PL184836B1

PL184836B1 - Sekwencja nukleotydowa polipeptyd kodowany przez tę sekwencję, szczep szczepionkowy, szczepionka, kompozycja diagnostyczna i sposób odróżniania zwierząt szczepionych

Info

Publication number: PL184836B1
Application number: PL95317755A
Authority: PL
Inventors: Robertus J. M. Moormann; Rijn Petrus A. Van
Original assignee: Inst Voor Veehouderij En Dierg
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 2002-12-31
Also published as: CZ369696A3; AU2631595A; HUT76352A; CA2192940A1; EP1985705A3; AU697866B2; US6180109B1; BR9508054A; JPH09511914A; EP1985705A2; PL317755A1; CN101255433A; NZ287563A; JP3846808B2; CA2192940C; MX9606463A; RU2201451C2; EP0766740A1; WO1995035380A1; HU220746B1

Abstract

1. Sekwencja nukleotydowa odpowiadajaca genomowi wirusa klasycznej goraczki swin (CSFV) lub jego mutanta, znamienna tym, ze zawiera sekwencje nukleotydowa ko- dujaca przynajmniej jedna z sekwencji aminokwasowych odpowiadajacych sekwencjom 1-168, 169-267, 268-494, 495-689 i 690-1063 z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujacych se- kwencje aminokwasowe 268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecje lub substytucje przez odpowiadajaca jej sekwencje pochodzaca z genomu innego szczepu pestiwirusa, lub komplement lub równowaznik RNA takiej sekwencji nukleotydowej. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób konstruowania pełnej długości kopii DNA tytułowego genomu szczepu C, klasycznego szczepu szczepionki gorączki świń, i transkrypcja jego RNA, które po transfekcji w komórkach powoduje syntezę infekcyjnego wirusa szczepu C. Wynalazek także obejmuje pochodzące ze szczepu C (pestiwirusowe) szczepionki, jak też podjednostkowe szczepionki wobec pestiwirusa i środki oraz sposoby diagnostyczne związane z infekcją pestiwirusem. Przedmiotem wynalazku jest tez sposób wykrywania immunoaktywnych substancji w próbce dzięki próbie współzawodnictwa.

Klasyczna gorączka świń (CSF) lub cholera świń jest wysoce zakaźną i często śmiertelną chorobą świń charakteryzującą się gorączką i krwotokami i mającą przebieg ostry lub przewlekły (Van Oirschot, 1986. Hog Cholera, str. 289-300. w Diseases of Swine. Iowa State University Press, Ames). Wybuchy choroby zachodzą z przerwami w kilku europejskich i innych krajach i mogą powodować wielkie straty ekonomiczne.

Szczepienie świń żywym osłabionym wirusem klasycznej gorączki świń (CSFV), szczepem szczepionkowym, „chińskim” szczepem (szczep C), zabezpiecza świnie przed CSF (Terpstra i Wensvoort. 1988. Vet. Microbiol. 16:123-128). Główną wadą szczepienia świń konwencjonalnymi szczepionkami, z których jedną jest szczep C, jest to, ze szczepione świnie są nieodróżnialne serologicznie od świń zainfekowanych zwykłym szczepem CSFV. Szczep C, jednak, jest uważany za jedną z najskuteczniejszych i bezpieczniejszych żywych szczepionek. Dodanie (serologicznego) markera do szczepu C byłoby wysoce korzystne i polepszyłoby szczepionkę.

CSFV jest członkiem rodzaju Pestivirus Flaviviridae (Francki, R.I.B. i in. 1991. Flaviviridae, str. 223-233. W Fifth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Archiv. Virol. Suppl. 2, Springer Verlag, Vienna) Innych dwóch członków rodzaju Pestivirus, strukturalnie, antygenowo i genetycznie blisko spokrewnionych z CSFV, to wirus bydlęcej biegunki wirusowej (BVDV) głównie atakującej bydło, i wirus choroby Bordera (bDv) głównie atakującej owce (Moennig i Plagemann, 1992 Adv. Virus Res. 41: 53-98; Moormann i in., 1990. Virology 177:184-198; Becher i in. 1994 Virology 198: 542-551).

Genomy pestiwirusów składają się z dodatniej nici cząsteczki RNA około 12,5 tysięcy par zasad (Renard i in. 1985. DNA 4: 429-438; Moormann i Hulst 1988. Virus Res. 11: 281-291; Becher i in 1994. Virology 198: 542-551) Genomy dodatniej nici RNA kilku niecytopatogennych szczepów BVDV. jednak, mogą być znacząco większe (Meyers i in. 1991.

184 836

Virology 180: 602-616; Meyers i in. 1992. Virology 191: 368-386; Qi i in. 1992. Virology 189:285-292).

Własną cechą wirusów z dodatnią nicią genomu RNA jest to, że ich genomowy RNA jest infekcyjny, to jest po transfekcji tym RNA komórek podtrzymujących replikację wirusową powstaje infekcyjny wirus. Jak się można spodziewać, genomowy (wirusowy) RNA pestiwirusów jest także infekcyjny (Moennig i Plagemann, 1992. Adv. Virus Res. 41: 53-98).

Od kilku lat technika rekombinacji DNA pozwala na in vitro transkrypcję klonowanego DNA. Ta możliwość otworzyła drogę do syntezy infekcyjnego RNA in vitro z kopii DNA genomu dodatniej nici RNA wirusa. Dobrze wiadomo w inżynierii cząstkowej molekularnej, że DNA, w przeciwieństwie do RNA, łatwo ulega manipulacji przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce. Tak więc dostępność techniki wytwarzania syntetycznego infekcyjnego RNA znacznie ułatwiła studia np. replikacji, wirulencji, patogenezy, rekombinacji RNA, opracowywania wektorów i antywirusowych strategii wirusów o dodatniej nici RNA. Jednak zastosowanie technologii może spowodować poważne trudności. Naturę tych trudności opisano w najnowszym przeglądzie Boyera i Haenni, 1994. (Virology 198: 415-426). W istocie sukces lub porażka konstrukcji pełnej długości kopii DNA genomu wirusa o dodatniej nici RNA i wytwarzania syntetycznego infekcyjnego RNA z takiej pełnej długości kopii DNA nie może być w sposób pewny przewidywana.

Przedmiotem ujawnienia są sekwencje nukleotydowe odpowiadające genomowi CSFV, obejmujące co najmniej część sekwencji nukleotydowej CSFV szczepu C opisanej jako SEKW. NR ID. 1, lub uzupełnienie lub równoważnik RNA takiej sekwencji nukleotydowej, lub jej mutantów. Przedmiotem ujawnienia są także zdegenerowane sekwencje nukleotydowe mające różne nukleotydy, lecz kodujące te same aminokwasy. Wynalazek ujawnia także polipeptydy kodowane przez te sekwencje nukleotydowe, i szczepy szczepionkowe, których genom zawiera taką sekwencję nukleotydową, w szczególności rekombinacyjny szczep wirusa oparty na transkryptach pełnej długości kopii DNA genomu CSFV szczepu C.

Częściowe sekwencje nukleotydowe wskazane powyżej są tez przydatne, a w szczególności te, które zawierają mutację w strukturalnym regionie genomu wirusa, to jest w sekwencji nukleotydowej kodującej aminokwasy 1-1063 sekwencji przedstawionej jako SEKW. NR ID. 1. Mutacja może być substytucją odpowiednią częścią genomu innego szczepu pestiwirusa, substytucją jednego aminokwasu, lub delecją. Mutacja może także być wstawioną lub podstawioną heterologiczną sekwencją nukleotydową zmieniającą strategię translacji sekwencji nukleotydowej CSFV lub zmieniając przetwarzanie polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową CSFV. Ponadto, mutacja może być wstawioną lub podstawioną heterologiczną sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd indukujący odporność wobec innego patogenu; w tym przypadku sekwencji CSFV użyto jako wektora dla heterologicznych immunogenów.

Wynalazek zajmuje się także sekwencjami nukleotydowymi genomu pestiwirusa ogólnie lub ich częściami lub mutantami, które to sekwencje zawierają mutację w subregionie białka E1, to jest w sekwencji nukleotydowej kodującej aminokwasy odpowiadające aminokwasom 691-750 lub 785-870 sekwencji przedstawionej na SEKW. NR ID. 1, jak też polipeptydami kodowanymi przez te sekwencje nukleotydowe. Te polipeptydy są szczególnie przydatne do chronienia zwierząt przed infekcją pestiwirusem w taki sposób, aby pozwolić na diagnozę rozróżniającą zwierzęta zainfekowane zwykłymi szczepami pestiwirusa i szczepione zwierzęta.

Przedmiotem ujawnienia są ponadto szczepionki zawierające sekwencję nukleotydową, polipeptyd lub szczep szczepionkowy wskazany powyżej, jak tez diagnostyczne kompozycje zawierające sekwencję nukleotydową lub polipeptyd wspomniany powyżej, lub przeciwciało przeciw takiemu polipeptydowi.

Przedmiotem ujawnienia są także sposoby i środki diagnozowania infekcji pestiwirusowych, szczególnie takimi środkami i sposobami, które rozrózniają pomiędzy zwierzętami zainfekowanymi i zwierzętami szczepionymi.

Przedmiotem ujawnienia jest także sposób określania substancji testowych, takich jak przeciwciało lub antygen w teście immunologicznym, dzięki próbie specyficznego wiązania,

184 836 w której stosuje się specyficznie wiązaną substancję odnośnikową w postaci unieruchomionej i tę samą specyficznie wiązaną substancję odnośnikową w postaci znakowanej.

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa odpowiadająca genomowi wirusa klasycznej gorączki świń (CSFV) lub jego mutanta charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą przynajmniej jedną z sekwencji aminokwasowych odpowiadających sekwencjom 1-168, 169-267, 268-494, 495-689 i 690-1063 z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa, lub komplement lub równoważnik RNA takiej sekwencji nukleotydowej.

Korzystnie sekwencja nukleotydowa według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej sekwencję aminokwasową 268-494 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa.

Korzystnie sekwencja nukleotydowa według wynalazku charakteryzuje tym, ze szczep pestiwirusa został wybrany spośród szczepów wirus bydlęcej biegunki wirusowej (BVDV) i szczepów wirus choroby Bordera (BDV).

Korzystnie sekwencja nukleotydowa według wynalazku zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej zmieniającej strategię translacji sekwencji nukleotydowej CSFV lub zmieniającą przetwarzanie polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową CSFV.

Korzystnie sekwencja nukleotydowa według wynalazku zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd indukujący odporność na inny patogen.

Korzystnie sekwencja nukleotydowa według wynalazku zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd markerowy.

Korzystnie sekwencja nukleotydowa według wynalazku koduje polipeptyd pestiwirusa odpowiadający sekwencji aminokwasowej 690-1063 z SEKW. NR ID. 1 lub jej część, zawierający mutację w jednym z epitopów w sekwencji aminokwasowej 691-750 lub 785-870, przy czym mutacja zmienia ten epitop.

Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd kodowany przez sekwencję nukleotydową odpowiadającą genomowi wirusa klasycznej gorączki świń (CSFV) lub jego mutanta charakteryzujący się tym, że zawiera przynajmniej jedną z sekwencji aminokwasowych odpowiadających sekwencjom 1-168, 169-267, 268-494, 495-689 i 690-1063 z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i przynajmniej jedna z sekwencji aminokwasowych 268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z innego szczepu pestiwirusa.

Korzystnie polipeptyd według wynalazku zawiera co najmniej sekwencję aminokwasową 268-494 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i przynajmniej jedna z sekwencji aminokwasowych 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadąjącąjej sekwencję pochodzącą z innego szczepu pestiwirusa.

Korzystnie polipeptyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że szczep pestiwirusa został wybrany spośród szczepów wirusa bydlęcej biegunki wirusowej (BVDV) i szczepów wirusa choroby Bordera (BDV).

Korzystnie polipeptyd według wynalazku zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej zmieniającej strategię translacji sekwencji nukleotydowej CSFV lub zmieniającą przetwarzanie polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową CSFV.

Korzystnie polipeptyd według wynalazku zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd indukujący odporność na inny patogen.

Korzystnie polipeptyd według wynalazku zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd markerowy.

184 836

Korzystnie polipeptyd według wynalazku jest polipeptydem pestiwirusa odpowiadającym sekwencji aminokwasowej 690-1063 z SEKW. NR ID. 1 lub jej część, zawierającym mutację w jednym z epitopów w sekwencji aminokwasowej 691-750 lub 785-870, przy czym mutacja zmienia ten epitop.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczep szczepionkowy, którego genom pochodzi z pełnej długości kopii DNA i/lub jego infekcyjnego transkryptu charakteryzujący się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą przynajmniej jedną z sekwencji aminokwasowych odpowiadających sekwencjom 1-168, 169-267, 268-494, 495-689 i 690-1063 z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 6901063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa.

Korzystnie szczep szczepionkowy według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej sekwencję aminokwasową 268-494 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającąjej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa.

Korzystnie szczep szczepionkowy według wynalazku charakteryzuje się tym, że szczep pestiwirusa został wybrany spośród szczepów wirusa bydlęcej biegunki wirusowej (BVDV) i szczepów wirusa choroby Bordera (BDV).

Korzystnie szczep szczepionkowy według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja nukleotydowa zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej zmieniającej strategię translacji sekwencji nukleotydowej CSFV lub zmieniającą przetwarzanie polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową CSFV.

Korzystnie szczep szczepionkowy według wynalazku charakteryzuje się tym, ze sekwencja nukleotydowa zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd indukujący odporność na inny patogen.

Korzystnie szczep szczepionkowy według wynalazku charakteryzuje się tym, ze sekwencja nukleotydowa zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd markerowy.

Korzystnie szczep szczepionkowy według wynalazku charakteryzuje się tym, ze sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd pestiwirusa odpowiadający sekwencji aminokwasowej 690-1063 z SEKW. NR ID. 1 lub jego część, zawierający mutację w jednym z epitopów w sekwencji aminokwasowej 691-750 lub 785-870, przy czym mutacja zmienia ten epitop.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka charakteryzująca się tym, ze obejmuje polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przynajmniej jedną z sekwencji aminokwasowych odpowiadających sekwencjom 1-168, 169-267, 268-494, 495689 i 690-1063 z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i w którym przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 268494, 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa, polipeptyd kodowany przez ten polipeptyd lub szczep szczepionkowy zawierający ten polipeptyd.

Korzystnie szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej sekwencję aminokwasową 268-494 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, przy czym przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa.

Korzystnie szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, ze szczep pestiwirusa został wybrany spośród szczepów wirusa bydlęcej biegunki wirusowej (BVDV) i szczepów wirusa choroby Bordera (BDV).

Korzystnie szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, ze polinukleotyd zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej zmieniającej strategię

184 836 translacji sekwencji nukleotydowej CSFV lub zmieniającą przetwarzanie polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową CSFV.

Korzystnie szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że polinukleotyd zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd indukujący odporność na inny patogen.

Korzystnie szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że polinukleotyd zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd markerowy.

Korzystnie szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że polinukleotyd koduje polipeptyd pestiwirusa odpowiadający sekwencji aminokwasowej 690-1063 z SEKW. NR ID. 1 lub jej część, zawierający mutację wjednym z epitopów w sekwencji aminokwasowej 691-750 lub 785-870, przy czym mutacja zmienia ten epitop.

Kolejnym przedmiotem wynalazkujest kompozycja diagnostyczna charakteryzująca się tym, że obejmuje polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przynajmniej jedną z sekwencji aminokwasowych odpowiadających sekwencjom 1-168, 169-267, 268-494, 495-689 i 690-1063 z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i w którym przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa, polipeptyd kodowany przez ten polinukleotyd i/lub przeciwciało otrzymane poprzez immunizację polipeptydem kodowanym przez ten polinukleotyd, i dodatkowo konwencjonalne składniki do przeprowadzania testu diagnostycznego, przy czym przynajmniej jeden składnik zestawu jest znakowany.

Korzystnie kompozycja diagnostyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej sekwencję aminokwasową 268-494 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, przy czym przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 691 750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa.

Korzystnie kompozycja diagnostyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że szczep pestiwirusa został wybrany spośród szczepów wirusa bydlęcej biegunki wirusowej (BVDV) i szczepów wirusa choroby Bordera (BDV).

Korzystnie kompozycja diagnostyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że polinukleotyd zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej zmieniającej strategię translacji sekwencji nukleotydowej CSFV lub zmieniającą przetwarzanie polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową CSFV.

Korzystnie kompozycja diagnostyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że polinukleotyd zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd indukujący odporność na inny patogen.

Korzystnie kompozycja diagnostyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że polinukleotyd zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd markerowy.

Korzystnie kompozycja diagnostyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, ze polinukleotyd koduje polipeptyd pestiwirusa odpowiadający sekwencji aminokwasowej 690-1063 z SEKW. NR ID. 1 lub jej część, zawierający mutację wjednym zepitopów w sekwencji aminokwasowej 691-750 lub 785-870, przy czym mutacja zmienia ten epitop.

Przedmiotem wynalazkujest także sposób odróżniania zwierząt naturalnie zainfekowanych szczepem polo wym pestiwirusa od zwierząt zaszczepionych, polegający na tym, ze dostarcza się badaną próbkę zawierającą przeciwciało ze zwierzęcia poddawanego rozróżnianiu, badaną próbkę kontaktuje się z antygenem oraz z przeciwciałem, które otrzymuje się poprzez immunizację tym antygenem, oraz mierzy się konkurowanie pomiędzy tym przeciwciałem i przeciwciałem zawartym w badanej próbce, charakteryzujący się tym. ze zwierzęta zostały zaszczepione zmutowanym polipeptydem pestiwirusa lub szczepem pestiwirusa, w którym przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe

184 836

268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 z sekwencji SEKW. NR. ID. 1 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa, natomiast stosowany antygen pestiwirusa zawiera przynajmniej część sekwencji aminokwasowej wybranej spośród sekwencji aminokwasowych odpowiadających 268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 z sekwencji SEKW. NR ID. 1.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako antygen pestiwirusa stosuje się dimeryzowany lub multimeryzowany polipeptyd i część przeciwciała jest unieruchomiona, a inna część przeciwciała jest znakowana.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że polipeptyd pestiwirusa i antygen odpowiadają sekwencji aminokwasowej 690-1063, a epitop jest umiejscowiony pomiędzy aminokwasami 785 i 870.

