JP3846808B2 - ペスチウイルス株のヌクレオチド配列、それらの配列によりコードされるポリペプチド、ならびにペスチウイルス感染の診断および予防のためのそれらの使用 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、Ｃ−株、すなわち古典的ブタコレラのゲノムの全長ＤＮＡコピーの構築、および細胞内へのトランスフェクション後には感染性Ｃ−株ウイルスの合成を生じるそのコピーのＲＮＡの転写のための方法を開示する。本発明は更に、Ｃ−株由来（ペスチウイルス）ワクチン、ならびにペスチウイルスに対するサブユニットワクチン、およびペスチウイルス感染に関する診断用手段と方法をも含む。それに加え本発明は、競合的アッセイによる、ある試料中の免疫活性物質の検出方法を提供する。
発明の背景
古典的ブタコレラ（ＣＳＦ）もしくはブタペストは接触伝染性が高く、かつブタの致死的疾患となることがしばしばであり、この疾患は発熱および出血を特徴とし、かつ急性もしくは慢性過程を辿ることがある（Ｖａｎ Ｏｉｓｃｈｏｔ． １９８６． Ｈｏｇ Ｃｈｏｌｅｒａ、ｐ．２８９−３００．Ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ．Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｅｓ）。この疾患の大流行は幾つかの欧州諸国および他の諸国で間欠的に生じており、かつ多大な経済的損失をもたらすことがある。
ブタの、生弱毒化古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）ワクチン株、すなわち「チャイニーズ（Ｃｈｉｎｅｓｅ）」株（Ｃ−株）での予防接種は、ブタをＣＳＦから保護する（Ｔｅｒｐｓｔｒａ ａｎｄ Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ、１９８８、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：１２３−１２８）。ブタを通常のワクチン（この内の一つがＣ−株である）で予防接種することの主な欠点は、予防接種を施したそれらのブタが、ＣＳＦＶの牧草地に見られる株に感染したブタと血清学的に区別できなくなることである。しかしながらこのＣ−株は、最も効果的かつ安全な生ワクチンの内の一つと考えられている。Ｃ−株への（血清学的）マーカーの添加は非常に有利でありかつそのワクチンを改善するものと思われる。
ＣＳＦＶは、フラビビリダエ（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）の内のペスティウイルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）属のメンバーである（Ｆｒａｎｃｋｉ，Ｒ．Ｉ．Ｂ．ｅｔ ａｌ，、１９９１、Ｆｌａｖｉｖｉｄａｅ、ｐ．２２３−２３３． Ｉｎ Ｆｉｆｔｈ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｒｃｈｉｖ．Ｖｉｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ． ２、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｖｉｅｎｎａ）。ＣＳＦＶに、構造的、抗原性的、および遺伝子的に密接に関連するペスティウイルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）属の他の２つのメンバーは、主にウシを冒すウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）および主にヒツジを冒すボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）である（Ｍｏｅｎｎｉｎｇ ａｎｄ Ｐｌａｇｅｍａｎｎ、１９９２．Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． ４１：５３−９８；Ｍｏｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：１８４−１９８；Ｂｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９４．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：５４２−５５１）。
ペスチウイルスのゲノムは、約１２．５ｋｂの正の鎖のＲＮＡ分子でできている（Ｒｅｎａｒｄ ｅｔ ａｌ． １９８５． ＤＮＡ ４：４２９−４３８；Ｍｏｏｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｈｕｌｓｔ １９８８． Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．１１：２８１−２９１；Ｂｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９４． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：５４２−５５１）。しかしながら数々の非細胞変性性ＢＶＤＶ株の正の鎖のＲＮＡゲノムはかなり巨大であったりもする（Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ． １９９１． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：６０２−６１６；Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ，１９９２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１：３６８−３８６：Ｑｉ ｅｔ ａｌ． １９９２． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９：２８５−２９２）。
正の鎖のＲＮＡゲノムを有するウイルス固有の特徴は、それらのゲノムＲＮＡが感染性を示すことであり、すなわちウイルス複製を支持する細胞内へのこのＲＮＡのトランスフェクションの後には感染性ウイルスが産生されるということである。予測されるとうり、ペスチウイルスのゲノム（ウイルス性）ＲＮＡもやはり感染性を示す（Ｍｏｅｎｎｉｎｇ ａｎｄ Ｐｌａｇｅｍａｎｎ、１９９２、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． ４１：５３−９８）。
ここ数年間の組換えＤＮＡ技法は、クローン化されたＤＮＡのインビトロ転写を可能にした。この可能性により正の鎖のＲＮＡウイルスのゲノムのＤＮＡコピーからインビトロで感染性ＲＮＡを合成するための方法が開発されている。分子工学の分野では、ＤＮＡはＲＮＡとは対照的に、部位特異的突然変異誘発により操作することが容易なことが熟知されている。従って、合成感染性ＲＮＡにより、例えばその正の鎖のＲＮＡウイルスの複製、菌力、病因、ＲＮＡ組換え、ベクターの開発、および抗ウイルス的攻略法についての研究が著しい飛躍を見せた。しかしながらこの技術の適用により深刻な問題が引き起こされることがある。これらの問題の特徴が、ＢｏｙｅｒおよびＨａｅｎｎｉ、１９９４（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：４１５−４２６）による最近の総説に記載されている。実際のところ、正の鎖のＲＮＡウイルスのゲノムの全長ＤＮＡコピーを構築すること、およびそのような全長ＤＮＡコピーから合成感染性ＲＮＡを作製することの可否を確実に予測することはできないのである。
発明の要約
本発明は、配列番号１に記載されるＣＳＦＶ Ｃ−株のヌクレオチド配列の一部、またはそのようなヌクレオチド配列の相補物もしくはＲＮＡ等価物、またはそれらの突然変異体の少なくとも一部分を含むＣＳＦＶゲノムに相当するヌクレオチド配列を提供する。異なるヌクレオチドを有するが、同一のアミノ酸をコードする縮重ヌクレオチド配列も提供される。本発明は更に、それらのヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドおよびワクチン株（そのワクチン株のゲノムはそのようなヌクレオチド配列を含む、特にＣＳＦＶ Ｃ−株のゲノムの全長ＤＮＡコピーの転写物に基づく組換えウイルス株）をも包含する。
先に示される部分的ヌクレオチド配列、特に、そのウイルスゲノムの構造性領域、すなわち配列番号１に記載される配列の内のアミノ酸１−１０６３をコードするヌクレオチド配列内にある突然変異を含む部分的ヌクレオチド配列も有用である。この突然変異は、他のペスチウイルス株のゲノムの対応部分による置換、ゲノムもしくはアミノ酸の内の一つの置換または欠失であることがある。この突然変異は更に、ＣＳＦＶヌクレオチド配列の翻訳様式を変化させるか、もしくはＣＳＦＶヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのプロセシングを変化させる挿入もしくは置換された異種ヌクレオチド配列であってもよい。それに加え、その突然変異は他の病原体に対する免疫を誘導するポリペプチドをコードする挿入もしくは置換された異種ヌクレオチド配列であってもよく；この場合、ＣＳＦＶ配列は異種免疫原のためのベクターとして用いられる。
本発明は更に、一般的にはペスチウイルスゲノムのヌクレオチド配列、またはその部分もしくは突然変異体（この配列はＥ１蛋白質の小領域、すなわち配列番号１に示される配列の内のアミノ酸６９１−７５０もしくは７８５−８７０に対応するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列内に一つの突然変異を含む）、ならびにそれらのヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドにも関する。これらのポリペプチドは、ペスチウイルスの牧草地に見られる株に感染した動物と予防接種を施した動物との間を認識する診断を可能にするというような方法で、ペスチウイルス感染から動物を保護するのに特に有用である。
それに加え本発明は、先に示されるヌクレオチド配列、ポリペプチド、もしくはワクチン株を含むワクチン、ならびに先に記載されるヌクレオチド配列もしくはポリペプチドを含む診断用組成物、またはそのようなポリペプチドに対して作製された抗体にも関する。
本発明は更に、ペスチウイルス感染の診断用の方法と手段、特に感染した動物と予防接種を施した動物との間を認識するような手段および方法に関する。
本発明は更に、免疫アッセイにおいて抗体もしくは抗原のような検査用物質を、特異的結合性検査により決定するための方法を提供し、この方法では、固定化された形態をとる特異的結合性対照用物質およびラベル化された形態をとる同一の特異的結合性対照用物質が用いられる。
発明の詳細な記述
本発明は、ＣＳＦＶの「チャイニーズ（Ｃｈｉｎｅｓｅ）」株（Ｃ−株；欧州特許出願公開第３５１９０１号）のＲＮＡゲノムの完全なｃＤＮＡ配列を提供する。このことにより、この配列の全長ＤＮＡコピーの構築が可能となり、そのＤＮＡコピーの合成ＲＮＡを転写させることができ、その合成ＲＮＡは適切な細胞（例えば、ＳＫ６−Ｍ細胞（Ｋａｓｚａ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．１９７２、Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．、１３：４６−５１；欧州特許出願公開第３５１９０１号）内へのトランスフェクションの後には感染性Ｃ−株ウイルスの合成を生じる。改変されたＣ−株ワクチン（例えば、（血清学的）マーカーを含むワクチン）の開発についてのこの知見の使用が記載される。本発明は一つのＣＳＦＶ株について説明されるが、本発明は、他のペスチウイルスとＣＳＦＶ Ｃ−株との間で特異的ゲノムセグメントを交換することによるか（これは以下に記載される）、もしくは他のペスチウイルスの「感染性」ＤＮＡコピーを構築することにより他のペスチウイルスについても適用可能かつ有用である。
Ｃ−株のゲノムＲＮＡのＤＮＡコピーのヌクレオチド配列が配列番号１に記載される。本文中に記載される番号は全てこの配列に関し、そして他のペスチウイルスの配列では若干の差異を生じることがある。このヌクレオチド配列は長さが１２，３１１ヌクレオチドであり、かつ３，８９８のアミノ酸のポリ蛋白質をコードする１１，６９４のヌクレオチドからなる一つの巨大な読み取り枠（ＯＲＦ）を含む。このＯＲＦのサイズはＣＳＦＶ株Ｂｒｅｓｃｉａ（Ｍｏｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：１８４−１９８）およびＡｌｆｏｒｔ（Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７１：５５５−５６７）のゲノムのものと同一である。
このＯＲＦはヌクレオチドの位置３７４〜３７６のＡＴＧで開始し、そしてヌクレオチドの位置１２，０６８〜１２，０７０のＴＧＡコドンで停止する。このＯＲＦの前方に存在する５’非コーディング領域は長さ３７３ヌクレオチドである。この配列は、株Ｂｒｅｓｃｉａ、Ａｌｆｏｒｔ、およびＣとの間では高度に保存されており（図２）、かつこの領域の予想される二次構造は、他のフラビビリダエ（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーであるＣ型肝炎ウイルス（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：５０４１−５０４５）の５’非コーディング領域のものに類似する。Ｃ型肝炎ウイルスの５’非コーディング領域は内部リポソームエントリー部位を含むことが既に示されている（Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６６：１４６７−１４８３）。このような部位は重要な調節機能を有する（Ａｇｏｌ、１９９１、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ．Ｒｅｓ． ４０：１０３−１８０）。Ｃ型肝炎ウイルスとの類似性により、ＣＳＦＶの５’−非コーディング領域が内部リボソームエントリー部位をも含むことが示され、この部位は重要な調節因子として、おおまかに言うと配列番号１の配列の内のヌクレオシド１２４と３７４との間に位置する。この内部リボソームエントリー部位は、そのウイルスを弱毒化させる目的での突然変異のため、ならびにＯＲＦの翻訳様式を変化させるための部位として用いられることがある。
ペスチウイルスの複製を調節する第二の重要領域は３’非コーディング領域である。株ＢｒｅｓｃｉａおよびＡｌｆｏｒｔの配列とＣ−株配列とを整列させた際に、このＣ−株に独特な１３ヌクレオチドの配列がその領域内に見いだされた（図２Ｂ）。この独特な配列ＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴは、配列番号１の配列の内のヌクレオチドの位置１２，１２８〜１２，１４０に位置する。株ＢｒｅｓｃｉａおよびＡｌｆｏｒｔの配列と比較した際にはＣ−株の配列内には一列に並んだ２つを上回るヌクレオチドの挿入のみが観察される。残りの部分に関しては、３つのＣＳＦＶ株の３’非コーディング領域における配列は相同性が高い。この領域内での各配列間の総体的相同性は、ＣＳＦＶ株とＢＶＤＶ株とを比較する際には低下する。それにも拘わらず、Ｃ−株のＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴ配列はＢＶＤＶの３’非コーディング領域の配列中には非存在であることが明らかになっている。従って、このＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴはＣ−株のゲノムに特異的であるように思われ、かっこの配列はＣ−株特異的配列のために秀でたマーカーを提供するであろう。この配列を、Ｃ−株特異的ペスチウイルスを同定するためにはヌクレオチドプローブのための基盤、および配列決定のための基盤として用いることができる。従って、３’非コーディング領域内（Ｃ−株内と同一の位置である必要はない）にこの配列を有する全ペスチウイルス株はＣ−株に関連するものと考えられ、かつ本発明の部分ともなる。
