekvence podle nároku 1, ve které pestivirus je virus klasického moru prasat, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující alespoň aminokyselinovou sekvenci 690-870 aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID No. 1, a dále obsahuje mutaci v nukleotidové sekvenci kódující aminokyseliny 268-494 sekvence uvedené v SEQ ID No. 1, přičemž tato mutace je deleci, inzercí nebo mutací vedoucí k nahrazení jedné nebo více aminokyselin kódovaných nukleotidovou sekvencí, nebo komplement nebo RNA ekvivalent takovéto nukleotidové sekvence.

4. Nukleotidová sekvence podle nároku 2, která obsahuje mutaci v nukleotidové sekvenci kódující alespoň aminokyseliny 690-1063, přičemž tato mutace je deleci, inzercí nebo mutací vedoucí k nahrazení jedné nebo více aminokyselin kódovaných nukleotidovou sekvencí.

5. Nukleotidová sekvence odpovídající genomu viru klasického moru prasat nebo jeho mutantní formě, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující alespoň jednu z aminokyselinových sekvencí 1-168, 169-267, 268-494, 495-689 a 690-1063 C-kmenu viru klasického moru prasat uvedené v SEQ ID No. 1, nebo komplement nebo RNA ekvivalent této nukleotidové sekvence.

6. Nukleotidová sekvence podle kteréhokoliv z nároku 3 nebo 4, kde mutace je inzerce heterologní nukleotidové sekvence, která mění translační strategii nukleotidové sekvence viru klasického moru prasat, nebo mění proces upravování polypeptidu, kódovaného nukleotidovou sekvencí viru klasického moru prasat.

7. Nukleotidová sekvence podle kteréhokoliv z nároku 3 nebo 4, kde mutace je inzerce heterologní nukleotidové sekvence kódující polypeptid indukující imunitní odpověď proti jinému patogenu.

8. Nukleotidová sekvence podle kteréhokoliv z nároku 3 nebo 4, kde mutace je inzerce heterologní nukleotidové sekvence kódující markerový polypeptid.

9. Polypeptid kódovaný nukleotidovou sekvencí podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.

10. Pestivirový polypeptid odpovídající aminokyselinové sekvenci 690-1063 ze SEQ ID No. 1 nebo její části, který obsahuje mutaci v jednom zepitopů v aminokyselinových sekvencích 691-750 nebo 785-870, přičemž mutace narušuje tento epitop.

11. Nukleotidová sekvence kódující polypeptid podle nároku 10.

12. Vakcínový kmen, jehož genom je odvozen z DNA kopie s úplnou délkou, případně z jejího infekčního transkriptu, nukleotidové sekvence podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.

-28CZ 295138 B6

13. Vakcína obsahující polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 nebo 11, polypeptid podle nároku 9 nebo 10, nebo vakcínový kmen podle nároku 12.

14. Diagnostický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu nukleotidovou sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, polypeptid podle nároku 10 nebo 11, případně protilátku proti polypeptidu podle nároku 9 nebo 10, a dále konvenční komponenty pro provedení diagnostického testu, přičemž nejméně jedna komponenta testu je značená.

15. Metoda zjištění přítomnosti sekvence odvozené od C-řetězce viru klasického moru prasat, vyznačující se tím, že je použita nukleotidová sekvence j j_ako nukleotidová sonda nebo primer.

16. Způsob rozlišení zvířete přirozeně infikovaného pestivirovým polním kmenem od vakcinovaného zvířete, které bylo vakcinované pestivirovým polypeptidem nebo pestivirovým kmenem, kde polypeptid nebo kmen jsou mutovány pomocí delece nebo substituce v alespoň jedné nukleotidové oblasti odpovídající nukleotidovým oblastem kódujícím aminokyselinové sekvence 268-494, 691-718, 717-750, 785-830, 829-870, 690-870 a 690-1063 ze SEQ ID No. 1, kde substituce je substitucí odpovídající oblastí genomu jiného pestivirového kmene, vyznačující se tím, že obsahuje tyto kroky:

- poskytne se testovaný vzorek obsahující protilátku zvířete, které má být rozlišeno,

- kontaktuje se testovaný vzorek s pestivirovým antigenem, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která chybí jako výsledek mutace v pestivirovém polypeptidu nebo pestivirovém kmenu, který se používá pro vakcinaci, a s protilátkou proti epitopu pestivirového antigenu, a

- měří se kompetice mezi protilátkou obsaženou v testovaném vzorku s protilátkou proti epitopu pestivirového antigenu.

17. Způsob rozlišení podle nároku 16, vyznačující se tím, že pestivirový antigen je dimerizovaný nebo multimerizovaný polypeptid a část protilátky je imobilizována a další část protilátky je označena.

18. Způsob podle nároku 16 nebo 17, vyznačující se tím, že pestivirový polypeptid a antigen odpovídají aminokyselinové sekvenci 690-1063 a uvedený epitop se nachází mezi aminokyselinami 785 a 870.