CN100516221C

CN100516221C - 突变体猪瘟病毒株的核苷酸序列,由这些序列编码的多肽及它们的应用

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Publication number: CN100516221C
Application number: CNB951936654A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特斯·雅各布斯·玛丽亚·莫尔曼; 彼得鲁斯·安东尼厄斯·范赖恩
Original assignee: INST VEEHOUDERIJ DIERGEZONDH
Current assignee: INST VEEHOUDERIJ DIERGEZONDH
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 2009-07-22
Anticipated expiration: 2015-06-16
Also published as: CZ369696A3; AU2631595A; HUT76352A; CA2192940A1; EP1985705A3; AU697866B2; US6180109B1; PL184836B1; BR9508054A; JPH09511914A; EP1985705A2; PL317755A1; CN101255433A; NZ287563A; JP3846808B2; CA2192940C; MX9606463A; RU2201451C2; EP0766740A1; WO1995035380A1

Abstract

本发明提供了突变体典型猪瘟病毒(CSFV)的基因组的核苷酸序列和突变的瘟病毒多肽，它在位于691-750或785-870位氨基酸序列内的一个表位上有一个突变，该突变改变了该表位。本发明还提供了测定样品中能与结合配对物的结合位点特异结合的试验物质存在与否的方法，此方法是通过将所说试验物质与可测剂量的能特异地结合到上述结合配对物的同一结合位点上的参照物质竞争而实现。

Description

突变体猪瘟病毒株的核苷酸序列，由这些序列编码的多肽及它们的应用

发明领域

本发明公开了构建C病毒株(一种典型猪瘟病毒疫苗株)基因组的全长DNA拷贝，并转录其RNA的方法，所述RNA在转染于细胞后导致合成感染性C病毒株的病毒。本发明还包括衍生自C株(瘟病毒)的疫苗，和抗瘟病毒的亚单位疫苗，以及有关瘟病毒感染的诊断手段和方法。本发明进一步提供了用竞争试验检测样品中免疫活性物质的方法。

发明背景

典型猪瘟(CSF)或猪瘟有较高传染性，常常是猪的致死病，该病特点是发热和出血，而且能形成急性或慢性病程(Van Orrschot，1986，猪瘟，P.289-300.《猪疾病》，衣阿华州立大学出版社，Ames)。在好几个欧洲国家及其他国家周期性地发生该病的流行，能导致很大的经济损失。

用典型猪瘟病毒(CSFV)的减毒活疫苗株，即“中国”株(C-株)接种猪，可以保护猪以抗CSF(Terpstra and Wensvoort，1988，Vet.Microbiol 16：123-128)。用常规疫苗(C株是其中之一)接种猪的主要弊端是，这些被接种过的猪不能与被CSFV野生株感染的猪从血清学上区分开来。然而C株仍被认为是最有效且安全的活疫苗之一。给C株附加一个(血清学)标记物将带来极大好处并将改进疫苗。

CSFV是黄病毒科瘟病毒属的一个成员(Francki，.I.Bet al.，1991，黄病毒科p.223-233，病毒分类国际会议第5次报告Archiv Virol Suppl.2，SpringerVerlag，维也纳).瘟病毒属中与CSFV在结构上，抗原性和遗传上均非常相关的另两个成员是，主要感染牛的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和主要感染羊的边界病毒毒(BDV)(Moennig and Plagemann，1992，高级病毒研究，41：53-98；Moormann etal.，1990，病毒学177：184-198；Becher etal.，1994，病毒学198：524-551)

瘟病毒属的基因组由一个约12.5kb的正链RNA分子组成(Renard等，1985，DNA 4：429-438；Moormann和Hulst 1988，病毒研究11：281-291′Becher etal.，1994，病毒学198-524-551)。而几种非致细胞病变性BVDV病毒株的正链RNA基因组可能大得多(Meyers et al.，1991，病毒学180：602-616；Meyers et al.，1992，病毒学191：368-386；Ol等，1992，病毒学189：285-292)。

带有正链RNA基因组的病毒的一个固有特点是它们的基因组RNA有传染性，即将这种RNA转染入能支持病毒复制的细胞就能产生感染性病毒。正如我们所预料的，瘟病毒属的基因组(病毒性)RNA也有传染性(Moennigand Plagemann，1992，Adv.高级病毒研究41：53-98)。

近几年来重组DNA技术已能在体外转录克隆的DNA。这种可能性为在体外从正链RNA病毒基因组的DNA拷贝合成感染性RNA开辟了一条道路。众所周知在分子工程领域内，DNA比RNA更易通过定点突变来进行操作。因此，这种技术产生合成的感染性RNA的应用能大大促进对正链RNA病毒的诸如复制、毒力、致病性、RNA重组、载体开发，以及抗病毒策略的研究。然而，该技术的应用可能带来严重问题，这些问题的特性已由Boyer和Haenni在1994年的一篇综述中作了描述(Virology 198：415-426)。实际上，并不能可靠预见构建一个正链RNA病毒基因组的全长DNA拷贝并从这个全长DNA拷贝产生出合成的感染性RNA是否能成功。

发明概述

本发明提供了对应于CSFV基因组的核苷酸序列，它包括示于SEQ ID No.1的CSFV C株的核苷酸序列的至少一部分，或该核苷酸序列的互补序列或相应RNA序列；或其突变体。本发明还提供了有不同核苷酸但编码相同氨基酸的简并核苷酸序列。本发明还涉及这些核苷酸序列编码的多肽，并涉及其基因组含有这种核苷酸序列的疫苗株，尤其是基于CSFV C毒株基因组的全长DNA拷贝转录本的重组病毒株。

如上所指的部分核苷酸序列也同样有用，特别是那些在病毒基因组的结构区，亦即编码示于SEQ ID No.1的序列的1-1063位氨基酸的核苷酸序列中有一突变的序列。突变可能是被其他瘟病毒毒株基因组的对应部分取代，可以是取代了一个或多个氨基酸，也可以是缺失。突变还可以是一段插入或取代的异源核苷酸序列，所述序列改变了CSFV核苷酸序列的翻译策略，或是改变了由CSFV核苷酸序列编码的多肽的加工。而且，突变还可能是这样一段插入的或取代的异源核苷酸序列，它编码一段能诱导抗另一种病原体的免疫力的多肽；这时CSFV序列被用来当作异源免疫原的载体。

本发明亦涉及瘟病毒基因组的全部或一部分的核苷酸序列或其突变体，该序列在E1蛋白的某一亚区，即在编码SEQ ID No.1.的序列的691-750位氨基酸或785-870位氨基酸的核苷酸序列中有一个突变，本发明同样还涉及这些核苷酸序列编码的多肽。这些多肽特别有用于用此方式保护动物抵抗瘟病毒属的感染，以便能作出诊断来区分被瘟病毒属的野生型病毒株感染的动物和已经预防接种的动物。

本发明还涉及带有如上所指的核苷酸序列，多肽，或疫苗化病毒株的疫苗，也涉及含有上文提到的核苷酸序列或多肽，或抗所述多肽的抗体的诊断组合物。

本发明还涉及诊断瘟病毒感染的方法和手段，特别是能区分被感染的动物和接种过的动物的手段和方法。

本发明亦提供了通过特异性结合试验测定诸如免疫测定法中的抗体或抗原这样的受验物质的方法，特异性结合试验中用到了固定化形式的特异性结合的参照物质和标记形式的相同特异性结合的参照物质。

本发明的详细描述

本发明提供了CSFV的“中国”株(C株：EP-A-351901)的RNA基因组的完整cDNA序列。这样就能构建该序列的全长DNA拷贝，它能转录出合成RNA，该RNA在转染了合适的细胞，如SK6-M细胞(asza，L.et al.，1972.Res.Vet.Sci.，13：46-51；EP-A-351901)后引起感染性C株病毒的合成。本发明描述了这一发现在开发修饰的C株疫苗，如含有一个(血清学)标记的疫苗中的用途。尽管本发明只举例说明了一种CSFV病毒株，但通过在其他瘟病毒和CSFVC株之间交换如下所述的特异性基因组片段，或通过构建其他瘟病毒的“感染性”DNA拷贝，它同样适用于并有用于其他瘟病毒属病毒株。

C株的基因组RNA的DNA拷贝的核苷酸序列描述在SEQ ID No.1中。本文提到的数字均与该序列有关，且在其他瘟病毒的序列中可能稍有区别。此核苷酸序列总长12,311个核苷酸，并含有一个编码3,898个氨基酸长的多聚蛋白的11,694个核苷酸长的大开放阅读框架(ORF)。此ORF的大小相同于CSFV Brescia病毒株(Moormann etal.，1990，病毒学177：184-198)，和CSFV Alfort病毒株(Meyers et al.，1989，病毒学177：555-567)的基因组。

ORF始于第374位至376位核苷酸的ATG并止于在12,068位至12,070位核苷酸的TGT密码子。ORF之前的5′端非编码区长373个核苷酸，其序列在病毒株Brescia，Alfort和C之间是高度保守的(图2)，且该区段预测的二级结构类似于丙型肝炎病毒(Brown et al.，1992，核酸研究20：5041-5045)(黄病毒科的另一成员)的5′端非编码区的二级结构。丙型肝炎病毒的5′非编码区显示含有一个内部核糖体进入位点(Tsukiyama-Kohara et al，1992，病毒学杂志66：1476-1483)。此位点有重要的调节功能(Agol，1991.高级病毒研究40：103-180)。与丙型肝炎病毒的相似性说明CSFV的5′非编码区也含有一个内部核糖体进入位点，它大致位于SEQ ID No.1的序列的124和374位核苷酸之间，可作为重要的调节因子。内部核糖体进入位点可用作为使病毒减毒而突变的位点，也可作为改变ORF的翻译策略的位点。

调节瘟病毒复制的第二个重要区域是3′端非编码区。将C株序列与Brescia株和Alfort株的序列进行对比，就可发现在这个3，端非编码区有一段13个核苷酸的序列对C株而言是独有的(图2B)。此独有序列TTTTCTTTTTTTT位于SEQ ID No.1序列中的12128位至12140位核苷酸。相对于Brescia株的Alfort株的序列，这是C株序列中发现的唯一一处一排内多于两个核苷酸的插入。三种CSFV病毒株的3′非编码区中的剩余序列具有高度同源性。当比较CSFV病毒株和BVDV病毒株时，该区序列间的总同源性较低，不过，很明显的是C株的TTTTCTTTTTTTT序列在BVDV株的3′非编码区序列中也不存在。因而TTTTCTTTTTTTT序列似乎是C株的基因组独有的，而且它将为C株特异性序列提供一个极好的标记。此序列能用来作为核苷酸探针和序列测定的基础，以鉴定C株特异性的瘟病毒。因此，所有在其3′非编码区有此序列(不必非在C株中的相同位置上)的瘟病毒毒株都被认为与C株有关，并且也是本发明的一部分。

瘟病毒基因组的DNA拷贝转录本的感染性的一个决定性参数是氨基酸序列。在这一点上，关于总的RNA病毒，以及特别对于瘟病毒的克隆和测序，有两方面必须考虑到。第一，正链RNA病毒基因组的突变频率高(复制期间约1/10⁴核苷酸)，因此，对于它所包含的病毒RNA没有哪种病毒或病毒RNA制品的贮液是可克隆化的。这些RNA分子中也可能有非感染性的分子。如果这是由大开放阅读框中超前终止密码子所致，就能很容易地被识别。影响病毒酶类的活性位点或蛋白质的已知结构的突变也是可识别的。然而，对大多数瘟病毒蛋白质来说不知道氨基酸序列与蛋白质的功能和结构的关系，故无法预见哪一个氨基酸是有效的而哪一个是无效的。第二，cDNA合成期间可导入突变。因此，需独立进行两次C株基因组的克隆和测序。对序列间有差异的区域至少要克隆并测序三次(参照图1)。在某一特殊位置遇到两次的序列被认为是该位置上的正确序列。以下发现证实了此方法用于产生C株基因组的DNA拷贝感染性转录本的必要性。经第二轮克隆和测序后组成的全长DNA拷贝pPARKflc-113(图3)似乎并无感染性。对第一轮和第二轮的cDNA克隆序列之间有差异的区域再进行克隆和测序后，看起来在第二轮cDNA克隆的全长拷贝中有5个氨基酸与被认为是正确的C株序列中的不同。更正了pPARKflc-113中的这5个氨基酸后得到的克隆pPRKflc-133可产生感染性转录本(图4)。这5个差异位于1414位(缬氨酸变成了丙氨酸)；2718位(甘氨酸变成天冬氨酸)；2877位(缬氨酸变成甲硫氨酸)；3228位(亮氨酸变成甲硫氨酸)；3278位(酪氨酸变成谷氨酸)。由非感染性cDNA序列在这些位置编码的氨基酸表示在箭头前，感染性拷贝中这些位置的氨基酸表示在箭头之后(SEQ ID No.1.)。是不是每个这样的氨基酸单独改变将消除C株DNA拷贝的感染性，还需通过用这5个氨基酸中每一个的单一突变来分析转录本的感染性才能确定。然而，这一发现显示氨基酸序列中小的不同可能对C株基因组的DNA拷贝转录本的感染性起决定性作用。它还说明在实践中，制备瘟病毒序列的拷贝的感染性转录本似乎会因为序列中未能觉察的微小变化(甚至是1个氨基酸水平上的变化)而变得不可能。

C株衍生的适合于(标记)疫苗开发的突变体均是本发明的部分。它们可能在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中包含了这样一些突变，如缺失、插入、(多个)核苷酸突变，以及来源于其他瘟病毒株的基因组片段的插入和/或交换。

C株序列可被分成4个适于突变和/或交换的区域。区域1是从核苷酸1至373的5′非编码序列。区域2从374位至3563位核苷酸，它编码结构蛋白N^pro-C-E2-E3-E1。区域3编码非结构蛋白，是从核苷酸3564至12068位。区域4是3′非编码序列，从12069至12311位核苷酸。

特别适于制备C株标记疫苗的一个区域含有编码结构蛋白N^pro-C-E2-E3-E1的基因组区域。该区位于SEQ ID No.1序列中的和1063位氨基酸1之间。此部分的基因组的优选亚区由以下氨基酸序列1-168(N^pro)，169至267(C)，268至494(E2)，495至689(E3)，690至1063(E1)，或其部分来确定。举例来说，编码C株E1的区域的N末端抗原性部分，即690至877位氨基酸与Brescia株的E1的相应区域交换(图4，pPRKflc-h6)。新产生的C株衍生物具有感染性，而且能通过与抗E1和E2的C株和Brescia株特异性单克隆抗体反应而区别于野生型病毒株和Brescia株，例如所得的C株与特异于Brscia株的E1的单克隆抗体反应(表1)。因此，该新突变体的抗原特性与其亲代病毒相比已经改变，证实用另一种CSFV毒株E1的N端部分来替换C株的E1的N端部分，是开发C株标记疫苗的一种方法。然而，本发明并不局限于在C株和其他CSFV株之间交换E1的N末端部分。来自任一其他瘟病毒毒株的E1的N端部分可用C株E1的相应部分交换。就这一点而言，从猪体内分离到的但不属于C株抗原组的瘟病毒毒株的E1序列就特别合适。在交叉中和作用基础上选择出的这些病毒株的例子包括病毒株“Van EE″，“Stam”，“SF UK87”，“Wisman”和“5250(Wensvoort et al.，1989，V，Microbiol 20：291-306；Wensvoort，1992，欧共体国家猪类实验室会议报告16-17 June 1992.VI/4059/92-EN(PVET/EN/1479)1992 p59-62)。

E1的N末端部分显示出包含有3个不同的抗原区，A，B和C，它们位于E1蛋白的不同部位，每个均与其中和性单克隆抗体强烈反应(Wensvoort 1989，普通病毒学杂志70：2865-2876；Van Rijn et al.1992 Vet Microbiol 33：221-230；Van Rijn et al.，1993.普通病毒学杂志Virol 74：2053-2060)。在受试的94株CSFV病毒的A区图谱中表位是保守的，而B区和C区的表位是非保守的(Wensvoort 1989，普通病毒学杂志70：2865-2876)。用Brescia株和C株的E1基因的杂合子(Van Rijn et al，1992 Vet Microbiol 33：221-230)，和用Brescia株的E1的缺失突变体对表位作图，暗示A区和B+C区在E1区的N端部分形成两种不同的抗原单位(Van Rijn et al.，1993普通病毒学杂志74：2056-2060)。在E1的N端部分中位于693，737，792，818，828和856位的6个半胱氨酸是E1正确折叠的决定性因素，这一发现更进一步支持了上面的暗示。然而，至少792位的半胱氨酸对Brescia株的感染性不是决定性因素，因为用该位置的半胱氨酸变为精氨酸的突变分离到了该病毒的单克隆抗体抗性突变株(Van Rijn et al.1993第九界国际病毒学大会论文及摘要8-13 August Glasgow Scotland)。

尽管氨基酸序列中的小改变可导致C株RNA的感染性丧失(见实施例2)，但792位半胱氨基酸改变则显示，在不太可能预见到适于修饰而又不失去功能的某一位置上一个氨基酸的改变仍有可能导致产生有活性的病毒突变体。因此，对C株序列中的每个氨基酸而言，某一特定氨基酸的改变对该病毒特性的影响将不得不凭经验确定。这又一次显示，对修饰C株，如对标记疫苗的开发没有明显的靶序列可在以前出版的资料的基础上作出鉴定。

C株标记疫苗的开发所必须的是将接种的猪和被CSFV野生株感染的猪进行血清学区分的可能性。以前曾显示由猪α疱疹病毒1型病毒的减毒活载体表达的E1，或由杆状病毒载体在昆虫细胞中表达的免疫亲和纯化的E1，在猪体内诱导了对抗猪瘟的保护性免疫反应(WO 91/00352；Van Zijl et al 1991病毒学杂志65：2761-27615；Hulst et al.，1992病毒学杂志67：5435-5442)。我们很吃惊地发现带有缺失的A区或带有缺失的B+C区的E1突变体(图5)，也在猪体内诱导了抗猪瘟的保护性免疫反应(表2)。这说明由疫苗病毒株诱导的保护性免疫并不依赖于同时抗A区和B+C区的中和抗体。因而，只在A区，或只在B+C区，或在这些区的某一部分用另一种瘟病毒的相应区交换或突变的瘟病毒株突变体，优选不限于是从猪中分离出的属于除C株外的其他抗原组的一种瘟病毒(例见上文)，均是本发明的部分。覆盖了A区并适合于交换或突变的E1区定位于785和870位氨基酸之间。该区的一些部分也适于交换或突变，如位于785和830位氨基酸之间和位于829和870位氨基酸之间的亚区域。覆盖B+C区并适于交换或突变的E1区定位于691和750位氨基酸之间。该区的某些部分也可能适于交换或突变，如位于691和718位氨基酸之间及717和750位氨基酸之间的亚区域。