ペスチウイルスのゲノムのＤＮＡコピーの転写物の感染性についての厳密なパラメーターはアミノ酸配列である。この点では、一般的にはＲＮＡウイルス、そして具体的にはペスチウイルスのクローニングおよび配列決定に関する２つの側面を考慮する必要がある。第一には正の鎖のＲＮＡウイルスのゲノムの突然変異頻度は高く（複製中約１／１０⁴ヌクレオチド）、そしてそのため保存物に含まれるウイルス性ＲＮＡに関してはウイルスもしくはウイルス性ＲＮＡ調製物の保存物がクローンであるものは、これまでには全く存在しない。これらのＲＮＡ分子の中でも、非感染性である分子が存在することがある。この現象が巨大読み取り枠内での早発性な停止コドンにより生じる場合には、この現象の認識は容易であろう。ウイルス酵素の活性部位もしくは蛋白質の既知の構造に影響を及ぼす突然変異も認識されるであろう。しかしながらアミノ酸配列と、ある蛋白質の機能および構造との間の関連が未知である場合には（ほとんどのペスチウイルスがこの事例に相当する）、どのアミノ酸が変化を生じているか、およびどのアミノ酸がそうではないのかを予想することは不可能となる。第二に、ｃＤＮＡ合成中に突然変異が導入されてしまうことがある。そのため、Ｃ−株のゲノムのクローン化および配列決定を独立に二度行った。配列間で不一致を示す領域については少なくとも３回のクローン化および配列決定を実施した（図１と比較されたい）。特別な部位で２度の一致を示した配列をその位置についての正しい配列とみなした。Ｃ−株のゲノムのＤＮＡコピーの感染性転写物の作製のためのこの研究法にとっての必須事項は、以下の所見により示される。全長ＤＮＡコピーであるｐＰＲＫｆｌｃ−１１３を第二周期目のクローニングおよび配列決定の後に作製したが（図３）、これは非感染性であるように思われる。第一および第二周期目のｃＤＮＡクローンの配列間に不整合を示す領域のクローニングおよび配列決定後には、第二周期目のｃＤＮＡクローンの全長コピーおよび正しいとみなされるＣ−株の配列中に違いを示す５つのアミノ酸が存在するように思われる。ｐＰＲＫｆｌｃ−１３３中のこれらの５つのアミノ酸の修正後には感染性転写物を作製するクローンｐＰＲＫｆｌｃ−１１３が取得された（図４）。この５つの相違点はアミノ酸の位置１４１４（Ｖａｌ→Ａｌａ）；２７１８（Ｇｌｙ→Ａｓｐ）；２８７７（Ｖａｌ→Ｍｅｔ）；３２２８（Ｌｅｕ→Ｍｅｔ）；３２７８（Ｔｙｒ→Ｇｌｕ）に存在する。非感染性であるｃＤＮＡ配列によりこれらの位置でコードされるアミノ酸が矢印の前に示されており、感染性を示すコピー中のこれらの位置でのアミノ酸が矢印の後に示されている（配列番号１）。各アミノ酸変化が個々にＣ−株ＤＮＡコピーの感染性を破壊するかどうかについては、それら５つのアミノ酸の各々について個々の突然変異を有する転写物の感染性を分析することによる決定を行う必要があるであろう。しかしながらこの所見により、アミノ酸配列中のささいな差異がＣ−株のゲノムのＤＮＡコピーの転写物の感染性にとっては重要であることがあるということが示される。この所見によっては更に、未確認のままとされてしまうことがある配列中のささいな違い（たとえ一つのアミノ酸レベルであったとしても）のため、ペスチウイルスの配列のコピーの感染性転写物を調製することは実際には不可能であるものとみなせる可能性があることが示される。
（マーカー）ワクチン開発に適するＣ−株由来の突然変異体は本発明の一部である。それらは配列番号１に記載されるヌクレオチド配列中に、欠失、挿入（複数）、ヌクレオチド突然変異のような突然変異、ならびに他のペスチウイルス株を起源とする挿入および／または交換されたゲノム断片を含むことがある。
Ｃ−株の配列を、突然変異および／または交換に適する４つの領域に分割することができる。領域１は、ヌクレオチド１〜３７３に連なる５’非コーディング配列である。領域２は構造蛋白質Ｎ^pro−Ｃ−Ｅ２−Ｅ３−Ｅ１をコードし、かつヌクレオチド３７４〜３５６３に連なる。領域３は非構造性蛋白質をコードし、かつヌクレオチド３５６４〜１２０６８に連なる。領域４はヌクレオチド１２０６９〜１２３１１に連なる３’非コーディング配列である。
Ｃ−株マーカーワクチンを作製するのに特に適する一つの領域は、構造蛋白質Ｎ^pro−Ｃ−Ｅ２−Ｅ３−Ｅ１をコードするゲノム領域を含む。この領域は配列番号１の配列中のアミノ酸１と１０６３との間に位置する。ゲノムのこの部分の好ましい小領域は以下のアミノ酸配列 １〜１６８（Ｎ^pro）、１６９〜２６７（Ｃ）、２６８〜４９４（Ｅ２）、４９５〜６８９（Ｅ３）、および６９０〜１０６３（Ｅ１）、もしくはそれらの部分により特定される。一例としては、Ｃ−株のＥ１（これはアミノ酸６９０〜８７７に連なる）をコードする領域のＮ−末端抗原性部分を、株ＢｒｅｓｃｉａのＥ１の対応領域と交換した（図４、ｐＰＲＫｆｌｃ−ｈ６）。この新規に作製されたＣ−株誘導体は感染性を示し、かつ野生型株および株Ｂｒｅｓｃｉａから、Ｃ−株およびＢｒｅｓｃｉａ特異的モノクローナル抗体（これらはＥ１およびＥ２に対するものである）との反応を通して識別することができ：一例としては、得られるＣ−株を、株ＢｒｅｓｃｉａのＥ１に特異的なモノクローナル抗体特異的と反応させる（表１）。従ってこの新規の突然変異体の抗原性特性は親ウイルスに関して既に変化させられており、Ｃ−株のＥ１のＮ−末端側半分の、他のＣＳＦＶ株のものとの交換がＣ−株マーカーワクチンの開発への一つの研究法であることが示される。しかしながら本発明は、Ｃ−株と他のＣＳＦＶ株との間のＥ１のＮ−末端側半分の交換に限定されることはない。いずれかの他のペスチウイルス株からのＥ１のＮ−末端側半分が、Ｃ−株のＥ１の対応部分（複数）と交換されることがある。この点では、ブタから単離されるが、ただしＣ−株以外の抗原群に属するペスチウイルス株のＥ１配列が特に適する。交差中和性を基に選択されたこのような株の例には、株「Ｖａｎ ＥＥ」、「Ｓｔａｍ」、「ＳＦ ＵＫ ８７］、「Ｗｉｓｍａｎ」、および「５２５０」が含まれる（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０：２９１−３０６；Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ、１９９２． Ｉｎ：Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｎａｔｉｏｎａｌ ｓｗｉｎｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ． １６−１７ ｊｕｎｅ １９９２． ＶＩ／４０５９／９２−ＥＮ（ＰＶＥＴ／ＥＮ／１４７９）１９９２、ｐ５９−６２）。
Ｅ１のＮ−末端側半分は３つの異なる抗原ドメインＡ、Ｂ、およびＣを含み、それらはＥ１蛋白質の異なる部分に位置し、そして各抗原は中和用モノクローナル抗体と強固に反応することが既に示されている（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ、１９８９、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：２８６５−２８７６；Ｖａｎ Ｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｖｅｔ．Ｍｏｃｒｏｂｉｏｌ． ３３：２２１−２３０；Ｖａｎ Ｒｉｊｉ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７４：２０５３−２０６０）。検査に供した９４のＣＳＦＶ株中で保存されるエピトープはドメインＡであるとマッピングにより決定された一方で、ドメインＢおよびＣのエピトープは非保存的である（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ、１９８９、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：２８６５−２８７６）。エピトープの、株ＢｒｅｓｃｉａおよびＣのＥ１遺伝子のハイブリッド（Ｖａｎ Ｒｉｊｉ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３３：２２１−２３０）、ならびに株ＢｒｅｓｃｉａのＥ１の欠損突然変異体を用いてのマッピングにより、ドメインＡおよびＢ＋ＣはＥ１のＮ−末端側半分中に２つの異なる抗原単位を形成することが示唆される（Ｖａｎ Ｒｉｊｉ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：２０５３−２０６０）。この示唆は更に、Ｅ１のＮ−末端側半分中の位置６９３、７３７、７９２、８１８、８２８、および８５６に存在する６つのシステインがＥ１の正確な折り畳み構造にとって重要であるという知見によっても支持された。しかしながら少なくともＣｙｓ７９２は株Ｂｒｅｓｃｉａの感染性にとっては重要ではなく、それはこのウイルスのモノクローナル抗体耐性突然変異体がこの位置ではＣｙｓ→Ａｒｇ突然変異を伴って単離されたためである（Ｖａｎ Ｒａｊｉ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｂｓｔｒａｃｔ ａｔ ｔｈｅ ９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８−１３ Ａｕｇｕｓｔ、Ｇｌａｓｇｏｗ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）。
アミノ酸配列中の僅かな変化がＣ−株のＲＮＡの感染性を破棄してしまうことがある一方で（実施例２を参照されたい）、位置７９２でのシステイン変化は、ある位置でのアミノ酸変化（これは機能の喪失を伴わない改変に適するとは予測しがたい）が依然として生存可能なウイルス突然変異体を生じることがあることを示す。従って、このウイルスの性質における特別なアミノ酸変化の効果を、経験に基づき株Ｃの配列中の各アミノ酸について決定する必要があるであろう。このことにより再度、Ｃ−株の改変にとっての明白な標的配列（例えば、マーカーワクチン開発のためのもの）はこれまでに公開されている情報に基づいてでは全く同定できないことが示される。
Ｃ−株マーカーワクチンの開発にとっての必須事項は、予防接種を施したブタとＶＳＦＶの牧草地に見られる株に感染したブタとの間を血清学的に識別する可能性である。Ｅ１もしくは免疫親和性的に精製されたＥ１を発現する生の弱毒化仮性狂犬病ウイルスベクターはバキュロウイルスベクターを用いると昆虫細胞内で発現されるが、この生の弱毒化仮性狂犬病ウイルスベクターはブタにおいて、ブタペストに対する防御免疫応答を誘導することが既に示されている（国際公開第９１／００３５２号；Ｖａｎ Ｚｉｊｌ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６５：２７６１−２７６５；Ｈｕｌｓｔ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６７：５４３５−５４４２）。驚くべきことに、欠失を生じたＡドメインもしくは欠失を生じたＢ＋Ｃドメインを有するＥ１の突然変異体（図５）もやはりブタにおいて、ブタペストに対する防御免疫応答を誘導することが見いだされた（表２）。このことにより、このワクチン株により誘導された防御免疫は、ドメインＡおよびＢ＋Ｃの両方に対する中和用抗体には依存しないことが示される。従って、他のペスチウイルス、好ましくはブタから単離されたＣ−株とは異なる抗原群に所属するペスチウイルス（しかしこれにのみ限定されるわけではない）の対応部分（例としては上記を参照されたい）を用いてＡドメインのみ、またはＢ＋Ｃドメインのみ、またはその複数部分に変化もしくは突然変異させてあるペスチウイルス株突然変異体も、本発明の部分である。ドメインＡを含みかつ交換もしくは突然変異に適するＥ１の領域は、アミノ酸７８５と８７０との間に位置する。この領域の内の複数部分が適切に交換もしくは突然変異される小領域（例えば、アミノ酸７８５と８３０との間、およびアミノ酸８２９と８７０との間に位置する小領域）であることもある。ドメインＢ＋Ｃを含みかつ交換もしくは突然変異に適するＥ１の領域は、アミノ酸６９１と７５０との間に位置する。この領域の内の複数部分も適切に交換もしくは突然変異される小領域（例えば、アミノ酸６９１と７１８との間、およびアミノ酸７１７と７５０との間に位置する小領域）であることもある。
ペスチウイルスに感染した動物はＥ２に対する抗体を産生する（Ｋｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９２． Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３２：２８１−２９２；Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ、非公開所見）。従って、突然変異（欠失、挿入、点突然変異）、または対応する遺伝子物質の抗原的に異なるペスチウイルスもしくは異なる抗原性群に属するペスチウイルスでの交換を介する（マーカー）ワクチン開発に適する第二領域は、Ｅ２をコードする領域である。
Ｃ−株は異種遺伝子物質（配列）の挿入および発現のためのベクターとして用いられることがある。ベクターの開発のためには、このＣ−株内に挿入された異種遺伝子物質が、巨大ＯＲＦの翻訳方法およびこのＯＲＦによりコードされるポリ蛋白質のプロセシングを変化させるように作用する。巨大ＯＲＦの翻訳方法を変化させるのに適する配列の例は、内部リボソームエントリー部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）を特定する配列である（Ｄｕｋｅ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｊ．Ｖｏｉｒｏｌ． ６６：１６０２−１６０９、およびそこに含まれる引用文献）。ポリ蛋白質のプロセシングを変化させるのに適する配列の例は、小胞体の膜を横切って細胞から輸出されるかもしくは膜内に挿入される蛋白質の移送の原因となるシグナル配列である（Ｂｌｏｂｅｌ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ７７：１４９６−１５００；Ｋｒｅｉｌ、１９８１、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５０：３１７−３４８）。シグナル配列は細胞性シグナルペプチダーゼにより開裂される。しかしながら、ウイルス性プロテアーゼの開裂部位をコードする配列が同様に、そのポリ蛋白質のプロセシングを変化させるのに用いられることがある。