W przypadku sekwencji CSFV użyto jako wektora dla heterologicznych immunogenów.

Wynalazek zajmuje się także sekwencjami nukleotydowymi genomu pestiwirusa ogólnie lub ich częściami lub mutantami, które to sekwencje zawierają mutację w subregionie białka E1, to jest w sekwencji nukleotydowej kodującej aminokwasy odpowiadające aminokwasom 691-750 lub 785-870 sekwencji przedstawionej na SEKW. NR ID. 1, jak też polipeptydami kodowanymi przez te sekwencje nukleotydowe. Te polipeptydy są szczególnie przydatne do chronienia zwierząt przed infekcjąpestiwirusem w taki sposób, aby pozwolić na diagnozę rozróżniającą zwierzęta zainfekowane zwykłymi szczepami pestiwirusa i szczepione zwierzęta.

Przedmiotem wynalazku są ponadto szczepionki zawierające sekwencję nukleotydową, polipeptyd lub szczep szczepionkowy wskazany powyżej, jak też diagnostyczne kompozycje zawierające sekwencję nukleotydową lub polipeptyd wspomniany powyżej, lub przeciwciało przeciw takiemu polipeptydowi.

Przedmiotem wynalazku są także sposoby i środki diagnozowania infekcji pestiwirusowych, szczególnie takimi środkami i sposobami, które rozróżniają pomiędzy zwierzętami zainfekowanymi i zwierzętami szczepionymi.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób określania substancji testowych, takich jak przeciwciało lub antygen w teście immunologicznym, dzięki próbie specyficznego wiązania, w której stosuje się specyficznie wiązaną substancję odnośnikowa w postaci unieruchomionej i tę samą specyficznie wiązaną substancję odnośnikową w postaci znakowanej.

Przedmiotem wynalazku jest kompletna sekwencja cDNA genomu rNa „chińskiego szczepu (szczepu C; EP-A-351901) CSFv. Pozwala ona na skonstruowanie pełnej długości kopii DNA tej sekwencji, z której można transkrybować syntetyczny RNA, który po transfekcji w dogodne komórki, takie jak SK6-M (Kasza, L. i in. 1972. Res. Vet. Sci.,13: 46-51; EP-A-351901) powoduje syntezę infekcyjnego szczepu C wirusa. Opisano zastosowanie tego odkrycia do opracowania zmodyfikowanej szczepionki szczepu C, np. szczepionki zawierającej (serologiczny) marker. Chociaż wynalazek zilustrowano jednym szczepem CSFV, stosuje się on także do innych szczepów pestiwirusa dzięki wymianie specyficznych genomowych segmentów, opisanych poniżej, pomiędzy innym pestiwirusem i szczepem C CSFV, lub dzięki konstrukcji „infekcyjnej” kopii DNA innego pestiwirusa.

Sekwencję nukleotydową kopii DNA genomowego RNA szczepu C przedstawiono na SEKW. NR ID. 1. Liczby wymienione w tekście są wszystkie spokrewnione z tą sekwencją i mogą się różnić nieco w sekwencjach innych pestiwirusów. Sekwencja nukleotydowa ma 12311 nukleotydów długości i zawiera jedną dużą otwartą ramkę odczytu (ORF) składającej się z 11694 nukleotydów kodującą białko składające się z 3898 aminokwasów. Rozmiary tego ORF są takie same, jak dla genomów szczepów CSFV Brescia (Moormann i in. 1990. Virology 177:184-198) i Alfort (Meyers i in. 1989. Virology 171: 555-567).

ORF rozpoczyna się od ATG przy pozycjach nukleotydów 374 do 376 i stopie przy kodonie TGA przy pozycjach nukleotydów 12068 do 12070. Region niekodujący 5' poprzedzający ORF ma 373 nukleotydy długości. Jego sekwencja jest wysoce zachowawcza pomiędzy szczepami Brescia, Alfort i C (fig. 2), i przewidywana drugorzędowa struktura tego regionu przypomina strukturę niekodującego regionu 5' wirusa hepatitis C (Brown i in. 1992, Nucleic Acids Res. 20 5041-5045), innego członka Flaviviridae. Niekodujący regionu 5' wirusa hepa184 836 titis C zawiera wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (Tsukiyama-Kohara i in. 1992. J. Virol. 66: 1476-1483). Takie miejsca pełnią ważne funkcje regulacyjne (Agol. 1991. Adv. Virus. Res. 40:103-180). Analogia z wirusem hepatitis C wskazuje, ze niekodujący region 5' CSFV także zawiera wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu, umiejscowione w przybliżeniu pomiędzy nukleotydami 124 i 374 SEKW. NR ID. 1, jako ważny element regulacyjny. Wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu może być użyte jako miejsce dla mutacji w celu osłabienia wirusa, jak też zmiany strategii translacji ORF.

Drugi ważny region regulacji replikacji pestiwirusów to region niekodujący 3'. Po porównaniu sekwencji szczepu C z sekwencją szczepów Brescia i Alfort, zauważa się sekwencję 13 nukleotydów właściwą dla szczepu C w regionie (fig. 2B). Ta unikalna sekwencja ttttctttttttt znajduje się w pozycjach nukleotydów od 12128 do 12140 w sekwencji SEKW. NR ID. 1. Jest to jedyna insercja więcej niż dwu nukleotydów obok siebie obserwowana w sekwencji szczepu C w porównaniu z sekwencją szczepów Brescia i Alfort. W pozostałej części, sekwencje w regionie niekodującym 3' trzech szczepów CSFV jest wysoce homologiczna. Całkowita homologia pomiędzy sekwencjami w tym regionie jest niższa przy porównaniu szczepów CSFV i BVDv. Niemniej jasne jest, ze sekwencja ttttctttttttt szczepu C nie występuje także w sekwencji regionów niekodujących 3' szczepów BVDV. Sekwencja TTTTCTTTTTTTT okazuje się więc być unikalna dla genomu szczepu C, i będzie stanowić doskonały marker dla specyficznej sekwencji szczepu C.

Sekwencję tę można użyć jako bazę dla sond nukleotydowych, i do określania sekwencji, w celu identyfikacji specyficznych dla pestiwirusów szczepu C. Tak więc wszystkie szczepy pestiwirusa mające tę sekwencję w regionie niekodującym 3' (niekoniecznie w identycznej pozycji jak w szczepie C) są uważane za spokrewnione ze szczepem C, i są także częścią wynalazku.

Istotnym parametrem infekcyjności transkryptów kopii DNA genomu pestiwirusa jest sekwencja aminokwasowa. W tym sensie należy rozwazyć dwa aspekty związane z klonowaniem i sekwencjnowaniem wirusów RNA ogólnie, a pestiwirusów w szczególności. Po pierwsze, częstość mutacji genomu dodatniej nici RNA wirusów jest wysoka (około 1/10⁴nukleotydów podczas replikacji), a więc żaden zapas wirusa lub wirusowego RNA nie jest klonujący z punktu widzenia zawartego wirusowego RNA. Pośród tych cząsteczek RNA mogą także być cząsteczki nieinfekcyjne. Jeśli jest to spowodowane przez przedwczesne kodony stopu w dużej otwartej ramce odczytu, byłoby to łatwe do rozpoznania. Także mutacje wpływające na aktywne miejsca wirusowych enzymów, lub znane struktury białek byłyby łatwe do rozpoznania. Jednakże dla nieznanej zależności pomiędzy sekwencją aminokwasową i funkcją i strukturą białka jest nieznana, jak w przypadku większości pestiwirusowych białek, nie da się przewidzieć, który aminokwas jest ważny, a który nie. Po drugie, mutacje mogą być wprowadzane podczas syntezy cDNA. Tak więc genom szczepu C klonowano i sekwencjonowano niezależnie dwukrotnie. Regiony z różnicami pomiędzy sekwencjami były klonowane i sekwencjonowane co najmniej trzykrotnie (por. fig. 1). Sekwencje, które spotykano dwukrotnie na poszczególnej pozycji, były uważane za poprawne na tej pozycji. Konieczność takiego podejścia do generowania infekcyjnych transkryptów kopii DNA genomu szczepu C opiera się na następującym odkryciu. Pełnej długości kopia DNA PRKflc-113, złożona po drugiej rundzie klonowania i sekwencjonowania (fig. 3), okazała się nieinfekcyjna. Po klonowaniu i sekwencjonowaniu regionów z różnicami pomiędzy sekwencjami klonów cDNA z pierwszej i drugiej rundy, znalazło się pięć aminokwasów różniących się w pełnej długości kopii klonów cDNA z drugiej rundy i sekwencji szczepu C uważanej za poprawną. Po korekcji tych 5 aminokwasów w pPRKflc-113, otrzymano klon pPRKflc-133 dający infekcyjne transkrypty (fig. 4). 5 różnic jest umiejscowionych na pozycjach aminokwasowych 1414 (Val—Ala); 2718 (Gly—AsP); 2877 (Val—Met); 3228 (Leu—Met); 3278 (Tyr—Glu). Aminokwasy kodowane w tych pozycjach przez sekwencję cDNA nieinfekcyjną podano przed strzałką, aminokwasy w tych pozycjach w kopii infekcyjnej podano za strzałką (SEKW. NR ID 1). Czy każda ze zmian aminokwasów indywidualnie zabroni infekcyjności kopii DNA szczepu C, będzie można określić analizując infekcyjność transkryptów z indywidualnymi mutacjami każdego z pięciu aminokwasów. Jednak odkrycie to pokazuje, że małe różnice

184 836 w sekwencjach aminokwasowych mogą być istotnie ważne dla infekcyjności transkryptów kopii DNA genomu szczepu C. Wskazuje także, ze przygotowanie infekcyjnych transkryptów kopii sekwencji pestiwirusa może w praktyce okazać się niemożliwe, ze względu na małe różnice w sekwencjach (nawet na poziomie jednego aminokwasu) które mogą przejść niezauważone.

Mutanty szczepu C nadające się do wytwarzania (znakowanej) szczepionki są częścią wynalazku. Mogą zawierać mutacje takie jak delecje, insercje, (wielokrotne) mutacje nukleotydowe, i wstawione i/lub wymienione genomowe fragmenty pochodzące z innych szczepów pestiwirusów, w sekwencji nukleotydowej opisanej w SEKW. NR ID. 1.

Sekwencja szczepu C może być podzielona na cztery regiony przydatne dla mutacji i/lub wymiany. Regionem pierwszym jest niekodująca sekwencja 5' od nukleotydu 1 do 373. Region drugi koduje strukturalne białka N^pro-C-E2-E3-E1 od nukleotydu 374 do 3563. Region trzeci koduje niestrukturalne białka od nukleotydu 3564 do 12068. Regionem czwartym jest niekodująca sekwencja 3' od nukleotydu 12069 do 12311.

Region szczególnie dogodny do wytwarzania szczepionek znakowanych szczepu C obejmuje genomowy region kodujący strukturalne białka Np^r0-C-E2-E3-E1. Region ten znajduje się pomiędzy aminokwasami 1 i 1063 w sekwencji SEKW. NR ID. 1. Korzystne subregiony tej części genomu wskazują następujące sekwencje aminokwasowe: 1-168 (Np^to), 169 do 267 (C), 268 do 494 (E2), 495 do 689 (E3), i 690 do 1063 (E1), lub ich części. Przykładowo N-termitalną antygenową część regionu kodującego El szczepu C, od aminokwasu 690 dd 877, wymieniono z odpowiednim regionem E1 szczepu Brescia (fig. 4, pPRKflc-h6). Nowo utworzona pochodna szczepu C jest infekcyjna i może być wydzielona z dzikiego typu szczepu i szczepu Brescia w reakcji ze szczepem C i monoklonalnymi przeciwciałami specyficznymi dla Brescia, skierowanymi wobec E1 i E2: przykładowo, powstały szczep C reaguje z monoklonalnymi przeciwciałami specyficznymi dla E1 szczepu Brescia (tabela 1). Tak więc antygenowe właściwości nowego mutanta zmieniły się w porównaniu z macierzystym wirusem, wskazując na to, że wymiana N-terminalnej połowy E1 szczepu C na połowę z innego szczepu CSFV jest jednym z podejść do opracowania znakowanej szczepionki szczepu C.

Jednakże wynalazek nie ogranicza się do wymiany N-terminalnych połówek E1 pomiędzy szczepem C i innym szczepem CSFV. N-terminalne połówki E1 z dowolnych innych szczepów pestiwirusa mogą być wymienione na odpowiednie części E1 szczepu C. W tym sensie, sekwencje E1 szczepów pestiwirusa wydzielone ze świń, lecz należące do antygenowych grup innych niż szczep C, są szczególnie dogodne. Przykłady takich szczepów, dobrane na zasadzie krzyzowego zobojętnienia, obejmują szczepy „Van EE, „Stam”, „SF UK 87”, „Wisman” i „5250” (Wensvoort i in. 1989. Vet. Microbiol. 20: 291-306; Wensvoort. 1992. W: Report on meeting of national swine laboratories within the European Community. 16-17 czerwca 1992. VI/4059/92-EN (PVET/EN/1479) 1992, str. 59-62).

N-terminalna połówka E1 okazała się zawierać trzy odróznialne antygenowe domeny, A, B i C, umiejscowione na odróżnialnych częściach białka E1 i poddawane reakcji z silnie neutralizującymi monoklonalnymi przeciwciałami (Wensv88rt. 1989. J. Gen. Virol. 70: 28652876; Van Rijn i in. 1992. Vet. Microbiol. 33: 221-230; Van Rijn i in. 1993. J. Gen. Virol. 74: 2053-2060). Epitopy zachowane pośród 94 badanych szczepów CSFV mapują się do domeny A, podczas gdy epitopy domen B i C są niekonserwatywne (Wensv8ort. 1989. J. Gen. Virol. 70: 2865-2876). Mapowanie epitopów hybrydami genów E1 szczepów Brescia i C (Van Rijn i in. 1992. Vet. Microbiol. 33: 221-230), i delecyjnymi mutantami E1 szczepu Brescia, sugerują, ze domeny A i B + C tworzą dwie odróznialne antygenowe jednostki N-terminalnej połówce E1 (Van Rijn i in. 1993. J. Gen. Virol. 74: 2053-2060). Sugestię tę wsparto następnie odkryciem, ze 6 cystein umiejscowionych w pozycjach 693, 737, 792, 818, 828 i 856, w N-terminalnej połówce E1 ma krytyczne znaczenie dla poprawnego zwijania E1. Jednakże co najmniej Lys 792 nie jest istotnie ważna dla infekcyjności szczepu Brescia, ponieważ wyizolowano odporny na monoklonalne przeciwciało mutant tego wirusa z mutacją Cys—>Arg w tej pozycji (Van Rijn i in. 1993. Presentation and abstract at the 9th International Congress of Yirology. 8-15 13 August. Glasgow. Szkocja).

184 836

Podczas gdy małe zmiany w sekwencji aminokwasowej mogą zablokować infekcyjność RNA szczepu C (patrz przykład 2), zmiana cysteiny w pozycji 792 pokazuje, ze zmiana aminokwasu w pozycji mniej przewidywanej jako przydatna do modyfikacji bez utraty funkcji, może nadal dać żywotny mutant wirusa. Tak więc wpływ poszczególnych zmian aminokwasów na właściwości wirusa musi być określany empirycznie dla każdego aminokwasu w sekwencji szczepu C. To pokazuje ponownie, ze nie istnieje oczywista docelowa sekwencja do modyfikacji szczepu C, np. dla opracowania znakowanej szczepionki, możliwa do zidentyfikowania na podstawie uprzednio opublikowanej informacji.

Istotna dla opracowania znakowanej szczepionki szczepu C jest możliwość rozróżnienia serologicznego pomiędzy szczepionymi świniami i świniami zarażonymi zwykłym szczepem CSFV. Wykazano uprzednio, ze żywy osłabiony wektor wirusa choroby Aujeszky'ego dający ekspresję E1, lub oczyszczone przez immunopowinowactwo E1, poddane ekspresji w komórkach owada z wektorem bakulowirusowym, indukuje ochronną odpowiedź immunologicznąu świń wobec cholery świń (WO 91/00352; Van Zijl i in. 1991. J. Virol. 65: 2761 2765; Hulst i in. 1993. J. Virol. 67: 5435-5c2). Odkryto niespodziewanie, ze mutanty E1 z delecją domeny A lub delecją domeny B + C (fig. 5), także indukują ochronną odpowiedź immunologiczną u świń wobec cholery świń (tabela 2). Wskazuje to, że ochronna odporność indukowana przez szczep szczepionkowy nie zależy od zneutralizowania przeciwciał wobec obu domen A i B + C. Tak więc mutanty szczepu pestiwirusowego mające wymienione lub zmutowane tylko domeny A, lub tylko domeny B + C, lub ich części, odpowiednim regionem innego pestiwirusa, korzystnie, lecz nie wyłącznie pestiwirusa wydzielonego ze świń z innej antygenowej grupy, niż szczep C (przykłady powyżej), są także częścią wynalazku. Region E1 pokrywający domenę A i dogodny dla wymiany lub mutacji, jest umiejscowiony pomiędzy aminokwasami 785 i 870. Części tego regionu mogą także być dogodnie wymieniane lub mutowane, np. podregiony umiejscowione pomiędzy aminokwasami 785 i 830 i pomiędzy aminokwasami 829 i 870. Region E1 pokrywający domeny B + C i dogodny dla wymiany lub mutacji jest umiejscowiony pomiędzy aminokwasami 691 i 750. Część tego regionu może także być dogodnie wymieniona lub zmutowana, np. podregiony umiejscowione pomiędzy aminokwasami 691 i 718 i pomiędzy aminokwasami 717 i 750.

Zwierzęta zainfekowane pestiwirusami wytwarzają przeciwciała wobec E2 (Kwang i in., 1992. Vet. Microbiol. 32: 281-292; Wensvoort. niepublikowana obserwacja). Tak więc drugim regionem dogodnym do opracowania (znakowanej) szczepionki poprzez mutację (delecję, insercję, punktową mutację), lub wymianę odpowiedniego genetycznego materiału z antygenowo różnym pestiwirusem, lub z pestiwirusem należącym do różnych antygenowo grup, jest region kodujący E2.