受瘟病毒感染的动物产生抗E2抗体(Kwang et al.，1992.Vet.Microbiol 32：281-292；Wensvoort未公开的意见)。因此，适于经突变(缺失，插入，点突变)或经与抗原性不同的瘟病毒交换相应遗传物质，或用属于不同抗原组的瘟病毒交换相应遗传物质以进行(标记)疫苗开发的第二个区就是编码E2的区域。

C株还可被用来作为插入和表达异源性遗传物质(序列)的载体。为了载体的开发，被插入C株中的异源遗传物质可用来改变大ORF的翻译策略及对由该ORF编码的多聚蛋白的加工。适于改变大ORF的翻译策略的序列的一个例子是带有内部核糖体进入位点(IRES)的序列(Duke et al.，1992病毒学杂志66：1602-1609及其参考文献)。适于改变多聚蛋白的加工的序列的一个例子是，负责从细胞中排出蛋白或是将蛋白穿过内质网膜而插入膜中的信号序列(Blobel 1980美国国家科学进展77：1496-1500；Kreil 1981 Annu Rev Biochem 50：317-348)。信号序列可被细胞信号肽酶切断。然而，编码病毒蛋白酶的切割位点的序列也可用于改变多聚蛋白的加工。

经一种C病毒株载体插入并表达的序列可用作鉴别受接种的猪的标记，或用作保护猪对抗由异源性插入序列产生的病原体。优选标记序列有强抗原性并属于在猪体内不复制的微生物。它们可编码已知的全基因产物(如衣壳或包膜蛋白)，或这些基因产物的抗原性部分(如表位)。优选标记序列来自以下病毒家族：腺病毒科，沙粒病毒科，Arteriviridae，布尼病毒科，嵌杯状病毒科，Circoviidae，冠状病毒科，黄病毒科，嗜肝DNA病毒科，疱疹病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科，乳多空病毒科，弹状病毒科，细小病毒科，痘病毒科，小RNA病毒科、呼肠病毒科、逆转录病毒科、及披膜病毒科。然而标记序列也可编码天然状态下不常见的人工抗原，或编码组织化学标记如大肠杆菌β-半乳糖苷酶，果蝇乙醇脱氢酶，人胎盘碱性磷酸酶，萤火虫萤光酶，及氯霉素乙酰转移酶。

编码一种或多种蛋白的异源遗传物质，该蛋白能诱导保护性免疫以对抗由异源遗传物质相应的病原菌所致疾病，可来自其他包括上述毒株之序列的瘟病毒株，也可来自猪细小病毒，猪呼吸道冠状病毒，传染性肠胃炎病毒，猪生殖和呼吸综合症病毒(Lelystad病毒，EP92200781.0)，猪α疱疹病毒1型，猪地方性腹泻病毒，以及猪流感病毒，这些遗传物质还可来自细菌，诸如出血败血性巴斯德菌，支气管败血性博德特氏杆菌，胸膜肺炎放线芽孢杆菌，Streptoccocus suis，舌骨痢疾密螺旋体，大肠杆菌，钩端螺旋体，以及象猪肺炎枝原体和猪鼻炎枝原体这样的枝原体。

在C株中异源序列插入的合适位点位于170和171位氨基酸残基之间，690和691位氨基酸残基之间，及691和692位氨基酸残基之间。它们均示于SEQ ID No.1中，但这些并不是仅有的位点。

本发明也包括一些诊断试验，它们可用于区分用标记疫苗或用含(突变的)E1和/或(突变的)E2的亚单位疫苗接种过的猪，以及用瘟病毒野生型毒株感染的猪。这类鉴别诊断试验的适当形式描述在实施例4和5中。在常规非区分性CSFV ELISA试验中，E1在由Wensvoort等人1988年描述的复合物捕获封闭(CTB)ELISA试验中被用作抗原(Vet.Microbiol 17：129-140)。现有技术中的CTB-ELISA，也称为液相封闭ELISA，或称为双抗体夹心ELISA，用到两种抗CSFV Brescia株的E1的单克隆抗体(Mabs)。定位于A区内的Mab b3的表位在CSFV各株之间是保守的，而定位于C区内的Mab b8的表位是非保守的(Wensvoort et al.1989，普通病毒学70：2865-2876)。上述CTB-ELISA是灵敏可靠的，并能专一地检测受瘟病毒感染的猪体内CSFV特异性抗体。故该试验可区分受CSFV病毒株感染的猪和受诸如BVDV病毒株感染的猪。但该试验不能区分受CSFV野生型毒株感染的猪和经C株疫苗接种的猪。而且该试验不适于与活的或死的E1亚单位疫苗联合使用。

本发明的一个试验是修改过的CTB-ELISA，它只以一种MAb如MAb b3为基础。这种仅仅基于一种Mab的CTB-ELISA以前未有人描述过，所述Mab即可用于结合ELISA试验板表面上的抗原也可用于与野生型血清竞争，这种CTB-ELISA是本发明的一个重要部分。既然已描述了该试验的原理，它就可用于诊断试剂盒的开发，以检测其他抗体，包括抗其它病毒或其它疾病的抗体，或能指示人或动物体的其他疾病的抗体。这一发现因而有用于所有CTB-ELISA，或是基于与CTB-ELISA相同原理的ELISA，它们均是在单一的Mab以及二聚体化或多聚体化抗原的基础上发展起来的。这里要求的试验方法也适用于测定其他特异性结合配对分子对的成员，如激活物/受体，酶/抑制物等，其中配对分子之一应有至少两个相同的结合位点。

因而本发明也包括了这样一种方法，它通过将上述试验物质与可测剂量的能特异性结合上述结合配对物之同一结合位点的参照物质(抗体)竞争能测定样品中能特异性结合结合配对物(如抗原)的结合位点的试验物质(如抗体)，所述方法包括：

(1)用以下物质与上述样品接触，(a)结合于固相载体上的上述参照物质(抗体)；(b)上述参照物质的结合配对物(抗原)，该结合配对物分子含有至少两个与上述参照物质一样的结合位点，(c)带标记的上述参照物质(抗体)；(2)测出上述标记物从上述载体上分离的程度。

作为一个例子，针对上述参照物质(抗体)的带有至少两个相同结合位点的上述结合配对物(抗原)是针对上述参照物质的结合配对物(抗原)的二聚体。

应用同样的原理，本发明还包括在样品中测定试验物质(抗原)的存在的方法，该试验物质的每个分子上有至少两个相同的能特异性结合其结合配对物(抗体)的结合位点。此方法包括：(1)用以下物质与上述样品接触(a)结合于固相载体上的上述结合配对物(抗体)，及(b)带标记的上述结合配对物(抗体)；(2)测定上述标记物与上述载体的结合程度。

这些方法中，抗体和抗原仅作为例子而提及；它们可以被其他特异性结合的配对分子替代。

本发明进一步提供了一个诊断试剂盒，它包括：(a)结合在固相载体上的参照单克隆抗体；(b)带标记的上述参照单克隆抗体；还可任选地包括(c)上述参照抗体的有至少两个与所说参照抗体相同之结合位点的抗原；试剂盒也可是上述成分(a)和/或(b)和(c)之间的混合；还可包括能进行竞争免疫学试验的其他成分。

此方法适于与在E1的一个或多个表位(如A区)有缺失的E1亚单位疫苗联合应用来作为鉴别诊断试验。该试验亦适合于与A区突变了的E1亚单位联合使用，该突变使产生的抗该突变的A区的抗体并不与Mab b3竞争Mabb3的表位。而且，这个试验适于与修饰后的C株或其他CSFV病毒株疫苗协同使用，所述CSFV疫苗株或是在A区有缺失，或是A区被不同于CSFV的其他抗原组的瘟病毒(见上)的A区所交换，或是A区发生了突变使针对该区的抗体不与Mab b3竞争Mab b3的表位。这里描述并举例说明了有关E1的A区的试验，而只以Mab b8为基础的相似试验也能用于与下面所说的疫苗协同使用，这类疫苗在B+C或C区有缺失，或是其B+C或C区被不同于CSFV的其它抗原组的瘟病毒(见上)的B+C区或C区所交换，或是其B+C区或C区突变后产生的针对这些区的抗体不与Mab b8竞争Mab b8的表位。本发明也举例说明了该试验与Brescia株的Mab b3或Mab b8的联合作用。但是，本试验也能用其他Mabs来建立，这些Mabs不仅是针对Brescia株的E1的A区或B+C区，或者是针对任何其他CSFV株的A区或B+C区，还可以是针对任何其他瘟病毒的E1中的类似区。这样的试验也可以以E2的表位为基础(见实施例5)。根据本发明在(修改过的)CTB-ELISAs中较合适的抗原应优选那些能与Mab b3或Mab b8或针对E 2表位的类似MAbs反应的CSFV株的E1二聚体或多聚体(加或减一个3’-TMR)或E2的二聚体或多聚体(见实施例5)。就带有突变的A区的疫苗而言，用于诊断试验的抗原二聚体或多聚体由缺失B+C的构建体合成(见实施例5)，而就带B+C区突变的疫苗而言，用于诊断试验的抗原二聚体或多聚体由缺失A的构建体合成(见图5的构建体；见实施例4和5)。我们确信E 1抗原的二聚体化(或多聚体化)形式是以E1 C末端部分中半胱氨酸残基形成的二硫键为基础。它容许极其灵敏的免疫试验，因为二聚体化的抗原分子对1个Mab而言含有两拷贝表位。因此，这一个Mab就可用于通过一个表位固定二聚体化抗原，并用于通过其他表位标记二聚体化的抗原。由野生型病毒株感染产生的样品血清中的抗体的竞争作用可抑制标记抗体与抗原的结合，并因此可导致能测出该抗体的敏感试验。本发明还涉及基于此方法的诊断试剂盒，该盒中包括基于E1或E2的抗原，及(酶)标记并固定的针对E1或E2表位的同型单克隆抗体，以及其他常规成分(试验板，稀释液，酶的底物，染色剂等)，这样就能进行竞争型的免疫试验。

根据本发明的疫苗包含如上所述的核苷酸序列，它既可以是核苷酸序列，也可以是疫苗株，还可以是存在于载体或宿主有机体内的核苷酸序列，或者也可以是如上所述的多肽，其含量足以产生针对瘟病毒感染的保护作用。该疫苗还可以是多用途疫苗，它包括其他免疫原或编码它们的核苷酸。该疫苗还能进一步包含常规载体、佐剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂等。根据本发明的疫苗可用常规方法制备。

本发明用于产生CSFV的C株基因组全长DNA拷贝的感染性转录本的方法对任何其他C株衍生物或瘟病毒属其他株均适用。这里所描述的产生减毒活CSFV疫苗株的方法亦极适用于为了制成疫苗而在体外减缓(修饰)C株或任何其它CSFV或其他瘟病毒株的毒性。

根据本发明的C株疫苗允许在接种过的猪和被CSFV野生型病毒株感染的猪之间进行血清学区分。用本发明的方法同样能很好地得到其他任一种CSFV病毒株或瘟病毒株的标记疫苗。这类标记疫苗可以通过如下的突变来开发，即突变(缺失，点突变，插入)编码E1的区域，或E1的N端部分，或E1的A区或B+C区，或编码C株的E2的区域，或衍生于C株或其他瘟病毒株基因组中的类似区，或用抗原性不同的瘟病毒的相应区域或是属于不同抗原组的瘟病毒的相应区域交换这些区域。

另一种开发C株标记疫苗的方法是向其基因组加入能表达在猪体内不复制的微生物的强抗原性蛋白质或表位(多个表位)的异源性遗传物质，或是能表达具有人为的特点并且在猪体内只有在不正常情况下才能发生的蛋白质或表位的遗传物质。

此外这种异源遗传物质能编码这样一类抗原，它们能在猪中诱导抗由其致病菌导致的疾病的保护性免疫。因此，应用C株，或C株衍生的病毒株，或任何其他瘟病毒株，来作为能诱导抗宿主体内特定疾病的保护作用的外源抗原的表达载体(该宿主是哺乳动物)，这也是本发明的一部分。上文中已描述了对表达外源序列的重组C株病毒及适于这些外源序列插入的位点的构建。同样可构建C株衍生的病毒，或任一种其他瘟病毒的类似的重组病毒。这些病毒因此也是本发明的一部分。

本发明的一个重要部分涉及在A区或B+C区有缺失的E1亚单位的免疫原性的潜力。正如表2中概括的，这两种E1突变体均能在猪体内诱导抗致死剂量的强毒性Brescia株的攻击的保护性免疫。应用在A区和B+C区内有缺失或其他突变的E1突变体作为死亚单位疫苗或作为由接种后的动物体内的载体系统所表达的抗CSF的活亚单位疫苗，这也是本发明的一部分。突变的E1加上其他抗原性CSFV蛋白，如E2或E2的突变形式，也适于作为死或活的亚单位疫苗(见上)。

本发明还包括能用于区分用CSFV标记疫苗或含(突变的)E1和/或(突变的)E2的亚单位疫苗接种的猪和被瘟病毒的野生型病毒株感染的猪的诊断试验。这样的诊断试验可以血清学、抗原检测或核苷酸检测为基础。到底哪种试验适合于当时的情况，这种选择取决于所用标记物的专一性。血清学诊断试验的合适形式之一是描述在实施例4中的经修改的CTB-ELISA。根据本发明，这种基于使用单一抗体的CTB-ELISA的方法并不限于只用在CSFV或其他瘟病毒上，而是也适用于为诊断而测定人或动物界的其他抗体，还适用于测定其他特异性结合的物质。

联合C株标记疫苗的恰当的抗原检测试验的一个例子就是测定猪血中的CSFV野生株E1而不是疫苗株E1的试验。如果C株的A区，通过例如被属于不同于CSFV的抗原组的瘟病毒株的A区交换而被修饰，这样的试验就可以以识别CSFV的A区保守的表位的单克隆抗体为基础。

可是，若为了开发标记疫苗对C株的E2作了修饰，那么与这样的疫苗相伴的血清学或抗原性诊断试验就能检测出接种的动物和感染的动物之间有关修饰的E2区的差别。这种诊断试验因此要用E2特有的序列作为抗原。这些E2特有的序列可能来源于亲代C株(见实施例5)，也可来源于抗原性不同于C株的CSFV株，或来源于不同于CSFV的其他抗原组的瘟病毒。但是，这些E2特有的序列也可以通过对任一种瘟病毒的天然E2进行突变(缺失、插入或点突变一处或多处)而获得，或是由任一种瘟病毒的E2的(突变)部分组成。二聚体的E2和多聚体的E2可在诊断试验中用作抗原(见实施例5)。E2与一种单克隆抗体联合(比较实施例4和5)也可用于CTB-ELISA试验，该试验的原理已在上文描述过。基于E2的诊断试验描述在实施例5中，其中抗原检测试剂盒是为了检测瘟病毒的E2，而且是建立在一种Mab的基础上，这样的试验试剂盒优选包含能识别E2的保守表位的抗体。这样的试验也是本发明的一部分。

最后，诊断试验有可能以对CSFV野生株的区域的特异性检测为基础，而在C株中这些区域已经过修饰。适合于该试验的技术包括核酸杂交(例如用特异异性探针杂交)和/或扩增(例如用聚合酶链式反应)。另外，通过对3’非编码区(或其一部分)进行PCR扩增就能将C株序列与CSFV野生株序列区别开，所述3’非编码区内有一段TTTTCTTTTTTTT序列是C株基因组特有的。

如果C株通过插入了外源标记序列而被修饰，那么，根据此序列的任何形式的诊断试验，如根据抗原，表位或由该序列编码的组织化学产物，或根据通过核酸杂交技术(如特异性探针杂交)和/或扩增技术(如聚合酶链式反应)对外源遗传信息的检测，也是本发明的一部分。

实施例1C株基因组的分子克隆和测序

细胞和病毒

猪肾细胞(SK6-M，EP-A-351901)在含5％胎牛血清(FBS)和抗生素的Eagle’s基本培养基上培养。如文献所述(Moormann et al.1990，Virology 177：184-198)测试FBS看是否有BVDV以及BVDV抗体。只有不含BVDV和BVDV抗体的血清可以使用。典型猪瘟病毒(CSFV)的“中国”疫苗株(C株)如EP-A-351901中所述适应于SK6-M细胞。被称作“Cedipest”的病毒株是非致细胞病变的并且用三倍终点稀释法进行生物学克隆。经三步扩增产生了滴度为3、5、106TCID₅₀/ml的克隆化病毒原种。

感染了C株的SK-6细胞的胞质RNA的分离

感染了C株的细胞中的胞内RNA如文献所述(Moormann etal.1990.Virolgy 177：198)作必要的分离。简短地说，在162cm²瓶(Costar)中的SK6-M单层细胞用Cedipest以每个细胞5TCID₅₀的感染复数(m.o.i.)感染。然后，细胞于37℃培育1.5小时，并加入新鲜培养基使终体积为40ml。7小时后加放线菌素D至终浓度1μg/ml。24小时后将细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗两次，在冰冷的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl p8.2，0.14M NaCl，2mM MgCl₂，5mM DTT，0.5％[v/v]NP-40，0.5％[W/V]脱氧胆酸钠，及10mM氧钒核糖核苷复合物(New England Biolabs))中裂解。裂解产物离心(4℃，4000g 5分钟)后上清用蛋白酶K(终浓度250μg/ml)37℃处理30分钟。用酚、氯仿和异戊醇(49∶49∶2)抽提两次，再用氯仿和异戊醇(24∶1)抽提1次。RNA贮存于乙醇中。

cDNA的合成和扩增

1至2μg感染了C株的细胞的胞质RNA及20pmol反义引物与1μl 10mM氢氧化甲基汞在室温保温10分钟。变性的RNA再与1μl 286mM β-巯基乙醇室温保温5分钟。RNA用无RNA酶H的200-400单位M-MLV逆转录酶(Promega)在1×M-MLV逆转录酶缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.3，75mM KCl，3mMMgCl₂和10mM DTT)，40U rRNasin(Promega)，及80μM的dATP，dGTP，dCTP和dTTP中于42℃逆转录45分钟。最终反应体积为25μl，样品用30μl矿物油(Sigma)铺盖。