Ｃ−株ベクター内に挿入され、かつその株により発現される配列が予防接種を施されたブタを同定するためのマーカーとして用いられることがあるか、あるいは挿入された異種配列の起源である病原体からブタを防御するのに用いられることがある。マーカー配列は恐らくは抗原性が高くかつ微生物に所属しながらも、ブタ内では複製することはないであろう。それらは既知の完全な遺伝子産物（例えば、カプシドもしくは包膜蛋白質）、またはそれらの遺伝子産物の抗原性部分（例えば、エピトープ）をコードすることがある。ウイルスを起源とする好ましいマーカー配列は以下の科に属する：アデノビリダエ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、アレナビリダエ（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリビリダエ（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、ブニアビリダエ（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、カリキビリダエ（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、キルコビリダエ（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナビリダエ（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビビリダエ（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナビリダエ（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスビリダエ（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、オルソミクソビリダエ（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソビリダエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｂｉｒｉｄａｅ）、パポバビリダエ（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドビリダエ（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボビリダエ（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポキシビリダエ（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナビリダエ（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、レオビリダエ（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、レトロビリダエ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、およびトガビリダエ（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）。しかしながら、マーカー配列が更に、天然の状態では通常は出現することのない人工抗原、または例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダーゼ、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のアルコールデヒドロゲナーゼ、ヒト胎盤のアルカリ性ホスファターゼ、ホタルのルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのような組織化学的マーカーをもコードすることがある。
異種遺伝子物質はその異種遺伝子物質に対応する病原体により引き起こされる疾患に対する防御免疫を誘導する一つもしくは複数の蛋白質をコードするが、その異種遺伝子物質は、先に特定される株、ブタのパルボウイルス、ブタの呼吸性コロナウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタの生殖性および呼吸性症候群ウイルス（レイリースタッド（Ｌｅｌｙｓｔａｄ）ウイルス、欧州特許第９２２００７８１．０号）、オージェツキー（Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ）病ウイルス（仮性狂犬病ウイルス）、ブタの風土性下痢症ウイルス、およびブタのインフルエンザウイルス、ならびに細菌（例えば、パステウレラ ムルトキダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ボルデテラ ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、アクチノバキルス プレウロプネウモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコックス スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、トレポネマ ヒオディセンテリァ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ）、エスケリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（大腸菌）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ））、ならびにマイコプラズマ（例えば、Ｍ．ハイポプネウモニアエ（Ｍ． ｈｙｐｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびＭ．リオリニス（Ｍ． ｌｙｏｒｈｉｎｉｓ））の配列を初めとする他のペスチウイルス株に由来することがある。
Ｃ−株中の異種配列の挿入に適する部位（しかしこれらのみばかりではない）は、アミノ酸残基１７０と１７１との間、残基６９０と６９１との間、および残基６９１と６９２との間に位置し、かつ配列番号１に示される。
本発明は更に、マーカーワクチン、または（突然変異を生じている）Ｅ１および／もしくは（突然変異を生じている）Ｅ２を含むサブユニットワクチンでの予防接種を施したブタと、ペスチウイルスの牧草地に見られる株に感染したブタとの間を識別するのに用いることができる診断検査も含む。このような識別用診断検査の適切な形態が実施例４および５に記載されている。通常の非識別的ＣＳＦＶ ＥＬＩＳＡ検査では、Ｅ１は、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔら、１９８８（Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １７：１２９−１４０）により記載される複合体捕捉的遮断性（ＣＴＢ）ＥＬＩＳＡにおける抗原として用いられる。従来の技術であるこのＣＴＢ−ＥＬＩＳＡは液相遮断的（Ｌｉｑｕｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）ＥＬＩＳＡもしくは二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡとも称され、ＣＳＦＶ株Ｂｒｅｓｃｉａに対して作製された２つのモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を用いる。Ｍａｂ ｂ３についてのエピトープはドメインＡ内に存在し、このエピトープはＣＳＦＶ株中では保存される一方で、Ｍａｂ ｂ８のエピトープはドメインＣ内に位置し、こちらのエピトープは非保存的である（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ、１９８９、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：２８６５−２８７６）。先のＣＴＢ−ＥＬＩＳＡは感受性および信頼性が高く、かつペスチウイルスに感染したブタにおけるＣＳＦＶ特異的抗体を検出する。従って、この検査はＣＳＦＶ株に感染したブタと、例えばＢＶＤＶに感染したブタとの間を認識する。しかしながら、この検査はＣＳＦＶの牧草地に見られる株に感染したブタとＣ−株ワクチンでの予防接種を施されたブタとの間を認識することはない。この検査は更に、Ｅ１サブユニットワクチン（生ワクチンもしくは死滅化ワクチンのいかんにかかわらず）と共に用いるのには適さない。
本発明に従うある検査は、唯一のＭＡｂ（例えば、ＭＡｂ ｂ３）のみに基づく改変ＣＴＢ−ＥＬＩＳＡである。このようなＣＴＢ−ＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートの表面への抗原の結合ならびに牧草地に見られる株に感染した動物血清との競合反応のために用いられる唯一つのＭＡｂにのみ基づくものであり、このようなＣＴＢ−ＥＬＩＳＡは未だに記載がなされてはおらず、かつ本発明の本質部分である。ここでこの検査の原理が記載されれば、他の抗体（これには、他のウイルスもしくは他の疾患に対する抗体、またはヒトもしくは動物の身体の他の症状の指標となる抗体が含まれる）の検出のための診断用キットの開発に有用となるようにこの原理を適用することができる。従ってこの知見は、全てのＣＴＢ−ＥＬＩＳＡもしくはＣＴＢ−ＥＬＩＳＡと同一の原理に基づくＥＬＩＳＡ（複数）にとって有用であり、これらのＥＬＩＳＡは単一のＭａｂならびに二量体形成もしくは多量体形成を生じた抗原に基づいて開発される。特許請求される検査方法は、特異的な結合相手分子同士（例えば、活性化因子／レセプター、および酵素／インヒビターなど）の他のメンバーの決定にも適用可能であり、この場合、これらの相手の内の一方は少なくとも２つの同一な結合部位を有する。
従って、本発明は、ある試料中で、ある結合相手（例えば、抗原）の結合部位と特異的に結合することが可能な検査用物質（例えば、抗体）の存在を、前記結合相手の同一の結合部位と特異的に結合することが可能な対照用物質（抗体）の測定可能量との前記検査用物質の競合により検出する方法を含み、この方法は、
（１）前記試料を、（ａ）固体担体に結合させた前記対照用物質（抗体）、（ｂ）前記対照用物質の結合相手（抗原）（前記結合相手分子は前記対照用物質のための少なくとも２つの同一な結合部位を含む）、および（ｃ）ラベルを備えた前記対照用物質（抗体）、と接触させ；
（２）前記担体からの前記ラベルの分離の度合いを測定することを含む。一例としては、前記対照用物質（抗体）への前記結合相手（抗原）（これは、少なくとも２つの同一な結合部位を含む）は、前記対照用物質に対する結合相手（抗原）の二量体である。
同一原理を使用すると、本発明は、ある試料中で、分子当たり少なくとも２つの同一な結合部位（これは結合相手（抗体）との特異的結合のためのものである）を有する検査用物質（抗原）の存在を検出する方法をも含み、この方法は、
（１）前記試料を、（ａ）固体担体に結合させた前記結合相手（抗体）、および（ｂ）ラベルを備えた前記結合相手（抗体）、と接触させ；
（２）前記担体に対する前記ラベルの結合の度合いを測定することを含む。
これらの方法では、抗体および抗原は例としてのみ引用されるに過ぎず；それらは他の特異的結合相手分子により置換されることがある。
更に、（ａ）前記固体担体に結合される対照用モノクローナル抗体、（ｂ）ラベルが提供されている前記対照用モノクローナル抗体；および場合によっては（ｃ）前記対照用抗体のための少なくとも２つの同一な結合部位を含む前記対照用抗体に対する抗原；あるいは前記構成成分（ａ）および／または（ｂ）と（ｃ）との間の複合体；ならびに競合性免疫学的アッセイを実施するための更に別の構成成分を含む診断用キットも提供される。
この方法は、Ｅ１の一つもしくは複数のエピトープ（例えば、ドメインＡ）に一つの欠失を有するＥ１サブユニットワクチと共に用いる識別的診断用検査として適切である。この検査は更に、Ａドメインが既に突然変異を受けており、そのためそのような突然変異を受けたＡドメインに対して誘導された抗体が、Ｍａｂ ｂ３のエピトープについてはＭａｂ ｂ３とは競合しないＥ１サブユニット共に用いるのにも適する。それに加え、この検査は、ドメインＡに一つの欠失を有するか、例えばＣＳＦＶ（先を参照されたい）とは異なる抗原群に属するペスチウイルスのものと既に交換されているドメインＡを有するか、あるいはそのドメインに対する抗体がＭａｂ ｂ３のエピトープについてＭａｂ ｂ３とは競合することがないように既に突然変異を施してあるドメインＡを有する改変されたＣ−株もしくは他のＣＳＦＶ株のワクチンと共に用いるのに適する。この検査はＥ１のドメインＡについて記載および例示されているが、Ｍａｂ ｂ８にのみ基づく類似の検査を、ドメインＢ＋ＣもしくはドメインＣ内に一つの欠失を有するか、ＣＳＦＶ（先を参照されたい）とは異なる抗原群に属するペスチウイルスのもので予め交換されているドメインＢ＋ＣもしくはドメインＣを有するか、あるいはそれらのドメインに対して作製された抗体がＭａｂ ｂ８のエピトープについてＭａｂ ｂ８と競合することのないように予め突然変異を生じさせてあるドメインＢ＋ＣもしくはドメインＣを有するワクチンと共に用いることができる。この検査は株ＢｒｅｓｃｉａのＭａｂ ｂ３もしくはＭａｂ ｂ８と共に用いて説明されている。しかしながらこの検査は、株ＢｒｅｓｃｉａのＥ１のドメインＡもしくはドメインＢ＋Ｃに対して作製されたか、あるいはいずれかの他のＣＳＦＶ株のドメインＡもしくはドメインＢ＋Ｃに対して作製された他のＭａｂ（複数）ばかりでなく、いずれかの他のペスチウイルスのＥ１内の類似ドメインに対するＭａｂ（複数）をも用いて有用なものとして設計されることがある。この検査は更に、Ｅ２のエピトープにも基づくことがある（実施例５を参照されたい）。本発明に従う（改変された）ＣＴＢ−ＥＬＩＳＡに適する抗原は、Ｍａｂ ｂ３もしくはＭａｂ ｂ８、またはＥ２エピトープに対して作製された類似のＭａｂ（複数）と反応するＣＳＦＶ株のＥ１（プラスもしくはマイナス３’−ＴＭＲ）あるいはＥ２（実施例５を参照されたい）の二量体もしくは多量体であることが好ましい。突然変異を生じさせてあるＡドメインを有するワクチンの場合には、診断用検査に用いられる抗原の二量体もしくは多量体は、欠失Ｂ＋Ｃ構築物により合成されることがあるし（実施例５を参照されたい）、あるいは突然変異を生じさせてあるＢ＋Ｃドメインを有するワクチンの場合には、その診断用検査に用いられる抗原の二量体もしくは多量体は、欠失Ａ構築物により合成されることがある（構築物に関しては図５と比較されたい；実施例４および５と比較されたい）。Ｅ１抗原の二量体（もしくは多量体）形成形態は、Ｅ１のＣ−末端部分内のシステイン残基により形成されるジスルフィド架橋に基づくものと考えられている。このことにより非常に感度の高い免疫アッセイが可能となるが、それは二量体を形成した抗原分子が一つのＭａｂのエピトープの２コピー分を含むためである。従って、この一つのＭａｂを、二量体形成を生じている抗原を一つのエピトープを介して固定化させるため、および二量体形成を生じている抗原を他のエピトープを介してラベル化するのに用いることができる。牧草地に見られる株での感染の結果として生じる試料血清抗体による競合は、ラベル化された抗体の抗原に対する結合を阻害し、そしてそのためそのような抗体の存在にとっては感受性の高い検査をもたらすことになる。本発明は更に、本方法に基づく診断用キットにも関し、そのようなキットはＥ１−もしくはＥ２−を基にする抗原、ならびに（酵素）でラベルされかつ固定化された同一の種類の抗体（これはＥ１もしくはＥ２エピトープに対するものである）、ならびに競合性タイプの免疫アッセイを実施するための更に別の通常の構成成分（プレート、賦形剤、酵素基質、着色料など）を含む。
本発明に従うワクチンは、先に記載されるヌクレオチド配列か（これは、そのもの自体としてか、またはワクチン株としてか、またはベクターもしくは宿主生物体内のいずれかで用いられる）、あるいは先に記載されるポリペプチドを、ペスチウイルス感染に対する防御を提供するのに有用な量で含む。このワクチンは更に、他の免疫原もしくはそれらをコードするヌクレオチドを含む多目的ワクチンであることもできる。これらのワクチンは更に、通常の担体、アジュバント、可溶化剤、乳化剤、保存料などを含むこともできる。本発明に従うワクチンは、通常の方法により調製することができる。
ＣＳＦＶ株、すなわちＣ−株のゲノムの全長ＤＮＡコピーの感染性転写物の産生のための本発明の方法は、取得されるいずれかの他のＣ−株もしくはペスチウイルス株に有用である。生の弱毒化ＣＳＦＶワクチン株について本明細書に記載される方法を、ワクチン目的のための、Ｃ−株もしくは他のいずれかのＣＳＦＶもしくはペスチウイルス株をインビトロで弱毒化（改変）させるのに非常に都合よく適用させることがある。
本発明に従うＣ−株ワクチンにより、予防接種を施したブタとＣＳＦＶの牧草地に見られる株に感染したブタとの間の血清学的識別が可能となる。いずれかの他のＣＳＦＶ−株もしくはペスチウイルス株のマーカーワクチンが、本発明の方法を用いて同様に首尾よく取得されることがある。このようなマーカーワクチンは、例えばＥ１、またはＥ１のＮ−末端側半分、またはＥ１のドメインＡもしくはＢ＋Ｃをコードする領域、あるいはＣ−株のＥ２をコードする領域、またはＣ−株由来であるかもしくは他のペスチウイルス株のゲノム内の類似領域に突然変異（欠失、点突然変異、挿入）を生じさせることか、そうでなければそれらの領域を抗原的に異なるペスチウイルスか、または異なる抗原群に属するペスチウイルスの対応領域と交換することにより開発されることがある。