Szczepu C można także uzyć jako wektora do insercji i ekspresji heterologicznego genetycznego materiału (sekwencji). Przy opracowywaniu wektorów, heterologiczny genetyczny materiał wstawiany do szczepu C służy do zmieniania strategii translacji dużej ORF i przetwarzania białka kodowanego przez tę ORF. Przykładem sekwencji przydatnej do zmiany strategii translacji dużej ORF jest sekwencja specyfikująca wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (1RES) (Duke i in. 1992. J. Virol. 66:1602-1609 i tam wymienione odnośniki). Przykładem sekwencji dogodnej do zmieniania przetwarzania białka jest sekwencja sygnałowa odpowiedzialna za przeniesienie białek usuwanych z komórki lub wstawianych w błony, przez błonę do siateczki śródcytoplazmatycznej (Blobel, 1980. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:1496-1500; Kreil, 1981. Annu. Rev. Biochem. 50: 317-348). Sekwencje sygnałowe są wycinane przez komórkowe peptydazy sygnałowe. Jednakże sekwencje kodujące miejsca cięcia wirusowych proteaz można równie dobrze stosować do zmieniania przetwarzania białka.

Sekwencje wstawione i poddane ekspresji przez wektor szczepu C mogą być używane jako markery do identyfikacji szczepionych świń, lub mogą być używane do chronienia świń przed patogenem, z którego pochodzi heterologiczna wstawiona sekwencja Markerowe sekwencje są korzystnie wysoce antygenowe i należą do mikroorganizmów nie replikujących u świń. Mogą kodować znane kompletne produkty genowe (np. białka kapsydowe lub otoczki) lub antygenowe części tych produktów genowych (np. epitopy). Korzystnie markerowe sekwencje pochodzą z wirusów należących do rodzin: Adenoviridae. Arenaviridae, Arteriviri14

184 836 dae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Rhabdoviridae, Parvoviridae, Poxviridae, Picomaviridae, Reoviridae, Retroviridae i Togaviridae. Jednakże markerowe sekwencje mogą także kodować sztuczne antygeny nie spotykane zwykle w naturze lub histochemiczne markery jak β-galaktozydaza Escherichia coli, dehydrogenaza alkoholu Drosophila, ludzka łożyskowa fosfataza alkaliczna, lucyferaza świetlika i acetylotransferaza chloramfenikolu.

Heterologiczny genetyczny materiał kodujący jedno lub więcej białek indukujących ochronną odporność przed chorobą wywoływaną przez patogen odpowiadający heterologicznemu genetycznemu materiałowi może pochodzić z innych szczepów pestiwirusów, w tym sekwencji szczepów opisanych powyżej, świńskiego parwowirusa, świńskiego koronawirusa dróg oddechowych, zakaźnego wirusa żołądkowo-jelitowego, świńskiego wirusa zespołu reprodukcji i dróg oddechowych (wirusa Lelystad EP. 92200781.0), wirusa choroby Aujeszky'ego, świńskiego wirusa endemicznej biegunki i świńskiego wirusa grypy, oraz bakterii, takich jak Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis, Treponema hyodysenteria, Escherichia coli, Leptospira i micoplazm, takich jak M. hyopneumoniae i M. lyorhinis.

Dogodne miejsca insercji heterologicznej sekwencji w szczepie C, ale nie jedyne, są umiejscowione pomiędzy resztami aminokwasowymi 170 i 171, pomiędzy resztami 690 i 691 i pomiędzy resztami 691 i 692, co pokazano w SEKW. NR ID. 1.

Wynalazek obejmuje także diagnostyczne testy stosowane do rozróżnienia świń szczepionych markerową szczepionką lub podjednostkową szczepionką zawierającą (zmutowane) E1 i/lub (zmutowane) E2 i świń zainfekowanych normalnym szczepem pestiwirusa.

Dogodne postaci takich różnicujących diagnostycznych testów opisano w przykładach 4 i 5. W konwencjonalnym nieróznicującym teście ELISA CSFV, stosuje się E1 jako antygen w kompleksowy pułapkowej blokującej (CTB) próbie ELISA opisanej przez Wensvoora i in., 1988. (Vet. Microbiol. 17:129-140). Ten dotychczasowy test CTB-ELlSA, także nazywany testem Liquid Phase Blocking ELISA, lub testem sandwiczowym ELISA z podwójnym przeciwciałem, stosuje dwa monoklonalne przeciwciała (Mab) wobec E1 szczepu CSFV Brescia. Epitop Mab b3, umiejscowiony w domenie A, zachowuje się wśród szczepów CSFV, podczas gdy epitop Mab b8, umiejscowiony w domenie C, nie zachowuje się (Wensvoort, 1989. J. Gen. Virol. 70: 2865-2876). Test CTB-ELISA jest czuły, pewny i specyficznie wykrywa specyficzne dla CSFV przeciwciała u świń zainfekowanych pestiwirusem. Tak więc test rozróznia pomiędzy świniami zainfekowanymi szczepem CSFV i świniami zainfekowanymi np. szczepem BVDV. Jednak test nie rozróżnia pomiędzy świniami zainfekowanymi zwykłym szczepem CSFV i świniami szczepionymi szczepionką szczepu C. Test ten nie jest także dogodny dla podjednostkowej szczepionki E1, żywej lub martwej.

Jednym z testów według wynalazku jest zmodyfikowany CTB-ELISA, oparty na tylko jednym MAb. Na przykład. MAb b3. Taki test CTB-ELISA, oparty na tylko jednym Mab, którego używa się do wiązania antygenu do powierzchni płytki ELISA, jak też współzawodniczenia z surowicą zwykłą, nie został dotąd opisany i stanowi zasadniczą część wynalazku. Po obecnym opisaniu zasad testu można go z pożytkiem zastosować do opracowania diagnostycznych zestawów do wykrywania innych przeciwciał, w tym przeciwciał wobec innych wirusów lub innych chorób, lub przeciwciał wskazujących na inne stany ciała człowieka lub zwierzęcia. Odkrycie jest więc przydatne dla testów CTB-ELISA, lub testów ELISA opartych na tej samej zasadzie co test CTB-ELISA, rozwijanych na podstawie pojedynczego Mab i dimeryzowanego lub multimeryzowanego antygenu. Zastrzeżony test stosuje się także do określania innych członków par specyficznie wiążących partnerskich cząsteczek, takich jak aktywatory/receptory, enzymy/inhibitory i tym podobne, w których jeden z partnerów ma co najmniej dwa identyczne miejsca wiązania.

Tak więc wynalazek ujawnia także sposób określania obecności testowej substancji (np. przeciwciała) zdolnego do specyficznego wiązania z miejscem wiązania partnera wiązania (np. antygenu), w próbce, dzięki współzawodnictwu testowej substancji z mierzalną ilością odnośnikowej substancji (przeciwciała) zdolnej do specyficznego wiązania z tym samym

184 836 miejscem wiązania partnera wiązania, obejmujący (1) zetknięcie próbki z (a) odnośnikową substancją (przeciwciałem) związanym ze stałym nośnikiem, (b) partnerem wiązania (antygenem) dla odnośnikowej substancji, przy czym partner wiązania cząsteczki zawiera co najmniej dwa identyczne miejsca wiązania odnośnikowej substancji, i (c) odnośnikową substancją (przeciwciałem) wyposażonym w marker; (2) zmierzenie stopnia oddzielenia markera od nośnika.

Przykładowo partner wiązania (antygen) dla odnośnikowej substancji (przeciwciała), zawierający co najmniej dwa identyczne miejsca wiązania to dimer partnera wiązania (antygenu) dla odnośnikowej substancji.

Zgodnie z tymi zasadami przedmiotem wynalazku jest także sposób określania obecności testowej substancji (antygenu) mającej co najmniej dwa identyczne miejsca wiązania na cząsteczkę do specyficznego wiązania z partnerem wiązania (przeciwciałem) w próbce, obejmujący (1) zetknięcie próbki z (a) partnerem wiązania (przeciwciałem) związanym ze stałym nośnikiem i (b) partnerem wiązania (przeciwciałem) wyposażonym w marker;

(2) zmierzenia stopnia wiązania markera z nośnikiem.

W sposobach tych przeciwciała i antygeny są wymieniane tylko przykładowo; mogą być podstawione innymi specyficznymi cząsteczkami partnerami wiązania.

Wynalazek ujawnia tez diagnostyczny zestaw zawierający: (a) odnośnikowe monoklonalne przeciwciało związane ze stałym nośnikiem, (b) odnośnikowe monoklonalne przeciwciało wyposażone w marker; i ewentualnie (c) antygen wobec odnośnikowego przeciwciała zawierający co najmniej dwa identyczne miejsca wiązania dla odnośnikowego przeciwciała; lub kompleks pomiędzy wymienionymi składnikami (a) i/lub (b) i (c); jak też dalsze składniki do prowadzenia immunologicznej próby współzawodnictwa.

Sposób jest dogodny jako różnicujący diagnostyczny test w połączeniu z podjednostkową szczepionką E1, która zawiera delecję w jednym lub więcej epitopach E1, np., domenie A. Test jest także dogodny w połączeniu z podjednostką E1 której domeny A zostały zmutowane w taki sposób, ze przeciwciała indukowane wobec takich zmutowanych domen A nie współzawodniczących z Mab b3 o epitop Mab b3. Ponadto, test jest dogodny w połączeniu ze zmodyfikowanymi szczepionkami szczepu C lub innego szczepu CSFV z delecją w domenie A, z domeną A wymienioną na domenę pestiwirusa należącego do różnej antygenowej grupy od CSFV (patrz powyżej), lub z domeną A zmutowaną tak, że przeciwciała skierowane wobec domeny nie współzawodniczą z Mab b3 o epitop Mab b3. Chociaż test opisano przykładami dla domeny A E1, podobny test oparty na wyłącznie Mab b8 można stosować w połączeniu ze szczepionką z delecją w domenie B + C lub domenie C, z domeną B + C lub domeną C wymienioną na domenę pestiwirusa należącego do różnej antygenowej grupy od CSFV (patrz powyżej), lub z domeną B + C lub domeną C zmutowaną tak, że przeciwciała skierowane wobec domeny nie współzawodniczą z Mab b8'o epitop Mab b8. Test zilustrowano dla Mab b3 lub Mab b8 szczepu Brescia. Jednakże test może być przydatnie zastosowany dla innych Mab skierowanych wobec domeny A lub domeny B + C E1 szczepu Brescia lub wobec domeny A lub domeny B + C dowolnego innego szczepu CSFV, lecz także dla Mab wobec analogicznych domen w E1 dowolnego innego pestiwirusa. Test może także opierać się na epitopach E2 (patrz przykład 5). Antygeny przydatne w (zmodyfikowanych) testach CTBELISA według wynalazku są korzystnie dimerami lub multimerami E1 (plus lub minus 3'TMR) lub E2 (patrz przykład 5) szczepów CSFV reagujących z Mab b3 lub Mab b8 lub podobnymi Mab skierowanymi wobec epitopów E2. W przypadku szczepionki ze zmutowaną domeną A, dimery lub multimery antygeny stosowane do diagnostycznego testu mogą być syntetyzowane przez delecję konstruktu B + C (patrz przykład 5), lub w przypadku szczepionki ze zmutowaną domeny B + C, dimery lub multimery antygeny stosowane do diagnostycznego testu mogą być syntetyzowane przez delecję konstruktu A (porównaj fig. 5 z konstruktami; porównaj przykłady 4 i 5). dimeryzowane (lub multimeryzowane) formy antygenu E1 są zapewne oparte na mostkach disiarczkowych tworzonych przez reszty cysternowe w C-terminalnej części E1. Pozwala to na bardzo wrażliwy test immunologiczny, ponieważ dimeryzowane cząsteczki antygenu zawierają dwie kopie epitopu jednego Mab Tak więc

184 836 ten jeden Mab może być użyty do unieruchomienia dimeryzowanego antygenu via jeden epitop i do znakowania dimeryzowanego antygenu via drugi epitop. Współzawodnictwo przeciwciał surowicy próbki powstałych w wyniku infekcji zwykłym szczepem inhibituje wiązania znakowanego przeciwciała z antygenem i daje wrażliwy test obecności takich przeciwciał. Przedmiotem wynalazku są także diagnostyczne zestawy oparte na tym sposobie, przy czym zestaw obejmuje antygeny oparte na El lub E2, i (enzymatycznie) znakowane i unieruchomione monoklonalne przeciwciała tego samego typu skierowane na epitop El lub E2, jak też dalsze konwencjonalne składniki (płytki, rozcieńczalniki, podłoże enzymowe, środki barwiące, itp.) do prowadzenia testu immunologicznego typu współzawodnictwa.

Szczepionka według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową opisaną powyżej, jako taką lub jako szczep szczepionkowy lub w wektorze lub organizmie gospodarza, lub polipeptyd opisany powyżej, w ilości skutecznej dla zabezpieczenia przed infekcją pestiwirusem. Szczepionka może także być wielozadaniową szczepionką zawierającą inne immunogeny lub nukleotydy je kodujące. Szczepionka może ponadto zawierać konwencjonalne nośniki, adiuwanty, solubilizery, emulgatory, konserwanty itp. Szczepionki według wynalazku można wytwarzać konwencjonalnymi sposobami.

Sposób według wynalazku wytwarzania infekcyjnych transkryptów pełnej długości kopii DNA genomu szczepu CSFV, szczepu C, jest przydatny w przypadku dowolnego innego szczepu pochodnego C, lub szczepu pestiwirusa. Sposób opisany tu dla żywej osłabionej szczepionki szczepu CSFV, może także być bardzo przydatnie zastosowany do in vitro osłabiania (modyfikacji) szczepu C lub dowolnego innego szczepu CSFV lub pestiwirusa, dla celów szczepień.

Szczepionka szczepu C według wynalazku pozwala na serologiczne rozróżnienie pomiędzy świniami szczepionymi i świniami zainfekowanymi zwykłym szczepem CSFV. Markerowe szczepionki dowolnego innego szczepu CSFV lub szczepu pestiwirusa można równie łatwo otrzymać stosując sposoby według wynalazku. Takie markerowe szczepionki można rozwijać np. przez mutowanie (delecje, punktowe mutacje, insercje) regionu kodującego El, lub N-terminalnej połówki Eł, lub domeny A lub B + C El, lub regionu kodującego E2 szczepu C, lub analogicznych regionów w genomie pochodzącym od szczepu C, lub innych szczepów pestiwirusów, lub dzięki wymianie tych regionów na odpowiadające im regiony antygenowo różnych pestiwirusów lub pestiwirusów należącym do różnych antygenowo grup.

Alternatywne podejście do opracowania markerowej szczepionki szczepu C to dodanie do jego genomu heterologicznego genetycznego materiału dającego ekspresję wysoce antygenowego białka lub epitopów mikroorganizmu nie replikującego u świń, lub sztucznego i nie występującego normalnie u świń.

Ponadto taki heterologiczny genetyczny materiał może kodować antygeny indukujące ochronną odporność na chorobę wywoływaną przez mikroorganizm patogenny dla świń. Tak więc zastosowanie szczepu C, lub szczepów pochodzących ze szczepu C, lub dowolnych innych szczepów pestiwirusa, jako wektorów ekspresji heterologicznych antygenów indukujących ochronę przed poszczególną chorobą w organizmie gospodarza, przy czym gospodarz jest ssakiem, jest także częścią wynalazku. Konstrukcję rekombinacyjnych wirusów szczepu C dających ekspresję heterologicznej sekwencji i dogodne miejsca insercji tych heterologicznych sekwencji opisano powyżej. Analogiczne rekombinacyjne wirusy można wytwarzać dla wirusów pochodnych szczepu C, lub dla dowolnego innego pestiwirusa. Wirusy te są zatem także częścią wynalazku.

Istotna część wynalazku odnosi się do immunogennnego potencjału podjednostki El z delecją w domenie A, lub domenie B + C. Jak podsumowano w tabeli 2, oba takie mutanty El są zdolne do indukowania ochronnej odporności u świń przed prowokacją śmiertelną dawką wysoce wirulentnego szczepu Brescia. Zastosowanie mutantów El zawierających delecje lub inne mutacje w domenach A i B + C jako martwych podjednostkowych szczepionek, lub jako żywych podjednostkowych szczepionek poddawanych ekspresji przez system wektora w szczepionym zwierzęciu, wobec CSF, jest także częścią wynalazku. Także zmutowane El wraz z innymi antygenowymi białkami CSFV, np. E2 lub zmutowaną formą E2, są przydatne jako martwe lub żywe podjednostkowe szczepionki (patrz powyżej).

184 836

Wynalazek ujawnia także diagnostyczne testy, które można stosować do rozróżniania pomiędzy świniami szczepionymi markerową szczepionką CSFV, lub podjednostkową szczepionką zawierającą (zmutowane) E1 i/lub (zmutowane) E2, i świniami zainfekowanymi zwykłym szczepem pestiwirusa. Taki diagnostyczny test może być oparty na serologii, wykrywaniu antygenu, lub wykrywaniu kwasu nukleinowego. Wybór właściwego testu w danym przypadku między innymi zalezy od specyficzności użytego markera. Jedną z dogodnych form serologicznego diagnostycznego testu jest zmodyfikowany test CTB-ELISA, opisany w przykładzie 4. Według wynalazku sposób ten, oparty na teście CTB-ELISA z zastosowaniem pojedynczego przeciwciała, nie ogranicza się do zastosowań w kontekście CSFV lub innych pestiwirusów, lecz stosuje się także do określania innych przeciwciał dla innych diagnostycznych celów u ludzi lub zwierząt, jak tez do określania innych specyficznie wiążących substancji.

Przykładem przydatnego test wykrywania antygenu w połączeniu ze markerową szczepionką szczepu C jest test wykrywający zwykły szczep CSFV E1, a nie szczep szczepionkowy E1 w krwi świń. Jeśli domenę A szczepu C zmodyfikowano np. przez wymianę domeny na domenę szczepu pestiwirusa należącego do różnych antygenowych grup niż CSFV, taki test może być oparty na monoklonalnych przeciwciałach rozpoznających konserwatywne epitopy domeny A CsfV.