经逆转录(RT)后样品于94℃变性10分钟。每种RT反应物的2.5μl小份在含1μM有义引物和1μM反义引物，各200μM的四种dNTPs，及2.5UTaq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)的100μl Taq聚合酶缓冲液(由Taq多聚酶的生产厂家提供)中进行39个循环的聚合酶链式反应(PCR)(循环：94℃60秒；55℃60秒和72℃1-2分钟)而扩增。样品用75μl矿物油(Sigma)覆盖。

覆盖了C株全部基因组的cDNA克隆

C株基因组进行两次各自独立的克隆。第一轮克隆期间(图1A)，用于第一链cDNA合成和PCR的引物是根据CSFV的Brescia株(Moor mann et al.1990，Virology 177：184-198)和Alfort株(Meyerst et al.1989.Virobgy171：555-567)之间，以及BVDV的Osloss株(Renard et al.EP0208672)和NADL株(Collettet al.1988.Virology，165：191-199)之间的序列同源性来选择的。cDNA片段的大小选择为0.5-2.5kb之间以便得到最佳扩增。凝胶纯化的扩增产物用T4DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶I处理，并用T4多聚核苷酸激酶磷酸化。然后，cDNA片段用T4连接酶连接到pGEM4z-blue的SmaI位点。

在第二轮克隆中(图1B)，引物从第一轮克隆所得的cDNA克隆的序列中选择。引物要在可能的地方含有适合于对扩增的cDNA片段进行克隆的限制性位点。经RT和PCR扩增(见上)后，cDNA片段可用两种不同的限制性酶切割，也可在其一端钝化和磷酸化(如上所述)，并在另一端用适当的限制性酶消化。若不能使用PCR产生的位于引物中的限制位点，就选择扩增的cDNA片段中的位点来克隆。凝胶纯化后，PCR产物被连接到经凝胶纯化的，并已用限制性酶消化产生了与PCR产物相容的末端的pGEM4z-blue(Promega)或pGEM5zf(+)(Promega)。

为获得含有C株基因组的最终5’和3’末端的cDNA克隆，应用3’-5’连接法(Mandl et al.1991.病毒学杂志65：4070-4077)。如上述从感染了C株的细胞中分离出胞质RNA，并通过5.7氯化铯垫层进一步纯化(Moormann and Hulst.1988.病毒研究11：281-291)。有暗示说BVDV基因组5’端无帽结构(Brock et al.1992.病毒学方法杂志38：39-46)，根据这一结果，将C株的基因组RNA未经焦磷酸酶处理就直接连接。8μg RNA用10U的T4 RNA连接酶(New England Biolabs)在反应混合液中连接，该反应混合液是50mM Tris-HCl pH8.0，10mM MgCl₂，10mM DTT，20U rRNasin(Promega)，10μg/ml BSA(无RNA酶)及1mM ATP。将混合物在37℃保温4小时。RNA用苯酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀，结粒，并重新悬浮于不含RNA酶的水中。2μg每份的RNA按上述进行逆转录和扩增。每次PCR的2μl的各等份用嵌套引物再扩增。对于逆转录过程，用反义引物与5’非编码区杂交。对于两个PCR扩增步骤用有义引物与3’非编码区杂交，并用反义引物与5’非编码杂交。经苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀后，PCR产物用NcoI(掺入嵌套PCR所用的有义引物中)和EagI(SEQ ID NO.1序列中的81位核苷酸)消化，然后连接至pUC21的NcoI-EagI位点(Vieira and Messing，1991，Gene 100：189-194)。

实施例1中所用到的所有修饰和克隆程序均基本按文献所述的进行(Sambrook et al.1989.分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。限制性酶和DNA修饰酶均可商购并按厂家说明来使用。质粒转化并维持在大肠杆菌DH5a菌株中(Hanahan，1985，DNA克隆1：109-135)。

cDNA克隆的测序

测序要用到的质粒DNA既可用碱裂解和氯化锂沉淀来抽提和纯化，也可用氯化铯离心来抽提和纯化(Sambrook et al.1989.分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。以T7聚合酶为基础的测序试剂盒(Pharmacia)被用于质粒DNA的直接双链测序。除了SP6，T7，和通用的pUC/M13正向和反向引物外，还根据CSFV Brescia株的序列用了寡核苷酸引物(Moormann等人，1990.Virology 77：184-198)。用Cyclone DNA合成仪(New Brunswick Scientific)或用392 DNA/RNA合成仪(Applied Biosystems)合成引物。在含8M尿素的6％丙烯酰胺凝胶上分析测序反应。测序数据在使用Speedreader软件和PCgene软件(Intelligenetics Inc.Applied Imaging Corp，Geneva.Swizerland)的Compaq 386计算机及在使用Mac Mollytetra程序的苹果Macintosh计算机上分析。

考虑到Taq聚合酶或C株RNA的异质性可能会导致序列错误或序列差异，可通过对两次独立的PCR反应所获得的两个cDNA克隆中最小的一个进行测序来确定C株cDNA克隆的全基因组序列。如果在特定区的两个克隆的核苷酸序列之间发现有差异，可通过对另一次独立的PCR反应所获得的第三个cDNA克隆进行测序来确定该区的共有核苷酸序列(图1A)。

实施例2C株基因组的全长DNA拷贝的感染性转录本的产生

构建cDNA克隆pPRKflc-113

根据示于图3的模式组成C株基因组RNA的全长DNA拷贝。首先，构建两个亚克隆，其中一个(pPRc64)含有基因组的5′部分的cDNA序列(1-5,560位核苷酸)，而另一个(pPRc111)则含有基因组3’部分的cDNA序列(5,463-12,311位核苷酸)。最初构建全长cDNA克隆是在pGEM4z-blue中尝试。但是该方法因全长序列插入此载体后不稳定而失败。为了增加克隆的稳定性，5’和3’部分克隆的插入物在低拷贝数载体pOK12(Vieira and Messing，1991，Gene 100：189-194)的衍生物中再克隆，最终分别产生了pPRc108和pPRc123。为了达到这种结果，pOK12通过缺失了多克隆位点(MCS)中的绝大多数限制性位点及T7启动子序列而得以修饰。最后得到的用于进一步的全长克隆的载体pPRK仍然在MSC中含有唯一的SpeI，NotI，EagI，BamHI，EcoRV，EcoRI，和XbaI位点。

具体地说，全长克隆pPRKflc-113的构建过程如下(图3)：质粒pPRc45和pPRc46的插入片段在位于C株序列(SEQ ID NO.1)中1249位核苷酸上的HpaI位点处连接起来，产生质粒pPRc49。pPRc49的插入片段再与pPRc44的插入片段在位于(SEQID NO.1)3241位核苷酸的NslI位点处连接，从而产生pPRc63。通过按下述将pPRc13的插入片段与C株基因组RNA5’终端区扩增的(PCR)cDNA片段连接就构建成5’半部分克隆pPRc64(核苷酸1至5560，SEQ ID NO.1)，合成一段5’末端有义引物，该引物含有一个EcoRI和一个SalI位点，其后连接着T7 RNA聚合酶启动子序列和C株基因组RNA的头23个核苷酸。该引物以及一段第二轮克隆的反义引物被用于扩增一个cDNA片段，而该cDNA片段被EcoRI和XhoI消化后克隆进经EcoRI-XhoI(SEQ ID NO.1中的216位核苷酸)消化的pPRc63。最后pPRc64的插入片段被再克隆进由EcoRI-XbaI消化的pPRK而产生pPRc108。

3’半部分克隆pPRc111(5,463至12,311位核苷酸，SEQ ID NO.1)通过连接4个第二轮克隆(pPRc67，53，58和55)及1个第一轮克隆(pPRc14)而构建成功。pPRc67和pPRc53的插入片段在位于7,778位核苷酸的Nhe I位点处连接而成pPRc71。pPRc55和pPRc58的插入片段在位于10,387位核苷酸处的ApaI位点处连接而成pPRc65。pPRc65和pPRc14的插入片段随后在位于11,717位核苷酸处的AflII连接而成pPRc73。pPRC73的插入片段在位于8,675位核苷酸处的PstI位点上与pPRc71的插入片段连接而成pPRc79。然后，包括了C株cDNA的完整3’末端序列的pPRc79的插入片段经过修饰导入了一个SrfI位点，该位点在消化后能精确地产生C株cDNA序列的3′末端(用于在3’末端精确的失控转录)。为达到这一点而合成了一段3’末端反义引物，它含有一个SrfI和一个XbaI位点及互补于C株基因组RNA的3’端序列的18个核苷酸。该引物和第一轮克隆的一段有义引物被用于扩增cDNA片段。该片段用SpeI(SEQ ID NO.1中的11,866位核苷酸)和XbaI消化并克隆进经SpeI-XbaI消化过的pPRc79，产生pPRc111。

全长cDNA克隆pPRKflc-113，最终通过将pPRc111的C株特异性NcoI⁵⁵³²-XbaImcs片段插入经NcoI⁵⁵³²-XbaI^mcs消化的pPRc108中而构建成。

构建全长克隆pPRKflc-133

全长cDNA克隆pPRKflc-113仍具有除了核苷酸沉默突变以外的5个点突变，它们致使氨基酸发生改变，不同于从至少两个第一轮cDNA克隆的序列中确定出的氨基酸序列。pPRkflc-113中的这五个点突变通过将受影响的DNA片段交换成含有优势序列的相应DNA片段而转变成优势序列(3个中转变了2个)。

在4,516位核苷酸处有点突变的5’半部分cDNA克隆pPRc108，通过其ScaI³⁴¹³-NcoI⁵⁵³²片段被pPRc124的相应片段交换而被改变。用pPRc32 PvuII⁴⁴⁸⁵-NheI⁵⁰⁶⁵片段交换pPRc44的相应片段就得到了克隆pPRc124(对照图1)。这一新的5’半部分cDNA克隆被命名为pPRc129。

为了能进行克隆，构建了一个3’半部分克隆，方法是从载体上的SalI位点(参照图3)直至位于5,509位(SEQ ID NO.1)核苷酸的HpaI位点之间缺失pPRKflc-113的C株序列的5’端部分，结果产生了pPRc123。在pPRc123中在8526，9002，10055和10205位核苷酸处的突变不得不作变动。8526位的突变经两个步骤而回复。首先，pPRc53的ApaI⁸⁵⁰⁶-PstI⁸⁵⁷⁵片段被pPRc90的该片段交换从而产生pPRc125。第二，pPRc123的NheI⁷³⁷⁹-PstI⁸⁶⁷⁵片段，被pPRc125的该片段交换从而产生pPRc127。

为了能回复9,002位，10,055位和10,205位的3个突变，先修饰了pPRc58使载体中的FspI位点缺失。结果pPRc58的EcoRI^mcs-NdeI片段被缺失(Ndel切割pGEM4z-blue)，产生了pPRc126。质粒pPRc126被用于回复10,055位和10,205位的突变，这是通过将其SacI^9,975-ApaI^10,387片段换成pPRc96的相应片段而实现的，这样做的结果是产生pPRc128。用pPRc90的AatII-FspI^9,016片段(Aat II切割pGEM4z-blue)取代pPRc128的AatII-FspI^9,016片段就能回复9002位的突变，结果产生pPRc130。最后，pPRc127的PstI^8,575-ApaI^10,387片段被pPRc130的相位片段取代而产生质粒pPRc132。所有改变了单个突变的亚克隆步骤均经测序而被证实。

在经NcoI^5,532-XbaI^mcs消化的pPRc129中插入pPRc132的NcoI^5,532-XbaI^mcs片段就构建成了全长克降隆pPRkflc-133。

构建杂交的全长克隆pPRKflc-h6

将pPRKflc-133的部分E1基因换成CSFV Brescia株的部分E1基因，就能形成抗原性不同但能存活的C株突变体。为此，pPRc129的NheI^2,443-AfIIII^2,999片段被pPEh6(Van Rijn et al.，1992)的相应片段取代，产生了5’半部分的杂交克隆pPRc139。将pPRc132的NcoI^5,532-XbaI^mcs片段插入pPRc139就构建成杂交全长克隆pPRKflc-h6。该克隆现含有CSFV的Brescia株的E1的抗原区，该区包括一个唯一的Bgl II位点。

实施例2中用到的所有修饰和克隆程序基本上按文献所述进行(Sambrook et al.，1989，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。限制性酶和DNA修饰酶可商购，并按厂家说明来使用。质粒在大肠杆菌DHα株中转化并保存。(Hanahan，1985，in DNA Cloning 1：109-135)。

体外RNA转录

用于体外RNA转录的质粒DNA用Qiagen层析柱(Westburg)按厂家条件纯化。质粒DNA用XbaI或SrfI线性化后用苯酚和氯仿抽提，乙醇沉淀，真空干燥，并溶解在适当体积的不含RNA酶的水中。1μg的线性化质粒DNA被用作体外转录的模板。RNA在100μl反应混合物中37℃下合成1小时，该反应混合物含有40mM Tris-HCl pH7.5，6.5mM MgCl₂，2mM亚精胺，10mM DTT，100U rRNasin(Promega)，ATP，GTP，CTP，UTP各0.5mM，及170单位的T7RNA聚合酶(Pharmacia)。37℃下用不含RNA酶的DNA酶I(Pharmacia)消化15分钟就除去了模板DNA，然后用苯酚和氯仿抽提，再用乙醇沉淀。RNA溶于20μl不含RNA酶的水中，并在260mm测紫外吸收来定量。

RNA转染

RNA转染混合液通过温和地混合50μl lipotectine(Gibco BRL)稀释液(无RNA酶的水中10μg lipofectin)和50μl RNA溶液(无RNA酶的水中1μg RNA)而组成，再在室温下保温该混合物15分钟。在直径35mm6孔的组织培养板中的亚汇合成片的单层SK6细胞被用于RNA转染。细胞用Dulbecco’s改良的Eagles培养基(DMEM)洗两次。再给细胞加1ml DMEM，然后加RNA反应混合液。37℃温育16小时后，培养基被2ml补加了5％FBS的DMEM更换。再在37℃温育3天。然后用CSFV将异性单克隆抗体(Mabs)按Wensvoort等人(Vet.Microbiol.1986，12：101-108)所述的免疫过氧化酶单层试验(IPMA)对细胞进行免疫染色。

鉴定重组C株病毒

被转染的细胞的上清被置于直径35mm的孔中的铺满的单层SK6细胞上，37℃温育5天。转染的单层细胞经胰酶消化并用DMEM稀释7.5倍后在75cm2培养瓶(Costar)中37℃生长7天。从此以后，将细胞冻融两次，4℃ 5000g离心10分钟澄清细胞悬浮液，再收获上清就制备出了病毒贮存液。

病毒通过IPMA，及通过对RT-PCR扩增的病毒片段进行限制性分析而被鉴定。用病毒FLc-h6和FLc-133感染SK6细胞后，单层细胞于37℃培养4天。随后，单层细胞用针对Brescia E1上保守表位的Mab(Mab b3，A区)和非保守表位的Mab(Mabs b5和b6，B+C区)，并用C株特异性而且针对E1的Mab(Mabc c2)或针对E2的Mab(Mab c5)(Wensvoort，G，1989，inThesis，pp 99-113，Utrecht，The Netherlands)进行免疫染色。在这一试验中，用被天然的Brescia病毒或天然的C株病毒感染的SK6细胞单层做对照。结果列于表1，均如所预期。简单说，Mab b3识别E1上的一个表位，它在CSFV的各病毒株之间是保守的，因此Mab b3识别表1中的所有病毒株。Mab b5和b6不能识别C株的E1，并因此只与Brescia株和FLc-h6反应。与之相反，Mab c2不识别Brescia株的E1，并因此只与C株和FLc-133反应。最后，Mab c5不识别Brescia株的E2，并因此与表1中除Brescia株以外的所有病毒均可反应。

病毒FLc-h6基因组RNA应含有一个唯一的Bgl II位点，它位于E1基因内(见上)。为了检查该位点的存在，从被重组病毒FLc-h6或FLc-133(如上所述经PCR扩增的)感染的SK6细胞中使用Van Rijn等人所述(1993，J.Gen.Virol.74：2053-2080)的引物分离出胞质RNA，并经Bgl II消化。事实上，FLc-h6的1，091个碱基对的扩增片段被Bgl II切割，产生了590个碱基对和501个碱基对的片段，而FLc-133的扩增片段仍完整无损。

实施例3

用E1的缺失突变体来免疫猪

构建并表达CSFV Brescia株E1的缺失突变体

已有文献显示表达在昆虫细胞中的CSFV Brescia株缺少T MR的E1在猪体内可诱导对抗CSF的保护性免疫反应(Hulst et al.，1993，J.Virol.67：5435-5442)。在E1的N末端的半部分中能诱导抗CSFV的中和抗体的两种相互区别的抗原性单位，A和B+C，也已确定(Wensvoort，1989，普通病毒学70：2865-2876；Van Rijn et al.1992.Vet Microbiol.33：221-230；Van Rijn et al.1993.普通病毒学74：2053-2060)。而且针对A区和B+C区的中和抗体在中和CSFV时表现出协同作用(Wensvoort 1989.普通病毒学70：2865-2876)。为了评价带有B+C区缺失或带有A区缺失的E1突变体的免疫原性，可在杆状病毒载体上制备出有关的构建体，并在猪体中检测所表达的突变体蛋白。

表达E1突变体的杆状病毒的构建通过对野生型AcNPV(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒)的DNA，以及带有能表达某特定E1突变体的序列的转移载体pAc Mo8的DNA进行重叠重组而完成。转移载体pAc Mo8通过在pAcAs3上唯一的BamHI位点的第一个碱基(G)的5’直接插入一个T(胸腺嘧啶)而衍生自pAcAs3(Vlak et al.1990，Virology，179：312-230)，这样就产生了重叠在Bam HI位点的第一个G上的ATG起始密码子。信使RNA由AcNPV p10启动子从插入BamH1位点的外源序列开始被转录。