Ｃ−株マーカーワクチンの開発のための別の研究法は、そのゲノムに、ブタ内では複製することがない微生物か、あるいは人工的性質でありかつブタでは通常は生じることがない抗原性の高い蛋白質もしくはエピトープ（複数）を発現する異種遺伝子物質を添加することである。
それに加え、そのような異種遺伝子物質は、ブタにとっての微生物性病原体により引き起こされる疾患に対する防御免疫を誘導する抗原をコードすることがある。従って、Ｃ−株もしくはＣ−株に由来する株、または何であれ他のペスチウイルス株の、宿主生物体（この宿主生物体は哺乳類である）における特別な疾患に対する防御を含む異種抗原の発現のためのベクターとしての適用も、本発明の部分である。異種配列を発現する組換えＣ−株ウイルスの構築法およびそれらの異種配列の挿入に適する部位は先に記載される。類似の組換えウイルスを、Ｃ−株由来のウイルスについてか、もしくはいずれかの他のペスチウイルスについて作製することができる。従ってこれらのウイルスも、本発明の部分である。
本発明の本質的部分は、ドメインＡもしくはドメインＢ＋Ｃに欠失を有するサブユニットＥ１の免疫原性能力に関する。表２にまとめられているように、これらの突然変異体Ｅ１の両方共が、高毒性Ｂｒｅｓｃｉａ株の致死量での攻撃誘発に対してブタに防御免疫を誘導させることが可能である。ＣＳＦに対する、ドメインＡおよびＢ＋Ｃに複数の欠失もしくは他の突然変異を含むＥ１の突然変異体の死滅化サブユニットワクチンとしてか、もしくは予防接種を施した動物内のベクター系により発現される生のサブユニットワクチンとしての使用も、本発明の部分である。他の抗原性ＣＳＦＶ蛋白質（例えば、Ｅ２もしくはＥ２の突然変異形態）と共に用いられる突然変異Ｅ１も、死滅化サブユニットワクチンもしくは生のサブユニットワクチンとして適切である（先を参照されたい）。
本発明は更に、ＣＳＦＶマーカーワクチンまたは（突然変異を生じている）Ｅ１および／もしくは（突然変異を生じているＥ２）を含むサブユニットワクチンでの予防接種を施したブタと、ペスチウイルスの牧草地に見られる株に感染したブタとの間を識別するのに用いることができる診断用検査をも含む。このような診断用検査は、血清学、抗原検出、もしくは核酸検出に基づくことがある。どの検査が所定の症例に適切であるかの選択は、中でも用いられるマーカーの特異性に依存する。血清学的診断用検査の一つの適切な形態は、実施例４に記載される改変ＣＴＢ−ＥＬＩＳＡである。本発明に従うと、単一抗体を用いるＣＴＢ−ＥＬＩＳＡに基づくこの方法はＣＳＦＶもしくは他のペスチウイルスの状況下での使用に制約されることはなく、しかもヒトもしくは動物の分野における他の診断目的用の他の抗体の決定、ならびに他の特異的結合性物質の決定に適用可能でもある。
Ｃ−株マーカーワクチンと共に用いる適切な抗原検出用検査の例は、ブタの血液中で、ワクチン株Ｅ１ではなくＣＳＦＶの牧草地に見られる株であるＥ１を検出する検査である。Ｃ−株のＡドメインは既に、例えば、ＣＳＦＶ以外の異なる抗原群に属するペスチウイルス株のものとの、このドメインの交換により改変されている場合には、このような検査はＣＳＦＶのＡドメインの保存されるエピトープを認識するモノクローナル抗体に基づくことがある。
しかしながら、Ｃ−株のＥ２領域がマーカーワクチン開発のために改変される場合には、そのようなワクチンを伴う血清学的もしくは抗原的診断用検査により、その改変されたＥ２領域に関連して、予防接種を施した動物と、感染を受けた動物との間の差異が検出される。従って、このような診断用検査は、抗原としてＥ２特異的配列を用いる。これらのＥ２特異的配列は、親Ｃ−株（実施例５を参照されたい）か、Ｃ−株とは抗原的に異なるＣＳＦＶ株か、もしくはＣＳＦＶとは異なる抗原群に属するペスチウイルスを起源とすることがある。しかしながら、これらのＥ２特異的配列は、いずれかのペスチウイルスの天然のＥ２の突然変異（欠失（一つもしくは複数）、挿入（一つもしくは複数）、または点突然変異（一つもしくは複数））を介して取得されることもあるか、あるいはいずれかのペスチウイルスのＥ２の（突然変異を生じさせてある）複数部分からできていることがある。二量体Ｅ２および多量体Ｅ２が診断用検査における抗原として用いられることがある（実施例５を参照されたい）。一つのモノクローナル抗体と組み合わせて用いられるＥ２がＣＴＢ−ＥＬＩＳＡ検査（この原理は既に先に記載されている）において用いられることがある。Ｅ２に基づく診断用検査が実施例５に記載される。抗原検出用キットがペスチウイルスＥ２を検出すべきものであり、かつ一つのＭａｂに基づく場合には、このような検査用キットはＥ２上の保存されるエピトープを認識する抗体を含むことが好ましい。このような検査もやはり本発明の部分である。
最後に、診断用検査は、ＣＳＦＶの牧草地に見られる株の内の、ある領域（これはＣ−株では改変される）の特異的検出に基づくことがある。この検査に適する技術には、例えば、特異的プローブとの核酸ハイブリダイゼーション、および／または例えばポリメラーゼ連鎖反応での増幅が含まれる。別法では、Ｃ−株配列が、Ｃ−株ゲノムに独特なＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴ配列を含む３’非コーディング領域（の一部分）のＰＣＲ増幅により、ＣＳＦＶの牧草地に見られる株の配列から識別されることがある。
Ｃ−株が異種マーカー配列の挿入により改変される場合には、この配列に基づく（例えば、抗原、エピトープ（一つもしくは複数）、またはこの配列によりコードされる組織化学的産物）か、あるいは核酸ハイブリダイゼーション技術（例えば、特異的プローブ）、および／または増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）を介する異種遺伝子情報の検出に基づく診断用検査のいずれかの形態も、やはり本発明の部分である。
実施例１
Ｃ−株のゲノムの分子クローニングおよび配列決定
細胞および細菌 ブタの腎臓細胞（ＳＫ６−Ｍ、欧州特許出願公開第３５１９０１号）は、５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および抗生物質を含むイーグル（Ｅａｇｌｅ’ｓ）の基本培地中で生育させた。ＦＢＳは記載される要領（Ｍｏｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：１８４−１９８）で、ＢＶＤＶおよびＢＶＤＶ抗体の存在について検査した。ＢＶＤＶおよびＢＶＤＶ抗体を含まない血清のみを用いた。古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）の「チャイニーズ（Ｃｈｉｎｅａｓｅ）」ワクチン株（Ｃ−株）を、欧州特許出願公開第３５１９０１号に記載される要領でＳＫ６−Ｍ細胞に適用させた。「Ｃｅｄｉｐｅｓｔ」と表示される株は非細胞変性性であり、そしてこれを３倍終点稀釈により生物学的にクローン化した。３回の増幅段階の後、３．５×１０⁶ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌの力価を示すクローン化されたウイルス保存物が産生された。
Ｃ−株に感染したＳＫ−６細胞の細胞質ＲＮＡの単離
Ｃ−株に感染した細胞からの細胞内ＲＮＡは、本質的には記載される要領（Ｍｏｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：１８４−１９８）で単離した。簡潔に記載すると、１６２ｃｍ²のボトル（Ｃｏｓｔｅｒ社）中の単層のＳＫ６−Ｍ細胞を、細胞当たり５ ＴＣＩＤ₅₀の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でのＣｅｄｉｐｅｓｔで感染させた。その後に細胞を３７℃で１．５時間インキュベートし、そして新鮮な培地を４０ｍｌの最終容量になるまで添加した。７時間後に、アクチノマイシンＤを、１μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加した。２４時間後には細胞を水冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄し、そして氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．２、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＤＴＴ、０．５％［ｖ／ｖ］ＮＰ−４０、０．５％［ｗ／ｖ］Ｎａ−デオキシコール酸塩、および１０ｍＭ バナジルリボヌクレオシド複合体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社））中で溶解させた。この溶解物を遠心分離にかけ（４℃、５分間、４０００ｇ）、そしてその上清をプロテイナーゼＫ（２５０μｇ／ｍｌ、最終濃度）で３０分間、３７℃で処理し、フェノール、クロロホルム、およびイソアミルアルコール（４９：４９：２）で２度抽出し、次いでクロロホルムおよびイソアミルアルコール（２４：１）で一回抽出した。ＲＮＡはエタノール中に保存した。
ｃＤＮＡの合成および増幅
Ｃ−株に感染した細胞の１〜２μｇの細胞質ＲＮＡ、および２０ｐモルの（−）センスプライマーを、１μｌの１０ｍＭ水酸化メチル水銀と共に１０分間、室温でインキュベートした。その後には、変性させたＲＮＡを１μｌの２８６ｍＭ β−メルカプトエタノールと共に５分間、室温でインキュベートさせた。このＲＮＡを、ＲＮａｓｅ Ｈが欠損している２００〜４００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、４５分間、４２℃で、１×Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および１０ｍＭ ＤＴＴ）、４０ＵのｒＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ならびに８０μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ中で逆転写させた。最終反応容積は２５μｌであった。この試料に３０μｌの鉱油（Ｓｉｇｍａ社）を重層した。
逆転写（ＲＴ）の後、この試料を１０分間９４℃で変性させた。各ＲＴ−反応の２．５μｌ部を、１μＭの（＋）および（−）センスプライマー、２００μＭの４つの各ｄＮＴＰ、ならびに２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を含む１００μｌのＴａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｔａｑポリメラーゼの製造業者により供給されたもの）中、３９周期（周期：９４℃、６０秒間；５５℃、６０秒間、および７２℃、１〜２分間）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた。この試料に７５μｌの鉱油（Ｓｉｇｍａ社）を重層した。
Ｃ−株の完全なゲノムを含むｃＤＮＡのクローニング
Ｃ−株のゲノムを独立に２度クローン化した。初回のクローニング中（図１Ａ）、第一鎖ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲのためのプライマーを、ＣＳＦＶ株Ｂｒｅｓｃｉａ（Ｍｏｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． １９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１７７：１８４−１９８）とＡｌｆｏｒｔ（Ｍｅｙｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ． １９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７１：５５５−５６７）との間、およびＢＶＤＶ株Ｏｓｌｏｓｓ（Ｒｅｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．欧州特許第０２０８６７２号）とＮＡＤＬ（Ｃｏｌｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ． １９８８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． １６５：１９１−１９９）との間の配列相同性を基に選択した。ｃＤＮＡ断片のサイズは至適増幅を達成する目的で０．５−２．５ｋｂの間で選択した。ゲル精製された増幅産物をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼ Ｉで処理し、そしてＴ４ポリヌクレオシドキナーゼでリン酸化させた。その後にはｃＤＮＡ断片をＴ４リガーゼでｐＧＥＭ４ｚ−ｂｌｕｅのＳｍａＩ部位内に連結させた。
第二周期のクローニングでは（図１Ｂ）プライマーは、第一周期のクローニング後に取得されたｃＤＮＡクローンの配列から選択した。可能な場合にはプライマーは、増幅されたｃＤＮＡ断片のクローニングに適する制限部位を含んでいた。ＲＴおよびＰＣＲ増幅（先を参照されたい）の後にはｃＤＮＡ断片を２つの異なる制限酵素で切り出すか、あるいは一方の末端で平滑化およびリン酸化させ（先に記載される要領で）かつ他方の末端では適切な制限酵素で消化するか、のいずれかが行われる。ＰＣＲにより誘導される制限部位（これは、そのプライマー中に存在する）を用いることが可能ではない場合には、増幅されたｃＤＮＡ断片内の一つの部位をクローニング用に選択する。ゲル精製の後にはＰＣＲ産物をゲル精製したｐＧＥＭ４ｚ−ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）もしくはｐＧＥＭ５ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）内に連結させ、制限酵素で消化させて、そのＰＣＲ産物のものに適合する末端を作製した。
Ｃ−株のゲノムの最終的な５’および３’末端を含むｃＤＮＡクローンを取得するためには我々は、３’−５’連結法（Ｍａｎｄｌ ｅｔ ａｌ． １９９１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：４０４７−４０７７）を用いた。細胞質ＲＮＡを先に記載の要領で、Ｃ−株に感染した細胞から単離し、そして５．７ ＣｓＣｌクッションを通して更に精製した（Ｍｏｏｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｈｕｌｓｔ． １９８８、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． １１：２８１−２９１）。ＢＶＤＶゲノムの５’末端にはＣａｐ構造が存在しないという示差に基づき（Ｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ． １９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ． ３８：３９−４６）、Ｃ−株のゲノムＲＮＡはピロホスファターゼでの前処理なしで連結させた。８μｇのＲＮＡを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、２０Ｕ ｒＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、１０μｌ／ｍｌ ＢＳＡ（ＲＮａｓｅを含まない）、および１ｍＭ ＡＴＰの反応混合物中、１０ＵのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて連結させた。この混合物を４時間、３７℃でインキュベートした。ＲＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、ペレット化させ、そしてＲＮａｓｅを含まない水中に再懸濁させた。２μｌ部のＲＮＡを逆転写させ、そして先に記載の要領で増幅させた。各ＰＣＲの２μｌ部をネスト式プライマーセットを用いて再増幅させた。逆転写のためには、（−）センスプライマーを用いて５’非コーディング領域に対するハイブリダイゼーションを実施した。２つのＰＣＲ増幅段階については、我々は（＋）センスプライマーを用いて３’非コーディング領域をハイブリダイズさせ、そして（−）センスプライマーを用いて５’非コーディング領域へのハイブリダイゼーションを行った。フェノール／クロロホルムでの抽出およびエタノール沈殿の後、ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ（ネスト式ＰＣＲで用いられる（＋）センスプライマー内に取り込ませてある）およびＥａｇＩ（配列番号１の配列内のヌクレオチド８１）で消化させ、そしてｐＵＣ２１のＮｃｏＩ−ＥａｇＩ部位内に連結させた（Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ、１９９１、Ｇｅｎｅ １００：１８９−１９４）。