Jednakże jeśli region E2 szczepu C jest zmodyfikowany do celów opracowania markerowej szczepionki, serologiczny lub antygenowy diagnostyczny test towarzyszący takiej szczepionce wykrywa różnice pomiędzy szczepionymi i zainfekowanymi zwierzętami, odnoszące się do zmodyfikowanego regionu E2. Takie diagnostyczne testy stosują więc specyficzne wobec E2 sekwencje jako antygen. Te specyficzne wobec E2 sekwencje mogą pochodzić z macierzystego szczepu C (patrz przykład 5), ze szczepów CSFV antygenowe różnych od szczepu C, lub z pestiwirusów należących do różnych antygenowo grup niż CSFV. Jednak te specyficzne wobec E2 sekwencje mogą być także otrzymane via mutację (delecję, insercję, lub punktową mutację) rodzimego E2 dowolnego pestiwirusa, lub mogą składać się ze (zmutowanych) części E2 dowolnego pestiwirusa. Dimeryczne E2 i multimeryczne E2 może być użyte jako antygen w diagnostycznym teście (patrz przykład 5). Także E2 w połączeniu z jednym monoklonalnym przeciwciałem (porównaj przykłady 4 i 5) można stosować w teście CTB-ELISA, którego zasady opisano powyżej. Diagnostyczny test oparty na E2 opisano w przykładzie 5. Gdy zestaw wykrywający antygen ma wykrywać pestiwirus E2 i jest oparty na jednym Mab, taki zestaw testowy korzystnie zawiera przeciwciało rozpoznające konserwatywny epitop na E2. Takie testy są także częścią wynalazku.

Na koniec, diagnostyczny test może być oparty na specyficznym wykrywaniu regionu zwykłych szczepów CSFV, zmodyfikowany wszczepie C. Dogodne techniki testu obejmują hybrydyzację kwasu nukleinowego, np. specyficznymi sondami, i/lub wzmocnienie, np. w reakcji łańcuchowej polimerazy. Alternatywnie, sekwencje szczepu C można rozróżniać od sekwencji zwykłego szczepu CSFV metodą wzmocnienia PCR (części) region niekodującego 3' zawierającego sekwencji ttttctttttttt unikalną dla genomu szczepu C.

Jeśli szczep C jest zmodyfikowany przez insercję heterologicznej sekwencji markera, dowolna postać diagnostycznego testu opartego na tej sekwencji, np. opartego na antygenie, epitopach, lub histochemicznych produktach kodowanych przez tę sekwencję, lub opartego na wykrywaniu heterologicznej genetycznej informacji technikami hybrydyzacji kwasu nukleinowego, np. specyficznymi sondami, i/lub technikami wzmocnienia, jak reakcja łańcuchowa polimerazy, jest także częścią wynalazku.

Przykład 1

Molekularne klonowanie i sekwencjonowanie genomu szczepu C.

Komórki i wirus

Komórki nerki świni (SK6-M. EP-A-351901) hodowano w podstawowej pożywce Eagle zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i antybiotyki. FBS badano na obecność BVDV i przeciwciał BVDv w sposób opisany (Moormann i in. 1990. Virology 177: 184-198). Użyto tylko surowice wolne od BVDV i przeciwciał BVDV. „Chiński” szczep szczepionkowy (szczep C) wirusa klasycznej gorączki świń (CSFV) adaptowano do komórek

184 836

SK6-M w sposób opisany w EP-A-351901. Szczep oznaczony „Cedipest” jest niecytopatyczny i był biologicznie klonowany przez trzykrotne rozcieńczenie. Po trzech etapach wzmacniania wytworzono zapas klonowanego wirusa z mianem 3,5 · 10⁶ TCID50/ml.

Wydzielanie cytoplazmatycznego RNA komórek SK-6 infekowanych szczepem C

Międzykomórkowy RNA z komórek zarazonych szczepem C wydzielono zasadniczo w sposób opisany (Moormann i in. 1990. Virology 177:184-198).

Krótko, warstwy jednokomórkowe komórek SK6-M w butlach 162 cm³ (Costar) zainfekowano Cedipest na poziomie infekcji (m.o.i.) 5 TCID50 na komórkę. Następnie komórki inkubowano przez 1,5 godziny w temperaturze 37°C i dodano świeżą pożywkę do końcowej objętości 40 ml. Po 7 godzinach dodano Actinomycin D do końcowego stężenia 1 (ig/ml. Po 24 godzinach komórki przemyto dwukrotnie zimną solanką buforowaną, fosforanem (PBS) i lizowaną w zimnym buforze lizy (50 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,14 M NaCl, 2 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,5% [objętościowo] NP-40, 0,5% [wagowo] deoksycholanu Na i 10 mM kompleksów wanadylowych rybonukleozydu (New England Biolabs)). Lizaty odwirowano (4°C, 5 minut, 4000 g) i supernatant potraktowano proteinazą K (końcowe stężenie 250 pg/ml,) przez 30 minut w temperaturze 37°C, ekstrahowano dwukrotnie fenolem, chloroformem i alkoholem izoamylowym (49:49:2) i ekstrahowano raz chloroformem i alkoholem izoamylowym (24:1). RNA przechowywano w etanolu.

Synteza i wzmocnienie cDNA

Jeden do 2 pg cytoplazmatycznego RNA komórek zainfekowanych szczepem C i 20 pmol (-)sensownego startera inkubowano z 1 pl 10 mM wodorotlenek metylortęci przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Denaturowany RNA inkubowano następnie z 1 pl 286 mM β-merkaptoetanolem przez 5 minut w temperaturze pokojowej. RNA poddano odwrotnej transkrypcji 200-400 jednostkami odwrotnej 5 transkryptazy M-MLV z deficytem RNazy H (Promega) przez 45 minut w temperaturze 42°C w 1 x buforze odwrotnej transkryptazy M-MLV (50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl₂ i 10 mM DTT), 40 U rRNasin (Promega) i 80 pM dATP, dGTP, dCTP i dTTP. Końcowa objętość reakcji wynosiła 25 pl. Próbki pokryto 30 pl mineralnego oleju (Sigma).

Po odwrotnej transkrypcji (RT) próbki denaturowano przez 10 minut w temperaturze 94°C. Porcje 2,5 pl każdej reakcji RT wzmocniono w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z 39 cykli (cykl: 94°C, 60 s; 55°C, 60 s i 72°C, 1-2 minuty) w 100 pl bufora polimerazy Taq (od wytwórcy polimerazy Taq) zawierającego 1 pM (+) jak też (-)sensownego startera, 200 pM każdego z czterech dNTP i 2,5 U polimerazy DNA Taq (Boehringer Mannheim). Próbki pokrywano 75 pl mineralnego oleju (Sigma).

Klonowanie cDNA pokrywającego cały genom szczepu C

Genom szczepu C klonowano niezaleznie dwukrotnie. Podczas pierwszej rundy klonowania (fig. 1 Al), startery syntezy pieiw/szej nici cDNA i PCR dobrano na podstawie homologii pomiędzy sekwencjami szczepów CSFV Brescia (Moormann i in. 1990. Virology 177:184198) i Alfort (Meyers i in. 1989. Virology 171:555-567) i szczepów BVDV Osloss (Renard i in. EP 0208672) i NADL (Collett i in. 1988. Virology. 165: 191-199). Rozmiary fragmentów cDNA dobrano pomiędzy 0,5-2,5 tysięcy par zasad w celu otrzymania optymalnego wzmocnienia. Oczyszczone na zelu produkty wzmocnienia potraktowano polimerazą T4 RNA i polimerazą I DNA Klenowa i fosforylowano kinazą polinukleotydową T4. Następnie fragmenty cDNA poddano ligacji ligaząT4 w miejscu Smal pGEM4z-blue.

W drugiej rundzie klonowania (fig. 1B), startery dobrano z sekwencji klonów cDNA otrzymanych po pierwszej rundzie klonowania. Tam, gdzie to możliwe, startery zawierały miejsca restrykcji dogodne do klonowania wzmocnionych fragmentów cDNA. Po wzmocnieniu RT i PCR (patrz powyżej), fragmenty cDNA pocięto dwoma różnymi enzymami restrykcji, lub stworzono lepkie końce i fosforylowano (w sposób opisany powyżej) na jednym końcu i trawiono dogodnym enzymem restrykcji na drugim końcu. Jeśli nie było możliwe użycie wprowadzonych przez PCR miejsc restrykcji umiejscowionych w starterach, wybierano do klonowania miejsce we wzmocnionym fragmencie cDNA. Po oczyszczeniu na zelu, produkty PCR poddano ligacji z oczyszczonym na żelu pGEM4z-blue (Promega) lub pGEM5zf(+)

184 836 (Promega), trawionych enzymami restrykcji tworzącymi końce zgodne z końcami produktów PCR.

W celu wytworzenia klonów cDNA zawierających ostateczne końce 5' i 3' genomu szczepu C, użyto sposobu ligacji 3'-5' (Mandl i in. 1991. Journal of Virology 65:4070-4077). Cytoplazmatyczny RNA wydzielono z komórek zainfekowanych szczepem C w sposób opisany powyżej i następnie oczyszczono przez warstwę 5,7 CsCl (Moormann i Hulst, 1988. Virus Res. 11:281-291). W oparciu o wyniki sugerujące, że na końcu 5' genomu BVDV nie ma struktury Cap (Brock i in. 1992. J. Virol. Meth. 38: 39- 46), genomowy RNA szczepu C poddano ligacji bez wcześniejszego działania pirofosfatazą. 8 pg RNA poddano ligacji w mieszaninie reakcyjnej 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCh, 10 mM DTT, 20 U rRNasin (Promega), 10 pg/ml BSA (bez RNazy) i 1 mM ATP, stosując 10 U ligazy t4 RNA (New England Biolabs). Mieszaninę inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C. RNA ekstrahowano fenolem/chloroformem, strącono etanolem, granulowano i umieszczono w zawiesinie w wolnej od RNazy wody. Porcje 2 pg RNA poddano odwrotnej transkrypcji i wzmocniono w sposób opisany powyżej. Porcje 2 pl każdej PCR wzmocniono stosując zagnieżdżony zestaw starterów. W celu odwrotnej transkrypcji użyto (-) sensowny starter hybrydyzujący do niekodującego regionu 5'. W dwu etapach wzmocnienia PCR użyto (+) sensownych starterów hybrydyzujących z regionem niekodującym 3' i (-) sensowne startery hybrydyzujące z niekodującym regionem 5'. Po ekstrakcji fenolem/chloroformem i strącaniu etanolem, produkty PCR trawiono Ncol (wstawiony w (+) sensowny starter użyty w zagnieżdżonym PCR) i EagI (nukleotyd 81 w sekwencji SEKW. NR ID. 1) i poddano ligacji w miejsce Ncol-EagI pUC21 (Vieira i Messing. 1991. Gene 100: 189-194).

Wszystkie modyfikacje i procedury klonowania użyte w przykładzie 1 prowadzono zasadniczo w sposób opisany (Sambrook i in. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Enzymy restrykcyjne i enzymy modyfikujące DNA zakupiono i użyto w sposób opisany przez dostawców. Plazmidy transformowano i trzymano w Escherichia coli szczep DH5(a (Hanahan. 1985. w DNA cloning 1:109-135).

Sekwencjonowanie klonów cDNA

Plazmid DNA użyty do sekwencjonowania ekstrahowano i oczyszczono metodą alkalicznej lizy i strącenia LiCl, lub metodą odwirowania CsCl (Sambrook i in. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Zestaw sekwencjonowaniem oparty na polimerazie T7 (Pharmacia) użyto do bezpośredniego dwuniciowego sekwencjonowania plazmidu DNA. Poza SP6, T7 i uniwersalnych starterach pUC/M13 w obu kierunkach, użyto oligonukleotydowych starterów opartych na sekwencji szczepu CSFV Brescia (Moormann i in. 1990. Virology 177:184-198). Startery syntetyzowane przy pomocy syntetyzatora DNA Cyclone (New Brunswick Scientific) lub syntetyzatora DNA/RNA 392 (Applied Biosystems). Reakcje sekwencjonowania analizowano na 6% żelu akryloamidowym zawierającym 8 M mocznik. Dane sekwencji analizowano na komputerze Compaq 386 stosując urządzenie Speedreader i oprogramowanie PCgene (Intelligenetics Inc, Applied Imaging Corp., Geneva, Szwajcaria) i na komputerze Apple Macintosh stosując program MacMollytetra.

Biorąc pod uwagę możliwość błędów sekwencji lub różnic wywoływanych przez polimerazę Taq lub niejednorodność RNA szczepu C, całą genomową sekwencję klonów cDNA szczepu C określono sekwencjonując minimum dwa klony cDNA, otrzymane po niezależnych reakcjach PCR. Jeśli obserwowano różnice pomiędzy sekwencjami nukleotydowymi dwu klonów z poszczególnych regionów, zgodną sekwencję nukleotydową tego regionu określano przez sekwencjonowanie trzeciego klonu cDNA otrzymanego po innej niezależnej reakcji PCR (fig. 1A).

Przykład 2

Wytwarzanie infekcyjnych transkryptów pełnej długości kopii DNA genomu szczepu C.

Konstrukcja klonu cDNA pPRKflc-113

Pełnej długości kopię DNA genomowego RNA szczepu C złożono według schematu z fig. 3. Najpierw skonstruowano dwa subklony. jeden (pPRc64) zawierający sekwencję

184 836 cDNA połówki 5' genomu (nukleotydy 1-5560) i drugi (pPRc111) zawierając sekwencję cDNA połówki 3' genomu (nukleotydy 5463-12311). Początkowo konstrukcję pełnej długości klonu cDNA próbowano wykonać w pGEM4z-blue. Jednakże podejście nie udało się ze względu na niestabilność pełnej długości insertu w tym wektorze. Dla zwiększenia stabilności klonów, inserty połówek klonów 5' i 3' reklonowano w pochodną wektora pOK12 o małej liczbie kopii (Vieira i Messing. 1991. Gene 100: 189-194), otrzymując odpowiednio pPRc108 ipPRc123,. W tym celu pOK12 zmodyfikowano wycinając większość miejsca restrykcji, miejsca wielokrotnego klonowania (MCS) i promotor sekwencji T7. Powstały wektor, pPRK, którego użyto do wszystkich następnych pełnej długości klonowań, nadal zawiera unikalne miejsca Spel, Nofl, EagI, BamHI, EcoRV, EcoRI i XbaI w MCS.

Szczegółowo, konstrukcja pełnej długości klonu pPRKflc-113 przebiegała jak następuje (fig. 3). Inserty plazmidów pPRc45 i pPRc46 złączono w miejscu HpaI, umiejscowionym na nukleotydowej pozycji 1249 w sekwencji szczepu C (SEKW. NR ID. I), co dało plazmid pPRc49. Insert pPRc49 następnie złączono z insertem pPRc44 w miejscu NsiI umiejscowionym na nukleotydowej pozycji 3241 (SEKW. NR ID. 1), co dało pPRc63. Połówkę 5' klonu pPRc64 (nukleotyd 1 do 5560, SEKW. NR ID. 1) skonstruowano łącząc insert pPRc63 ze wzmocnionym (PCR) fragmentem cDNA ostatecznego regionu 5' genomowego RNA szczepu C jak następuje. Zsyntetyzowano (+) sensowny starter końca 5' zawierający miejsce EcoRI i Sali, a następnie promotor sekwencji polimerazy RNA T7 i pierwsze 23 nukleotydy genomowego RNA szczepu C. Ten starter i (-) sensowny starter drugiej rundy klonowania użyto do wzmacniania fragmentu cDNA trawionego EcoRI i XhoI klonowanego do trawionego EcoRl-XhoI (nukleotyd 215 w SEKW. NR ID. 1) pPRc63. Na koniec, insert pPRc64 reklonowano do trawionego EcoRI-XbaI pPRK otrzymując pPRc108.

Połówkę 3' klonu pPRc111 (nukleotyd 5463 do 12311, SEKW. NR ID. 1) skonstruowano łącząc 4 klony z drugiej rundy (pPRc67, 53, 58 i 55) i jeden klon z pierwszej rundy (pPRc14). Inserty pPRc67 i pPRc53 złączono w miejscu NheI umiejscowionym na nukleotydowej pozycji 7778, otrzymując pPRc71. Inserty pPRc55 i pPRc58 złączono w miejscu ApaI umiejscowionym w nukleotydowej pozycji 10387, otrzymując pPRc65. Inserty pPRc65 i pPRc14 złączono następnie w miejscu AfiII w nukleotydowej pozycji 11717, otrzymując pPRc73. Insert pPRc73 złączono z insertem pPRc71 w miejscu PstI umiejscowionym w nukleotydowej pozycji 8675, otrzymując pPRc79. Następnie insert pPRc79, zawierający kompletną 3'-terminalną sekwencję cDNA szczepu C, zmodyfikowano tak, aby wprowadzić miejsce Sr1I które po trawieniu utworzy dokładny koniec 3' sekwencji cDNA szczepu C (dla dokładnej końcowej transkrypcji na końcu 3'). Aby to osiągnąć, zsyntetyzowano (-) sensowny starter końca 3' zawierający miejsca Sr1I i XbaI i 18 nukleotydów komplementarnych z 3'-terminalną sekwencją genomowego RNA szczepu C. Ten starter i (+) sensowny starter z pierwszej rundy klonowania użyto do wzmacniania fragmentu cDNA. Fragment trawiono SpeI (nukleotyd z pozycji 11866, SEKW. NR ID. 1) i XbaI i klonowano do trawionego SpeIXbaI pPRc79, otrzymując pPRc111.

Pełnej długości cDNA klonu pPRKflc-113, skonstruowano na koniec wstawiając specyficzny dla szczepu C NcoI⁵⁵³²-Xbał^mcs fragment pPRc111 do trawionego NcoI⁵³³²-XbaI^mcspPRc108.

Konstrukcja pełnej długości klonu pPRKflc-133

Pełnej długości cDNA klonu pPRKflc-113 miał wciąż, poza cichymi nukleotydowymi mutacjami, 5 punktowych mutacji prowadzących do zmian aminokwasów w porównaniu z sekwencją aminokwasową określoną z sekwencji co najmniej dwu klonów cDNA z pierwszych rund. Te 5 punktowych mutacji wpPRKfle-113 zmieniono na przeważającą sekwencje (2 z 3) przez wymianę naruszonych fragmentów DNA na odpowiednie fragmenty DNA zawierające przeważąjące sekwencje.