编码E1突变体的序列是通过PCR扩增从插入pPRb2(Van Rijn et al.1992，Vet Microbiol.33：221-230)的E1而衍生来的。为此构建了两个其序列中包含一个BamHI位点的引物。5’末端(有义)引物序列是5’-AGA TT

TAAA GTA TTA AGA GGA CAG GT-3’(SEQID NO.2)。引物中下划物序列与Brescia株序列中的2362-2381位核苷酸相同(Moormann et al.1990，Virology，177：184-198)，粗体字母指BamHI位点。3’末端(反义)引物在BamHI位点的邻位有一个终止密码子。该3′端引物序列是5′-TA GTC

GAA TTC TGC GAA GTA ATC TGA-3′(SEQ IDNo.3)。此引物中下划线序列互补于Brescia株序列中的3433-3453位核苷酸(Moormann et al.，1990 Virology 177：184-198)；粗体字母指BamHI位点，而斜体字母指终止密码子。

扩增的序列被克隆进pAc Mo8的BamHI位点，并用限制性酶分析来检查载体中的正确定向。正确的转移载体命名为pPAb11。在AcNPVDNA和pPAb11的DNA之间重叠重组，以及对表达E1的杆状病毒载体的选择和纯化均按文献所述进行(Hulst et al.1993 J.Virol 67：5435-5442)。进一步在放射免疫沉淀试验中鉴定E1，以及用E1特异性Mabs鉴定E1也按Hulst等人所述(J.Virol 1993 67：5435-5442)进行。所得的重组杆状病毒表达无T MR的野生型Brescia E1(比较图3中从上往下数第二条杠)。这种缺TMR的E1可以从细胞中分泌出来(Hulst et al.，1993 J.Virol 67：5435-5442)。

从pPAb11的E1基因中缺失编码B+C区的区域可通过将pPAb11的NheI-Bgl II片段换成pPEh14的相应片段(Van Rijnet al，1993 J.Gen Virol 74：2053-2060)而完成，所得的转移载体命名为pPAb16。它含有在E1基因中从693位密码子至746位密码子的缺失。与此相类似，编码A区的区域也通过将pPAb11的Nhel-BglII片段换成pPEh18的相应片段(VanRijn et al.，1993，J.Gen Virol 74：2053-2060)而从pPAb11中缺失，从而产生转移载体pPAb12，pPAb12包括E1基因中从800位至864位密码子的一段缺失。

按上述构建选择能表达缺失的E1的重组杆状病毒并对其表达产物进行了鉴定。

对猪的免疫接种和攻击

4组(或2组)无特定病原体(SPF)的6至8周龄的猪，在第0天先用1ml含4μg E1(突变体)的水-油双乳剂进行肌内接种，第28天再用1ml含15μg E1(突变体)的水-油双乳剂再接种(表2)。如上述构建含A区缺失或B/C区缺失的E1突变体，以及野生型E1，并用示于图5的构建体来详细说明。关于第0天的第一次接种，用的是被适当的重组杆状病毒感染的昆虫细胞的上清。上清中E1的含量按以前所述来校准(Hulst etal.1993病毒学杂志67：5435-5442)。对第28天的再接种，我们从被感染的昆虫细胞上清中用免疫亲和层析纯化出E1((Hulst et al.1993同上)。所有接种组的猪，以及一组未接种的对照组猪(含两个SPF动物)用100 LD₅₀的CSFV Brescia456610株经鼻内攻击(Terpstra and Wensvoort 1988 Vet.Microbiol 16：123-128)。该攻击剂量在无保护的猪体内引起急性病，该病的特点是从第3-5天开始发生高热和血小板减少，到第7天至11天死亡。接种后第40，42，45，47，49，51，53和56天采集肝素化(EDTA)血样，并按文献所述(Hulst et al.1993同上)分析血小板和CSFV病毒。在第0，21，28，42和56天采集血清血样，并在CTB-ELISA(Wensvoort et al.，1988，Vet Microbiol 17：129-140)和过氧化物酶联中和试验(NPLA，Terpstra et al.，1984 Vet Microbiol 9：113-120)中检验，以测定抗CSFV的(中和)抗体。CTB-ELISA检验的结果表示为标准信号的抑制百分比：抑制＜30％为阴性，抑制在30-50％为可疑，抑制＞50％为阳性。NPLA滴度表示为在50％影印培养物中中和100TCID₅₀的Brescia株的相应血清稀释度的倒数。

逐日观察所有动物，看是否出现疾病的征兆，并测量体温。疾病的临床表现是：发烧，厌食、白细胞减少，血小板减少和麻痹。

实施例4

在一种单克隆抗体基础上开发对CSFV的CTB-ELISA(CTB-DIF)

对诊断试验的描述

本实施例描述了一种CTB-ELISA(CTB-DIF)，它是现有用于检测CSFV特异性抗体的CTB-ELISA(Wensvoort etal，1955 Vet Microbiol 17：129-140)的修改方案。

此CTB-DIF建立在以下发现的基础上，即被能表达E1-TMR的重组杆状病毒感染的SF21细胞能有效地分泌二聚体化的E1到培养基中。当被上述杆状病毒感染的细胞的培养基在非还原条件下经SDS-PAGE电泳后在Western blot上进行分析就能检测这种二聚体化分引泌的E1。对E1特异性Mabs而言，在E1二聚体上存在两个拷贝的表位(每个单体上一个)。故与二聚体化抗原一起)E1特异性单克隆抗体能被用作捕获抗体而包被在微滴板小孔壁上，也可以用作与辣根过氧化酶(HRPO)偶联的检测抗体。

CTB-DIF与在A区有缺失(见图5的构建体)的E1亚单位疫苗联合时是有效的，它还显示能区别两类CSFV特异性抗体，其一在经缺失A区的E1接种的猪体内产生，另一类在低毒力CSFV病毒株Henken，Zoelen，Sergen，331和Cedipest(EP-A-351901)感染的猪体内产生。

4只SPF猪，编号为766，786，789和770，用含A区中一个缺失的E1突变体按实施例3所述方法(亦见于表2)进行接种，并在接种后第44天用有毒的CSFV Brescia株攻击。在接种后第28，42和56天采集血清并进行检验。

在有4只SPF猪的小组中亦制备出了抗低毒力CSFV病毒株的血清。用病毒株Henken，Zoelen，Bergen，331感染的猪，在感染后第0，21，28和42天时采集血清并检验。用Cedipest接种的猪，在接种后第0，44，72和170天时采集血清进行检验。

用上述血清进行了三种不同的血清学试验。试验1是由Terpstra等人1984年(Vet Microbiol 9：113-120)所述的过氧化物酶酶联中和试验(NPLA)，用来检测抗CSFV的中和抗体。试验2是CTB-ELISA(Wensvoort et al.，1988 Vet Microbiol 17：129-140)，用来常规检测抗CSFV抗体。

CTB-DIF用到了Mab b3(亦称为CVI-HCV-39.5)(Wensvoort 1989 J.Gen Virol 70；2865-2876)，它能识别位于CSFV的E1的A1区内一个表位。ELISA板的孔均用Mab b3(1∶2000稀释)(捕获抗体)来包被。经洗板后，孔中加入偶联(HRPO)的Mab b3(1∶4000稀释)(检测抗体)。感染了能产生E1-TMR并含有浓度为20μg/ml的二聚体化E1的杆状病毒的sf21细胞培养基被稀释至1∶500，并与待检血清(1∶2.5稀释)一起预温。这种血清-抗原混合物再被加入到包被好的ELISA板小孔中的偶联物上。温育后再次洗板上小孔，然后加色原-底物溶液。如果捕获Mab和偶联Mab均结合上了抗原，HRPO就会产生显色反应，说明受检血清CSFV抗体为阴性。如果抗原上的表位被受检血清中的抗体封闭，则偶联的HRPO就会被洗去，而小孔中仍清亮，说明受检血清中含有抗CSFV A1区的抗体。三种不同的血清学检验其结果见表3。

用A区内有一缺失的E1接种的猪，其接种后第42天的血清确实在NPLA和CTB-ELISA中发生了反应，而不在CTB-DIF中反应。对同一只猪用有毒的CSFV Brescia株攻击，则接种后第56天(也就是攻击后第12天)其血清在所有3种检验中均为阳性反应，说明攻击后出现了增强反应。用病毒株Henken，Zoelen，Bergen和331接种的猪其血清从感染后第21天开始在NPLA，CTB-ELISA和CTP-DIF中均为阳性反应。用Cedipest疫苗株接种的猪从接种后第44天开始出现了同样的反应。

因此，CTB-DIF应严格按所要求的进行，并适于伴有一种带突变的E1A区的CSFV标记疫苗，致使抗这个突变的A区的抗体不与Mab b3竞争属于Mabb b3的表位。

CTB-DIF中用到的抗原是示于图5的二聚体化缺少TMR的野生型Brescia E1。不过由图5的“B+C区缺失”构建体合成的二聚体化E1亦适于作为本试验中的一种抗原。

实施例5以E1和E2为基础的用于CSFV的CTB-ELISA的比较

本实施例描述了实施例4的CTB-DIF的一种修改试验，还描述了以CSFV的E2为基础的CTB-ELISA，并比较了这些ELISA与另三种检测针对E1的抗体的CTB-ELISA及NPLA(Terpstra et al.1984.Vet.Microbiol.9：113-120)的敏感性。

实施例4的CTB-DIF，在表4至8中被称为E1-Bac-DIF，它用昆虫细胞(SF21细胞)中合成的完整的无TMR的E1作为抗原。修改后的E1-Bac-DIF，称为E1-Bac-dBC-DIF，用的是昆虫细胞(SF21细胞)中合成的缺失B+C区(对照图5)的无TMR的E1作抗原。正如Western blot上所确立的，带有B+C区缺失的无TMR的E1是从细胞中以二聚体形式分泌出的(结果未显示)。E1-bac-dBC-DIF试验如下进行：37℃下，ELISA板的小孔用Mab b3(1∶4000稀释)(捕获抗体)包被16小时，然后洗涤。含20μg/ml二聚体化抗原E1-dBC的培养基按1∶50稀释，再与受检血清(1∶2.5稀释)一起预温(37℃0.5小时)。该血清抗原复合物然后被加入到经包被的E LISA板上。37℃温育1小进后，各孔经洗涤，再加入偶联了HRPO(1∶1000稀释)的Mab b3(检测抗体)。37℃温育1小时，各孔再洗涤，然后加色原--底物溶液。室温下显色反应10分钟。对显色反应的解释与实施例4中的一样。

表4至表8中所述的其他检测针对CSFV E1的抗体的CTB-ELISA分别是E1-CSFV ELISA，它用来自CSFV感染的细胞的天然E1作为抗原(Wensvoort et al.1988.Vet.Mic robiol，17：129-140)；E1-Bac和E1-Bac-DIF ELISA，用昆虫细胞中合成的无TMR的E1作为抗原；E1-CSFV和E1-Bac ELISA，用CSFV Mab b3和b8(Wensvoort 1989.J.Gen.Viol.70：2865-2876)分别作为捕获及检测用抗体；而E1-Bac-DIF ELISA只用Mab b3，既作为捕获抗体又作为检测抗体；E1-CSFV ELISA严格按Wensvoort等人1988年所述执行(Vet.Microbiol.17：129-140)。E1-Bac及E1-Bac-DIF ELISA则按上述E1-Bac-dBC-DIF的程序作如下修改后进行，在E1-Bac ELISA中所用的抗原是1∶400稀释了的存在于SF21细胞培养基中的二聚体化E1，浓度为20μg/ml，而该SF21细胞是被相应的E1杆状病毒构建体(比较图5)感染了的细胞。在此ELISA中，偶联HRPO的Mab b8是检测抗体，用的是1∶1000的稀释度。E1-Bac-DIF ELISA用与E1-BacELISA一样的抗原，但稀释度为1∶200。该ELISA用HRPO偶联的Mab b3作为检测抗体，稀释度1∶1000。

E2-Bac ELISA使用SF21细胞中合成的CSFV E2抗原，此SF21细胞已被Bac CE2构建体(Hulst et al.，1994.Virology 200：558-565)感染。由于E2并不从受感染的昆虫细胞中分泌出来，故用的是这些细胞的裂解物。与E1相似，我们发现当在SDS-PAGE凝胶中以非变性条件分析感染细胞的裂解物时，大多数E2是二聚体化的(结果未显示)。以此E2抗原为基础开发的CTB-ELISA最好是联合应用Mab c5和c12(Wensvoo G.1989，In Thesis，pp99-113，Utrecht)来进行。但也可以用只与Mabc 5或只与Mab c12联合的E2。在竞争试验中Mab c5和Mabc12在结合E2这一点上相互抑制，这说明这些Mabs识别E2上的相同或重叠的表位(结果未显示)。E2-Bac ELISA按下述执行：Mabc12稀释成1∶1000并包被在ELISA板的孔中(37℃16小时)，然后洗板，被Bac CE2感染的SF21细胞的裂解物(1∶1250稀释)与受检血清(1∶1)一起在37℃预温半小时，该血清抗原复合物然后被加入包被板的孔中，37℃温育1小时，随后洗板，再与偶联HRPO的Mab c5(1∶2000稀释)一起温育。37℃1小时后再次洗板，再加入色原-底物溶液。显色反应室温下进行10分钟。对显色反应的解释与实施例4中的一样。所有上述稀释均在NPLA缓冲液+4％PS(Terpstra et al，Vet.Miorobiol.9：113-120)中进行。

表4中显示了3只用Cedipest疫苗接种的SPF猪的血清用上述各种CTB-ELISAS及NPLA分析所得的结果。血清是在接种后第0，16，23，30，37，44，50，72，113，141和170天收集后分析的。表5至表8显示了分别用低毒力CSFV病毒株331，Bergen，Henken和Zoelen感染的各含5只SPF猪的组中其血清经上述各种CTB-ELISA和NPLA分析的结果。血清是在感染后第0，10，14，17，24，28，35和42天时收集来分析的。从经Cedipest株接种的猪采集的血清从接种后第16天开始既在5种CTB-ELISA中反应又在NPLA中反应。在这个时间点上E2-Bac ELISA和E1-Bac-dBC-DIF的灵敏性比其他3种CTB-ELISAS的若不是更高，也是一样高。从接种后第37天直至第170天，所有血清在5种CTB-ELISA中和在NPLA中均有一致的反应(阳性)。被低毒力CSFV病毒株感染的猪的血清也在5种CTB-ELISA及在NPLA中有反应。从感染后第21天直至第42天，在5种CTB-ELISA和在NPLA中观察到的血清反应均一致，只有偶尔例外。需要对更多的低毒力病毒株感染动物的血清进行分析，看它们能否总结出在感染后的早期(直至第17天)，5种CTB-ELISA的灵敏性之间是否存在显著性差异。

我们可以得出结论：E2-Bac ELISA和E1-Bac-CTB-DIFELISA均按所希望的进行。因此E2-Bac ELISA适合于伴随一种CSFV标记疫苗(如突变的或非突变的E1亚单位，在E2区内修饰了的C株标记疫苗)，该疫苗不会诱导与本ELISA中的Mabs竞争的抗体。E1-Bac-dBC-DIF ELISA也象E1-Bac-DIF ELISA(实施例4中的CTB-DIF ELISA)一样适于伴随一种带有E1的突变的A区的CSFV标记疫苗，从而使针对该突变的A区的抗体不会与Mab b3竞争Mab b3的表位。

附图描述

图1

用于测定C株的核苷酸序列的cDNA克隆的图示。图1A表示第一轮cDNA克隆(见正文)。编号32，90和96的cDNA克隆被用于将pPRKflc-113(见图3)的唯一的第一轮cDNA克隆。图1B表示第二轮的cDNA克隆(见正文)。编了号的第二轮克隆被用来构建pPRKflc-113(见SEQ ID No.1)。与C株基因组的核苷酸序列有关的cDNA位置均在图底部用比例尺线(千碱基对，Kb)表示。有关当前鉴定的CSFV基因，及它们在CSFV基因组中的组织形式的图示表示在图的顶部。

在本领域的工作人员中有关瘟病毒蛋白的命名尚未统一。本文所述的E 2蛋白亦被称为9p42(Tamura et al.1993，病毒学，193：1-10)，gp44/48(Thielet al.，1991.病毒学杂志65：4705-4712)或E0(Rumenapf et al.1993.病毒学杂志67：3288-3294).E3蛋白亦被称为gp25(Ta mur a et al.1993，病毒学，193：1-10)gp33(Thiel et al.，1991.病毒学杂志65：4705-4712)，或E1(Rumenapf et al.1993.病毒学杂志67：3288-3294)。本发明的E1蛋白亦被称为gp53(Tamura et al.，1993，病毒学193：1-10)，gp55(Thiel et al，1991，病毒学杂志65：4705-4712)，gp51-54(Moormann et al.，1990，病毒学177：184-198)和E2(Rumenapf et al.1993.病毒学杂志67：3288-3294)。CSFV的N末端自身蛋白酶N^pro(BVDV的p20，Wiskevchen et al.1991.病毒学杂志64：4508-4514)亦被称为p23，它由Thiel et al在1981年(病毒学杂志65：4705-4712)所鉴定。对该蛋白酶中的在各瘟病毒之是保守的识别序列的切割导致产生C(株)的N末端(Stark et al，1993.J.Virol.67：7088-7095)。

图2

CSFV的病毒株Brescia，Alfort和C的5′(A)和3′(B)非编码区核苷酸序列的对比。除了最初12个核苷酸外，Brescia株的5′非编码序列已由Moormann et al，1990.Virology 177：184-198描述。在此之前，Brescia株的5′非编码区的最初12个核苷酸未见有人报道。象C株基因组的最终5′和3′序列一样，它们也用本专利申请的实施例1中所述的3′-5′RNA连接法来确定。Alfort株5′非编码序列除了开始9个核苷酸外，已由Meyers et al 1989Virology 171：555-567描述。Alfort株基因组的开始9个核苷酸由Meyers在题为“Virus der Klassisc hen Schweinepest：Genomanalyse und Verglei chmit dem Virus der Bovinan Vira len Diarrhoe”1990.Tubingen.Germany的论文中公布。B resc ia株及Alfort株的3′非编码区序列分别由Moorman et al.1990，virology 177：184-198和Meyers等，1989，Virology 171：155-567描述。大ORF的起始密码子ATG和终止密码子TGA(参照SEQ ID No.1)均被下划线示出。