実施例１に用いられる全改変法およびクローニング法は、本質的には記載の要領で実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）。制限酵素およびＤＮＡ改変用酵素は商品として購入し、そして供給社により記載される要領で使用した。プラスミドは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α内で形質転換および維持した（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ １：１０９−１３５）。
ｃＤＮＡクローンの配列決定
配列決定に用いられるプラスミドＤＮＡは、アリカリ性溶解およびＬｉＣｌ沈殿によるか、あるいはＣｓＣｌ遠心分離のいずれかにより抽出および精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）。Ｔ７ポリメラーゼを基にする配列決定用キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）をプラスミドＤＮＡの直接的二本鎖配列決定のために用いた。ＳＰ６、Ｔ７、ならびに万能型ｐＵＣ／Ｍ１３の正方向および逆方向プライマーに加え、ＣＳＦＶ株Ｂｒｅｓｃｉａの配列を基にするオリゴヌクレオチドプライマーを用いた（Ｍｏｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． １９９０． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：１８４−１９８）。プライマーはＣｙｃｌｏｎｅ ＤＮＡ合成機（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）もしくは３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で合成した。配列反応物を、８Ｍ尿素を含む６％のアクリルアミドゲル上で分析した。配列データは、ＳｐｅｅｄｒｅａｄｅｒハードウエアおよびＰＣｇｅｎｅソフトウエア（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．社、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いるＣｏｍｐａｑ ３８６コンピューター、およびプログラムＭａｃＭｏｌｌｙｔｅｔｒａを用いるＡｐｐｌｅ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピューターで解析した。
ＴａｑポリメラーゼもしくはＣ−株ＲＮＡの異種性により生じる配列誤差もしくは配列の差異の可能性を考慮して、Ｃ−株のｃＤＮＡクローンの全ゲノム配列は、独立したＰＣＲ反応の後に取得される最小の２つのｃＤＮＡクローンの配列決定を行うことにより決定した。２つのクローンの特別な領域のヌクレオチド配列間に差異が観察される場合には、その領域の共通ヌクレオチド配列を、更に別の独立したＰＣＲ反応の後に取得される第三のｃＤＮＡクローンの配列決定を行うことにより決定した（図１Ａ）。
実施例２
Ｃ−株のゲノムの全長ＤＮＡコピーの感染性転写物の作製
ｃＤＮＡクローンｐＰＲＫｆｌｃ−１１３の構築 Ｃ−株のゲノムＲＮＡの全長ＤＮＡコピーは、図３に示されるスキームに従って構築した。最初に２つのサブクローン（その内の一つ（ｐＰＲｃ６４）はそのゲノムの５’側半分のｃＤＮＡ配列（ヌクレオチド １〜５，５６０）を含み、そしてもう一方（ｐＰＲｃ１１１）はそのゲノムの３’側半分のｃＤＮＡ配列（ヌクレオチド ５，４６３〜１２，３１１）を含む）を構築した。まず最初に全長ｃＤＮＡクローンの構築を、ｐＧＥＭ４ｚ−ｂｌｕｅ内で試してみた。しかしながらこのベクター内では全長挿入断片が不安定であるためこの研究法は失敗に終わった。このクローンの安定性を増加させるため、５’側半分および３’側半分のクローンの挿入断片を低コピー数のベクターｐＯＫ１２の誘導体内に再クローン化させて（Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ、１９９１． Ｇｅｎｅ １００：１８９−１９４）ｐＰＲｃ１０８およびｐＰＲｃ１２３を各々取得した。この目的のためにはｐＯＫ１２を、多重クローニング部位（ＭＣＳ）の制限部位の大半およびＴ７プロモーター配列を除去することにより改変させた。得られるベクター、ｐＰＲＫは更に進んだ全ての全長クローニングのために用いられたが、このベクターは依然として非反復のＳｐｅＩ、ＮｏｔＩ、ＥａｇＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、およびＸｂａＩ部位をＭＣＳ中に含む。
詳細を記載すると、全長クローンｐＰＲＫｆｌｃ−１１３の構築は、以下の要領で進めた（図３）。プラスミドｐＰＲｃ４５とｐＰＲｃ４６との各挿入断片を、Ｃ−株の配列（配列番号１）内のヌクレオチドの位置１２４９に位置するＨｐａＩ部位で連結させてプラスミドｐＰＲｃ４９を取得した。その後にｐＰＲｃ４９の挿入断片を、ヌクレオチドの位置３２４１（配列番号１）に位置するＮｓｉＩ部位でｐＰＲｃ４４の挿入断片と連結させてｐＰＲｃ６３を取得した。５’側半分のクローンであるｐＰＲｃ６４（配列番号１のヌクレオチド１〜５５６０）を、ｐＰＲｃ６３の挿入断片を、以下の要領で、Ｃ−株のゲノムＲＮＡの最終的５’領域の増幅（ＰＣＲ）ｃＤＮＡ断片と連結させることにより構築した。ＥｃｏＲＩおよびＳａｉＩ部位、ならびにその後に続くＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列およびＣ−株のゲノムＲＮＡの最初の２３ヌクレオチドを含む５’末端（＋）センスプライマーを合成した。このプライマーおよび第二周期のクローニングの（−）センスプライマーを用いてｃＤＮＡ断片を増幅させ、これをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化させて、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ（配列番号１中のヌクレオチド２１６）消化させたｐＰＲｃ６３内にクローン化させた。最後に、ｐＰＲｃ６４の挿入断片を、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ消化させたｐＰＲＫ内に再度クローン化させてｐＲｃ１０８を取得した。
３’側半分のクローンｐＰＲｃ１１１（配列番号１のヌクレオチド５，４６３〜１２，３１１）は、４つの第二周期のクローン（ｐＰＲｃ６７、５３、５８、および５５）ならびに一つの第一周期のクローン（ｐＰＲｃ１４）を連結させることにより構築した。ｐＰＲｃ６７とｐＰＲｃ５３の挿入断片を、ヌクレオチドの位置７，７７８に位置するＮｈｅＩ部位で連結させてｐＰＲｃ７１を取得した。ｐＰＲｃ５５とｐＰＲｃ５８とをヌクレオチドの位置１０，３８７に位置するＡｐａＩ部位で連結させてｐＰＲｃ６５を取得した。その後にｐＰＲｃ６５およびｐＰＲｃ１４の各挿入断片をヌクレオチドの位置１１，７１７のＡｆｆＩＩ部位で連結させてｐＰＲｃ７３を取得した。ｐＰＲｃ７３の挿入断片を、ヌクレオチドの位置８，６７５に存在するＰｓｔＩ部位でｐＰＲｃ７１の挿入断片と連結させてｐＰＲｃ７９を取得した。その後にｐＰＲｃ７９の挿入断片（これは、Ｃ−株のｃＤＮＡの完全な３’末端配列を含む）を、ＳｒｆＩ部位が導入されるように改変させ、消化後にはこの部位によりＣ−株 ｃＤＮＡ配列の厳密な３’末端が取得された（３’末端での厳密なランオフ転写のためのもの）。この作業を達成するために、ＳｒｆＩおよびＸｂａＩ部位、ならびにＣ−株のゲノムＲＮＡの３’末端配列に相補的な１８ヌクレオチドを含む３’末端の（−）センスプライマーを合成した。このプライマーおよび第一周期のクローニングの（＋）センスプライマーを用いてｃＤＮＡ断片を増幅させた。この断片をＳｐｅＩ（配列番号１のヌクレオチドの位置１１，８６６）およびＸｂａＩで消化させ、そしてＳｐｅＩ−ＸｂａＩ消化させたｐＰＲｃ７９内にクローン化させてｐＰＲｃ１１１を取得した。
最終的には全長ｃＤＮＡクローンｐＰＲＫｆｌｃ−１１３は、ｐＰＲｃ１１１のＣ−株特異的ＮｃｏＩ⁵⁵³²−ＸｂａＩ^mcsをＮｃｏＩ⁵⁵³²−ＸｂａＩ^mcs消化させたｐＰＲｃ１０８内に挿入することにより構築した。
全長クローンｐＰＲＫｆｌｃ−１３３の構築
全長クローンｐＰＲＫｆｌｃ−１３３はサイレントヌクレオチド突然変異の他にも、少なくとも第一周期のｃＤＮＡクローンの配列から決定されるアミノ酸配列と比較してみると、アミノ酸変化を生じさせることになる５つの点突然変異を有していた。ｐＰＲＫｆｌｃ−１１３中のこれら５つの点突然変異を、冒されたＤＮＡ断片と、優勢配列を含む対応ＤＮＡ断片との交換を通して優勢配列（３つの内の２つ）に変化させた。
ヌクレオチドの位置４，５１６に点突然変異を有する５’側半分のｃＤＮＡクローンｐＰＲｃ１０８は、ｐＰＲｃ１０８のＳｃａｌ¹⁰⁸−Ｎｃｏｌ⁵⁵³²断片をｐＰＲｃ１２４のものと置換することにより変化させた。クローンｐＰＲｃ１２４は、ｐＰＲｃ４４のＰｖｕＩＩ⁴⁴⁸⁵−ＮｈｅＩ⁵⁰⁶⁵断片を、ｐＰＲｃ３２の対応断片で置換することにより作製した（図１と比較されたい）。この新規の５’側半分のｃＤＮＡクローンをｐＰＲｃ１２９と表示した。
クローニングの目的で、３’側半分のクローンを、そのベクターのＳａｌＩ部位からｐＰＲｃ１１３のＣ−株配列の５’部分を、ヌクレオチドの位置５，５０９（配列番号１）のＨｐａＩ部位まで欠失させることにより構築してｐＰＲｃ１２３を取得した。ｐＰＲｃ１２３突然変異体では、ヌクレオチドの位置８，５２６、９，００２、１０，０５５、および１０，２０５が変化を受けていなければならない。位置８，５２６での突然変異は２段階で復帰させた。最初にｐＰＲｃ５３のＡｐａＩ⁸，⁵⁰⁶−ＰｓｆＩ⁸，⁶⁷⁵断片をｐＰＲｃ９０のものと交換してｐＰＲｃ１２５を取得した。第二にｐＰＲｃ１２３のＮｈｅＩ⁷，³⁷⁸−ＰｓｔＩ⁸，⁶⁷⁵断片をｐＰＲｃ１２５のものと交換してｐＰＲｃ１２７を取得した。
位置９，００２、１０，０５５、および１０，２０５の３つの突然変異を復帰を可能にするために、我々はまずｐＰＲｃ５８を、そのベクター中のＦｓｐＩ部位が欠失を生じるように改変させた。この目的のためには、ｐＰＲｃ５８のＥｃｏＲＩ^mcs−ＮｄｅＩ断片に欠失を生じさせて（ｐＧＥＭ４ｚ−ｂｌｕｅ中でＮｄｅＩ開裂させる）ｐＰＲｃ１２６を取得した。位置１０，０５５および１０，２０５での突然変異を、そのＳａｃＩ⁹，⁹⁷⁵−ＡｐａＩ¹⁰，³⁸⁷断片をｐＰＲｃ９６の対応断片で置換することにより復帰させるためにプラスミドｐＰＲｃ１２６を用いてｐＰＲｃ１２８を取得した。位置９００２での突然変異を、ｐＰＲｃ１２８のＡａｔＩＩ−ＦｓｐＩ⁹⁰¹⁶（ｐＧＥＭ４ｚ−ｂｌｕｅ中でＡａｆＩＩ開裂させる）をｐＰＲｃ９０のＡａｆＩＩ−ＦｓｐＩ⁹，⁰¹⁶断片で置換することにより復帰させてｐＰＲｃ１３０を取得した。最終的にはｐＰＲｃ１２７のＰｓｔＩ⁸，⁶⁷⁵−ＡｐａＩ¹⁰，³⁸⁷断片をｐＰＲｃ１３０の対応断片で置換させてプラスミドｐＰＲｃ１３２を取得した。単一突然変異を変化させる全サブクローニング段階は配列決定により確認した。
ｐＰＲｃ１３３の全長クローンを、ｐＰＲｃ１３２のＮｃｏＩ⁵，⁵³²−ＸｂａＩ^mcs断片をＮｃｏＩ⁵，⁵³²−ＸｂａＩ^mcs消化させたｐＰＲｃ１２９内に挿入することにより構築した。
ハイブリッド全長クローンｐＰＲＫｆｌｃ−ｈ６の構築
抗原的には異なるが、生存可能なＣ−株突然変異体をｐＰＲＫｆｌｃ−１３３から、この構築物のＥ１遺伝子の部分をＣＳＦＶ株Ｂｒｅｓｃｉａのものと交換することにより作製することができる。この目的のためには、ｐＰＲｃ１２９のＮｈｅＩ²，⁴⁴³−ＡｆｌＩＩＩ²，⁹⁹⁸断片をｐＰＥｈ６（ｖａｎ Ｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．、１９９２）の対応断片で置換することにより５’側半分のハイブリッドクローンｐＰＲｃ１３９を取得した。ハイブリッド全長クローンｐＰＲＫｆｌｃ−ｈ６を、ｐＰＲｃ１３２のＮｃｏＩ⁵，⁵³²−ＸｂａＩ^mcs断片をｐＰＲｃ１３９内に挿入することにより構築した。このクローンは今度は、非反復のＢｇｌＩＩ部位を含むＣＳＦＶ−株ＢｒｅｓｃｉａのＥ１の抗原領域を含んでいた。
実施例２に用いられる全改変およびクローニング方法は本質的には記載される要領（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）で実施された。制限酵素およびＤＮＡ改変用酵素は商品として購入し、そして供給社により記載される要領で使用した。プラスミドは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α形質転換内で形質転換および維持した（Ｈａｎａｈａｎ． １９８５、ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ １：１０９−１３５）。
インビトロＲＮＡ転写
インビトロ転写に用いられるプラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ社）を、製造業者の条件に従って用いて精製した。ＸｂａＩもしくはＳｒｆＩでの直線化の後には、プラスミドＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、減圧乾固させ、そしてＲＮａｓｅを含まない適当量の水に溶解させた。
１μｇの直線化させたプラスミドＤＮＡをインビトロ転写用の鋳型として用いた。ＲＮＡを３７℃で１時間、４０ｍＭ ＴｒｉＳ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、６ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ スペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、１０ｍＭ ＤＴＴ、１００Ｕ ｒＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、０．５ｍＭの各ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、および１７０単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を含む１００μｌの反応混合物中で合成させた。鋳型ＤＮＡをＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）での１５分間、３７℃下の消化により除去し、その後にフェノールおよびクロロホルムでの抽出、ならびにエタノール沈殿を実施した。このＲＮＡを２０μｌのＲＮａｓｅを含まないＨ₂Ｏ中に溶解させ、そして２６０ｎｍでのＵＶ測定により定量した。
ＲＮＡトランスフェクション