Połówkę 5' klonu cDNA pPRc108, z punktową mutacją na nukleotydowej pozycji 4516, zmieniono zastępując fragment Sca-ł^34lJ-Ncoł55³² pPRc108 fragmentem pPRcl24. Klon pPRc124 wytworzono wymieniając fragment PvuH⁴⁴ 5-NHeI5°⁶5 pPRc44 odpowiednim fragmentem pPRc32 (porównaj fig. 1). Nową połówkę 5' klonu cDNA oznaczono pPRc129.

184 836

Dla celów klonowania połówkę 3' klonu skonstruowano wycinając część 5' sekwencji szczepu C pPRKflc-113 od miejsca SatI w wektorze (porównaj fig. 3) do miejsca HpaI w nukleotydowej pozycji 5509 (SEKW. NR ID. 1), z utworzeniem pPRcl23. W pPRcl23 należało zmienić mutacje przy pozycjach nukleotydów 8526, 9002, 10055 i 10205. Mutację w pozycji 8526 odtworzono w dwu etapach. Po pierwsze fragment ApaI⁸⁵⁰⁶-PstI⁸⁶⁷⁵ pPRc53 wymieniono na fragment pPRc90, co dało pPRc125. Po drugie fragment NheI7³7⁸-PstI⁸675 pPRcl23 wymieniono na fragment pPRcl25, co dało pPRcl27.

Aby odtworzyć 3 mutacje w pozycjach 9002, 10055 i 10205, zmodyfikowano pPRc58 tak, że miejsce FspI w wektorze wycięto. W tym celu fragment EcoRI^mcs-NdeI pPRc58 wycięto (cięcia Ndel w pGEM4z-blue), co dało pPRc126. Plazmid pPRc126 użyto dla odtworzenia mutacji w pozycjach 10055 i 10205 zastępując fragment SacI75-ApaI1°³87 odpowiednim fragmentem pPRc96, co dało pPRc128. Mutację w pozycji 9002 odtworzono zastępując AatII-FspI⁹°1 (cięcia AatII w pGEM4z-blue) pPRcl28 fragmentem AatII-FspI⁹⁰^ pPRc90, co dało pPRcl30. Na koniec fragment PstI8675-ApaI¹⁽⁾³87 pPRc127 zastąpiono odpowiednim fragmentem pPRc130, co dało plazmid pPRc132. Wszystkie etapy subklonowania, w których zmieniano pojedyncze mutacje weryfikowano przez sekwencjonowanie.

Pełnej długości klon pPRKflc-133 skonstruowano wstawiając fragment Nco^²XbaI^mcs pPRc132 trawionym NcoI553²-XbaI^mcs pPRc129.

Konstrukcja hybrydowego pełnej długości klonu pPRKflc-h6

Antygenowo różne, lecz żywotne mutanty szczepu C można wytworzyć zpPRKflc133, dzięki wymianie części genu E1 tego konstruktu na fragment szczepu CSFV Brescia. W tym celu fragment NheI² -Af1III^2W> ppRc129 zastąpiono odpowiednim fragmentem pPEh6 (van Rijn i in., 1992), wytwarzając połówkę 5' hybrydowego klonu pPRcl39. Hybryd pełnej długości klonu pPRKflc-h6 skonstruowano wstawiając fragment NcoI5532-xbaI™cs pPRcl32 do pPRcl39. Klon zawierał teraz antygenowy region E1 szczepu CSFV Brescia, w tym unikalne miejsce Bg1II.

Wszystkie modyfikacje i procedury klonowania użyte w przykładzie 2 prowadzono zasadniczo w sposób opisany (Sambrook i in. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Enzymy restrykcji i enzymy modyfikujące DNA zakupiono i użyto w sposób opisany przez dostawców. Plazmidy transformowano i trzymano w Escherichia coli szczep DH5a (Hanahan. 1985. w DNA cloning 1: 109-135).

Transkrypcja RNA in vitro

Plazmid DNA użyty do in vitro transkrypcji RNA oczyszczono stosując kolumny Qiagen (Westburg), zgodnie z instrukcjami producenta. Po linearyzacji Xbal lub Sr1I, plazmid DNA ekstrahowano fenolem i chloroformem, strącono etanolem, osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuszczono we właściwej objętości wolnej od RNazy wody.

Użyto 1 pg linearyzowanego plazmidu DNA jako wzorca do transkrypcji in vitro. RNA zsyntetyzowane w temperaturze 37°C przez 1 godzinę w 100 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 6 mM MgCh, 2 mM Spermidine, 10 mM DTT, 100 U rRNasin (Promega), 0,5 mM każdej z ATP, GTP, CTP, UtP i 170 jednostek polimerazy RNA T7 (Pharmacia). Wzorzec DNA usunięto przez trawienie wolną od RNazy DNaseI (Pharmacia) przez 15 minut w temperaturze 37°C, następnie ekstrahowano fenolem i chloroformem i strącono etanolem. RNA rozpuszczono w 20 p l wolnej od RNazy H2O i określono ilościowo pomiarem w nadfiolecie przy 260 nm.

Transfekcja RNA

Mieszaninę do transfekcji RNA skomponowano łagodnie mieszając 50 pl rozcieńczonej lipofektyny (Gibco BRL) (10 pg lipofektyny w wolnej od RNazy H2O) i 50 pl roztworu RNA (1 pg RNA w wolnej od RNazy H2O) i inkubując mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Do transfekcji RNA użyto prawie zlewających się monowarstw komórek SK6 w 6-studzienkowych płytkach do hodowli tkanek o średnicy 35 mm, (Greiner). Komórki przemyto dwukrotnie zmodyfikowaną pożywką Eagles Dulbecco (DMEM). Następnie do komórek dodano 1 ml DMEM, następnie mieszaninę do transfekcji RNA. Po inkubacji przez 16 godzin w temperaturze 37°C, pożywkę zastąpiono 2 ml DMEM uzupełnionego 5% FBS.

184 836

Inkubację prowadzono przez dalsze 3 dni w temperaturze 37°C. Następnie komórki barwiono immunologicznie specyficznymi dla CSFV monoklonalnymi przeciwciałami (Mab) metodą próby monowarstwy immunoperoksydazy (IPMA) w sposób opisany przez Wensvoort i in. (Vet. Microbiol. 1986. 12: 101-108).

Właściwości rekombinacyjnych wirusów szczepu C

Supematanty transfekowanych komórek umieszczono na zlewających się monowarstwach komórek SK6 w studzienkach o średnicy 35 mm i inkubowano przez 5 dni w temperaturze 37°C. Komórki transfekowanych monowarstw trypsynowano i rozcieńczono 7,5 razy DMEM i hodowano przez dalsze 7 dni w temperaturze 37°C w kolbach 75 cm² (Costar). Następnie wytworzono zapas wirusa zamrażając i rozmrażając komórki dwukrotnie, klarując zawiesiny komórek przez odwirowanie przy 5,000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C i zbieranie supematantów.

Wirus zbadano metodą IPMA i analizy restrykcyjnej wzmocnionych RT-PCR wirusowych fragmentów. Po infekcji komórek SK6 wirusami FLc-h6 i F1c-B3. Monowarstwy inkubowano przez 4 dni w temperaturze 37°C. Następnie, monowarstwy zabarwiono immunologicznie stosując Mab skierowane wobec konserwatywnych (Mab b3, domeny A) i niekonserwatywnych (Mab b5 i b6, domeny B+C) epitopów na E1 Brescia i Mab specyficzne dla szczepu C i skierowane wobec E1 (Mab c2) lub E2 (Mab c5) (Wensvoort, G. 1989. W Thesis, str. 99-113, Utrecht, Holandia). Monowarstwy komórek SK6 zainfekowanych rodzimym wirusem Brescia lub rodzimym wirusem szczepu C były próbami kontrolnymi w tym teście. Wyniki przedstawiono w tabeli 1, i są one takie, jak się można spodziewać. Krótko, Mab b3 rozpoznaje epitop na E1 zachowany w szczepach CSFV, a więc rozpoznaje wszystkie szczepy w tabeli 1. Mab b5 i b6 nie rozpoznają E1 szczepu C, a więc reagują tylko ze szczepami Brescia i F1c-h6. W przeciwieństwie do tego, Mab c2 nie rozpoznaje E1 szczepu Brescia i reaguje więc tylko ze szczepami C i FLc-133. Na koniec, Mab c5 nie rozpoznaje E2 szczepu Brescia i reaguje więc z wszystkimi wirusami w tabeli 1 poza szczepem Brescia.

Genomowy RNA wirusa FLc-h6 powinien zawierać unikalne miejsce Bg1II, umiejscowione w genie E1 (patrz powyżej). W celu sprawdzenia obecności tego miejsca, cytoplazmatyczny RNA wydzielono z komórek SK6 zainfekowanych rekombinacyjnym wirusem 5 FLch6, lub zainfekowanych FLc-133, wzmocnionym PCR w sposób opisany powyżej, stosując startery opisane przez Van Rijna i in., 1993. J. Gen. Virol. 742053-2060) i trawiono Bglll. W istocie, wzmocniony fragment 1091 par zasad zFLc-h6 został pocięty Bg1II, dając fragmenty 590 i 501 par zasad, podczas gdy wzmocniony fragment FLc-133 pozostał nietknięty.

Przykład 3

Immunizacja świń delecyjnymi mutantami E1.

Konstrukcja i ekspresja delecyjnych mutantów El

Wykazano uprzednio, ze pozbawione TMR E1 szczepu CSFV Brescia, poddane ekspresji w komórkach owada, indukuje ochronną odpowiedź immunologiczną u świń wobec CSF (Hulst i in., 1993. J. Virol. 67: 5435-5442). Zdefiniowano także dwie odróznialne antygenowe jednostki, A i B+C, wN-temiinalnej połówce E1, indukujące neutralizujące przeciwciała wobec CSFV, (Wensvoort, 1989. J. Gen. Virol. 70: 2865-2876; Van Rijn i in. 1992. Vet. Microbiol. 33: 221-230; Van Rijn i in. 1993 J. Gen. Virol. 74: 2053-2060). Ponadto neutralizujące przeciwciała skierowane wobec domeny A i domeny B+C działają synergistycznie w neutralizacji CSFV (Wensvoort, 1989. J. Gen. Virol. 70: 2865-2876). W celu ocenienia immunogenności mutanta E1s z delecją domeny B+C lub z delecją domeny A, wykonano odpowiednie konstrukty w wektorze bakulowirusowym i poddane ekspresji mutantowe białka zbadano na świniach.

Bakulowirusy dające ekspresję mutanta E1s skonstruowano via nakładającą się rekombinację DNA dzikiego typu AcNPV (wirus jądrowej wielościenności Autographa califomica) i DNA wektora transferowego pAcMo8 zawierającego sekwencję kodującą dany mutant E1. Wektor transferowy pAcMo8 pochodził z pAcAs3 (Vlak i in., 1990. Virology 179:312-320) przez wstawienie T bezpośrednio w kierunku 5' od pierwszej zasady (G) unikalnego miejsca BamHI tego wektora W ten sposób utworzono startowy kodon ATG pokrywający pierwszą G

184 836 miejsca BamHI. m-RNA jest transkrybowane od heterologicznej sekwencji wstawionej w miejsce BamHI przez promotor p10 AcNPV.

Sekwencje kodujące mutant E1s pochodziły z insertu E1 pPRb2 (Van Rijn i in., 1992. Vet. Microbiol. 33:221-230) poprzez wzmocnienie PCR. W tym celu skonstruowano dwa startery zawierające w sekwencji miejsce BamHI. Koniec 5' (+ sensowny) startera ma sekwencję 5'-AGA TTG GAT CCT AAA GTA T TA AGA GGA CAG GT-3' (SEKW. NR ID. 2). Podkreślona sekwencja w tym starterze jest identyczna z nukleotydami 2362-2381 w sekwencji szczepu Brescia (Moormann i in., 1990. Virology 177:184-198), pogrubione litery wskazują miejsce BamHI. Koniec 3' (- sensowny) startera zawiera kodon stopu sąsiadujący z miejscem BamHI. Ma on sekwencję 5'-TA GTC GGA TCC TTA GAA TTC TGC GAA GTA ATC TGA-3’ (SEKW. NR ID. 3). Podkreślona sekwencja w starterze jest komplementarna do nukleotydów 3433-3453 w sekwencji szczepu Brescia (Moormann i in., 1990. yirology 177: 184-198); pogrubione litery wskazują miejsce BamHI i kursywa wskazuje kodon stopu.

Wzmocnione sekwencje klonowano w miejsce BamHI pAcMo8 i sprawdzono na poprawną orientację w wektorze metodą analizy restrykcji enzymatycznej. Poprawny wektor transferowy oznaczono pPAb11. Nakładkową rekombinację pomiędzy DNA AcNPY i DNA pPAbl l oraz selekcję i oczyszczanie wektora bakulowirusa dający ekspresję E1 wykonano w sposób opisany (Hulst i in., 1993. J. Virol. 67: 5435-5442). Dalsze badanie E1 w próbach radioimmunostrąceniowych i ze specyficznymi dla E1 Mab także opisał Hulst i in. (J. Virol., 1993. 67:5435-5442). Powstały rek8mbinacdjnd bakulowirus daje ekspresję dzikiego typu Brescia E1 bez TMR (porównaj drugi słupek od góry na fig. 3). Ten E1 bez TMR jest wydzielany z komórki (Hulst i in., 1993. J. Virol. 67:5435-5442).

Delecję regionu kodującego domeny B+C z genu E1 pPAb11 osiągnięto dzięki wymianie fragmentu Nhel-BgllI tego konstruktu z odpowiednim fragmentem pPEh14 (Van Rijn i in., 1993. J. Gen. Virol. 74:2053-2060). Powstały wektor transferowy oznaczono pPAb16. Zawiera on delecję w genie E1 od kodonu 693 do 746. Podobnie region kodujący domeny A wycięto z pPAb11 dzięki wymianie fragmentu Nhel-Bg1II pPAb11 na odpowiedni fragment pPEh18 (Van Rijn i in., 1993. J. Gen. Virol. 74:2053-2060), otrzymując wektor transferowy pPAbl2. pPAbl2 zawiera delecję w genie E1 od kodonu 800 do 864.

Rekombinacyjne bakulowirusy dające ekspresję E1s z delecją skonstruowano, wybrano i zbadano ze względu na ich produkty ekspresji E1, w sposób opisany powyżej.

Immunizacja i prowokacja u świń

Grupy czterech (lub dwu) wolnych od specyficznych patogenów (SPF), 6- do

8-tygodniowych świń szczepiono domięśniowo w dniu 0 1 ml podwójnej emulsji woda-olej zawierającej 4 pg (mutanta) E1 i szczepiono ponownie w dniu 28 1 ml podwójnej emulsji woda-olej zawierającej 15 pg (mutanta) E1 (tabela 2). Konstrukcję mutanta E1 zawierającego delecję w domenie A, lub delecję w domenie B/C i dzikiego typu E1 opisano powyżej i przedstawiono konstrukty na fig. 5. Do pierwszego szczepienia w dniu 0 użyto supernatant komórek owadzich zainfekowanych właściwymi rekombinacyjnymi bakulowirusami. Ilość E1 w supematancie kalibrowano w sposób opisany wcześniej (Hulst i in., 1993. J. Virol. 67: 5435-5442). Do ponownego szczepienia w dniu 28 E1 oczyszczono przez immunopowinowactwo z supematanta zainfekowanych komórek owadzich (Hulst i in., 1993. ibid.). Świnie ze wszystkich szczepionych grup i nieszczepionej grupy kontrolnej dwu zwierząt ŚPF, prowokowano donosowo 100 LD50 szczepu CSFV Brescia 456610 (Terpstra i Wensvo8rt, 1988. Vet. Microbiol. 16: 123-128). Taka dawka prowokacyjna prowadzi do ostrej choroby u niechronionych świń, charakteryzującej się wysoką gorączką i trombocytopenią od dnia 3 do 5 i do śmierci w dniach 7 do 11. Próbki hepardniz8wanej (EDTA) krwi pobierano w dniach 40, 42, 45, 47, 49, 51, 53 i 56 po szczepieniu i analizowano na trombocyty i wirusa CSFV w sposób opisany (Hulst i in., 1993. Ibid.). Próbki surowicy krwi pobrano w dniach 0, 21,28, 42 i 56 i badano metodą CTB-ELISA (Wensvoort i in , 1988. Vet. Microbiol. 17- 129-140) i w próbie zobojętniania związanej peroksydazy (NPLA. Terpstra i in. 1984. Vet. Microbiol. 9: 113-120). w celu wykrycia (neutralizujących) przeciwciał wobec CSFV. Wyniki testu CTBELISA wyrażono jako procentową inhibicję standardowego sygnału; <30% inhibicji jest

184 836 negatywne, 30-50% inhibicji jest wątpliwe, >50% inhibicji jest pozytywne. Miana NPLA wyrażono jako odwrotność surowicy rozcieńczenia zobojętniającego 100 TCID 50 szczepu Brescia w 50% replikatów kultur.

Wszystkie zwierzęta obserwowano codziennie szukając oznak choroby i mierzono temperaturę ciała. Klinicznymi oznakami choroby były: gorączka, anoreksja, leukopenia, trombocytopenia i paraliż.

Przykład 4

Opracowanie testu CTB-ELISA (CTB-DIF) dla CSFV, opartego na jednym monoklonalnym przeciwciele.

Opis testu diagnostycznego

Przykład opisuje test CTB-ELISA (CTB-DIF), będący modyfikacją istniejącego CTBELISA (Wensvoort i in., 1988. Vet. Microbiol. 17: 129-140) do wykrywania specyficznych dla CSFV przeciwciał.