图3

全长cDNA克隆pPRKflc-113的构建图示。在图1的说明中已解释了克隆的编号。克隆插入片段的融合位点用垂直线表示，相应于这些线的位点在图的底部示出。pOK12。下划线的克隆数字表示具有pOK12Vieira and Messing.1991.Gene 100：189-194)衍生的载体序列(见图4)的cDNA克隆。pPRKflc-113的5’和3’末端通过对cDNA片段的PCR扩增而特制成。(见实施例2)。扩增的片段均用PCR来表明。图底部的比例尺寸，及对CSFV的基因组成方式的图示，均被描述在图1的说明中。

图4

克隆pPRKflc-113，pPRKflc-133和pPRKflc-h6的载体序列和全长cDNA插入序列的图示。对载体pPRK，一种pPOK12的衍生物(Vieira and Messing，1991，Gene，100：189-194)的构建已在实施例2中描述。Kan^R，卡那霉素抗性基因；ORi复制起始点；′i，编码β-半乳糖苷酶基因的阻遏物的基因；PO，β-半乳糖苷酶基因的启动子/操纵子区；LacZ，能编码β-半乳糖苷酶的α亚单位的β-半乳糖苷酶基因。对载体中的几个限制性位点，以及载体中直接位于全长插入序列侧面的序列，均已指明。相应位点已描述在实施例2中。pPRKflc-113中的棒和数字对应于五个密码子的核苷酸。这五个密码子在此构建体中被更换，从而产生pPRKflc-113。后一个构建体具有如SEQ ID NO.1中所指示的序列。pPRKflc-h6中的黑盒子表明pPRKflc-133的E1区，它被Brescia株的对应区交换。衍生自特定的全长构建体的转录本是有感染性还是无感染性，这一点在构建体右侧作了说明。T7，T7启动子序列，全长构建体的插入序列均参照比例尺(千碱基对为单位)作了说明，它们代表示于SEQ ID No.1中的C株核苷酸序列。

图5

在带一个杆状病毒载体的昆虫细胞中表达的E1蛋白突变体的图示。所有E1蛋白均由Brescia株的核苷酸序列编码(Moormann etal.，1990 Virology 177：184-198)，而且在该序列的大ORF中668位密码子的赖氨酸上开始它们的N末端。天然E1的C末端是位于大ORF的1063位密码子的亮氨酸，而另三种E1的C末端均位于1031位氨基酸上。带点的框代表从668至689位氨基酸残基的N-末端信号序列，从806至826位氨基酸残基的内部疏水序列，及位于E1区内从1032至1063位氨基酸残基的C末端跨膜区(TMR)。带有缺失的B+C或A区的E1突变体中所缺失的氨基酸序列用代表这些蛋白的杆的中断来说明。与E1氨基酸序列有关的这些缺失的定位可从图底部的比较尺上确定。该比例尺说明了E1在由Brescia株的大ORF编码的氨基酸序列中的定位。

表1对重组C株病毒的鉴定

表3CSFV的区分诊断ELISA试验

Serum	DPV or DPI<sup>a</sup>	NPLA<sup>b</sup>	CTB-ELISA<sup>c</sup>	CTB-DIF<sup>d</sup>
Serum	DPV or DPI<sup>a</sup>	NPLA<sup>b</sup>	CTB-ELISA<sup>c</sup>	CTB-DIF<sup>d</sup>	766	28	＜25	9	27
768	28	＜25	0	27	766	28	＜25	9	27
768	28	＜25	0	27	769	28	＜25	17	0
770	28	＜25	11	0	769	28	＜25	17	0
770	28	＜25	11	0	766	42	3200	61	0
768	42	2400	52	0	766	42	3200	61	0
768	42	2400	52	0	769	42	2400	99	26
770	42	400	65	0	769	42	2400	99	26
770	42	400	65	0	766	56	＞3200	99	65
768	56	＞3200	100	104	766	56	＞3200	99	65
768	56	＞3200	100	104	769	56	＞3200	101	105
770	56	＞3200	101	104	769	56	＞3200	101	105
770	56	＞3200	101	104	Henken	0	＜12.5	5	18
Henken	21	50	76	47	Henken	0	＜12.5	5	18
Henken	21	50	76	47	Henken	28	75	92	88
Henken	42	300	100	102	Henken	28	75	92	88
Henken	42	300	100	102	Zoelen	0	＜12.5	0	0
Zoelen	17	37.5	85	71	Zoelen	0	＜12.5	0	0
Zoelen	17	37.5	85	71	Zoelen	21	150	90	80
Zoelen	42	400	100	108	Zoelen	21	150	90	80
Zoelen	42	400	100	108	Bergen	0	＜12.5	1	49
Bergen	21	25	96	100	Bergen	0	＜12.5	1	49
Bergen	21	25	96	100	Bergen	28	100	99	95
Bergen	42	300	100	103	Bergen	28	100	99	95
Bergen	42	300	100	103	331	0	18.75	4	15
331	21	100	92	90	331	0	18.75	4	15
331	21	100	92	90	331	28	300	99	99
331	42	300	100	105	331	28	300	99	99
331	42	300	100	105	Cedipest	0	＜12.5	0	19
Cedipest	44	75	85	93	Cedipest	0	＜12.5	0	19
Cedipest	44	75	85	93	Cedipest	72	50	89	102
Cedipest	170	150	98	106	Cedipest	72	50	89	102

^a)DPV：接种后的天数，DPI：感染后的天数

^b)NPLA滴度以在50％的影印培养物中中和100TCID50的HCV Brescia株的相应血清稀释度的倒数表示(Terpstra等人，1984，Vet.Microbiol.9：113-120)。

^c)复合物捕获封闭ELISA即CTB-ELISA，或区分CTB-ELISA即CTB-DIF。试验结果表示为对标准信号的抑制百分率：抑制＜30％为阴性，抑制30-50％为可疑，抑制＞50％为阳性。

表4用CSFV Cedipest株免疫的血清所做的各种CTB-ELISA试验的比较

a，b：有关解释请分别参见表3的脚注a和脚注b。

c：CTB-ELISA的E1CSFV，E1-Bac，E1-Bac-DIF，E1-Bac-dBC-DIF和E2-Bac均解释在实施例5中。试验结果均表示为标准信号的抑制百分率：抑制＜30％为阴性，抑制30-50％为可疑，抑制＞50％为阳性。

表5用CSFV 331株免疫的血清所做的各种CTB-ELISA试验的比较

a，b，c：见表4的脚注

表6用CSFV Bergen株免疫的血清所做的各种CTB-ELISA试验的比较

a，b，c：见表4的脚注

表7用CSFV Henken株免疫的血清所做的各种CTB-ELISA试验的比较

a，b，c：见表4的脚注

表8用CSFV Zoelen株免疫的血清所做的各种CTB-ELISA试验的比较

a，b，c：见表4的脚注

序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：

(A)名称：动物保健研究所

(B)邮政信箱：365

(C)城市：莱利斯塔德

(E)国家：荷兰

(F)邮政编码：8200 AJ

(G)电话：31-3200-76611

(ii)发明名称：瘟病毒株的核苷酸序列，由这些序列编码的多肽及其在诊断和预防瘟病毒感染中的应用

(iii)序列数：3

(v)本申请数据：

(A)申请号：94201743.5

(2)SEQ ID No：1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：12311碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴：线性

(ii)分子型：cDNA

(v)片段类型：完整序列

(vi)原始来源：

(A)生物体：典型猪瘟病毒C株

(ix)特征：

(A)关键：独有序列TTTTCTTTTTTTT

(B)位置：12128-12140碱基

(ix)特征：

(A)关键：插入位点

(B)位置：883-884碱基(170-171氨基酸)

(ix)特征：

(A)关键：插入位点

(B)位置：2443-2444碱基(690-691氨基酸)

(ix)特征：

(A)关键：插入位点

(B)位置：2446-2447碱基(691-692氨基酸)

(xi)序列描述：SEQ ID No.1

GTATACGAGG TTAGTTCATT CTCGTATACA CGATTGGACA AATCAAAATT ATAATTTGGT 60

TCAGGGCCTC CCTCCAGCGA CGGCCGAACT GGGCTAGCCA TGCCCATAGT AGGACTAGCA 120

AAACGGAGGG ACTAGCCATA GTGGCGAGCT CCCTGGGTGG TCTAAGTCCT GAGTACAGGA 180

CAGTCGTCAG TAGTTCGACG TGAGCAGAAG CCCACCTCGA GATGCTACGT GGACGAGGGC 240

ATGCCAAGAC ACACCTTAAC CCTAGCGGGG GTCGCTAGGG TGAAATCACA CCACGTGATG 300

GGAGTACGAC CTGATAGGGC GCTGCAGAGG CCCACTATTA GGCTAGTATA AAAATCTCTG 360

CTGTACATGG CAC 373

ATG GAG TTG AAT CAC TTT GAA CTT TTA TAC AAA ACA AAC AAA CAA AAA 421

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Asn Lys Gln Lys

1 5 10 15

CCA ATG GGA GTG GAG GAA CCG GTG TAC GAT GCC ACG GGG AGA CCG TTG 469

Pro Met Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Ala Thr Gly Arg Pro Leu

20 25 30

TTC GGA GAC CCG AGT GAG GTA CAC CCA CAA TCA ACA CTG AAG CTA CCA 517

Phe Gly Asp Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro

35 40 45

CAT GAT AGG GGT AGA GGC AAC ATT AAA ACA ACA CTG AAG AAC CTA CCT 565

His Asp Arg Gly Arg Gly Asn Ile Lys Thr Thr Leu Lys Asn Leu Pro

50 55 60

AGG AAA GGC GAC TGC AGG AGC GGC AAC CAT CTA GGC CCG GTC AGT GGG 613

Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly

65 70 75 80

ATA TAT GTA AAA CCC GGC CCT GTC TTT TAC CAG GAC TAC ATG GGC CCG 661

Ile Tyr Val Lys Pro Gly Pro Val Phe Tyr Gln Asp Tyr Met Gly Pro

85 90 95

GTC TAC CAT AGA GCC CCT CTG GAG TTT TTT GAC GAA GTG CAG TTC TGC 709

Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Val Gln Phe Cys

100 105 110

GAG GTG ACC AAA AGG ATA GGT AGG GTG ACA GGT AGC GAC GGA AAG CTT 757

Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu

115 120 125

TAC CAT ACA TAT GTG TGC ATC GAT GGC TGC ATA CTG CTG AAG CTG GCC 805

Tyr His Thr Tyr Val Cys Ile Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala

130 135 140

AAG AGG GGT GAG CCA AGA ACC CTG AAG TGG ATT AGA AAT TTC ACC GAC 853

Lys Arg Gly Glu Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asp

145 150 155 160

TGT CCA TTG TGG GTT ACC AGT TGC TCC GAT GAT GGC GCA AGT GGG AGT 901

Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser

165 170 175

AAA GAG AAG AAG CCA GAT AGG ATC AAC AAA GGC AAA TTA AAA ATA GCC 949

Lys Glu Lys Lys Pro Asp Arg Ile Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala

180 185 190

CCA AAA GAG CAT GAG AAG GAC AGC AGA ACT AGG CCA CCT GAC GCT ACG 997

Pro Lys Glu His Glu Lys Asp Ser Arg Thr Arg Pro Pro Asp Ala Thr

195 200 205

ATC GTG GTG GAA GGA GTA AAA TAC CAG GTC AAA AAG AAA GGT AAA GTT 1045

Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gln Val Lys Lys Lys Gly Lys Val

210 215 220

AAA GGA AAG AAT ACC CAA GAC GGC CTG TAC CAC AAC AAG AAT AAA CCA 1093

Lys Gly Lys Asn Thr Gln Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro

225 230 235 240

CCA GAA TCT AGG AAG AAA CTA GAA AAA GCC CTA TTG GCA TGG GCG GTG 1141

Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val

245 250 255

ATA GCA ATT ATG TTG TAC CAA CCA GTT GAA GCC GAA AAT ATA ACT CAA 1189

Ile Ala Ile Met Leu Tyr Gln Pro Val Glu Ala Glu Asn Ile Thr Gln

260 265 270

TGG AAC CTG AGT GAC AAC GGC ACT AAT GGT ATC CAG CAT GCT ATG TAC 1237

Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gln His Ala Met Tyr

275 280 285

CTT AGA GGG GTT AAC AGA AGC TTG CAT GGG ATC TGG CCG GGG GAA ATA 1285

Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Gly Glu Ile

290 295 300

TGC AAA GGA GTC CCA ACC CAC CTG GCC ACA GAC GTG GAG CTG AAA GAA 1333

Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Val Glu Leu Lys Glu

305 310 315 320

ATA CAG GGA ATG ATG GAT GCC AGC GAG GGG ACA AAC TAT ACG TGC TGT 1381

Ile Gln Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Gly Thr Asn Tyr Thr Cys Cys

325 330 335

AAG TTA CAG AGA CAT GAA TGG AAC AAA CAT GGA TGG TGT AAC TGG CAC 1429

Lys Leu Gln Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp His

340 345 350

AAT ATA GAC CCC TGG ATA CAG CTG ATG AAT AGA ACC CAA GCA GAC TTG 1477

Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gln Leu Met Asn Arg Thr Gln Ala Asp Leu

355 360 365

GCA GAA GGC CCT CCG GTC AAG GAG TGC GCT GTG ACT TGC AGG TAC GAT 1525

Ala Glu Gly Pro Pro Val Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp

370 375 380

AAA GAT GCT GAC ATC AAC GTG GTT ACC CAG GCT AGA AAC AGG CCA ACA 1573

Lys Asp Ala Asp Ile Asn Val Val Thr Gln Ala Arg Asn Arg Pro Thr

385 390 395 400

ACC CTG ACC GGC TGC AAG AAA GGG AAA AAT TTT TCT TTT GCG GGT ACA 1621

Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr

405 410 415

GTT ATA GAG AGC CCA TGT AAT TTC AAT GTT TCC GTG GAG GAT ACC TTG 1669

Val Ile Glu Ser Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Thr Leu

420 425 430

TAT GGG GAT CAT GAG TGC GGC AGT TTG CTC CAG GAC GCA GCT CTG TAC 1717

Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gln Asp Ala Ala Leu Tyr

435 440 445

CTA GTA GAT GGA ATG ACC AAC ACT ATA GAG AAT GCC AGA CAG GGA GCA 1765

Leu Val Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gln Gly Ala

450 455 460

GCG AGG GTG ACA TCC TGG CTC GGG AGG CAA CTC AGA ACT GCT GGG AAG 1813

Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gln Leu Arg Thr Ala Gly Lys

465 470 475 480

AGG TTG GAG GGT AGA AGC AAA ACC TGG TTT GGC GCT TAT GCC CTA TCG 1861

Arg Leu Glu Gly Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu Ser

485 490 495

CCT TAC TGT AAT GTA ACA AGC AAA ATA GGG TAC ATA TGG TAC ACT AAC 1909

Pro Tyr Cys Asn Val Thr Ser Lys Ile Gly Tyr Ile Trp Tyr Thr Asn

500 505 510

AAC TGC ACC CCA GCT TGC CTC CCC AAA AAC ACA AAG ATA ATA GGC CCT 1957

Asn Cys Thr Pro Ala Cys Leu Pro Lys Asn Thr Lys Ile Ile Gly Pro

515 520 525

GGT AAA TTT GAC ACT AAT GCA GAA GAC GGA AAG ATT CTC CAT GAG ATG 2005

Gly Lys Phe Asp Thr Asn Ala Glu Asp Gly Lys Ile Leu His Glu Met

530 535 540

GGG GGC CAC CTA TCA GAA TTT CTG CTG CTT TCT CTG GTT GTT CTG TCT 2053

Gly Gly His Leu Ssr Glu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Val Val Leu Ser

545 550 555 560

GAC TTC GCC CCT GAA ACA GCC AGC GCG TTA TAC CTC ATT TTG CAC TAC 2101

Asp Phe Ala Pro Glu Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Leu Ile Leu His Tyr

565 570 575

GTG ATT CCT CAA CCC CAT GAT GAA CCT GAA GGC TGC GAT ACG AAC CAG 2149

Val Ile Pro Gln Pro His Asp Glu Pro Glu Gly Cys Asp Thr Asn Gln

580 585 590

CTG AAT CTA ACA GTA GAA CTC AGG ACT GAA GAC GTA ATA CCG TCA TCA 2197

Leu Asn Leu Thr Val Glu Leu Arg Thr Glu Asp Val Ile Pro Ser Ser

595 600 605

GTC TGG AAT GTT GGT AAA TAT GTG TGT GTT AGA CCA GAC TGG TGG CCA 2245

Val Trp Asn Val Gly Lys Tyr Val Cys Val Arg Pro Asp Trp Trp Pro

610 615 620

TAT GAA ACC GAG GTG GCT CTG TTA TTT GAA GAG GTA GGA CAG GTC GTA 2293

Tyr Glu Thr Glu Val Ala Leu Leu Phe Glu Glu Val Gly Gln Val Val

625 630 635 640

AAG TTA GCC TTA CGG GCG CTG AGG GAT TTG ACT AGG GTC TGG AAT AGC 2341

Lys Leu Ala Leu Arg Ala Leu Arg Asp Leu Thr Arg Val Trp Asn Ser

645 650 655

GCA TCA ACC ATT GCA TTC CTC ATC TGC TTG ATA AAA GTA TTA AGA GGA 2389

Ala Ser Thr Ile Ala Phe Leu Ile Cys Leu Ile Lys Val Leu Arg Gly

660 665 670

CAG ATC GTG CAA GGT GTG GTA TGG CTG TTA CTA GTA ACT GGG GCA CAA 2437

Gln Ile Val Gln Gly Val Val Trp Leu Leu Leu Val Thr Gly Ala Gln

675 680 685

GGC CGG CTA GCC TGC AAG GAA GAT TAC AGG TAC GCA ATA TCG TCA ACC 2485

Gly Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr

690 695 700

GAT GAG ATA GGG CTA CTT GGG GCC GGA GGT CTC ACC ACC ACC TGG AAG 2533

Asp Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys

705 710 715 720

GAA TAC AAC CAC GAT TTG CAA CTG AAT GAC GGG ACC GTT AAG GCC AGT 2581

Glu Tyr Asn His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ser

725 730 735

TGC GTG GCA GGT TCC TTT AAA GTC ACA GCA CTT AAT GTG GTC AGT AGG 2629

Cys Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg

740 745 750

AGG TAT TTG GCA TCA TTG CAT AAG AAG GCT TTA CCC ACT TCC GTG ACA 2677

Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Lys Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr

755 760 765

TTC GAG CTC CTG TTC GAC GGG ACC AAC CCA TCA ACT GAG GAA ATG GGA 2725

Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly

770 775 780

GAT GAC TTC AGG TCC GGG CTG TGC CCG TTT GAT ACG AGT CCT GTT GTT 2773

Asp Asp Phe Arg Ser Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val

785 790 795 800

AAG GGA AAG TAC AAT ACG ACC TTG TTG AAC GGT AGT GCT TTC TAT CTT 2821

Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu

805 810 815

GTC TGC CCA ATA GGG TGG ACG GGT GTC ATA GAG TGC ACA GCA GTG AGC 2869

Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser

820 825 830

CCA ACA ACT CTG AGA ACA GAA GTG GTA AAG ACC TTC AGG AGA GAC AAG 2917

Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Asp Lys

835 840 845

CCC TTT CCG CAC AGA ATG GAT TGT GTG ACC ACC ACA GTG GAA AAT GAA 2965

Pro Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu

850 855 860

GAT TTA TTC TAT TGT AAG TTG GGG GGC AAC TGG ACA TGT GTG AAA GGC 3013

Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly

865 870 875 880

GAG CCA GTG GTC TAC ACA GGG GGG CTA GTA AAA CAA TGT AGA TGG TGT 3061

Glu Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Leu Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys

885 890 895

GGC TTC GAC TTC GAT GGG CCT GAC GGA CTC CCG CAT TAC CCC ATA GGT 3109

Gly Phe Asp Phe Asp Gly Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly

900 905 910

AAG TGC ATT TTG GCA AAT GAG ACA GGT TAC AGA ATA GTA GAT TCA ACG 3157

Lys Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val Asp Ser Thr

915 920 925

GAC TGT AAC AGA GAT GGC GTT GTA ATC AGC ACA GAG GGG AGT CAT GAG 3205

Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly Ser His Glu

930 935 940

TGC TTG ATC GGT AAC ACG ACT GTC AAG GTG CAT GCA TCA GAT GAA AGA 3253

Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser Asp Glu Arg

945 950 955 960

TTG GGC CCT ATG CCA TGC AGA CCT AAA GAG ATT GTC TCT AGT GCT GGA 3301

Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly

965 970 975

CCT GTA AAG AAA ACC TCC TGT ACA TTC AAC TAC ACA AAA ACT TTG AAG 3349

Pro Val Lys Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Lys

980 985 990

AAC AGG TAC TAT GAG CCC AGG GAC AGC TAC TTC CAG CAA TAT ATG CTT 3397

Asn Arg Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu

995 1000 1005

AAG GGT GAG TAT CAG TAC TGG TTT GAC CTG GAT GCG ACT GAC CGC CAC 3445

Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Ala Thr Asp Arg His

1010 1015 1020

TCA GAT TAC TTC GCA GAA TTT GTT GTC TTG GTG GTG GTA GCA CTG TTA 3493

Ser Asp Tyr Phe Ala Glu Phe Val Val Leu Val Val Val Ala Leu Leu

1025 1030 1035 1040

GGA GGA AGA TAT GTC CTG TGG CTG ATA GTG ACC TAC GTA GTT CTA ACA 3541

Gly Gly Arg Tyr Val Leu Trp Leu Ile Val Thr Tyr Val Val Leu Thr

1045 1050 1055

GAA CAA CTC GCC GCT GGT TTA CCA TTG GGC CAG GGT GAG GTA GTG TTG 3589

Glu Gln Leu Ala Ala Gly Leu Pro Leu Gly Gln Gly Glu Val Val Leu

1060 1065 1070

ATA GGG AAC TTA ATT ACC CAT ACA GAC ATT GAG GTC GTA GTA TAT TTT 3637

Ile Gly Asn Leu Ile Thr His Thr Asp Ile Glu Val Val Val Tyr Phe

1075 1080 1085

TTA CTA CTC TAT TTG GTC ATG AGG GAT GAA CCT ATA AAG AAA TGG ATA 3685

Leu Leu Leu Tyr Leu Val Met Arg Asp Glu Pro Ile Lys Lys Trp Ile

1090 1095 1100

CTG CTG CTG TTC CAT GCT ATG ACT AAC AAT CCA GTC AAG ACC ATA ACA 3733

Leu Leu Leu Phe His Ala Met Thr Asn Asn Pro Val Lys Thr Ile Thr

1105 1110 1115 1120

GTG GCA TTG CTC ATG GTT AGT GGA GTT GCC AAG GGT GGA AAG ATA GAT 3781

Val Ala Leu Leu Met Val Ser Gly Val Ala Lys Gly Gly Lys Ile Asp

1125 1130 1135

GGC GGT TGG CAG CGA CTG CCG GGG ACC AGC TTT GAC ATC CAA CTC GCG 3829

Gly Gly Trp Gln Arg Leu Pro Gly Thr Ser Phe Asp Ile Gln Leu Ala

1140 1145 1150

CTG ACA GTT ATA GTA GTC GCT GTG ATG TTG CTG GCA AAG AGA GAT CCG 3877

Leu Thr Val Ile Val Val Ala Val Met Leu Leu Ala Lys Arg Asp Pro

1155 1160 1165

ACT ACT GTC CCC TTG GTT ATA ACA GTG GCA CCC CTG AGG ACA GCT AAG 3925

Thr Thr Val Pro Leu Val Ile Thr Val Ala Pro Leu Arg Thr Ala Lys

1170 1175 1180

ATG ACT AAC GGA CTT AGT ACG GAT ATA GCC ATA GCC ACA GTG TCA GCA 3973

Met Thr Asn Gly Leu Ser Thr Asp Ile Ala Ile Ala Thr Val Ser Ala

1185 1190 1195 1200

GCG TTG CTA ACC TGG ACC TAC ATT AGT GAC TAT TAC AGA TAC AAG ACC 4021

Ala Leu Leu Thr Trp Thr Tyr Ile Ser Asp Tyr Tyr Arg Tyr Lys Thr

1205 1210 1215

TGG CTA CAG TAC CTT ATC AGC ACA GTG ACA GGT ATC TTT TTA ATA AGG 4069

Trp Leu Gln Tyr Leu Ile Ser Thr Val Thr Gly Ile Phe Leu Ile Arg

1220 1225 1230

GTA CTG AAG GGA ATA GGT GAG TTG GAT TTA CAC ACT CCG ACC TTG CCA 4117

Val Leu Lys Gly Ile Gly Glu Leu Asp Leu His Thr Pro Thr Leu Pro

1235 1240 1245

TCT CAT AGA CCC CTC TTT TTC ATT CTC GTG TAC CTT ATT TCC ACT GCA 4165

Ser His Arg Pro Leu Phe Phe Ile Leu Val Tyr Leu Ile Ser Thr Ala

1250 1255 1260

GTG GTA ACA AGA TGG AAT CTG GAC ATA GCC GGA TTG CTG TTG CAG TGT 4213

Val Val Thr Arg Trp Asn Leu Asp Ile Ala Gly Leu Leu Leu Gln Cys

1265 1270 1275 1280

GTC CCA ACC CTT TTG ATG GTT TTT ACG ATG TGG GCA GAC ATT CTC ACC 4261

Val Pro Thr Leu Leu Met Val Phe Thr Met Trp Ala Asp Ile Leu Thr

1285 1290 1295

CTG ATC CTC ATA CTG CCC ACT TAC GAG TTA ACG AAG CTA TAT TAT CTT 4309

Leu Ile Leu Ile Leu Pro Thr Tyr Glu Leu Thr Lys Leu Tyr Tyr Leu

1300 1305 1310

AAG GAA GTG AGG ATT GGG GCA GAA AAG GGC TGG TTA TGG AAA ACC AAC 4357

Lys Glu Val Arg Ile Gly Ala Glu Lys Gly Trp Leu Trp Lys Thr Asn

1315 1320 1325

TTC AAG AGG GTA AAC GAC ATA TAC GAA GTT GAC CAA GCT GGT GAA GGG 4405

Phe Lys Arg Val Asn Asp Ile Tyr Glu Val Asp Gln Ala Gly Glu Gly

1330 1335 1340

GTA TAC CTA TTC CCG TCA AAA CAA AAG ACA AGT TCA ATG ACA GGC ACC 4453

Val Tyr Leu Phe Pro Ser Lys Gln Lys Thr Ser Ser Met Thr Gly Thr

1245 1350 1355 1360

ATG TTG CCA TTG ATC AAA GCC ATA CTT ATC AGC TGC GTC AGT AAT AAG 4501

Met Leu Pro Leu Ile Lys Ala Ile Leu Ile Ser Cys Val Ser Asn Lys

1365 1370 1375

TGG CAG TTC ATA TAT CTA CTG TAC TTG ATA TTT GAA GTA TCT TAC TAC 4549

Trp Gln Phe Ile Tyr Leu Leu Tyr Leu Ile Phe Glu Val Ser Tyr Tyr

1380 1385 1390

CTC CAC AAG AAG ATC ATA GAT GAA ATA GCA GGA GGG ACC AAC TTC ATC 4597

Leu His Lys Lys Ile Ile Asp Glu Ile Ala Gly Gly Thr Asn Phe Ile

1395 1400 1405

TCA AGA CTT GTA GCC GCT TTG ATC GAA GTC AAT TGG GCC TTT GAC AAC 4645

Ser Arg Leu Val Ala Ala Leu Ile Glu Val Asn Trp Ala Phe Asp Asn

1410 1415 1420

GAA GAA GTT AGG GGT TTG AAG AAG TTC TTC CTG TTG TCT AGT AGG GTT 4693

Glu Glu Val Arg Gly Leu Lys Lys Phe Phe Leu Leu Ser Ser Arg Val

142 1430 1435 1440

AAA GAA CTG ATC ATC AAA CAC AAA GTG AGG AAT GAA GTA ATG GTC CGC 4741

Lys Glu Leu Ile Ile Lys His Lys Val Arg Asn Glu Val Met Val Arg

1445 1450 1455

TGG TTT GGT GAC GAA GAG GTC TAT GGG ATG CCG AAG TTG GTT GGC CTA 4789

Trp Phe Gly Asp Glu Glu Val Tyr Gly Met Pro Lys Leu Val Gly Leu

1460 1465 1470

GTC AAG GCA GCA ACA TTG AGT AAA AAT AAA CAT TGT ATT TTG TGC ACC 4837

Val Lys Ala Ala Thr Leu Ser Lys Asn Lys His Cys Ile Leu Cys Thr

1475 1480 1485

GTC TGT GAA GAC AGA GAG TGG AGA GGA GAA ACC TGC CCA AAA TGC GGG 4885

Val Cys Glu Asp Arg Glu Trp Arg Gly Glu Thr Cys Pro Lys Cys Gly

1490 1495 1500

CGT TTT GGG CCA CCA ATG ACC TGT CGC ATG ACC CTA GCC GAC TTT GAA 4933

Arg Phe Gly Pro Pro Met Thr Cys Gly Met Thr Leu Ala Asp Phe Glu

1505 1510 1515 1520

GAG AAA CAC TAT AAG AGG ATC TTT TTT AGA GAG GAT CAA TCA GAA GGG 4981

Glu Lys His Tyr Lys Arg Ile Phe Phe Arg Glu Asp Gln Ser Glu Gly

1525 1530 1535

CCG GTT AGG GAG GAG TAC GCA GGG TAT CTG CAA TAT AGA GCC AGA GGG 5029

Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Gly Tyr Leu Gln Tyr Arg Ala Arg Gly

1540 1545 1550

CAA TTG TTC CTG AGG AAT CTC CCA GTG CTA GCA ACA AAA GTC AAG ATG 5077

Gln Leu Phe Leu Arg Asn Leu Pro Val Leu Ala Thr Lys Val Lys Met

1555 1560 1565

CTC CTG GTC GGC AAT CTT GGG ACG GAG GTG GGA GAT TTG GAA CAC CTT 5125

Leu Leu Val Gly Asn Leu Gly Thr Glu Val Gly Asp Leu Glu His Leu

1570 1575 1580

GGC TGG GTG CTT AGA GGG CCT GCC GTT TGC AAG AAG GTC ACT GAA CAT 5173

Gly Trp Val Leu Arg Gly Pro Ala Val Cys Lys Lys Val Thr Glu His

1585 1590 1595 1600

GAG AAA TGT ACC ACA TCC ATG ATG GAC AAA TTG ACT GCT TTT TTC GGT 5221

Glu Lys Cys Thr Thr Ser Met Met Asp Lys Leu Thr Ala Phe Phe Gly

1605 1610 1615

GTT ATG CCG AGG GGC ACC ACA CCT AGA GCC CCT GTG AGA TTC CCT ACC 5269

Val Met Pro Arg Gly Thr Thr Pro Arg Ala Pro Val Arg Phe Pro Thr

1620 1625 1630

TCT CTC TTA AAG ATA AGA AGG GGT TTG GAA ACT GGC TGG GCG TAC ACA 5317

Ser Leu Leu Lys Ile Arg Arg Gly Leu Glu Thr Gly Trp Ala Tyr Thr

1635 1640 1645

CAC CAA GGT GGC ATC AGT TCA GTG GAC CAT GTC ACT TGT GGA AAA GAC 5365

His Gln Gly Gly Ile Ser Ser Val Asp His Val Thr Cys Gly Lys Asp

1650 1655 1660

TTA CTG GTA TGT GAC ACT ATG GGC CGG ACA AGG GTT GTT TGC CAG TCA 5413

Leu Leu Val Cys Asp Thr Met Gly Arg Thr Arg Val Val Cys Gln Ser

1665 1670 1675 1680

AAT AAT AAG ATG ACA GAT GAG TCC GAG TAT GGA GTT AAA ACT GAC TCC 5461

Asn Asn Lys Met Thr Asp Glu Ser Glu Tyr Gly Val Lys Thr Asp Ser

1685 1690 1695

GGA TGC CCG GAA GGA GCT AGG TGT TAT GTG TTT AAC CCA GAG GCG GTT 5509

Gly Cys Pro Glu Gly Ala Arg Cys Tyr Val Phe Asn Pro Glu Ala Val

1700 1705 1710

AAC ATA TCA GGG ACT AAA GGA GCC ATG GTC CAC TTA CAA AAA ACT GGA 5557

Asn Ile Ser Gly Thr Lys Gly Ala Met Val His Leu Gln Lys Thr Gly

1715 1720 1725

GGA GAA TTC ACC TGT GTG ACA GCA TCA GGA ACT CCG GCT TTC TTT GAT 5605

Gly Glu Phe Thr Cys Val Thr Ala Ser Gly Thr Pro Ala Phe Phe Asp

1730 1735 1740

CTT AAA AAC CTT AAA GGC TGG TCA GGG CTA CCG ATA TTT GAG GCA TCA 5653

Leu Lys Asn Leu Lys Gly Trp Ser Gly Leu Pro Ile Phe Glu Ala Ser

1745 1750 1755 1760

AGT GGA AGG GTA GTC GGC AGG GTC AAG GTC GGT AAG AAT GAG GAC TCT 5701

Ser Gly Arg Val Val Gly Arg Val Lys Val Gly Lys Asn Glu Asp Ser

1765 1770 1775

AAA CCA ACC AAG CTT ATG AGT GGA ATA CAA ACA GTT TCC AAA AGT ACC 5749

Lys Pro Thr Lys Leu Met Ser Gly Ile Gln Thr Val Ser Lys Ser Thr

1780 1785 1790

ACA GAC TTG ACA GAA ATG GTA AAG AAA ATA ACT ACC ATG AGC AGG GGA 5797

Thr Asp Leu Thr Glu Met Val Lys Lys Ile Thr Thr Met Ser Arg Gly

1795 1800 1805

GAA TTC AGA CAA ATA ACC CTT GCT ACA GGT GCC GGA AAA ACC ACG GAA 5845

Glu Phe Arg Gln Ile Thr Leu Ala Thr Gly Ala Gly Lys Thr Thr Glu

1810 1815 1820

CTC CCT AGG TCA GTC ATA GAA GAG ATA GGG AGG CAT AAG AGA GTC TTG 5893

Leu Pro Arg Ser Val Ile Glu Glu Ile Gly Arg His Lys Arg Val Leu

1825 1830 1835 1840

GTC TTG ATT CCT CTG AGG GCG GCA GCA GAG TCA GTA TAC CAA TAT ATG 5941

Val Leu Ile Pro Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ser Val Tyr Gln Tyr Met