ＲＮＡトランスフェクションミックスは、５０μｌのリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）の希釈液（ＲＮａｓｅを含まないＨ₂Ｏ中の１０μｇのリポフェクチン）および５０μｌのＲＮＡ溶液（ＲＮａｓｅを含まないＨ₂Ｏ中の１μｇのＲＮＡ）を緩和に混合させること、およびこのミックスの室温下、１５分間のインキュベーションにより作製された。φ３５ｍｍ、６−ウエルの組織培養用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）中の密集状態には至っていない単層のＳＫ６−細胞をＲＮＡトランスフェクションのために用いた。この細胞をダルベッコーの改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））で２度洗浄した。その後に１ｍｌのＤＭＥＭをこの細胞に添加し、次いでＲＮＡトランスフェクションミックスを添加した。１６時間、３７℃下でのインキュベーションの後、培地を、５％ＦＢＳを補足してある２ｍｌのＤＭＥＭに置き換えた。インキュベーションを更に３日間、３７℃で継続させた。その後に細胞を、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔら（Ｖｅｔ．Ｎｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９８６． １２：１０１−１０８）により記載される要領で、免疫パーオキシダーゼ単層アッセイ（ＩＰＭＡ）によりＣＳＦＶ特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）（複数）で免疫染色した。
組換えＣ−株ウイルスの特徴決定
トランスフェクトさせた細胞の上清を、φ３５ｍｍのウエル中のＳＫ−６細胞の密集単層に移し、そして５日間、３７℃下でインキュベートした。トランスフェクトさせた単層の細胞をトリプシン処理に付し、そしてＤＭＥＭで７．５倍に希釈し、そして更に７日間、３７℃下、７５ｃｍ²のフラスコ（Ｃｏｓｔｅｒ社）中で成長させた。その後にウイルス保存物を、その細胞を２度凍結−解凍させ、細胞上清を５，０００×ｇで１０分間、４℃下での遠心分離により清澄化させ、そしてその上清を回収することにより調製した。
ウイルスの特徴決定は、ＩＰＭＡにより、かつＲＴ−ＰＣＲ増幅させたウイルス断片の制限分析により実施した。ＳＫ−６細胞の、ウイルスＦＬｃ−ｈ６およびＦｌｃ−１３３での感染の後、単層を４日間、３７℃下でインキュベートした。その後に単層を、ＢｒｅｓｃｉａのＥ１上で保存されるエピトープ（Ｍａｂ ｂ３、ドメインＡ）ならびに保存されないエピトープ（Ｍａｂ ｂ５およびｂ６、ドメインＢ＋Ｃ）に対して作製されたＭａｂ（複数）を、Ｃ−株に特異的であってかつＥ１（Ｍａｂ ｃ２）もしくはＥ２（Ｍａｂ ｃ５）に対して作製されたＭａｂ（複数）と共に用いて免疫染色した（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ．Ｇ、１９８９、Ｉｎ Ｔｈｅｓｉｓ、ｐｐ９９−１１３、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。天然のＢｒｅｓｃｉａウイルスもしくは天然のＣ−株ウイルスに感染したＳＫ−６細胞の単層が、このアッセイにおける対照であった。この結果が表１に示されており、そしてそれは予想どうりのものとなっている。簡潔に説明すると、Ｍａｂ ｂ３はＣＳＦＶ株中で保存されるＥ１上のエピトープを認識し、そしてそのため表１内の全株を認識する。Ｍａｂ ｂ５およびｂ６はＣ−株のＥ１は認識せず、そしてそのため株ＢｒｅｓｃｉａおよびＦｌｃ−ｈ６のみと反応する。それとは対照的に、Ｍａｂ ｃ２は株ＢｒｅｓｃｉａのＥ１は認識せず、そしてそのため株ＣおよびＦＬｃ−１３３とのみ反応する。最終的にはＭａｂ ｃ５は株ＢｒｅｓｃｉａのＥ２を認識はせず、そしてそのため株Ｂｒｅｓｃｉａを除く表１の全ウイルスと反応する。
ウイルスＦＬｃ−ｈ６のゲノムＲＮＡは非反復のＢｇｌＩＩ部位を含むはずであり、この部位はＥ１遺伝子上に存在する（先を参照されたい）。この部位の存在についての確認をとるためには、細胞質ＲＮＡを組換えウイルスＦＬｃ−ｈ６に感染しているか、もしくはＦＬｃ−１３３に感染しているＳＫ６−細胞から単離し、先に記載の要領でＶａｎ Ｒｉｊｎら（１９９３、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：２０５３−２０６０）により記載されるプライマーを用いてＰＣＲ−増幅させ、そしてＢｇｌＩＩで消化させた。ＦＬｃ−ｈ６の１，０９１塩基対の増幅断片は確かにＢｇｌＩＩによる切断を受けて５９０塩基対および５０１塩基対の断片を生じた一方で、ＦＬｃ−１３３の増幅断片は切断を受けない状態に留まった。
実施例３
Ｅ１の欠失突然変異体でのブタの免疫化
ＣＳＦＶ株ＢｒｅｓｃｉａのＥ１の欠失突然変異体の構築および発現
ＣＳＦＶ株Ｂｒｅｓｃｉａの無ＴＭＲ Ｅ１が昆虫細胞により発現され、ブタにおいてＣＳＦに対する防御免疫応答を誘導することが既に示されている（Ｈｕｌｓｔ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６７：５４３５−５４４２）。Ｅ１のＮ−末端側半分内の２つの異なる抗原単位、ＡおよびＢ＋ＣはＣＳＦＶに対する中和抗体を誘導するが、これらの抗原単位もやはり特定されている（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ、１８７８、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：２８６５−２８７６；Ｖａｎ Ｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３３：２２１−２３０；Ｖａｎ Ｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：２０５３−２０６０）。それに加え、ドメインＡおよびドメインＢ＋Ｃに対して作製された中和抗体はＣＳＦＶの中和の際には共同的に作用する（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ、１８８９、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：２８６５−２８７６）。ドメインＢ＋Ｃの欠失、もしくはドメインＡの欠失を有する突然変異体Ｅ１（複数）の免疫原性を評定するため、バキュロウイルスベクター中に関連性構築物を作製し、そして発現される突然変異蛋白質をブタにおいて検査した。
バキュロウイルスが発現する突然変異体Ｅ１（複数）は、野生型ＡｃＮＰＶ（アウトグラファ カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の核多角体病ウイルス）ＤＮＡと、特別な突然変異体Ｅ１をコードする配列を含む転移ベクターｐＡｃＭｏ８のＤＮＡとの重複組換えを介して構築した。転移ベクターｐＡｃＭｏ８は、ｐＡｃＡｓ３（Ｖｌａｋ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：３１２−３２０）から、後者のベクターの非反復ＢａｍＨＩ部位の５’側の第一塩基（Ｇ）に直接挿入することにより取得された。この方法でＡＴＧ開始コドンが、ＢａｍＨＩ部位の最初のＧと重複した状態で作製された。ＡｃＮＰＶ ｐ１０プロモーターにより、ＢａｍＨＩ部位内に挿入された異種配列からメッセンジャーＲＮＡが転写される。
突然変異体Ｅ１（複数）をコードする配列は、ＰＣＲ増幅を介してｐＰＲｂ２（Ｖａｎ Ｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３３：２２１−２３０）のＥ１挿入断片から取得された。この目的のためには、配列中に一つのＢａｍＨＩ部位を含む２つのプライマーを構築した。５’末端側（＋センス）プライマーは、配列５’−ＡＧＡ ＴＴＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＡＡＡ ＧＴＡ ＴＴＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＴ−３’（配列番号２）を有する、このプライマー中で下線が施されている配列は、株Ｂｒｅｓｃｉａの配列中のヌクレオチド２３６２−２３８１と同一であり（Ｍｏｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：１８４−１９８）；太字体はＢａｍＨＩ部位を示す。３’末端（−センス）プライマーはＢａｍＨＩ部位付近に停止コドンを含む。これは配列５’−ＴＡ ＧＴＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＧＣ ＧＡＡ ＧＴＡ ＡＴＣ ＴＧＡ−３’（配列番号３）を有する。このプライマー中の下線が施された配列は、株Ｂｒｅｓｃｉａの配列中のヌクレオチド３４３３−３４５３に対して相補的であり（Ｍｏｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：１８４−１９８）；太字体はＢａｍＨＩ部位を示し、そして斜字体の文字は停止コドンを示す。
増幅させた配列をｐＡｃＭｏ８のＢａｍＨＩ部位内にクローン化させ、そして制限酵素分析によりベクター内での正しい配向についての検査を施した。正しい転移ベクターをｐＰＡｂ１１と表示した。ＡｃＮＰＶ ＤＮＡとｐＰＡｂ１１のＤＮＡとの間の重複組換え、ならびにバキュロウイルスベクターが発現するＥ１の選択および精製を記載される要領で実施した（Ｈｕｌｓｔ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５４３５−５４４２）。放射性免疫沈降アッセイおよびＥ１特異的Ｍａｂ（複数）でのＥ１の更に進んだ特徴決定もＨｕｌｓｔら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９３、６７：５４３５−５４４２）により記載されている。得られる組換えバキュロウイルスはＴＭＲを含まない野生型Ｂｒｅｓｃｉａ Ｅ１を発現する（図３の上から２番目の横線を比較されたい）。この無ＴＭＲ Ｅ１は細胞から分泌される（Ｈｕｌｓｔ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５４３５−５４４２）。
ｐＰＡｂ１１のＥ１遺伝子からのドメインＢ＋Ｃをコードする領域の欠失は、この構築物のＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＰＥｈ１４の対応断片で交換することにより達成された（Ｖａｎ Ｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：２０５３−２０６０）。得られる転移ベクターをｐＰＡｂ１６と表示した。このベクターはＥ１遺伝子内にコドン６３６から７４６にまで広がる欠失を含む。同様に、ｐＰＡｂ１１のＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片をｐＰＥｈ１８の対応断片と交換することによりｐＰＡｂ１１からのドメインＡをコードする領域の欠失が生じて（Ｖａｎ Ｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．、１９９３４５３、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：２０５３−２０６０）転移ベクターｐＰＡｂ１２が取得された。ｐＰＡｂ１２はＥ１遺伝子中にコドン８００から８６４にまで広がる欠失を含む。
組換えバキュロウイルスが発現する欠失Ｅ１については、先に記載される要領での構築、選択、およびそれらのＥ１発現産物に関する特徴決定を実施した。
ブタの免疫化および攻撃誘発露出
４匹（もしくは２匹）の群の特異的病原体を含まない（ＳＰＦ）６〜８週令のブタに０日日に、４μｇの（突然変異体）Ｅ１を含む水中油中水型乳剤１ｍｌでの筋肉内注射による予防接種を施し、そして２８日目に１５μｇの（突然変異体）Ｅ１を含む水中油中水型乳剤１ｍｌでの再予防接種を施した（表２）。ドメインＡの欠失もしくはドメインＢ／Ｃの欠失を含む突然変異体Ｅ１、および野生型Ｅ１の構築法が先に記載されており、そして図５に示される構築物により具体化されている。０日目の第一回目の予防接種については、適切な組換えバキュロウイルスで感染させた昆虫細胞の上清を用いた。その上清中のＥ１の量を以前に記載される要領で換算した（Ｈｕｌｓｔ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５４３５−５４４２）。２８日目の再予防接種についてはＥ１を、感染した昆虫細胞の上清から免疫親和性精製した（Ｈｕｌｓｔ ｅｔ ａｌ．、１９９３、上述）。予防接種を施した全ての群のブタ、および２匹のＳＰＦ動物からなる予防接種を施していない対照群を、１００ＬＤ₅₀のＣＳＦＶ株Ｂｒｅｓｃｉａ ４５６６１０で鼻内的に攻撃誘発させた（Ｔｅｒｐｓｔｒａ ａｎｄ Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ． １９８８． Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １６：１２３−１２８）。この攻撃誘発は、無防護のブタにおいては３〜５日目に出現する高熱および血小板減少症を特徴とする急性疾患をもたらし、そして７〜１１日目にはそれらのブタを死に至らしめる。ヘパリン処理を施した（ＥＤＴＡ）血液試料を予防接種後、４０、４２、４５、４７、４９、５１、５３、および５６日目に採取し、そして記載される要領で血小板およびＣＳＦＶウイルスについての分析を行った（Ｈｕｌｓｔ ｅｔ ａｌ．、１９９３、上述）。血清血液試料を、０、２１、２８、４２、および５６日目に採取し、そしてＣＳＦＶに対する（中和用）抗体を検出する目的で、ＣＴＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １７：１２９−１４０）内、および中和用パーオキシダーゼ−関連性アッセイ（ＮＰＬＡ、Ｔｅｒｐｓｔｒａ ｅｔ ａｌ． １９８４、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９：１１３−１２０）内での検査を実施した。ＣＴＢ−ＥＬＩＳＡにおける検査結果は標準シグナルのパーセンテージ阻害として表示され；＜３０％阻害は陰性、３０〜５０％阻害は偽陽性、＞５０％阻害は陽性である。ＮＰＬＡ力価は、同型培養の１００ ＴＣＩＤ₅₀の株Ｂｒｅｓｃｉａを５０％中和する血清稀釈率の逆数として表示される。
全動物は毎日、疾患の兆候についての所見をとり、そして体温の測定を実施した。疾患の臨床的兆候は：発熱、食欲低下、白血球減少、血小板減少、および麻痺であった。
実施例４
モノクローナル抗体に基づくＣＳＦＶのためのＣＴＢ−ＥＬＩＳＡ（ＣＴＢ−ＤＩＦ）の開発
診断用検査の説明
本実施例はＣＴＢ−ＥＬＩＳＡ（ＣＴＢ−ＤＩＦ）についての記載を行っており、このＥＬＩＳＡは現存するＣＴＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １７：１２９−１４０）のＣＳＦＶ特異的抗体の検出のための改変物である。
ＣＴＢ−ＤＩＦは、Ｅ１−ＴＭＲを発現する組換えバキュロウイルスに感染したＳＦ２１細胞が二量体を形成しているＥ１を培地中に効率的に分泌するという所見に基づいている。二量体を形成しつつ分泌されるこのＥ１は、先のバキュロウイルスに感染した細胞の培地を、非還元的条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける電気泳動後にウエスタンブロットで分析することにより検出された。Ｅ１特異的Ｍａｂ（複数）については２コピーのエピトープがＥ１の二量体上に存在する（各単量体上に一つずつ）。従って二量体を形成している抗原と組み合わせて用いることで、特別なＥ１特異的Ｍａｂを捕捉用抗体（これは、マイクロタイタープレートのウエルの壁面にコートされている）ならびにセイヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と複合体形成している検出用抗体として用いることができる。
ＣＴＢ−ＤＩＦは、ドメインＡ内に欠失を有するＥ１サブユニットワクチンと組み合わせて用いるのに有用であることが示されており（構築法については図５を参照されたい）、かつドメインＡに欠失を生じているＥ１で予防接種したブタにおいて誘導されたＣＳＦＶ特異的抗体と、低毒性ＣＳＦＶ株Ｈｅｎｋｅｎ、Ｚｏｅｌｅｎ、Ｂｅｒｇｅｎ、３３１、およびＣｅｄｉｐｅｓｔに感染したブタにおいて誘導されたＣＳＦＶ特異的抗体との間を認識することが示されている（欧州特許出願公開第３５１９０１号）。