CTB-DIF jest oparty na odkryciu, ze komórki SF21 zakażone rekombinacyjnym bakulowirusem dającym ekspresję E1-TMR, wydajnie wydzielają dimeryzowany E1 do środowiska. Taki dimeryzowany wydzielany E1 wykryto w środowisku komórek zainfekowanych powyzszym bakulowirusem analizowano metodą Western blot po elektroforezie w SDSPAGE w nieredukujących warunkach. Ze specyficznych dla E1 Mab na dimerach E1 są obecne dwie kopie epitopu (jedna na każdym monomerze). Tak więc w połączeniu z dimeryzowanym antygenem konkretny specyficzny dla E1 Mab można użyć jako przeciwciało wychwytujące, powlekające ścianki studzienek płytki do mikromiareczkowania, jak też przeciwciało wykrywające, sprzężone z peroksydazą chrzanu (HRPO).

CTB-DIF okazuje się być przydatna w połączeniu z podjednostkową szczepionką E1, zawierającą delecję w domenie A (patrz konstrukt z fig. 5) i okazuje się rozróżniać pomiędzy przeciwciałami specyficznymi dla CSFV indukowanymi u świń szczepionych E1 z delecją domeny A i przeciwciałami specyficznymi dla CSFV indukowanymi u świń zainfekowanych niskowirulentnymi szczepami CSFV Henken, Zoelen, Bergen, 331 i Cedipest (EP-A-351901).

Cztery świnie SPF, numerowane 766, 786, 789 i 770, zaszczepiono mutantem E1 zawierającym delecję w domenie A, jak opisano w przykładzie 3 (patrz także tabela 2) i prowokowano wirulentnym szczepem CSFV Brescia w dniu 44 po szczepieniu. Surowice pobierane w dniach 28, 42 i 56 po szczepieniu badano.

Surowice wobec niskowirulentnych szczepów CSFV wytworzono także w grupie czterech świń SPF. Surowice świń zainfekowanych szczepami Henken, Zoelen, Bergen i 331 badano w dniach 0, 21, 28 i 42 po infekcji. Surowice świń szczepionych szczepionką Cedipest badano w dniach 0, 44, 72 i 170 po szczepieniu.

Trzy różne serologiczne testy przeprowadzono z powyzsz.ymi surowicami. Test 1 jest próbą zobojętniania związanej peroksydazy (NPLA) opisaną przez Terpstrę i in. 1984. (Vet. Microbiol. 9: 113-120), do wykrywania neutralizujących przeciwciał wobec CSFV. Test 2 jest testem CTB-ELISA (Wensvoort i in., 1988. Vet. Microbiol. 17: 129-140) do rutynowego wykrywania przeciwciał wobec CSFV.

CTB-DIF wykorzystuje Mab b3 (także znane jako CVI-HCV-39.5) (Wensvoort, 1989. J. Gen. Virol. 70:2865-2876), rozpoznające epitop umiejscowiony w domenie Al E wCSFV. Studzienki płytki ELISA powleka się Mab b3 (rozcieńczenie 1:2000) (przeciwciało przechwytujące). Po przemyciu studzienek dodaje się do studzienek Mab b3 sprzężone z (HRPO), (rozcieńczenie 1:4000) (przeciwciało wykrywające). Pożywkę komórek Sf21 zainfekowanych bakulowirusem wytwarzającym E1-TMR i zawierającym dimeryzowane E1 do stężenia 20 pg/ml rozcieńcza się 1:500 i preinkubuje z testową surowicą (rozcieńczoną 1:2,5). Mieszaninę surowica/antygen dodaje się następnie do koniugatu w studzienkach powlekanych płytek ELISA. Po inkubacji studzienki przemywa się ponownie i dodaje roztwór chromogenu. Jeśli przechwytujące i sprzęzone Mab związało się z antygenem, HRPO indukuje reakcję chromogenną, wskazując, ze test surowicy na przeciwciała CSFV jest negatywny. Jeśli epitop na antygenie jest zablokowany przez przeciwciała z testowej surowicy, koniugat HRPO będzie wymyty i studzienki pozostaną czyste, wskazując, ze testowa surowica zawiera przeciw184 836 ciała wobec CSFV, domeną A1. Wyniki trzech różnych serologicznych testów wskazuje tabela 3.

Surowice świń szczepionych E1 z delecją w domenie A reagują w testach NPLA i CTBELISA, a nie w CTB-DIF, w dniu 42 po szczepieniu. Po prowokacji wirulentnym szczepem CSFV Brescia surowice tych samych świnie reagują pozytywnie we wszystkich 3 testach w dniu 56 po szczepieniu (dzień 12 po prowokacji), wskazując, że zaszła odpowiedź przypominająca po prowokacji. Od dnia 21 po infekcji surowice świń szczepionych szczepami Henken, Zoelen, Bergen i 331 reagują pozytywnie w teście NPLA, CTB-ELISA, i CTB-DIF. Od dnia 44 po szczepieniu, tak samo jest dla świń szczepionych szczepem szczepionkowym Cedipest. Tak więc CTB-DIF zachowuje się dokładnie zgodnie z oczekiwaniem i nadaje się do tego, aby towarzyszyć markerowej szczepionce CSFV o zmutowanej domenie A E1, takiej, że przeciwciała skierowanymi wobec tej zmutowanej domeny A nie współzawodniczą z Mab b3 o epitop Mab b3.

Antygen użyty w CTB-DIF jest dimeryzowanym E1 pozbawionym TMR dzikiego typu Brescia przedstawionym na fig. 5. Jednakże dimeryzowane E1 syntetyzowane przez konstrukt z „delecyjną domeną B+C z fig. 5 jest także dogodne jako antygen w teście.

Przykład 5

Porównanie CTB-ELISA dla CSFV opartego na E1 i E2.

Opis testów diagnostycznych

Przykład opisuje modyfikację testu CTB-DIF z przykładu 4 i CTB-ELISA opartego na E2 CSFV i porównuje wrażliwość tych testów ELISA z 3 innymi testami CTB-ELISA wykrywającymi przeciwciała skierowane wobec E1 i NPLA (Terpstra i in. 1984. Vet. Microbiol. 9: 113-120).

CTB-DIF z przykładu 4, nazywany E1-Bac-DIF w tabelach 4 do 8, stosuje nietknięty pozbawiony TMR E1 zsyntetyzowany w komórkach owada (komórki SF21) jako antygen. Modyfikacja E1-Bac-DIF, nazywana E1-Bac-dBC-DIF, stosuje pozbawiony TMr E1 zsyntetyzowany w komórkach owada (SF21 komórki) z delecją domen B+C (porównaj fig. 5) jako antygen. Jak wykazała próba Western biot, pozbawiony TMR E1 z delecją domen B + C jest wydzielany z komórek jako dimer (wyników nie pokazano). Test E1-bac-dBC-DIF wykonuje się jak następuje. Studzienki płytki ELISA powleka się Mab b3 (rozcieńczenie 1:-4000) (przeciwciało przechwytujące), 16 godzin w temperaturze 37°C i przemywa. Medium zawierające dimeryzowany antygen E1-dBC do stężenia 20 pg/ml rozcieńcza się 1:50 i preinkubuje z testową surowicą (rozcieńczenie 1:2,5) (0,5 godziny w temperaturze 37°C). Mieszaninę surowica-antygen dodaje się następnie do powlekanych płytek ELISA. Po inkubacji 1 godzinę w temperaturze 37°C, studzienki przemywa się i dodaje Mab b3 sprzężony z HAPO (rozcieńczenie 1:1000) (przeciwciało wykrywające). Po inkubacji 1 godzinę w temperaturze 37°C, studzienki przemywa się ponownie i dodaje się roztwór chromogenu. Chromogenną reakcję prowadzi się przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Interpretacja chromogennej reakcji jest taka sama, jak wyjaśniona w przykładzie 4.

Inne testy CTB-ELISA wykrywające przeciwciała skierowane wobec E1 CSFV opisane w tabelach 4 do 8 to test E1-CSFV ELISA, stosujący rodzime E1 z CSFV zainfekowanych komórek jako antygen (Wensvoort i in., 1988. Vet. Microbiol. 17: 129-140); test E1-Bac i E1BacDIF ELISA, stosujący pozbawiony TMR E1 zsyntetyzowany w komórkach owada jako antygen. Testy E1-CSFV i E1-Bac ELISA stosują odpowiednio Mab b3 i b8 CSFV (Wensvoort 1989. J. Gen. Virol. 70: 2865-2876) jako przeciwciało przechwytujące i wykrywające, podczas gdy E1-Bac-DIF ELISA stosuje tylko Mab b3 jako przeciwciało przechwytujące iwykrywające. E1-CSFV ELISA wykonuje się dokładnie w sposób opisany przez Wensvoorta i in.,1988. (Vet. Microbiol. 17: 129-140). E1-Bac i E1-Bac-DIF ELISA wykonuje się w sposób opisany powyżej dla E1-Bac-dBC-DIF z następującymi modyfikacjami. W E1-Bac ELISA stosowanym antygenem jest rozcieńczenie 1:-400 dimeryzowanego E1 z pożywki komórek SF21, zainfekowanych odpowiednim konstruktem E1 bakulowirusa (porównaj fig. 5), w stężeniu 20 pg/ml. Mab b8 sprzężony z HRPO jest w tym teście ELISA przeciwciałem wykrywającym i stosuje się go w rozcieńczeniu 1 1000 E1-Bac-DIF ELISA stosuje się ten sam

184 836 antygen jak w E1-Bac ELISA, lecz w rozcieńczeniu 1:200. Mab b3 sprzężony z HRPO stosuje się jako przeciwciało wykrywające w tym teście ELISA w rozcieńczeniu 1:1000.

Test E2-Bac ELISA stosuje antygen CSFV E2 zsyntetyzowany w komórkach SF21 zainfekowanych konstruktem Bac CE2 (Hulst i in., 1994. Virology 200: 558-565). Ponieważ E2 nie jest wydzielany z zarażonych komórek owada, stosuje się lizat tych komórek. Jak E1, większość E2 znajduje się jako dimeryzowane cząsteczki, gdy lizaty zainfekowanych komórek analizuje się w warunkach niedenaturujących na żelach SDS-PAGE (wyników nie pokazano). CTB-ELISA opracowany na podstawie tego antygenu E2 działa optymalnie w połączeniu z Mab C5 i C12 (Wensvoort, G., 1989. W Thesis, str. 99-113, Utrecht). Jednakże można stosować także E2 w połączeniu tylko z Mab C5 lub Mab C12. W próbie współzawodnictwa Mabs C5 i C12 inhibitują się nawzajem w wiązania z E2. Wskazuje to, ze te Mab rozpoznają te same lub nakładające się epitopy na E2 (wyników nie pokazano). Test E2-Bac ELISA prowadzi się jak następuje. Mab C12 rozcieńcza się 1:1000 i powleka nim studzienki płytki ELISA (16 godzin w temperaturze 37°C). Następnie studzienki przemywa się. Lizaty komórek SF21 zainfekowanych Bac CE2, rozcieńczone 1:1250, preinkubuje się z testową surowicą (1:1) przez 0,5 godziny w temperaturze 37°C. Mieszaninę surowica-antygen dodaje się następnie do studzienek powlekanych płytek i inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Następnie płytki przemywa się i inkubuje z Mab C5 sprzęzonym z HRPO (rozcieńczenia 1:2,000). Po 1 godzinie w temperaturze 37°C płytki przemywa się ponownie i dodaje się roztwór chromogenu. Chromogenną reakcję prowadzi się przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Interpretacja chromogennej reakcji jest taka sama, jak wyjaśniona w przykładzie 4. Wszystkie powyżej opisane rozcieńczenia prowadzi się w buforze NPLA + 4% PS (Terpstra i in., Vet. Microbiol. 9: 113-120).

Tabela 4 pokazuje wyniki analizy surowic 3 świń SPF szczepionych szczepionką Cedipest przy pomocy powyżej opisanych testów CTB-ELISA i NPLA. Surowice analizowano w dniach 0, 16, 23, 30, 37, 44, 50, 72, 113, 141 i 170 po szczepieniu. Tabele 5 do 8 pokazują wyniki analizy w testach powyżej opisanych CTB-ELISA i NPLA surowic grupy świń SPF zainfekowanych niskowirulentnymi szczepami CSFV, odpowiednio 331, Bergen, Henken i Zoelen. Surowice analizowano w dniach 0, 10, 14, 17, 24, 28, 35 i 42 po infekcji. Od dnia 16 po szczepieniu, surowice od świń szczepionych szczepem Cedipest reagują w każdym z 5 testów CTB-ELISA, jak tez w NPLA. W tym czasie wrażliwość E2-Bac ELISA iE1-BacdBC-DIF jest równie dobra, jeśli nie lepsza, niż innych 3 testów CTB-ELISA. Od dnia 37 po szczepieniu do dnia 170, wszystkie surowice reagują spójnie (pozytywnie) w 5 testach CTBELISA i w NPLA. Surowice świń zainfekowanych niskowirulentnymi szczepami CSFV także reagują we wszystkich 5 testach CTB-ELISA i w NPLA. Poza nielicznymi wyjątkami obserwuje się spójność w reakcji surowic w 5 testach CTB-ELISA i NPLA od dnia 21 po infekcji do dnia 42. Należy zanalizować więcej surowic zwierząt zainfekowanych niskowirulentnymi szczepami, aby wnioskować, czy istnieją znaczące różnice pomiędzy wrażliwością 5 testów CTB-ELISA zaraz po infekcji (do dnia 17).

Można wnioskować, ze testy E2-Bac ELISA i E1-Bac-CTB-DIF ELISA zachowują się w oczekiwany sposób Tak więc E2-Bac ELISA może korzystnie towarzyszyć markerowej szczepionce CSFV (np. podjednostkowej E1, zmutowanej lub nie, markerowej szczepionce szczepu C zmodyfikowanego regionie E2) nie indukującej przeciwciał współzawodniczących z Mab w tym teście ELISA. Test E1-Bac-dBC-DIF ELISA jest tak przydatny, jak test E1-BacDIF ELISA (CTB-DIF ELISA z przykładu 4) jako uzupełnienie markerowej szczepionki CSFV o zmutowanej domenie A E1, tak, ze przeciwciała skierowane wobec zmutowanej domeny A nie współzawodniczą z Mab b3 o epitop Mab b3.

Figura 1

Schematyczne przedstawienie klonów cDNA użytych do określenie nukleotydowej sekwencji szczepu C. Figura 1A wskazuje klony cDNA z pierwszej rundy (patrz tekst). Klonów cDNA z numerami 32, 90 i 96 użyto do zmiany pPRKflc-113 wpPRKflc-133 (patrz przykład 2). Klon 14 był jednym z pierwszej rundy klonem cDNA użytym do konstrukcji pPRKflc-113 (patrz fig. 3). Figura 1B wskazuje klony cDNA z drugiej rundy (patrz tekst). Numerowane klony cDNA z drugiej rundy użyto do konstrukcji pPRKflc-113 (patrz SEKW.

184 836

NR ID. 1). Pozycje cDNA względem sekwencji nukleotydowej genomu szczepu C są wskazywane na podziałce (w tysiącach par zasad) na dole figury. Schematyczne przedstawienie obecnie zidentyfikowanych genów CSFV i ich organizację w genomie CSFV wskazano w górnej części figury.

Nie ma dotychczas zgodności pomiędzy badaczami na nomenklaturę białek pestiwirusów. Białko E2 opisane tutaj jest także nazywane gp 42 (Tamura i in. 1993. Virology 193: 1-10), gp44/48 (Thiel i in. 1991. J. Virol. 65: 4705-4712) lub E0 (Rumenapf i in. 1993. J. Virol. 67: 3288-3294). Białko E3 jest także nazywane gp25 (Tamura i in. 1993. Virology 193:110), gp33 (Thiel i in. 1991. J. Virol. 65: 4705- 4712) lub E1 (Rumenapf i in. 1993. J. Virol. 67: 3288-3294). Białko E1 według wynalazku jest także nazywane gp53 (Tamura i in. 1993. Virology 193:1-10), gp55 [Thiel i in. 1991. J. Virol. 65: 4705-4712), gp51-54 (Moormann i in. 1990. Virology 177:184-198) i E2 (Rumenapf i in. 1993. J. Virol. 67: 3288-3294). Nterminalną autoproteazę N^pro CSFV (p20 BVDV, Wiskerchen i in. 1991. J. Virol. 64: 45084514), także nazywaną p23, zidentyfikował Thiel i in. 1531. (J. Virol. 65: 4705-4712). Rozcięcie sekwencji rozpoznającej, konserwatywnej pośród pestiwirusów, tąproteazą daje koniec N C (Stark i in. 1993. J. Virol. 67: 7088-7095).

Figura 2.

Dopasowanie sekwencji nukleotydowych niekodujących regionów 5' (A) i 3' (B) szczepów CSFV Brescia, Alfort i C. Poza pierwszymi 12 nukleotydami niekodującą sekwencję 5' szczepu Brescia opisał Moormann i in., 1990. Virology 177:184-198. Pierwszych 12 nukleotydów niekodującego regionu 5' szczepu Brescia nie publikowano dotychczas. Jak ostateczne sekwencje 5' i 3' genomu szczepu C, określono je metodą ligacji 3'-5' RNA opisaną w przykładzie 1 tego zgłoszenia patentowego. Poza pierwszymi 9 nukleotydami, niekodującą sekwencję 5' szczepu Alfort opisał Meyers i in., 1989. Virology 171: 555-567. Pierwsze 9 nukleotydów genomu szczepu Alfort opublikował Meyers w pracy zatytułowanej: „Virus der Klassischen Schweinepest: Genomanalyse und Vergleich mit dem Virusa der Bovinen Viralen Diarrhóe”. 1990 Tubingen, Niemcy. Sekwencje regionów niekodujących 3' szczepów Brescia i Alfort opisali odpowiednio Moormann i in., 1990. Virology 177: 184-198 i Meyers i in., 1989. Virology 171: 555-567. Kodon startu ATG i stopu TGA dużej ORF (por. SEKW. NR ID. 1) są podkreślone.

Figura 3.

Schemat konstrukcji pełnej długości cDNA klonu pPRKflc-113. Numery klonów wyjaśniono w legendzie fig. 1. Miejsca fuzji insertów klonów wskazują pionowe linie. Miejsca odpowiadające tym liniom są wskazane na dole figury. Podkreślone numery klonów wskazują na klony cDNA mające pochodzące zpOK12 (Vieira i Messing, 1991. Gene 100:189-194) sekwencje wektora (patrz fig. 4). Końce 5' i 3' pPRKflc-113 zostały dopasowane przez wzmocnienie PCR fragmentów cDNA (patrz tekst przykładu 2). Wzmocnione fragmenty oznaczono PCR. Skala na dole figury i schematyczne przedstawienie organizacji genomu CSFV opisano w legendzie fig. 1.