1845 1850 1855

AGA CAA AAA CAT CCA AGC ATC GCA TTT AAC CTG AGG ATA GGG GAG ATG 5989

Arg Gln Lys His Pro Ser Ile Ala Phe Asn Leu Arg Ile Gly Glu Met

1860 1865 1870

AAG GAA GGG GAC ATG GCC ACA GGG ATA ACT TAT GCT TCA TAC GGT TAC 6037

Lys Glu Gly Asp Met Ala Thr Gly Ile Thr Tyr Ala Ser Tyr Gly Tyr

1875 1880 1885

TTC TGT CAG ATG CCA CAA CCT AAG TTG CGA GCC GCA ATG GTT GAG TAC 6085

Phe Cys Gln Met Pro Gln Pro Lys Leu Arg Ala Ala Met Val Glu Tyr

1890 1895 1900

TCC TTC ATA TTT CTT GAT GAG TAC CAC TGT GCC ACC CCT GAA CAA TTG 6133

Ser Phe Ile Phe Leu Asp Glu Tyr His Cys Ala Thr Pro Glu Gln Leu

1905 1910 1915 1920

GCT ATC ATG GGA AAG ATT CAC AGA TTT TCA GAG AAC CTG CGG GTG GTG 6181

Ala Ile Met Gly Lys Ile His Arg Phe Ser Glu Asn Leu Arg Val Val

1925 1930 1935

GCC ATG ACC GCA ACA CCA GTA GGC ACG GTA ACG ACC ACA GGG CAG AAA 6229

Ala Met Thr Ala Thr Pro Val Gly Thr Val Thr Thr Thr Gly Gln Lys

1940 1945 1950

CAC CCT ATA GAA GAA TTC ATA GCC CCA GAT GTG ATG AAA GGG AAA GAC 6277

His Pro Ile Glu Glu Phe Ile Ala Pro Asp Val Met Lys Gly Lys Asp

1955 1960 1965

TTA GGT TCA GAG TAC TTG GAC ATT GCT GGA TTA AAG ATA CCA GTA GAG 6325

Leu Gly Ser Glu Tyr Leu Asp Ile Ala Gly Leu Lys Ile Pro Val Glu

1970 1975 1980

GAG ATG AAG AGC AAT ATG CTG GTT TTT GTG CCC ACC AGG AAC ATG GCA 6373

Glu Met Lys Ser Asn Met Leu Val Phe Val Pro Thr Arg Asn Met Ala

1985 1990 1995 2000

GTG GAG ACA GCA AAG AAA TTG AAA GCT AAG GGT TAT AAC TCA GGC TAC 6421

Val Glu Thr Ala Lys Lys Leu Lys Ala Lys Gly Tyr Asn Ser Gly Tyr

2005 2010 2015

TAT TAT AGT GGT GAG GAT CCA TCT AAC CTG AGG GTG GTA ACA TCG CAG 6469

Tyr Tyr Ser Gly Glu Asp Pro Ser Asn Leu Arg Val Val Thr Ser Gln

2020 2025 2030

TCC CCG TAC GTG GTG GTG GCA ACC AAC GCG ATA GAA TCA GGT GTT ACT 6517

Ser Pro Tyr Val Val Val Ala Thr Asn Ala Ile Glu Ser Gly Val Thr

2035 2040 2045

CTC CCG GAC TTG GAT GTG GTT GTC GAT ACA GGG CTT AAG TGT GAA AAG 6565

Leu Pro Asp Leu Asp Val Val Val Asp Thr Gly Leu Lys Cys Glu Lys

2050 2055 2060

AGA ATA CGG CTG TCA CCT AAG ATG CCC TTC ATA GTG ACG GGC CTG AAG 6613

Arg Ile Arg Leu Ser Pro Lys Met Pro Phe Ile Val Thr Gly Leu Lys

2065 2070 2075 2080

AGA ATG GCT GTC ACG ATT GGG GAA CAA GCC CAG AGA AGG GGG AGA GTT 6661

Arg Met Ala Val Thr Ile Gly Glu Gln Ala Gln Arg Arg Gly Arg Val

2085 2090 2095

GGG AGA GTA AAG CCT GGA AGA TAC TAC AGG AGT CAA GAA ACT CCC GTT 6709

Gly Arg Val Lys Pro Gly Arg Tyr Tyr Arg Ser Gln Glu Thr Pro Val

2100 2105 2110

GGT TCT AAA GAT TAC CAT TAT GAT TTA CTG CAA GCA CAG AGG TAC GGT 6757

Gly Ser Lys Asp Tyr His Tyr Asp Leu Leu Gln Ala Gln Arg Tyr Gly

2115 2120 2125

ATT GAA GAT GGG ATA AAC ATC ACC AAA TCC TTT AGA GAG ATG AAC TAT 6805

Ile Glu Asp Gly Ile Asn Ile Thr Lys Ser Phe Arg Glu Met Asn Tyr

2130 2135 2140

GAT TGG AGC CTT TAT GAG GAG GAC AGT CTG ATG ATT ACA CAA TTG GAA 6853

Asp Trp Ser Leu Tyr Glu Glu Asp Ser Leu Met Ile Thr Gln Leu Glu

2145 2150 2155 2160

ATT CTT AAT AAT TTG TTG ATA TCA GAT GAA CTA CCA ATG GCA GTA AAA 6901

Ile Leu Asn Asn Leu Leu Ile Ser Asp Glu Leu Pro Met Ala Val Lys

2165 2170 2175

AAT ATA ATG GCC AGG ACT GAC CAC CCA GAA CCA ATT CAG CTG GCG TAC 6949

Asn Ile Met Ala Arg Thr Asp His Pro Glu Pro Ile Gln Leu Ala Tyr

2180 2185 2190

AAC AGC TAC GAA ACA CAA GTG CCA GTG CTA TTC CCA AAA ATA AAG AAT 6997

Asn Ser Tyr Glu Thr Gln Val Pro Val Leu Phe Pro Lys Ile Lys Asn

2195 2200 2205

GGA GAG GTG ACT GAC AGT TAC GAT AAC TAT ACC TTC CTC AAC GCA AGA 7045

Gly Glu Val Thr Asp Ser Tyr Asp Asn Tyr Thr Phe Leu Asn Ala Arg

2210 2215 2220

AAA TTA GGG GAT GAT GTA CCC CCT TAC GTG TAT GCC ACA GAG GAT GAG 7093

Lys Leu Gly Asp Asp Val pro Pro Tyr Val Tyr Ala Thr Glu Asp Glu

2225 2230 2235 2240

GAC TTA GCG GTA GAG CTG CTG GGC TTA GAC TGG CCG GAC CCT GGA AAC 7141

Asp Leu Ala Val Glu Leu Leu Gly Leu Asp Trp Pro Asp Pro Gly Asn

2245 2250 2255

CAA GGG ACC GTA GAG ACT GGC AGA GCA CTA AAA CAG GTA GTT GGT CTA 7189

Gln Gly Thr Val Glu Thr Gly Arg Ala Leu Lys Gln Val Val Gly Leu

2260 2265 2270

TCA ACA GCT GAG AAT GCC CTG TTA GTA GCC TTA TTC GGC TAC GTA GGA 7237

Ser Thr Ala Glu Asn Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Tyr Val Gly

2275 2280 2285

TAT CAG GCG CTT TCA AAG AGG CAT ATA CCA GTA GTC ACA GAC ATA TAT 7285

Tyr Gln Ala Leu Ser Lys Arg His Ile Pro Val Val Thr Asp Ile Tyr

2290 2295 2300

TCA ATT GAA GAT CAC AGG TTG GAA GAC ACC ACA CAC CTA CAG TAC GCC 7333

Ser Ile Glu Asp His Arg Leu Glu Asp Thr Thr His Leu Gln Tyr Ala

2305 2310 2315 2320

CCA AAT GCT ATC AAG ACG GAG GGG AAG GAG ACA GAA TTG AAA GAG CTA 7381

Pro Asn Ala Ile Lys Thr Glu Gly Lys Glu Thr Glu Leu Lys Glu Leu

2325 2330 2335

GCT CAG GGG GAT GTG CAG AGA TGT GTG GAA GCC ATG ACC AAT TAT GCA 7429

Ala Gln Gly Asp Val Gln Arg Cys Val Glu Ala Met Thr Asn Tyr Ala

2340 2345 2350

AGA GAG GGT ATC CAA TTT ATG AAG TCT CAG GCA CTG AAG GTG AAG GAA 7477

Arg Glu Gly Ile Gln Phe Met Lys Ser Gln Ala Leu Lys Val Lys Glu

2355 2360 2365

ACC CCT ACT TAC AAG GAG ACA ATG GAC ACT GTG ACG GAC TAT GTA AAG 7525

Thr Pro Thr Tyr Lys Glu Thr Met Asp Thr Val Thr Asp Tyr Val Lys

2370 2375 2380

AAA TTC ATG GAG GCG CTG GCA GAC AGT AAA GAA GAC ATC ATA AAA TAT 7573

Lys Phe Met Glu Ala Leu Ala Asp Ser Lys Glu Asp Ile Ile Lys Tyr

2385 2390 2395 2400

GGG CTG TGG GGG ACG CAC ACA GCC TTA TAT AAG AGC ATC AGT GCC AGG 7621

Gly Leu Trp Gly Thr His Thr Ala Leu Tyr Lys Ser Ile Ser Ala Arg

2405 2410 2415

CTT GGG GGT GAG ACT GCG TTC GCT ACC CTG GTA GTG AAG TGG CTG GCA 7669

Leu Gly Gly Glu Thr Ala Phe Ala Thr Leu Val Val Lys Trp Leu Ala

2420 2425 2430

TTT GGG GGT GAA TCA ATA GCA GAC CAT GTC AAA CAA GCG GCC ACA GAC 7717

Phe Gly Gly Glu Ser Ile Ala Asp His Val Lys Gln Ala Ala Thr Asp

2435 2440 2445

TTG GTC GTT TAC TAT ATC ATC AAC AGA CCT CAG TTC CCA GGA GAC ACG 7765

Leu Val Val Tyr Tyr Ile Ile Asn Arg Pro Gln Phe Pro Gly Asp Thr

2450 2455 2460

GAG ACA CAA CAA GAC GGA AGG AAA TTT GTG GCC AGC CTA CTG GCC TCA 7813

Glu Thr Gln Gln Asp Gly Arg Lys Phe Val Ala Ser Leu Leu Ala Ser

2465 2470 2475 2480

GCT CTA GCT ACT TAC ACA TAC AAA AGC TGG AAT TAC AAT AAC CTG TCC 7861

Ala Leu Ala Thr Tyr Thr Tyr Lys Ser Trp Asn Tyr Asn Asn Leu Ser

2485 2490 2495

AAG ATA GTT GAA CCG GCT TTG GCC ACT CTG CCC TAT GCC GCC ACA GCT 7909

Lys Ile Val Glu Pro Ala Leu Ala Thr Leu Pro Tyr Ala Ala Thr Ala

2500 2505 2510

CTC AAA TTA TTC GCC CCC ACC CGA TTG GAG AGC GTT GTC ATA TTA AGT 7957

Leu Lys Leu Phe Ala Pro Thr Arg Leu Glu Ser Val Val Ile Leu Ser

2515 2520 2525

ACC GCA ATC TAC AAA ACC TAC CTA TCA ATC AGG CGC GGA AAA AGC GAT 8005

Thr Ala Ile Tyr Lys Thr Tyr Leu Ser Ile Arg Arg Gly Lys Ssr Asp

2530 2535 2540

GGT TTG CTA GGC ACG GCG GTT AGT GCG GCT ATG GAG ATC ATG TCA CAA 8053

Gly Leu Leu Gly Thr Gly Val Ser Ala Ala Met Glu Ile Met Ser Gln

2545 2550 2555 2560

AAT CCA GTA TCC GTG GGC ATA GCA GTC ATG CTA GGG GTA GGG GCC GTG 8101

Asn Pro Val Ser Val Gly Ile Ala Val Met Leu Gly Val Gly Ala Val

2565 2570 2575

GCA GCC CAC AAT GCA ATC GAA GCC AGT GAG CAG AAA AGA ACA CTA CTC 8149

Ala Ala His Asn Ala Ile Glu Ala Ser Glu Gln Lys Arg Thr Leu Leu

2580 2585 2590

ATG AAA GTC TTT GTA AAG AAC TTC TTG GAC CAG GCA GCC ACA GAT GAA 8197

Met Lys Val Phe Val Lys Asn Phe Leu Asp Gln Ala Ala Thr Asp Glu

2595 2600 2605

TTA GTC AAG GAG AGT CCT GAA AAA ATA ATA ATG GCT TTG TTT GAA GCA 8245

Leu Val Lys Glu Ser Pro Glu Lys Ile Ile Met Ala Leu Phe Glu Ala

2610 2615 2620

GTG CAG ACA GTC GGC AAC CCT CTT AGA CTT GTA TAC CAC CTT TAT GGA 8293

Val Gln Thr Val Gly Asn Pro Leu Arg Leu Val Tyr His Leu Tyr Gly

2625 2630 2635 2640

GTT TTT TAT AAA GGG TGG GAG GCA AAA GAG TTG GCC CAA AGG ACA GCC 8341

Val Phe Tyr Lys Gly Trp Glu Ala Lys Glu Leu Ala Gln Arg Thr Ala

2645 2650 2655

GGT AGG AAC CTT TTC ACT TTA ATC ATG TTC GAG GCT GTG GAA CTG CTG 8389

Gly Arg Asn Leu Phe Thr Leu Ile Met Phe Glu Ala Val Glu Leu Leu

2660 2665 2670

GGA GTA GAC AGT GAA GGA AAG GTC CGC CAG CTA TCA AGT AAT TAC ATA 8437

Gly Val Asp Ser Glu Gly Lys Val Arg Gln Leu Ser Ser Asn Tyr Ile

2675 2680 2685

CTA GAG CTT TTG TAT AAG TTC CGT GAC AGT ATC AAG TCT AGC GTG AGG 8485

Leu Glu Leu Leu Tyr Lys Phe Arg Asp Ser Ile Lys Ser Ser Val Arg

2690 2695 2700

GAG ATG GCA ATC AGC TGG GCC CCT GCC CCT TTC AGT TGT GAT TGG ACA 8533

Glu Met Ala Ile Ser Trp Ala Pro Ala Pro Phe Ser Cys Asp Trp Thr

2705 2710 2715 2720

CCG ACG GAT GAC AGA ATA GGG CTC CCC CAA GAC AAT TTC CAC CAA GTG 8581

Pro Thr Asp Asp Arg Ile Gly Leu Pro Gln Asp Asn Phe His Gln Val

2725 2730 2735

GAG ACG AAA TGC CCC TGT GGT TAC AAG ATG AAG GCA GTT AAG AAT TGT 8629

Glu Thr Lys Cys Pro Cys Gly Tyr Lys Met Lys Ala Val Lys Asn Cys

2740 2745 2750

GCT GGA GAA CTG AGA CTC TTG GAG GAG GAG GGT TCA TTT CTC TGC AGA 8677

Ala Gly Glu Leu Arg Leu Leu Glu Glu Glu Gly Ser Phe Leu Cys Arg

2755 2760 2765

AAT AAA TTC GGG AGA GGT TCA CGG AAC TAC AGA GTG ACA AAA TAT TAT 8725

Asn Lys Phe Gly Arg Gly Ser Arg Asn Tyr Arg Val Thr Lys Tyr Tyr

2770 2775 2780

GAT GAC AAC CTA TTA GAA ATA AAG CCA GTG ATA AGA ATG GAA GGG CAT 8773

Asp Asp Asn Leu Leu Glu Ile Lys Pro Val Ile Arg Met Glu Gly His

2785 2790 2795 2800

GTG GAA CTC TAC TAC AAG GGG GCC ACC ATC AAA CTG GAT TTC AAC AAC 8821

Val Glu Leu Tyr Tyr Lys Gly Ala Thr Ile Lys Leu Asp Phe Asn Asn

2805 2810 2815

AGC AAA ACA ATA TTG GCA ACC GAT AAA TGG GAG GTT GAT CAC TCC ACT 8869

Ser Lys Thr Ile Leu Ala Thr Asp Lys Trp Glu Val Asp His Ser Thr

2820 2825 2830

CTG GTC AGG GTG CTC AAG AGG CAC ACA GGG GCT GGA TAT CAT GGG GCA 8917

Leu Val Arg Val Leu Lys Arg His Thr Gly Ala Gly Tyr His Gly Ala

2835 2840 2845

TAC CTG GGC GAG AAA CCG AAC CAC AAA CAC CTG ATA GAG AGG GAC TGT 8965

Tyr Leu Gly Glu Lys Pro Asn His Lys His Leu Ile Glu Arg Asp Cys

2850 2855 2860

GCA ACC ATC ACC AAA GAT AAG GTC TGT TTT CTC AAA ATG AAG AGA GGG 9013

Ala Thr Ile Thr Lys Asp Lys Val Cys Phe Leu Lys Met Lys Arg Gly

2865 2870 2875 2880

TGC GCA TTT ACT TAT GAC TTA TCC CTT CAC AAC CTT ACC CGA CTG ATT 9061

Cys Ala Phe Thr Tyr Asp Lau Ser Leu His Asn Leu Thr Arg Leu Ile

2885 2890 2895

GAA TTG GTA CAC AAG AAT AAC TTG GAA GAC AAA GAG ATT CCC GCT GCT 9109

Glu Leu Val His Lys Asn Asn Leu Glu Asp Lys Glu Ile Pro Ala Ala

2900 2905 2910

ACG GTT ACA ACC TGG CTG GCT TAC ACA TTT GTA AAT GAA GAT ATA GGG 9157

Thr Val Thr Thr Trp Leu Ala Tyr Thr Phe Val Asn Glu Asp Ile Gly

2915 2920 2925

ACC ATA AAA CCA GCC TTC GGG GAG AAA GTA ACG CTG GAG ATG CAG GAG 9205

Thr Ile Lys Pro Ala Phe Gly Glu Lys Val Thr Leu Glu Met Gln Glu

2930 2935 2940

GAG ATA ACC TTG CAG CCT GCT GTT GTG GTG GAT ACA ACA GAC GTA GCC 9253

Glu Ile Thr Leu Gln Pro Ala Val Val Val Asp Thr Thr Asp Val Ala

2945 2950 2955 2960

GTG ACT GTG GTA GGG GAA GCC CCC ACT ATG ACT ACA GGG GAG ACA CCG 9301

Val Thr Val Val Gly Glu Ala Pro Thr Met Thr Thr Gly Glu Thr Pro

2965 2970 2975

ACA GTG TTC ACC AGC TCA GGT TCA GGC CTG AAA AGC CAA CAA GTT TTG 9349

Thr Val Phe Thr Ser Ser Gly Ser Gly Leu Lys Ser Gln Gln Val Leu

2980 2985 2990

AAA CTA GGG GTA GGT GAA GGC CAA TAT CCA GGG ACT AAT CCA CAG AGG 9397

Lys Leu Gly Val Gly Glu Gly Gln Tyr Pro Gly Thr Asn Pro Gln Arg

2995 3000 3005

GCA AGC CTG CAC GAA GCC ATA CAA GGT GCA GAT GAG AGG CCC TCG GTG 9445

Ala Ser Leu His Glu Ala Ile Gln Gly Ala Asp Glu Arg Pro Ser Val

3010 3015 3020

CTG ATA TTG GGG TCT GAT AAA GCC ACC TCT AAT AGA GTG AAG ACT GCA 9493

Leu Ile Leu Gly Ser Asp Lys Ala Thr Ser Asn Arg Val Lys Thr Ala

3025 3030 3035

AAG AAT GTA AAG GTA TAC AGA GGC AGG GAC CCA CTA GAA GTG AGA GAT 9541

Lys Asn Val Lys Val Tyr Arg Gly Arg Asp Pro Leu Glu Val Arg Asp

3045 3050 3055

ATG ATG AGG AGG GGA AAG ATC CTG GTC GTA GCC CTG TCT AGG GTT GAT 9589

Met Met Arg Arg Gly Lys Ile Leu Val Val Ala Leu Ser Arg Val Asp

3060 3065 3070

AAT GCT CTA TTG AAA TTT GTT GAC TAC AAA GGC ACC TTT CTA ACT AGG 9637

Asn Ala Leu Leu Lys Phe Val Asp Tyr Lys Gly Thr Phe Leu Thr Arg

3075 3080 3085

GAG GCC CTA GAG GCA TTA AGT TTG GGC AGG CCT AAA AAG AAA AAC ATA 9685

Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ser Leu Gly Arg Pro Lys Lys Lys Asn Ile