７６６、７８６、７８９、および７７０と番号付けされる４匹のＳＰＦブタに、実施例３に記載される要領で、ドメインＡに欠失を含む突然変異体Ｅ１での予防接種を施し（表２も参照されたい）、そして予防接種後４４日目に毒性ＣＳＦＶ株Ｂｒｅｓｃｉａでの攻撃誘発を施した。予防接種後２８、４２、および５６日目に採取された血清を検査した。
低毒性ＣＳＦＶ株に対する血清も、４匹のＳＰＦブタの群において調製した。株Ｈｅｎｋｅｎ、Ｚｏｅｌｅｎ、Ｂｅｒｇｅｎ、および３３１に感染したブタからの血清を、感染後、０、２１、２８、および４２日目に検査した。Ｃａｄｅｐｅｓｔワクチンでの予防接種を施したブタからの血清を、予防接種後、０、４４、７２、および１７０日目に検査した。
先の血清に関し、３つの異なる血清学的検査を実施した。検査１は、Ｔｅｒｐｓｔｒａ ｅｔ ａｌ． １９８４、（Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９：１１３−１２０）により記載される、ＣＳＦＶに対する中和抗体を検出するための中和用パーオキシダーゼー関連性アッセイ（ＮＰＬＡ）である。検査２は、ＣＳＦＶに対する抗体を日常的に検出するためのＣＴＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １７：１２９−１４０）である。
ＣＴＢ−ＤＩＦはＭａｂ ｂ３（ＣＶＩ−ＨＣＶ−３９．５とも称される）（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ、１９８９． Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：２８６５−２８７６）を用い、このＭａｂ ｂ３はＣＳＦＶのＥ１のドメインＡ１に位置するエピトープを認識する。ＥＬＩＳＡプレートのウエルをＭａｂ ｂ３（１：２，０００の希釈率）（捕捉用抗体）でコートする。これらのウエルを洗浄した後に、ＨＲＰＯに対して複合体結合させたＭａｂ ｂ３（１：４，０００の希釈率）（検出用抗体）をこれらのウエルに添加する。バキュロウイルスが産生するＥ１−ＴＭＲに感染し、かつ二量体を形成しているＥ１を２０μｇ／ｍｌの濃度まで含むＳｆ２１細胞の培地を１：５００に希釈し、そして検査用血清（１：２．５の希釈率）と共に予備インキュベートする。その後にこの血清−抗原混合物を、コーティングが施されているＥＬＩＳＡプレートの各ウエル内の複合体に添加する。インキュベーションの後、これらのウエルを再度洗浄し、そして色素原−基質溶液を添加する。捕捉用Ｍａｂおよび複合体形成したＭａｂの両方がその抗原に結合している場合には、このＨＲＰＯは色素原性反応を誘導し、このことにより、この検査用血清がＣＳＦＶ抗体については陰性であることが示される。抗原上のエピトープが検査用血清からの抗体により遮断される場合には、このＨＲＰＯ−複合体は洗い落とされるであろうし、そしてそれらのウエルは透明のままに留まるであろうし、このことによりその検査用血清はＣＳＦＶ、ドメインＡに対する抗体を含むことが示される。これら３つの異なる血清学的検査に関する結果が表３に示される。
ドメインＡ内に欠失を有するＥ１での予防接種を施したブタの血清は、予防接種後４２日目に、ＮＰＬＡおよびＣＴＢ−ＥＬＩＳＡ中では反応を示すが、ＣＴＢ−ＤＩＦ中では何の反応も示さない。毒性ＣＳＦＶ株Ｂｒｅｓｃｉａでの攻撃誘発後には、同一のブタの血清は予防接種後５６日目（攻撃誘発後１２日目）での３つ全ての検査において陽性反応を示し、このことにより追加応答が攻撃誘発後に生じたことが示される。感染後２１日目から開始するが、株Ｈｅｎｋｅｎ、Ｚｏｅｌｅｎ、Ｂｅｒｇｅｎ、および３３１での予防接種を施したブタからの血清は、ＮＰＬＡ、ＣＴＢ−ＥＬＩＳＡ、およびＣＴＢ−ＤＩＦにおいて陽性反応を示す。予防接種後４４日目から開始するが、Ｃａｄｉｐｅｓｔワクチン株での予防接種を施したブタについても同一のことが当てはまる。
従って、ＣＴＢ−ＤＩＦは真に所望されるとうりの作用を示し、かつＥ１のドメインＡに突然変異を生じているＣＳＦＶマーカーワクチンと共に用いるのに適し、その結果、この突然変異を生じているドメインＡに対して作製された抗体は、Ｍａｂ ｂ３のエピトープに関してはＭａｂ ｂ３と競合することがない。
ＣＴＢ−ＤＩＦに用いられる抗体は、図５に示される、二量体を形成している無ＴＭＲ野生型Ｂｒｅｓｃｉａ Ｅ１である。しかしながら、図５の「欠失ドメインＢ＋Ｃ」構築物により合成される、二量体を形成するＥ１もこの検査における抗原として適切である。
実施例５
Ｅ１およびＥ２に基づくＣＳＦＶについてのＣＴＢ−ＥＬＩＳＡの比較
診断用検査の比較
この実施例は、実施例４のＣＴＢ−ＤＩＦの改変法、およびＣＳＦＶのＥ２を基にするＣＴＢ−ＥＬＩＳＡを説明し、かつこれらのＥＬＩＳＡについて、Ｅ１およびＮＰＬＡに対して作製された抗体を検出する他の３つのＣＴＢ−ＥＬＩＳＡと、感度の点での比較を行う（Ｔｅｒｐｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．、１９８４、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９：１１３−１２０）。
実施例４のＣＴＢ−ＤＩＦ（表４〜８ではＥ１−Ｂａｃ−ＤＩＦと称される）は、抗原として、昆虫細胞（ＳＦ２１細胞）内で合成された昆虫の無ＴＭＲ Ｅ１を用いる。Ｅ１−Ｂａｃ−ＤＩＦ（Ｅ１−Ｂａｃ−ｄＢＣ−ＤＩＦと称される）の改変物は、抗原として、欠損を生じたドメインＢ＋Ｃを有する昆虫細胞（ＳＦ２１細胞）（図５と比較されたい）内で合成された無ＴＭＲ Ｅ１を用いる。ウエスタンブロット上で確認したところ、欠損を生じたドメインＢ＋Ｃを有する無ＴＭＲ Ｅ１が細胞から二量体として分泌される（結果非公開）。検査Ｅ１−ｂａｃ−ｄＢＣ−ＤＩＦは以下の要領で実施される。ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルをＭａｂ ｂ３（１：４，０００の希釈率）（捕捉用抗体）で、１６時間、３７℃下でコートし、そして洗浄する。２０μｇ／ｍｌの濃度までの、二量体を形成している抗原Ｅ１−ｄＢＣを含む培地を１：５０に希釈し、そして検査用血清（１：２．５の希釈率）と共に予備インキュベートする（０．５時間、３７℃下）。その後にこの血清−抗原混合物をコーティングを施したＥＬＩＳＡプレートに添加する。インキュベーション（１時間、３７℃下）の後、各ウエルを洗浄し、そしてＭａｂ ｂ３（ＨＲＰＯに対して複合体形成させてある）（１：１，０００の希釈率）（検出用抗体）を添加する。インキュベーション（１時間、３７℃下）の後、各ウエルを再度洗浄し、そして色素原−基質溶液を添加する。色素原反応は１０分間、室温で実施される。色素原反応の解釈法は、実施例４に説明されるものと同一である。
表４〜８に記載されるＣＳＦＶのＥ１に対して作製された抗体を検出する他のＣＴＢ−ＥＬＩＳＡは、抗原としてＣＳＦＶ感染細胞からの天然のＥ１を用いるＥ１−ＣＳＦＶ ＥＬＩＳＡ（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １７：１２９−１４０）；抗原として昆虫細胞中で合成される無ＴＭＲ Ｅ１を用いるＥ１−ＢａｃおよびＥ１−Ｂａｃ−ＤＩＦ ＥＬＩＳＡである。Ｅ１−ＣＳＦＶおよびＥ１−Ｂａｃ ＥＬＩＳＡは、捕捉用および検出用抗体に、それぞれＣＳＦＶ Ｍａｂ ｂ３およびｂ８（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：２，８６５−２，８７６）を用いる一方で、Ｅ１−Ｂａｃ−ＤＩＦ ＥＬＩＳＡは、捕捉用および検出用の両抗体として、Ｍａｂ ｂ３のみを用いる。Ｅ１−ＣＳＦＶ ＥＬＩＳＡは、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔら、１９８８（Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １７：１２９−１４０）により記載される要領に従い忠実に実施される。Ｅ１−ＢａｃおよびＥ１−Ｂａｃ−ＤＩＦ ＥＬＩＳＡは、以下の改変事項を伴いながら、Ｅ１−Ｂａｃ−ｄＢＣ−ＤＩＦについて先に記載される要領で実施される。Ｅ１−Ｂａｃ ＥＬＩＳＡでは、用いられる抗原は、２０μｇ／ｍｌの濃度での関連するＥ１バキュロウイルス構築物（図５と比較されたい）で感染させたＳＦ２１細胞の培地中に存在する、１：４００の希釈率の二量体を形成するＥ１である。ＨＲＰＯに対して複合体形成させてあるＭａｂ ｂ８は、このＥＬＩＳＡでは検出用抗体であり、かつこれは１：１０００の希釈率で用いられる。Ｅ１−Ｂａｃ−ＤＩＦ ＥＬＩＳＡはＥ１−Ｂａｃ ＥＬＩＳＡと同一の抗原を用いるが、ただし希釈率は１：２００である。ＨＲＰＯと複合体形成させたＭａｂ ｂ３は、１：１，０００の希釈率で、このＥＬＩＳＡの検出用抗体として用いられる。
Ｅ２−Ｂａｃ ＥＬＩＳＡは、Ｂａｃ ＣＥ２構築物（Ｈｕｌｓｔ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００：５５８−５６５）に感染したＳＦ２１細胞内で合成されるＣＳＦＶ Ｅ２抗原を用いる。Ｅ２は感染させた昆虫細胞からは分泌されないため、これらの細胞の溶解物が用いられる。Ｅ１と同様に大半のＥ２は、感染細胞の溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの非変性性条件下で分析する際には二量体を形成する分子として見いだされる（結果非公開）。このＥ２抗原を基に開発されたＣＴＢ−ＥＬＩＳＡは、Ｍａｂ Ｃ５およびＣ１２（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．、１９８９、Ｉｎ Ｔｈｅｓｉｓ、ｐｐ９９−１１３、Ｕｔｒｅｃｈｔ）と共に用いると至適状態で作動する。しかしながらＥ２は、Ｍａｂ Ｃ５もしくはＭａｂ Ｃ１２とのみ組み合わせても用いられることがある。競合アッセイでは、Ｍａｂ Ｃ５およびＣ１２は、Ｅ２に対する結合に関して互いに阻害し合う。このことにより、これらのＭａｂはＥ２上の同一もしくは重複するエピトープを認識することが示される（結果非公開）。Ｅ２−Ｂａｃ ＥＬＩＳＡは以下の要領で実施される。Ｍａｂ Ｃ１２を１：１，０００に希釈し、そしてＥＬＩＳＡプレートの各ウエルにコーティングする（１６時間、３７℃下）。その後に各ウエルを洗浄する。Ｂａｃ ＣＥ２に感染したＳＦ２１細胞の溶解物（１：１，２５０に稀釈されている）を検査用血清（１：１）と共に、０．５時間、３７℃下で予備インキュベートする。その後にこの血清−抗原混合物を、コーティングを施してあるプレートの各ウエルに添加する。その後にプレートを洗浄し、そしてＨＲＰＯに対して複合体形成させてあるＭａｂ Ｃ５（１：２，０００の希釈率）と共にインキュベートする。１時間、３７℃下の後に、プレートを再度洗浄し、そして色素原−基質溶液を添加する。この色素原反応は１０分間、室温で実施される。色素原反応の解釈法は実施例４に説明されるものと同一である。先に記載される稀釈は全て、ＮＰＬＡ緩衝液＋４％ ＰＳ中で実施される（Ｔｅｒｐｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９：１１３−１２０）。
表４は、Ｃａｄｉｐｅｓｔワクチンでの予防接種を施した３匹のＳＰＦブタの血清の、先に記載されるＣＴＢ−ＥＬＩＳＡ（複数）およびＮＰＬＡでの分析の結果を示す。血清は、予防接種後、０、１６、２３、３０、３７、４４、５０、７２、１１３、１４１、および１７０日目に分析した。表５〜８は、各々低毒性のＣＳＦＶ株 ３３１、Ｂｅｒｇｅｎ、Ｈｅｎｋｅｎ、およびＺｏｅｌｅｎに感染した５匹のＳＰＦブタの群の血清の、先に記載されるＣＴＢ−ＥＬＩＳＡ（複数）およびＮＰＬＡでの分析の結果を示す。血清は、感染後、０、１０、１４、１７、２４、２８、３５、および４２日目に分析した。予防接種後１６日目から開始し、Ｃｅｄｉｐｅｓｔ株での予防接種を施したブタからの血清は、５つのＣＴＢ−ＥＬＩＳＡならびにＮＰＬＡの各々で反応を示す。この時点で、Ｅ２−Ｂａｃ ＥＬＩＳＡおよびＥ１−Ｂａｃ−ｄＢＣ−ＤＩＦの感度は、他の３つのＣＴＢ−ＥＬＩＳＡのものと比較して一層優れているというわけでなくとも、同程度には良好である。予防接種後３７日目から最高１７０日目まで、全血清は一致して（陽性を示す）５つのＣＴＢ−ＥＬＩＳＡならびにＮＰＬＡで反応する。低毒性ＣＳＦＶ株に感染したプタの血清も、５つのＣＴＢ−ＥＬＩＳＡならびにＮＰＬＡで反応を示す。時として生じる例外として、５つのＣＴＢ−ＥＬＩＳＡならびにＮＰＬＡにおける血清の反応における一貫性が感染後２１日目から最高４２日目まで観察される。低毒性株に感染した動物のより多くの血清を分析して、これらが感染後初期（最高１７日目まで）での５つのＣＴＢ−ＥＬＩＳＡの感度の間の有意な差異であるかどうかの結論付けを可能にすることが必要である。
Ｅ２−Ｂａｃ ＥＬＩＳＡおよびＥ１−Ｂａｃ−ＣＴＢ−ＤＩＦ ＥＬＩＳＡの両方共が所望されたように作用するということを結論付けることができる。従って、Ｅ２−Ｂａｃ ＥＬＩＳＡは、このＥＬＩＳＡにおいてはＭａｂ（複数）と競合する抗体を誘導することのないＣＳＦＶマーカーワクチン（例えば、サブユニットＥ１（突然変異を生じているかいないかのいかんにかかわりなく）、Ｅ２領域での改変を受けているＣ−株マーカーワクチン）と共に使用するのに適する。Ｅ１−Ｂａｃ−ｄＢＣ−ＤＩＦ ＥＬＩＳＡは、Ｅ１のドメインＡが突然変異を受けているＣＳＦＶマーカーワクチンと共に用いるのには、Ｅ１−Ｂａｃ−ＤＩＦ ＥＬＩＳＡ（実施例４のＣＴＢ−ＤＩＦ ＥＬＩＳＡ）と同程度に適切であり、そのためこの突然変異を生じたドメインＡに対して作製された抗体は、Ｍａｂ ｂ３のエピトープについてＭａｂ ｂ３と競合することはない。
図面の説明
図１、
Ｃ−株のヌクレオチド配列を決定するのに用いられるｃＤＮＡクローンの概略図。図１は第一周期のｃＤＮＡクローンを示す（本文を参照されたい）。番号３２、９０、および９６のｃＤＮＡクローンを用いてｐＰＲＫｆｌｃ−１１３をｐＰＲＫｆｌｃ−１３３に変化させた（実施例２を参照されたい）。クローン１４は、ｐＰＲＫｆｌｃ−１１３の構築のために用いられた唯一の第一周期ｃＤＮＡクローンであった（図３を参照されたい）。図１Ｂは第二周期のｃＤＮＡクローンを示す（本文を参照されたい）。番号付けされている第二周期ｃＤＮＡクローンを用いてｐＰＲＫｆｌｃ−１３３を構築した（配列番号１を参照されたい）。Ｃ−株のゲノムのヌクレオチド配列に関するｃＤＮＡの位置は、図の下段のスケールバー（キロベースでの表示）により示される。ＣＳＦＶの現行で同定される遺伝子の概略図およびＣＳＦＶゲノム内でのそれらの配向が図の上段に示される。
ペスチウイルス蛋白質の命名法に関しては当業者間でも未だ合意に達してはいない。本明細書に記載されるＥ２蛋白質も、ｇｐ４２（Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：１−１０）、ｇｐ４４／４８（Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６５：４７０５−４７１２）、もしくはＥ０

とも称される。Ｅ３蛋白質は、ｇｐ２５（Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：１−１０）、ｇｐ３３（Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６５：４７０５−４７１２）、もしくはＥ１

とも称される。本発明のＥ１蛋白質は、ｇｐ５３（Ｔａｍｉｒａ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：１−１０）、ｇｐ５５（Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６５：４７０５−４７１２）、ｇｐ５１−５４（Ｍｏｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：１８４−１９８）、およびＥ２