Figura 4.

Schematyczne przedstawienie sekwencji wektora i pełnej długości insertów cDNA w klonach pPRKflc-113, pPRKflc-133 i pPRKflc-h6. Konstrukcję wektora pPRK, pochodnej pOK12 (Vieira i Messing. 1991. Gene 100: 189-194), opisano w przykładzie 2. Kan^R, gen oporności na kanamycynę; ORI, początek replikacji; i, gen kodujący represor genu β-galaktozydazy; PO, region promotora/operatora genu β-galaktozydazy; lacZ, część genu β-galaktozydazy kodująca podjednostkę a β-galaktozydazy. Wskazano kilka miejsc restrykcji wektora i sekwencje bezpośrednio flankujące pełnej długości inserty w wektorze. Odpowiednie miejsca opisano w tekście przykładu 2. Lizaki i numery wpPRKfic-11.3 odpowiadają nukleotydom pięciu kodonów zmienionych w tym konstrukcie, dając pPRKflc-133. Ten ostatni konstrukt ma sekwencję wskazaną w SEKW. NR ID. 1.

Czarny prostokąt wpPRKflc-h6 wskazuje region E1 pPRKflc-133, który wymieniono na odpowiedni region szczepu Brescia. Czy transkrypty otrzymane z danego pełnej długości konstruktu są infekcyjne (+) czy nie (-) wskazano z prawej strony konstruktu. T7, sekwencja

184 836 promotora T7. Inserty pełnej długości konstruktów są wskazane względem skali (w tysiącach par zasad) reprezentującej sekwencję nukleotydową szczepu C według SEKW. NR ID. 1.

Figura 5.

Schematyczne przedstawienie mutantowych białek E1 poddane ekspresji w komórkach owada z wektorem bakulowirusowym. Wszystkie białka E1 są kodowane przez sekwencję nukleotydową szczepu Brescia (Moormann i in., 1990. Virology 177:184-198) i zaczynają się na końcu N Lys w pozycji kodonu 668 w dużej ORF tej sekwencji. Koniec C rodzimego E1 to Leu w pozycji kodonu 1063 w dużej ORF, podczas gdy końce C trzech innych białek E1 umiejscowione są na pozycji aminokwasowej 1031. Kropkowane prostokąty w słupkach reprezentują N-terminalną sekwencję sygnałową, od reszty aminokwasowej 668 do 689, wewnętrzną sekwencję hydrofobową, od reszty aminokwasowej 806 do 826 i C-terminalny region transmembranowy (TMR), umiejscowiony w regionie od reszty aminokwasowej 1032 do 1063 E1. Wycięte sekwencje aminokwasowe w mutantowych E1 z delecją domeny B+C lub A wskazano przerwami w słupkach reprezentujących te białka. Umiejscowienie tych delecji względem sekwencji aminokwasowej E1 można określić ze skali na dole figury. Skala wskazuje umiejscowienie E1 w sekwencji aminokwasowej kodowanej przez dużą ORF szczepem Brescia.

Tabela 1

Właściwości rekombinacyjnych wirusów C

Mab specyficzne wobec CSFV
	skierowane przeciwko E1	skierowane przeciwko E2
wirus	konserwatywne epitopy	epitopy specyficzne dla Brescia	epitopy specyficzne dla , „C”	epitopy specyficzne dla , ,C”
C”	+	-	+	+
Brescia	+	+	-	-
FLc-133	+	-	+	+
FLc-h6	+	+	-	+

184 836 cn

U ο

F| <υ •Η ε

υ σι o

O

Fi

O* <υ σ

Μ Η I I I Ή £

I I I I I I 4- + <ΰ ο

Μ ο

X υ

4- 44- 4+ 44- + 4- 405 •Η u

φ

Φ σ> μ 3. (Ο

Lf) Εχι t-ι co u ··

X >1 Ο Φ X C Η ζΊ φ υ χ ο 2 Φ Η >ι υ χ οι 3 d

Φ -Η Ν ω

-r-ł g

(O

X c

φ

X g

flj r*4 (0

Ή υ

-Η υ

<υ

Ν

Μ α

ο σ> 0) υ στ •η (0 , Ή C 4J α>

-Γ“\

Ο

Λ

Ο

Ν

Ο

C flj ιπ

-Η οο C ej Ό σ ο ο ο ο ο ο ο ο σοοοοοοοοο CM<NC4CMC4C4iDCMC4C4 cofOfnforocor-łmtOco Λ Α Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ σ ο ο °55^θΟ^^θ°,Χ4 ^{ν ν}

ΟΟ“ΟΟΟ“ιΠυΐ • ~ (\ι h; c\j cn ΐΠίΠίΠιΠιΠιΠιΛιΌ^ιΠιΠιΓ) OJ CM OJ OJ OJ CJ OJ OJ Γ, OJ OJ CJ ννννννννϊίννν ο

χ χ Ω θ' Ω

3.

ο =r ο c

•m

U Φ r—I

Φ

Ό

Ή β

Ό

-m β

Φ

Ή

O.

Φ

N υ

N ω

ιΠνΠιΠιΠιΠιΌιΑιΑ νννννννν ιηιΠιΓϊιΌιΠιΠιΡιΌιΠιΠιΠίΠ

NNCMNNNNNNNCNN Η «-I Η M r~l Η Η r-I Η Η Η r-1 νννννννννννν cnd<n<ncnchcrt<T)

ΟΊΦΟΊΦΟΊΟΊΑΟΊ

Ο

Η β

οι

Φ υ

r-J f—I

XI

E-* <

CO

Μ ι-Ί ω

ι

CQ

Ε-*

U οο ’Τ' σι m r— γ- σ> οο

0000^^0^^° υ

Η

Λ

Η χ:

c

Η <Ο «Γ LD ιΓ) οοοοοοοοοοοο

Λί >. rn Μ 43 U Ε 4J > <U e ω -ν Η 5 c 3 α> -2

11J <0 >ι ω 4J (0 c Ή φ •Η U Ό <fl <0 Φ Ν Μ

Η

Ν *ϋ £0

HJ «Η

C

Η χη .^coaiOHCjtOTrjrrinu'] ^r-r^r^r-o-o-r-r-r-r-r-rο ο ο ο,χ: η υ 2 Φ Ο X Η β g

Φ Φ χ 2 χ λ; > φ χι ο β χ χ ν ο > ο (X 2

Ο Ν Ot ο • φ >1 β X

X

Φ β

Ν

Ο

X

U >

X

Ο

4Ό

Ο β

U

Φ

X

Ο φ

Η β

X

Ο

Ο ο

X υ

X φ

β

Ν

Ο β -Η Φ β Η Η β '—I X α>

ΓΊ · Ο — υ ν Φ· •η ε φ φ X X 3 Φ Ν φ Φ X σι 'U 'Φ

Ο β

υ φ

χ ο · > Η X

Ο - ο •Ν ο Η X χ υ φ

ο g φ φ

Otφ· X Ο g

Ο

τ) φ

•Η β

ο β ο •Η Ot (U 2 ν -φ u

Ν ΟΙ φ

Ω 3 Cit X co β

Ό β

Η s 2 'Φ · t—I — ω 3

Φ Ό χ

X Λ Φ

Η X Λ

Ο

JZ θ' υ φ

Φ Η . Φ ι—I

Ν < Ο U CO Η

X X >ιβ Ο μ ω ο φ ι υ υ m χ η s υ

Ο X β φ φ > 2

Ο · χ «γ

Φ co Φ Ω -Μ Ή

Π5 Η -U φ- <Ο Ν LO Μ

0) Η •I—}

Ξ Ν θ’ φ

β β ο Φ Φ 2 4-1 Ο ν χ ο -Η <44 >. > Ο.Τ3

Ο Ο g U Ν ω •Η C0 Λί CJ -U

W * c—I

N CJ (0 •H c ω £λ

O Ό -U o >1 a υ

O >1

O X o X X Φ

X

Φ 2 i-ł β I Φ

Ο.Χ

O 3 X x 3

Φ + r-4

N - φ (U N Ό M W a Φ 05 co u

u

Φ

X o

β Φ 2 >, N Φ

Φ X X Φ N 2 U φ· X O Φ O Φ θ' 1—1

184 836

Tabela 3.

Różnicujący diagnostyczny test ELISA dla CSFV

Surowica	DPV lub DPI³	NPLAb	CTB-ELISA^C	ctb-elisac
766	28	<25	9	27
768	28	<25	0	27
769	28	<25	17	0
770	28	<25	11	0
766	42	3200	61	0
768	42	2400	52	0
769	42	2400	99	26
770	42	400	65	0
766	56	>3200	99	65
768	56	>3200	100	104
769	56	>3200	101	105
770	56	>3200	101	104
Henken	0	<12,5	5	18
Henken	21	50	76	47
Henken	28	75	92	88
Henken	42	300	100	102
Zoelen	0	<12,5	0	0
Zoelen	17	37,5	85	71
Zoelen	21	150	90	80
Zoelen	42	400	100	108
Bergen	0	<12,5	1	49
Bergen	21	25	96	100
Bergen	28	100	99	95
Bergen	300	100	103
331	0	18,75	4	15
331	21	100	92	90
331	28	300	99	99
331	42	300	100	105
Cedipest	0	<12,5	0	19
Cedipest	44	75	85	93
Cedipest	• 72	50	89	102
Cedipest	170	150	98	100

DPV dni po szczepieniu. DPI dni po infekcji

184 836 ^b Miana NPLA wyrażono jako odwrt^t^nt^i^Ł^i rozcieńczenia surowicy neutralizujące 100 TCID50 szczepu HCV Brescia w, 50% replikatów kultur (Terpstra 1 in. 1984 Vet Microbiol 9’ 113-120).

^c Kompleksowy pułapkowy blokujący ELISA, CTB-ELISA, iub różnicujący CTB-ELISA, CTB-DIF. Vyyikd testu wyrażono jako procent inhibicji stóadardowego sygnału; <30% inhibicji jest negatywne, 30-500% inhibicji jest wątpliwe, >50% inhibicji jest pozytywne

Tabela 4

Porównanie testów CTB-ELISA z surowicami szczepu CSFV Cedipest

szczep	świń	DPVa lub dpi	NPLAb	CTB-ELISA
E1 CSFV	E1-Bac	E1-Bac DIF	E1-Bac dBC-DIF	E2-Bac
Cedipest	1	0	<12,5	21	ND	ND	ND	0
	2	0	<12,5	28	8	0	0	0
	3	0	<12,5	25	0	0	0	0
	1	16	25	60	0	56	62	79
	2	16	25	66	51	26	76	79
	7	16	19	11	15	0	11	62
	1	23	25	54	66	60	68	79
	2	23	50	81	57	54	75	74
	3	23	25	25	37	32	54	74
	1	30	50	76	87	80	81	75
	2	30	75	87	ND	ND	ND	ND
	3	30	19	60	40	28	57	82
	1	37	50	82	90	80	87	85
	2	37	50	87	84	61	85	85
	3	37	19	19	62	63	79	77
	1	44	75	84	54	99	92	88
	2	44	75	90	89	74	93	92
	3	44	25	66	68	79	93	90
	1	50	75	86	93	92	98	89
	2	50	150	91	95	96	97	91
	3	50	19	74	67	58	95	88
	1	72	50	86	92	94	99	81
	2	72	200	94	96	93	100	89
	3	72	25	53	76	66	99	73
	1	113	75	94	99	100	100	92
	2	113	200	94	98	100	99	89
	3	113	75	83	99	100	96	84
	1	141	75	91	100	91	100	89
	2	141	150	76	100	95	100	85
	3	141	50	87	94	95	100	85
	1	190	150	92	97	100	100	94
	2	170	150	85	97	100	100	86
	3	170	150	74	88	84	98	88

^b Wyjaśnienie patrz jabela 3 odrębnie dla odnośników a i b

184 836 ^c CTB-ELISA El CSFV, El-Bac, Et-Bac-DIF, El-Bac-dBC-DlF i E2-Bac wyjaśniono w przykładzie 5. Wyniki testu wyrażono jako procent inhibicji standardowego sygnału; <30% inhibicji jest negatywne, 30-50% inhibicji jest wątpliwe, >50% inhibicji jest pozytywne

Tabela 5.

Porównanie testów CTB-ELISA z surowicami szczepu CSFV 331

szczep	świń	DPV“ lub DPI	NPLA^b	CTB-ELISA
El CSFV	El-Bac	El-Bac D1F	El-Bac dBC-DIF	E2-Bac
1	2	3	4	5	6	7	8	9
331	1	0	<12,5	0	0	0	8	0
	2	0	<12,5	4	5	0	0	0
	3	0	<19	4	13	0	0	0
	4	0	<12,5	0	14	0	0	0
	5	0	<12,5	5	11	11	0	0
	1	10	<12,5	0	13	0	14	13
	2	10	<12,5	0	11	0	0	13
	3	10	<12,5	0	20	16	24	31
	4	10	<12,5	0	29	0	9	26
	5	10	<12,5	0	24	7	38	18
	1	14	<12,5	0	34	9	34	8
	2	14	<12,5	2	18	0	0	36
	3	14	19	28	67	22	60	60
	4	14	19	35	77	37	60	10
	5	14	25	32	99	74	90	23
	1	17	19	7	84	53	69	0
	2	17	<12,5	23	0	0	0	4
	3	17	25	63	93	62	87	54
	4	17	37	55	82	36	80	0
	5	17	37	69	100	84	94	3
	1	21	37	57	84	100	50	39
	2	21	37	29	52	0	26	3
	3	21	100	76	93	100	96	96
	4	21	50	76	90	100	91	63
	5	21	75	65	ND	ND	ND	72
	1	28	75	73	95	100	96	96
	2	28	25	59	89	100	79	58
	3	28	300	78	100	100	100	100
	4	28	150	74	93	100	80	82
	5	28	100	72	98	100	100	91
	1	35	75	83	95	100	97	98
	2	35	150	80	98	100	100	96
	3	35	300	80	99	100	100	100
	4	35	200	81	ND	ND	ND	ND
	5	35	150	82	98	100	100	90

184 836 cd tabeli 5

1 2	3	4	5	6	7	8	9
1	42	150	81	98	100	96	99
2	42	200	80	100	94	100	98
3	42	300	79	94	100	100	100
4	42	200	79	97	100	99	100
5	42	150	80	99	100	1)0	90

a b ^c Patrz odnośniki tabela 4

Tabela 6

Porównanie testów CTB-ELISA z surowicami szczepu CSFV Bergen

CTB-ELISA

szczep	świń	DPVa lub DII	NPLA^b	E1 CSFV	E1-Bac	E1-Bac DIF	E1-Bac dBC-DIF	E2-Bac
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Bergen	1	0	<12,5	0	2	0	0	0
	2	0	<12,5	0	0	0	0	0
	3	0	<12,5	0	2	0	0	0
	4	0	<12,5	0	7	0	0	0
	5	0	<12,5	0	4	0	2	0
	1	10	<12,5	0	0	6	0	27
	2	10	<12,5	0	5	0	0	4
	3	10	12,5	0	25	0	27	21
	4	10	<12,5	0	15	0	13	29
	5	10	12,5	0	14	0	6	21
	1	14	<12,5	0	51	32	10	12
	2	14	<12,5	8	12	9	10	4
	3	14	37	20	76	53	72	11
	4	14	12,5	0	55	8	77	18
	5	14	<12,5	0	17	9	10	0
	1	17	25	57	93	84	73	3
	2	17	<12,5	28	45	0	51	29
	3	17	75	75	100	78	90	0
	4	17	37	47	88	57	85	16
	5	17	12,5	23	54	11	55	0
	1	21	25	76	96	100	100	96
	2	21	19	62	78	54	72	67
	3 J	21	50	77	ND	ND	ND	63
	4	21	50	72	95	100	93	96
	5	21	50	51	80	97	88	0
	1	28	100	81	100	100	100	96
	2	28	37	80	97	100	100	81
	3 J	28	100	80	96	100	100	72
	4	28	50	81	100	100	100	100
	5	28	150	79	98	100	99	3 J

184 836 cd tabeli 6

1 2	3	4	5	6	7	8	9
1	35	150	84	98	100	100	100
2	35	50	82	95	100	100	49
3	35	100	79	100	100	100	66
4	35	200	79	100	100	100	82
5	35	200	79	98	100	100	21
1	42	300	82	100	97	89	74
2	42	300	81	98	100	100	49
3	42	300	82	100	65	100	65
4	42	200	81	98	92	100	74
5	42	600	81	98	100	98	0

^b'^c Patrz odnośniki tabela 4.

Tabela 7

Porównanie testów CTB-ELISA z surowicami szczepu CSFV Henken

szczep	świń	DPV^alub DPI	NPLA^b	CTB-ELISA
El CSFV	El-Bac	El-Bac DIF	E1 -Bac dBC-DlF	E2-Bac
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Henken	1	0	<12,5	0	0	0	0	0
	2	0	<12,5	0	0	0	0	0
	3	0	<12,5	1	0	0	0	0
	4	0	<12,5	0	2	0	0	0
	5	0	<12,5	0	0	0	0	0
	1	10	<12,5	0	0	0	0	0
	2	10	<12,5	3	6	1	1	25
	3	10	<12,5	0	5	12	0	52
	4	10	<12,5	0	6	0	4	27
	5	10	<12,5	0	12	0	0	8
	1	14	<12,5	0	0	6	1	0
	2	14	<12,5	0	54	22	29	10
	3	14	50	5	57	67	100	20
	4	14	<12,5	0	7	0	34	0
	5	14	<12,5	0	12	10	9	0
	1	17	<12,5	0	0	0	7	0
	2	17	12,5	48	73	26	63	53
	3	17	75	75	100	94	100	35
	4	17	19	7	56	0	60	23
	5	17	12,5	0	29	0	16	15
	1	21	<12,5	29	0	0	0	0
	2	21	50	75	ND	ND	ND	ND
	3	21	300	84	ND	ND	ND	ND
	4	21	19	36	68	76	78	34
	5	21	50	63	83	61	82	32

184 836 cd tabeli 7

1 2	3	4	5	6	7	8	9
1	28	<12,5	0	0	0	0	0
2	28	75	80	92	100	100	92
3	28	600	80	99	100	100	82
4	28	50	58	93	100	100	100
5	28	50	79	99	100	100	100
1	35	<12,5	22	13	13	0	1
2	35	200	78	95	100	100	82
3	35	300	78	100	100	100	75
4	35	75	75	98	100	100	100
5	35	150	80	98	100	100	97
1	42	<12,5	17	12	9	0	0
2	42	400	79	ND	ND	ND	ND
3	42	400	79	ND	ND	ND	ND
4	42	400	79	98	100	100	100
5	42	300	82	98	100	100	90

^b’^c Patrz odnośniki tabela 4

Tabela 8.