3090 3095 3100

ACC AAG GCA GAA GCG CAG TGG TTG CTG TGC CCC GAG GAC CAA ATG GAA 9733

Thr Lys Ala Glu Ala Gln Trp Leu Leu Cys Pro Glu Asp Gln Met Glu

3105 3110 3115 3120

GAG CTA CCC GAC TGG TTC GCA GCC GGG GAA CCC ATT TTT TTA GAG GCC 9781

Glu Leu Pro Asp Trp Phe Ala Ala Gly Glu Pro Ile Phe Leu Glu Ala

3125 3130 3135

AAC ATT AAA CAT GAC AGG TAC CAT CTG GTG GGG GAT ATA GCT ACC ATC 9829

Asn Ile Lys His Asp Arg Tyr His Leu Val Gly Asp Ile Ala Thr Ile

3140 3145 3150

AAG GAA AAA GCC AAA CAG TTG GGG GCT ACA GAC TCC ACA AAG ATA TCT 9877

Lys Glu Lys Ala Lys Gln Leu Gly Ala Thr Asp Ser Thr Lys Ile Ser

3155 3160 3165

AAG GAG GTT GGT GCT AAA GTG TAT TCT ATG AAA CTG AGT AAT TGG GTG 9925

Lys Glu Val Gly Ala Lys Val Tyr Ser Met Lys Leu Ser Asn Trp Val

3170 3175 3180

ATG CAA GAA GAA AAT AAA CAG GGC AAT CTG ACC CCC TTG TTT GAA GAG 9973

Met Gln Glu Glu Asn Lys Gln Gly Asn Leu Thr Pro Leu Phe Glu Glu

3185 3190 3195 3200

CTC CTG CAA CAG TGT CCA CCC GGG CGC CAG AAC AAA ACT GCA CAC ATG 10021

Leu Leu Gln Gln Cys Pro Pro Gly Gly Gln Asn Lys Thr Ala His Met

3205 3210 3215

GTC TCT GCT TAC CAA CTA GCT CAA GGG AAC TGG ATG CCG ACC AGC TGC 10069

Val Ser Ala Tyr Gln Leu Ala Gln Gly Asn Trp Met Pro Thr Ser Cys

3220 3225 3230

CAT GTT TTC ATG GGG ACC GTA TCT GCC AGG AGA ACC AAG ACC CAC CCA 10117

His Val Phe Met Gly Thr Val Ser Ala Arg Arg Thr Lys Thr His Pro

3235 3240 3245

TAC GAA GCA TAC GTT AAG TTA AGG GAG TTG GTA GAG GAG CAC AAG ATG 10165

Tyr Glu Ala Tyr Val Lys Leu Arg Glu Leu Val Glu Glu His Lys Met

3250 3255 3260

AAA ACA CTG TGT CCC GGA TCA AGC CTG GGT AGG CAC AAC GAT TGG ATA 10213

Lys Thr Leu Cys Pro Gly Ser Ser Leu Gly Arg His Asn Asp Trp Ile

3265 3270 3275 3280

ATT GGA AAA ATT AAA TAC CAG GGA AAC CTG AGG ACC AAA CAC ATG TTG 10261

Ile Gly Lys Ile Lys Tyr Gln Gly Asn Leu Arg Thr Lys His Met Leu

3285 3290 3295

AAC CCC GGC AAG GTG GCA GAG CAA CTG TGC AGA GAG GGA CAC AGA CAC 10309

Asn Pro Gly Lys Val Ala Glu Gln Leu Cys Arg Glu Gly His Arg His

3300 3305 3310

AAT GTG TAT AAC AAG ACA ATA AGC TCA GTA ATG ACA GCT ACT GGT ATC 10357

Asn Val Tyr Asn Lys Thr Ile Ser Ser Val Met Thr Ala Thr Gly Ile

3315 3320 3325

AGG TTG GAG AAG TTG CCC GTG GTT AGG GCC CAG ACA GAC CCA ACC AAC 10405

Arg Leu Glu Lys Leu Pro Val Val Arg Ala Gln Thr Asp Pro Thr Asn

3330 3335 3340

TTC CAC CAA GCA ATA AGG GAT AAG ATA GAC AAG GAA GAG AAC CTA CAA 10453

Phe His Gln Ala Ile Arg Asp Lys Ile Asp Lys Glu Glu Asn Leu Gln

334 3350 3355 3360

ACC CCG GGT TTA CAT AAG AAA TTA ATG GAA GTT TTC AAC GCA TTG AAA 10501

Thr Pro Gly Leu His Lys Lys Leu Met Glu Val Phe Asn Ala Leu Lys

3365 3370 3375

CGA CCC GAG TTA GAG TCC TCC TAC GAC GCC GTG GAA TGG GAG GAA CTG 10549

Arg Pro Glu Leu Glu Ser Ser Tyr Asp Ala Val Glu Trp Glu Glu Leu

3380 3385 3390

GAG AGA GGA ATA AAC AGG AAG GGT GCT GCT GGT TTT TTC GAA CGC AAA 10597

Glu Arg Gly Ile Asn Arg Lys Gly Ala Ala Gly Phe Phe Glu Arg Lys

3395 3400 3405

AAT ATA GGG GAA ATA TTG GAT TCA GAG AAA AAT AAA GTC GAA GAG ATT 10645

Asn Ile Gly Glu Ile Leu Asp Ser Glu Lys Asn Lys Val Glu Glu Ile

3410 3415 3420

ATT GAC AAT CTG AAA AAA GGT AGA AAC ATT AAA TAT TAT GAA ACC GCG 10693

Ile Asp Asn Leu Lys Lys Gly Arg Asn Ile Lys Tyr Tyr Glu Thr Ala

3425 3430 3435 3440

ATC CCA AAG AAT GAG AAG AGG GAC GTC AAC GAT GAC TGG ACC GCC GGT 10741

Ile Pro Lys Asn Glu Lys Arg Asp Val Asn Asp Asp Trp Thr Ala Gly

3445 3450 3455

GAT TTC GTG GAC GAG AAG AAA CCT AGA GTC ATA CAA TAC CCT GAA GCA 10789

Asp Phe Val Asp Glu Lys Lys Pro Arg Val Ile Gln Tyr Pro Glu Ala

3460 3465 3470

AAA ACA AGA CTG GCC ATC ACC AAG GTG ATG TAT AAG TGG GTG AAG CAG 10837

Lys Thr Arg Leu Ala Ile Thr Lys Val Met Tyr Lys Trp Val Lys Gln

3475 3480 3485

AAG CCA GTA GTT ATA CCC GGG TAT GAA GGG AAG ACA CCT CTA TTC CAA 10885

Lys Pro Val Val Ile Pro Gly Tyr Glu Gly Lys Thr Pro Leu Phe Gln

3490 3495 3500

ATT TTT GAC AAA GTA AAG AAG GAA TGG GAT CAA TTT CAA AAT CCA GTG 10933

Ile Phe Asp Lys Val Lys Lys Glu Trp Asp Gln Phe Gln Asn Pro Val

3505 3510 3515 3520

GCA GTG AGC TTC GAC ACT AAG GCG TGG GAC ACC CAG GTA ACC ACA AAA 10981

Ala Val Ser Phe Asp Thr Lys Ala Trp Asp Thr Gln Val Thr Thr Lys

3525 3530 3535

GAT TTG GAG CTG ATA AGG GAC ATA CAA AAG TAT TAT TTC AAG AAG AAA 11029

Asp Leu Glu Leu Ile Arg Asp Ile Gln Lys Tyr Tyr Phe Lys Lys Lys

3540 3545 3550

TGG CAC AAA TTT ATT GAC ACC CTG ACC ACG CAT ATG TCA GAA GTA CCC 11077

Trp His Lys Phe Ile Asp Thr Leu Thr Thr His Met Ser Glu Val Pro

3555 3560 3565

GTG ATC AGT GCT GAT GGG GAA GTA TAC ATA AGG AAA GGG CAA AGA GGC 11125

Val Ile Ser Ala Asp Gly Glu Val Tyr Ile Arg Lys Gly Gln Arg Gly

3570 3575 3580

AGT GGA CAA CCT GAC ACA AGT GCG GGC AAC AGC ATG CTA AAT GTC TTA 11173

Ser Gly Gln Pro Asp Thr Ser Ala Gly Asn Ser Met Leu Asn Val Leu

3585 3590 3595 3600

ACA ATG GTT TAC GCC TTC TGC GAG GCC ACA GGA GTA CCC TAC AAG AGC 11221

Thr Met Val Tyr Ala Phe Cys Glu Ala Thr Gly Val Pro Tyr Lys Ser

3605 3610 3615

TTT GAC AGG GTG GCA AAA ATT CAT GTG TGC GGG GAT GAT GGC TTC CTG 11269

Phe Asp Arg Val Ala Lys Ile His Val Cys Gly Asp Asp Gly Phe Leu

3620 3625 3630

ATC ACA GAA AGA GCT CTC GGT GAG AAA TTT GCA AGT AAG GGA GTC CAG 11317

Ile Thr Glu Arg Ala Leu Gly Glu Lys Phe Ala Ser Lys Gly Val Gln

3635 3640 3645

ATC CTT TAT GAA GCT GGG AAG CCC CAG AAG ATC ACT GAA GGG GAC AAA 11365

Ile Leu Tyr Glu Ala Gly Lys Pro Gln Lys Ile Thr Glu Gly Asp Lys

3650 3655 3660

ATG AAA GTG GCC TAC CAA TTT GAT GAT ATT GAG TTT TGC TCC CAT ACA 11413

Met Lys Val Ala Tyr Gln Phe Asp Asp Ile Glu Phe Cys Ser His Thr

3665 3670 3675 3680

CCA ATA CAA GTA AGA TGG TCA GAT AAC ACT TCT AGT TAC ATG CCG GGG 11461

Pro Ile Gln Val Arg Trp Ser Asp Asn Thr Ser Ser Tyr Met Pro Gly

3685 3690 3695

AGA AAT ACA ACC ACA ATC CTG GCA AAG ATG GCC ACG AGG TTA GAT TCC 11509

Arg Asn Thr Thr Thr Ile Leu Ala Lys Met Ala Thr Arg Leu Asp Ser

3700 3705 3710

AGC GGT GAA AGG GGT ACC ATA GCA TAT GAG AAA GCA GTA GCA TTT AGC 11557

Ser Gly Glu Arg Gly Thr Ile Ala Tyr Glu Lys Ala Val Ala Phe Ser

3715 3720 3725

TTC CTG CTG ATG TAC TCC TGG AAC CCA CTA ATT AGA AGG ATC TGC TTA 11605

Phe Leu Leu Met Tyr Ser Trp Asn Pro Leu Ile Arg Arg Ile Cys Leu

3730 3735 3740

CTG GTG CTA TCA ACT GAA CTG CAA GTG AAA CCA GGG AAG TCA ACT ACT 11653

Leu Val Leu Ser Thr Glu Leu Gln Val Lys Pro Gly Lys Ser Thr Thr

3745 3750 3755 3760

TAC TAT TAT GAA GGA GAC CCG ATA TCT GCC TAC AAG GAA GTC ATC GGC 11701

Tyr Tyr Tyr Glu Gly Asp Pro Ile Ser Ala Tyr Lys Glu Val Ile Gly

3765 3770 3775

CAC AAC CTT TTT GAT CTT AAG AGA ACA AGC TTT GAG AAG CTG GCC AAG 11749

His Asn Leu Phe Asp Leu Lys Arg Thr Ser Phe Glu Lys Leu Ala Lys

3780 3785 3790

TTA AAT CTT AGC ATG TCT GTA CTC GGG GCC TGG ACT AGA CAC ACC AGT 11797

Leu Asn Leu Ser Met Ser Val Leu Gly Ala Trp Thr Arg His Thr Ser

3795 3800 3805

AAA AGA CTA CTA CAA GAC TGT GTC AAT ATA GGT GTT AAA GAG GGC AAT 11845

Lys Arg Leu Leu Gln Asp Cys Val Asn Ile Gly Val Lys Glu Gly Asn

3810 3815 3820

TGG CTA GTC AAT GCA GAC AGA CTA GTA AGT AGC AAG ACC GGG AAT AGG 11893

Trp Leu Val Asn Ala Asp Arg Leu Val Ser Ser Lys Thr Gly Asn Arg

3825 3830 3835 3840

TAC ATA CCC GGA GAG GGT CAC ACC CTG CAA GGA AGA CAT TAT GAA GAA 11941

Tyr Ile Pro Gly Glu Gly His Thr Leu Gln Gly Arg His Tyr Glu Glu

3845 3850 3855

CTG GTG TTG GCA AGA AAA CAG ATC AAC AAC TTT CAA GGG ACA GAC AGG 11989

Leu Val Leu Ala Arg Lys Gln Ile Asn Asn Phe Gln Gly Thr Asp Arg

3860 3865 3870

TAC AAC CTA GGC CCA ATA GTC AAC ATG GTG TTA AGG AGG CTG AGA GTC 12037

Tyr Asn Leu Gly Pro Ile Val Asn Met Val Leu Arg Arg Leu Arg Val

3875 3880 3885

ATG ATG ATG ACG CTG ATA GGG AGA GGG GCA 12067

Met Met Met Thr Leu Ile Gly Arg Gly Ala

3890 3895

TGAGCGCGGG TAACCCGGGA TCTGAACCCG CCAGTAGGAC CCTATTGTAG ATAACACTAA 12127

TTTTCTTTTT TTTCTTTTTT ATTTATTTAG ATATTATTAT TTATTTATTT ATTTATTTAT 12187

TGAATGAGTA AGAACTGGTA TAAACTACCT CAAGTTACCA CACTACACTC ATTTTTAACA 12247

GCACTTTAGC TGGAAGGAAA ATTCCTGACG TCCACAGTTG GGCTAAGGTA ATTTCTAACG 12307

GCCC 12311

(3)SEQ ID No：2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：32碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴：线性

(ii)分子型：DNA

(v)片段类型：引物序列

(vi)原始来源：合成

(ix)特征：

(A)关键：与典型猪瘟病毒Brescia株的2362-2381核苷酸相同的序列

(B)位置：13-32碱基

(ix)特征：

(A)关键：BamHI限制性位点

(B)位置：6-11碱基

(xi)序列描述：SEQ ID No.2

AGATTGGATC CTAAAGTATT AAGAGGACAG GT 32

(4)SEQ ID No：3的信息

(i)序列特征：

(A)长度：35碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴：线性

(ii)分子型：DNA

(v)片段类型：引物序列

(vi)原始来源：合成

(ix)特征：

(A)关键：与典型猪瘟病毒Brescia株的3433-3453核苷酸相同的序列

(B)位置：15-35碱基

(ix)特征：

(A)关键：BamHI限制性位点

(B)位置：6-11碱基

(ix)特征：

(A)关键：终止密码子

(B)位置：12-14碱基

(xi)序列描述：SEQ ID No.3

TAGTCGGATC CTTAGAATTC TGCGAAGTAA TCTGA 35

Claims

1、SEQ ID NO：1的突变体典型猪瘟病毒(CSFV)株基因组的核苷酸序列，其包含编码SEQ ID NO：1的693-746位和800-864位的氨基酸序列的核苷酸区域中的至少一个区域的缺失。

2、突变的CSFV E1多肽，其包含SEQ ID NO：1的693-746位和800-864位的氨基酸序列区域中的至少一个区域的缺失。

3、疫苗株，其基因组产生自权利要求1所述的核苷酸序列的DNA拷贝，和/或该拷贝的感染性转录本。

4、含有权利要求3的疫苗株的疫苗。

5、诊断试剂盒，其含有至少一种权利要求1所述的核苷酸序列、或权利要求2的多肽和其他用于进行诊断检测的常规成分，至少一种试剂盒的成分是标记的。

6、一种瘟病毒抗原在制备用于区分自然感染瘟病毒野外毒株的动物与经预防接种的动物的诊断物质中的应用，所述瘟病毒抗原包含由编码SEQ ID NO：1的693-746位或800-864位的氨基酸序列的一个核苷酸区域所编码的氨基酸序列，所述的经预防接种的动物被接种了瘟病毒多肽或瘟病毒株，所述瘟病毒多肽或瘟病毒株包含编码SEQ IDNO：1的693-746位和800-864位的氨基酸序列的核苷酸区域中的至少一个核苷酸区域的缺失，其中所述诊断物质用于包括以下步骤的如下方法中：

-提供含有待区分的动物的抗体的检测样品；

-将所述的检测样品与瘟病毒抗原相接触，该抗原包含一氨基酸序列，作为缺失的结果，这种氨基酸序列不存在于用于预防接种的所述的瘟病毒多肽或瘟病毒株中，并与针对所述的瘟病毒抗原的表位的抗体相接触，以及

-测定所述检测样品中的所述抗体与针对所述瘟病毒抗原的表位的所述抗体之间的竞争。

7、权利要求6的应用，其中所述的瘟病毒抗原是二聚体化或多聚体化多肽，且所述抗体的一部分被固定而另一部分被标记。