とも称される。ＣＳＦＶのＮ−末端オートプロテアーゼＮ^pro（ＢＶＤＶのｐ２０、Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６４：４５０８−４５１４）（ｐ−２３とも称される）はＴｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９９１（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６５：４７０５−４７１２）により同定された。このプロテアーゼの認識配列（この配列は、ペスチウイルス間で保存される）の開裂によりＣのＮ−末端が取得される（Ｓｔａｒｋ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６７：７０８８−７０９５）。
図２、
ＣＳＦＶ株Ｂｒｅｓｃｉａ、Ａｌｆｏｒｔ、およびＣの５’（Ａ）および３’（Ｂ）非コーディング領域のヌクレオチド配列のアラインメント。最初の１２ヌクレオチドを除いた株Ｂｒｅｓｃｉａの５’非コーディング配列が、Ｍｏｏｒｍａｎｎら、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：１８４−１９８、により既に記載されている。株Ｂｒｅｓｃｉａの５’非コーディング配列の最初の１２ヌクレオチドは以前には発表されてはいなかった。Ｃ−株のゲノムの最終的５’および３’配列と同様、これらは本出願の実施例１に記載される３’−５’ ＲＮＡ連結方法を用いて決定された。最初の９ヌクレオチドを除いた株Ａｌｆｏｒｔの５’非コーディング配列が、Ｍｅｙｅｒｓら、１９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７１：５５５−５６７、により既に記載されている。株Ａｌｆｏｒｔのゲノムの最初の９ヌクレオチドはＭｅｙｅｒｓにより、

に発表された。株ＢｒｅｓｃｉａおよびＡｌｆｏｒｔの３’非コーディング領域の配列は、Ｍｏｏｒｍａｎｎら、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：１８４−１９８、およびＭｅｙｅｒｓら、１９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７１：５５５−５６７、により既に各々記載されている。巨大ＯＲＦのＡＴＧ開始コドンおよびＴＧＡ停止コドン（配列番号１と比較されたい）に下線が施されている。
図３、
全長ｃＤＮＡクローンｐＰＲＫｆｌｃ−１１３の構築法の概略。クローン番号は図１の説明文に既に説明されている。クローンの挿入断片の融合部位が縦線で示されている。これらの線に相当する部位が図の下段に示されている。下線を施したクローン番号は、ｐＯＫ１２（Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ、１９９１、Ｇｅｎｅ １００：１８９−１９４）由来のベクター配列を有するｃＤＮＡを示す（図４を参照されたい）。ｐＰＲＫｆｌｃ−１１３の５’および３’末端は、ｃＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を介して特別にあつらえた（実施例２を参照されたい）。ＰＣＲで増幅させた断片が示される。図の下段のスケールバー、およびＣＳＦＶのゲノム構成の概略図は、図１の説明文に既に記載されている。
図４、
ベクター配列、ならびにクローンｐＰＲＫｆｌｃ−１１３、ｐＰＲＫｆｌｃ−１３３、およびｐＰＲＫｆｌｃ−ｈ６中の全長ｃＤＮＡ挿入断片の概略図。ベクターｐＰＲＫ（ｐＯＫ１２の誘導体）（Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ、１９９１、Ｇｅｎｅ １００：１８９−１９４）の構築法は既に実施例２に記載されている。Ｋａｎ^R（カナマイシン耐性遺伝子）；Ｏｒｉ（複製起点）；’ｉ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子のレプレッサーをコードする遺伝子）；ＰＯ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター／オペレーター領域）；ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼのαサブユニットをコードするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）。このベクターの幾つかの制限部位、およびこのベクター内の全長挿入断片を直接フランクする配列が示されている。関連部位が実施例２の本文中に記載されている。ｐＰＲＫｆｌｃ−１１３中の丸つき棒線および番号は、この構築物内で変化させられ、結果としてｐＰＲＫｆｌｃ−１３３を生じた５つのコドンのヌクレオチドに相当する。後者の構築物は、配列番号１に記載される配列を有する。
ｐＰＲＫｆｌｃ−ｈ６中の黒四角は、株Ｂｒｅｓｃｉａの対応領域と交換されているｐＰＲＫｆｌｃ−１３３のＥ１領域を示す。特別な全長構築物に由来する転写物が感染性（＋）であるか非感染性（−）であるかが、その構築物の右端に示される。Ｔ７、Ｔ７プロモーター配列、全長構築物の挿入断片が、配列番号１に示されるＣ−株のヌクレオチド配列を表すスケールバー（キロベースで表示される）に関連して示される。
図５、
バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞内で発現される突然変異体Ｅ１蛋白質の概略図。全Ｅ１蛋白質は株Ｂｒｅｓｃｉａのヌクレオチド配列によりコードされ（Ｍｏｏｒｎａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：１８４−１９８）、かつこの配列中の巨大ＯＲＦ内のコドンの位置６６８に存在するＬｙｓでそれらのＮ−末端が開始する。天然のＥ１のＣ−末端は巨大ＯＲＦ内のコドンの位置１，０６３でのＬｅｕである一方で、他の３つのＥ１蛋白質のＣ−末端は、アミノ酸の位置１，０３１に位置する。棒線中の斑入り四角はＮ−末端シグナル配列（このシグナル配列は、Ｅ１のアミノ酸残基６６８〜６８９に広がる）、内部疎水性配列（この配列は、Ｅ１のアミノ酸残基８０６〜８２６に広がる）、およびＣ−末端貫膜領域（ＴＭＲ）（Ｅ１のアミノ酸残基１，０３２〜１，０６３に広がる領域内に存在する）を表す。欠失を生じているＢ＋ＣもしくはＡドメインを有する突然変異Ｅ１（複数）内の欠失されたアミノ酸配列は、これらの蛋白質を表す棒内の中断部分により示されている。Ｅ１のアミノ酸配列に関するこれら欠失の位置は、図の下段のスケールバーから決定することができる。このスケールバーは、株Ｂｒｅｓｃｉａの巨大ＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列中のＥ１の位置を示す。

本発明の特徴および主要な態様は次のとおりである。
１．古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）のゲノム、またはその一部分もしくは突然変異体に相当し、配列番号１に示されるＣＳＦＶ Ｃ−株のヌクレオチド配列、またはそのようなヌクレオチド配列の相補物もしくはＲＮＡ相同物の少なくとも一部分を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。
２．古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）のゲノム、またはその一部分もしくは突然変異体に相当し、配列番号１に示されるアミノ酸配列の内の少なくともアミノ酸配列２６８−４９４をコードするヌクレオチド配列、またはそのようなヌクレオチド配列の相補物もしくはＲＮＡ相同物を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。
３．配列番号１に示される配列の内のアミノ酸配列１−１０６３をコードするヌクレオチド配列内に一つの突然変異を含む、上記１もしくは２に記載のヌクレオチド配列。
４．アミノ酸６９０−８７０をコードするヌクレオチド配列内に一つの突然変異を含む、上記３に記載のヌクレオチド配列。
５．前記突然変異が、他のペスチウイルス株のゲノムの対応部分による置換である、上記１〜４の内のいずれか一つに記載のヌクオチド配列。
６．前記突然変異が、欠失、挿入、またはそのヌクレオチド配列によりコードされる一つもしくは複数のアミノ酸の置換をもたらす突然変異である、上記１〜４の内のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列。
７．前記突然変異が、ＣＳＦＶヌクレオチド配列の翻訳方法を変化させるか、あるいはＣＳＦＶヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのプロセシングを変化させる異種ヌクレオチド配列の挿入である、上記１〜４の内のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列。
８．前記突然変異が、他の病原体に対する免疫を誘導するポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列の挿入である、上記１〜４の内のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列。
９．前記突然変異が、マーカーポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列の挿入である、上記１〜４の内のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列。
１０．上記１〜９の内のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド。
１１．配列番号１のアミノ酸配列６９０−１０６３もしくはその部分に相当し、アミノ酸配列６９１−７５０もしくは７８５−８７０内に含まれるエピトープの内の一つに一つの突然変異を含み、前記突然変異が前記エピトープを変化させることを特徴とする、ペスチウイルスのポリペプチド。
１２．上記１１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
１３．そのゲノムが、上記１〜８の内のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列の全長ＤＮＡコピーおよび／またはその感染性転写物に由来するワクチン株。
１４．上記１〜９もしくは１２の内のいずれか一つに記載の配列を有するポリヌクレオチド、上記１０もしくは１１に記載のポリペプチド、または上記１３に記載のワクチン株を含むワクチン。
１５．上記１〜９の内のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列、上記１０もしくは１１に記載のポリペプチド、および／または上記１０もしくは１１に記載のポリペプチドに対して作製された抗体を少なくとも含む、診断用組成物。
１６．ＣＳＦＶ Ｃ−株由来の配列のためのマーカーとしての、ヌクレオチド配列ＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴの使用。
１７．予防接種を施した動物からペスチウイルスに感染した動物を識別し、前記予防接種を施した動物が、配列番号１のアミノ酸配列２６８−４９４もしくは６９０−１０６３に一つの突然変異を含むペスチウイルスポリペプチドもしくはペスチウイルス株での予防接種を施され、ある検査用試料を、アミノ酸配列２６８−４９４もしくはアミノ酸配列６９０−１０６３に相当するペスチウイルス抗原またはそれらの部分、および前記ペスチウイルス抗原のエピトープに対して作製された抗体と接触させ、そのエピトープは予防接種に用いられる突然変異を生じさせたポリペプチドもしくはペスチウイルス株内に機能的状態では存在しない、診断方法。
１８．前記ペスチウイルス抗原が二量体もしくは多量体を形成するポリペプチドであって、かつ前記抗体の部分が固定化されており、そして前記抗体の他の部分がラベル化されている、上記１７に記載の方法。
１９．前記ペスチウイルスポリペプチドおよび前記抗原がアミノ酸配列６９０−１０６３に相当し、そして前記エピトープがアミノ酸７８５と８７０との間に位置する、上記１７もしくは１８に記載の方法。
２０．ある試料中で、ある結合相手の結合部位に特異的に結合することが可能な検査用物質の存在を、前記検査用物質と、前記結合相手の同一の結合部位と特異的に結合することが可能な対照用物質の測定可能量との競合により決定する：
（１）前記試料を、（ａ）前記対照用物質の結合相手（前記結合相手分子は、前記対照用物質のための少なくとも２つの同一な結合部位を含む）、（ｂ）固体担体に結合させてある前記対照用物質、および（ｃ）ラベルが提供されている前記対照用物質、と接触させること；
（２）前記担体への前記ラベルの結合の度合いを測定すること、
を含む方法。
２１．前記結合相手が、前記対照用物質に対する結合相手の二量体もしくは多量体である、上記２０に記載の方法。
２２．ある試料中で、ある結合相手との特異的に結合について、分子当たり少なくとも２つの同一な結合部位を有する検査用物質の存在を決定する：
（１）前記試料を、（ａ）固体担体に結合させてある前記結合相手、および（ｂ）ラベルが提供されている前記結合相手物質、と接触させること；
（２）前記担体への前記ラベルの結合の度合いを測定すること、
を含む方法。
２３．（ａ）固体担体に結合させてある対照用抗体、（ｂ）ラベルが提供されて入る前記対照用抗体；および場合によっては（ｃ）前記対照用抗体のための少なくとも２つの同一な結合部位を含む、前記対照用抗体に対する抗原か；あるいは前記構成成分（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の間の複合体；ならびに競合的免疫学的アッセイを実施するための更に別の構成成分、を含む診断用キット。
（配列表）
配列番号：１
配列の長さ：１２３１１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
起源
生物名：Classical Swine Fever Virus C-strain
配列の特徴
特徴を表す記号：Unique seq．ＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴ
存在位置：１２１２８−１２１４０
特徴を表す記号：Insertion site
存在位置：８８３−８８４
特徴を表す記号：Insertion site
存在位置：３４４３−２４４４
特徴を表す記号：Insertion site
存在位置：３４４６−３４４７
配列

配列番号：２
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：Primer bind
存在位置：２３６２−２３８１
配列

配列番号：３
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列

Claims (4)

1. 古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）のC株のゲノムの配列番号１に記載のヌクレオチドにおいて、該ゲノムのＥ１タンパク質をコードする領域中のＡドメインもしくはＢ＋ＣドメインもしくはＡ＋Ｂ＋Ｃドメインに代えペスチウイルスのブレシア（Ｂｒｅｓｃｉａ）株の対応する各ドメインを含有することを特徴とするＣＳＦＶのＣ株のゲノムに相当するヌクレオチドまたは該ヌクレオチドの相補的ヌクレオチドもしくはＲＮＡ相同物。
2. 請求項１に記載のヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
3. ゲノムが、請求項１に記載のヌクレオチドの全長ＤＮＡコピーおよび／またはその感染性転写物に由来する古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）ワクチン株。
4. 請求項２に記載のポリペプチドまたは請求項３に記載のワクチン株と少なくともキャリアーを含有するワクチン。

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