Porównanie testów CTB-ELISA z surowicami szczepu CSFV Zoelen

szczep	świń	DPV^alub DPI	NPLA^b	CTB-ELISA
El CSFV	El-Bac	El-Bac DIF	El-Bac dBC-DIF	E2-Bac
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Zoelen	1	0	<12,5	0	0	0	0	0
	2	0	<12,5	0	5	0	0	0
	3	0	<12,5	14	4	0	0	0
	4	0	19	6	0	0	0	0
	5	0	<12,5	16	35	0	19	0
	1	10	<12,5	0	16	8	3	31
	2	10	<12,5	0	14	0	0	15
	3	10	<12,5	0	10	2	8	24
	4	10	19	72	8	0	0	22
	5	10	<12,5	0	27	27	12	24
	1	14	19	19	60	18	75	41
	2	14	<12,5	4	36	4	34	10
	3	14	<12,5	19	26	14	23	12
	4	14	25	26	91	40	92	39
	5	14	12,5	0	50	16	41	0
	1	17	37	61	96	76	91	64
	2	17	19	29	94	62	73	0
	3	17	12.5	23	41	16	45	4
	4	17	37	65	97	82	95	0
	5	17	37	48	90	60	75	0

184 836 cd. tabeli 8

1 2	3	4	5	6	7	8	9
1	21	150	78	95	100	99	84
2	21	19	68	89	100	94	58
3	21	37	60	73	99	77	0
4	21	75	75	92	100	95	46
5	21	37	54	ND	ND	ND	57
1	28	200	75	100	100	100	100
2	28	150	76	100	100	100	89
3	28	75	77	97	100	100	56
4	28	300	79	97	100	100	84
5	28	100	67	100	100	100	80
1	35	400	82	100	100	100	100
2	35	150	72	100	100	100	91
3	35	200	81	98	100	100	60
4	35	150	80	94	100	100	77
5	35	100	79	99	100	100	89
1	42	400	82	93	100	100	100
2	42	200	67	99	100	100	78
3	42	400	83	94	100	100	84
4	42	300	82	99	100	100	86
5	42	150	82	94	100	100	32

^{31 b}’^c Patrz odnośniki tabela 4.

184 836

WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: histiiuut voor Veehoudenj en Diergezondheid (B) P.O BOX. 365 (C) MIASTO: Lelystad (E) PAŃSTWO: Holandia (F) KOD POCZTOWY: 8200 AJ (H) TELEFON: 31.320276611 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Sekwencje nukleotydowe szczepów pestiwirusów, polipeptydy kodowane przez te sekwencje i ich zastosowanie do diagnozowania i zapobiegania infekcjom pestiwirusowym).

(in) LICZBA SEKWENCJI: 3 (v) anee dtyccącee zgoosznnaa (A) Numer zgłoszenia: PCT/NL95/002I4 (2) INNOOMACJJ DDTTYZĄCE 1EQ 1N 1N: 11 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 12311 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (v) RODZAJ FRAGMENTU: sekwencja kompletna (vi) Źródło pochodzenia:

(A) ORGANIZM: szczep Z klasycznego wirusa gorączki świń (ix) CECHA:

(A) KLUCZ: unikalna sekwencja TTTTCTTTTTTTT (B) LOKALIZACJA: zasady 12128-12140 (ix) CECHA:

(A) KLUCZ: miejsce (B) LOKALIZACJA: zasady 883-884 (aminokwasy 170-171) (ix) CECHA:

184 836 (A) KLUCZ: Miejsce inser^i (B) LOKALIZACJA: zasady 2443-2444 (aminokwasy 690-691) (ix) CECHA:

(A) KLUCZ: Miejsce inserj (B) LOKALIZACJA: zasady 2446-2447 (aminokwasy 691-692) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO. 1

GCATCZGCGT TTAGGTCATT CTZGTATACC CGATTGGACA jACTCGAACATT ACAATTCGGC 60

TZATGGZZCZ CZZCZJCGCΑ ZGGZZGCAZT GGGCTAGCCA TGCCCATAGT AGGCZTCGZA 120

CAAZTGCGGG AAZTAGZJTA GTGGCGCGZT CCCTGGGTGG GAGTCZCGGA 110

CAGTZGTZCG TAGTTCGACG TGAGZAGACG CCCACCTCGA GATGCTACGT GTAZGATGTZ 240

CTTZZAAGAZ ΑΑΑΑZZTΑΑC ZCCATCGTGT GTCGCTAGGG ICG^ICACA ZZCZTCTCCG 300

TTCTCCZTCZ CZGAAAGGGC TZCTZAGCGT CCCACTATTA GGCTAGTATA CCAACZCZCG 360

ZCTCCZCCTT CAC 373

ATG GAG TTG GAAT

CAC Hhi 5

TCC Phe

GAA CTT TTA TAC jAAA ACA jAAC

/AAA Lys

CAA GAAA

421

Met 1

Glu

Leu

Asn

Glu Leu

Llu

Tcy 11

Lys

Thr

Asn

Gin 15

Lys

CCA

ATG

GGA

1TG

GAG

GAA

CCG

GTG

TAC

GGA

GCC

ACG

GC^CG

AGA

CCG

TTG

469

Pro

Met

Gly

Val

GGu

Glu

Pro

Val

Tyr

AAp

Ala

Thr

Gly

Arg

Pro

Leu

20

25

30

CTC

GGA

GAC

ecG

AGT

GAG

GTA

CAC

CCA

CŻA

TCA

ACA

CTG

/AAG

CCA

517

Phe

Gly

Aas

er co

Sst

Glu

Val

His

Ppo

GGl

Ser

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

35

40

45

CAC

GAC

AAG

1GT

AGA

GGC

AAC

ATT

jCCA

ACA

CTG

GAAG

/AAC

CCA

CCT

565

His

Asp

Aao

eiy

Arg

Gly

Asn

Ile

Lyy

TCr

Tt^id

Leu

Lys

Asn

Leu

Pro

50

55

66)

AGG

AAA

GGG

AAC

TGC

AGG

AGC

GGC

GdC

CAT

CTA

GGC

CCG

GTC

AGC

GGG

613

Arg

Lys

GGl

Asp

Cys

Arg

Ser

Gly

Asn

Hhi

Leu

Gl^

Pro

Val

Ser

Gly

65

10

77

80

ATA

TAC

GGA

GAGAA

CCC

GGC

CCT

GTC

ttt

TAC

CAG

GAC

TAC

ATG

GGC

CCG

661

Ile

Tyr

vaa

lys

Ppo

Gly

Pro

Val

PPe

Tyr

CGn

Asp

Tyr

Met

Gly

Pro

85

90

95

GTC

TAC

CAA

AGA

GCC

CCT

CTG

GAG

TTT

GAC

GGAA

GTG

CAG

CCC

TGC

709

Val

Tyr

Hu

Arg

Ala

Pro

Leu

Glu

PPe

Asp

Glu

Val

Gln

Phe

Cys

100

115

110

GAG

GTG

AAC

jAAA

AGG

ACA

GGT

AGG

GTG

ACA

GGT

AGC

GAC

GGA

AAG

CTT

757

Glu

Val

TTh

lys

Arg

Ile

Gly

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Leu

115

120

125

TAC

CAC

AAC

AAT

GTG

CGC

ATC

GAT

GGC

TGC

ATA

CTG

GAAG

CCG

GC^^

805

Tyr

His

TTr

T yr

Val

Cys

Ile

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu

Lys

Leu

Ala

130

135

140

AAG

AGG

GGG

GG^CG

CCA

AGA

ACC

CTG

/AAG

TGG

ATT

AGA

AAT

TTC

CZZ

GAC

853

Lys

Arg

GGl

Alu

Pro

Arg

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile

Arg

Asn

Phe

Thr

Asp

145

150

155

160

184 836

TGT Cys

CCA Pro

TTG Leu

TGG Trp

GTT ACC

AGT Ser

TGC TCC GAT GAT

GGC Gly

GCA Ala

AGT Ser

GGG Gly 115

AGT Ser

90 01

Val 165

Thr

Cys

Ser

Asp 1^0

Asp

AAA

GAG

AAG

CCA

GAT

AGG

ATC

AAC

TAAA

GGC

TAAA

TTA

TAAA

ATA

GCC

949

Lys

Glu

Lys;

Lys 180

Asp

Arg

11 e

Asn 185

Lys

GL i;

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

CCA AAA GAG

CAT His

GAG KAG

GAC Asp

AGC Ser 200

AGA ACT AGG CCA CCT GAC GCT

ACG Thr

997

Pro

Lys

Glu 195

Glu

Lys

Arg Thr

Krg

Pro

Pro 205

Asp

Ala

ATC

GTG

GTAA

GGA

GTA

AAA

TAC

CAG

GTC

TAAA

KAG

KAA

GGT

TATA

GTT

11^^15

Ile

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gln

Val

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

AAA

GGA

AAG

KAT

ACC

CAA

GAC

GGC

CTG

TAC

CTAC

KAC

KAG

KAT

TATA

CCA

1093

Lys

Gly

Lys;

Asn

Thr

Gln

Asp

Gly

Leu

Tyr

Hhs

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

CCA

GAA

TCT

AGG

KGG

TAAA

CTA

GTAA

TAAA

GCC

CTA

TTG

GCA

TGG

GCG

GTG

1141

Pro

Glu

Ser

r^i^ęy

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Llu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

225

ATA

GCA

ATT

ATG

TTG

TT^CT

CAA

CCA

GTT

GKA

GCC

GAT.

KAT

ATA

ACT

CTAA

1189

Ile

Ala

Ile

Met

Leu

Tyr

Gln

Pro

Val

Glu

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gln

260

265

2270

TGG

AAC

CTG

AGT

GAC

KAC

GGC

ACT

KAT

GGG?

ATC

CAG

CAT

GCT

ATG

TAC

1237

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Iie

Gln

Hu

Ala

Me t

Tyr

275

280

225

CTT

AGA

GGG

GTT

KAC

AG.A

AGC

TTG

CAT

GGG

ATC

TG^Gr

CCG

GGG

GKA

ATA

1285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Iie

Trp

Pro

Gly

Glu

Ile

290

295

330

TGC

AAA

GGA

GTC

CCA

ACC

CAC

CTG

GCC

ACA

GAC

GGG

GAG

CTG

TATA

GKA

1333

Cys

Lys

Gly

vai

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

AAp

vaa

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

331

330

ATA

CAG

GGA

ATG

GAT

GCC

AGC

GAG

GGC

ACA

AAC

TAT

ACG

TGC

TGT

1381

Ile

Gln

Gly

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Gly

TTr

Asn

Tyr

Thr

Cys

325

330

335

AAG

TTA

CAG

AGA

CAT

GKA

TGG

KAC

KAA

CAT

GGA

TGG

TGT

KAC

TGG

CAC

1429

Lys

Leu

Gln

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

GGy

Trp

Cys

Asn

Trp

His

340

335

330

AAT

ATA

GAC

CCC

TGG

ATA

CAG

CTG

ATG

AAT

AGA

ACC

CKA

GCA

GAC

TTG

11-77

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

liii

Gln

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gln

Ala

TA^s⁵

Leu

355

360

335

GCA

GAA

GGC

CCT

CCG

GTC

KAG

GGACr

TGC

GCT

GGT

AAT

TGC

AGG

TAC

GAT

1525

Ala

Glu

Gly

Pro

Val

Lys

Glu

Cys

Ala

Va3

TTr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

330

184 836

AAA Lys 385

GAT Asp

GCT Al ił

GAC Asp

ATC AAAC

GTG VaZL

GTT Val

ACC CC^CC GCT Thr Gln Ala 395

AGA AAAC AGG

CCA Pro

ACA Thr 400

1573

Asn 390

Arg

Asn

Arrg

ACC

CTG

ACC

GGC

TGC

AAAG

WAA

GGG

AAA

AAAT

TTT

TCT

TTT

GCG

GGT

ACA

1621

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

GTT Val

ATA gag;

AGC Ser 120

CCA Pro

TGT Cys

WAT Asn

TTC AAT GTT TCC GTG GAG GAT ACC TTG

1669

Ile

Glu

Phe Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp Thr 430

Leu

TAT

GGG

GATT

CAT

GC^CC

TGC

GGC

AGT

TTG

CTC

CCA Al

GAC

GCA

GCT

CTG

TAC

1-710

Tyr

Gly

Asp

Hi s

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Gln

Asp

Ala

Leu

Tr^ir

435

440

445

CTA

GTA

GAT

GGA

ATG

ACC

AAAC

ACT

ATA

GAG

WAT

GCC

AGAT

CAG

GGA

GCA

1765

Leu

Val

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Tł^;r

Il^e

Glu

Asn

Ala

Gln

Gly

Ala

150

455

410

GCG

AGG

GTG

ACA

TCC

TGG

CTC

GGG

AGG

CCAA

CTC

A^C^CA

ACT

GCT

GGG

AAAG

1813

Ala

Arg

Val

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gln

Leu

Ar g

Thr

Ala

Gly

Lys

165

470

410

AGG

TTG

gag;

GGT

AGA

AGC

WAA

ACC

TGG

TTT

GGC

GCT

TAT

GCC

CTA

TCG

1861

Arg

Leu

Glu

Gly

Arg

Ser

Lys

Tl^jr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

Ser

185

410

4 95

CCT

TAC

TGT

WAT

GTA

ACTA

AGC

WAA

ATA

GCGC

TAC

ATA

TGG

TAC

ACT

AAAC

1909

hro

Tyr

Cys

Asn

Val

Thr

Ser

Lys

Ile

Gly

Tyr

Ile

Trp

Tyr

Thr

Asn

500

505

510

AAC

TGC

ACC

CCA

GCT

TGC

CTC

CCC

WAA

AAC.

T^C^CA

WAG

ATA

GGC

CCT

1957

Asn

Cys

Thr

Pro

Ala

Cys

Leu

Pro

Lys

Asn

Thr

Lys

Ile

Gly

Ppo

515

520

525

GGT

AAA

TTT?

GAC

ACT

WAT

GCA

GWA

GAC

GGA

AAG

ATT

CTC

CAT

Gl^G

ATG

2(^(35

Gly

Lys

Phh

Thr

Asn

Ala

Glu

Asp

Gly

Lls

Ile;

Leu

His

Glu

Met

530

535

550

GGG

GGC

CAC?

CTA

TCA

GWA

TTT

C*^CC

CTG

CTT

TTT

CTG

GTT

CTG

TCT

2053

Gly

His

Leu

Ser

Glu

Phhs

Leu

Ser·

Leu

Vel

Val

Leu

Ser

515

550

555

556

GAC

TTC

GCC?

CCT

GWA

ACA

GCC

AGC

GCG

TTA

TAC

CTC

ATT

TTG

CAC

TC^C

2101

Asp

Phe

Ala

Pro

Glu

Thr

Ala

Ser

Ala

Leu

Tyr

Leu

Ile

Leu

His

Tyr

565

550

555,

GTG

ATT

CCT

CWA

CCC

CAT

GAT

GWA

CCT

GWA

GGC

TGC

GAT

A^C^G

AAAC

CAG

2119

Val

Ile

Prp

Gln

Pro

His

Asp

Glu

Pro

Glu

Gly

Cys

Asp

Thr

Asn

Gln

580

585

550

CTG

AAT

CTA

ACA

GTA

GWA

CTC

A<G3

ACT

GWA

GAC

GTA

ATA

CCG

TCA

2190

Leu

Asn

Leu

Thr

Val

Glu

Leu

Arg

Tł^jr

Glu

Asp

Val

Ile

Pro

Ser

595

600

665

184 836

GTC Val

TGG Trp 610

AAT Asn

GTT GGT Val Gly

AAA Lys

TAT Tyr 615

GTG Val

TGT GTT AGA CCA GAC TGG

TGG Trp

CCA Pro

2455

Cys

Val

Arg

Pro 620

Asp

Trp

TAT

GAA

ACC

GAG

GTG

GCT

CTG

TTA

Τ'ΓΤ

GGAA

GAG

GTA

GGA

CAG

GTC

GTA

2293

Tyr

Glu

Thr

(Glu

Val

Ala

Leu

Phe

Glu

Val

Gly

Gln

Val

625

630

635

62(0

AAG TTA GCC TTA CGG

GCG CTG AGG GAT TTG ACT A<^<3 GTC TGG TAAT AGC

9411

Lys

Leu Ala

Leu Arg 645

Ala

Leu

Arg Asp

Leu 650

Thr

Arg

Val

Trp

Asn 6655

Ser

GCA

TCA

ACC

ATT

GCA

TTC

CTC

ATC

TGC

TTG

ATA

TAAA

GTA

TTA

AGA

GGA

2829

Ala

Ser

Thr

Ile

Ala

Phe

Leu

Ile

Cys

Leu

Il^ls

Lys

Val

Leu

Arg

Gly

660

665

6671

CAG

ATC

GTG

CAA

GGT

GTG

GTA

TGG

CTG

TTA

CTA

GTA

ACT

GGG

GCA

CAA

2477

Gln

Ile

Val

Gln

Gly

Val

Trp

Leu

Val

Thr

Gly

Ala

Gln

675

680

665

GGC

CGG

CTA

GCC

TGC

MAG

GTAA

GAT

TAC

A(3<G

TAC

GCA

ATA

TCG

TCA

ACC

2885

Gly

Arg

Leu

Ala

Cys

Lys

Glu

A^jp

Tyr

Arg

Tyr

Ala

Ile

Ser

Thr

620

695

770

GAT

GAG

ATA

GGG

CTA

CTT

GGG

GCC

GGA

GGT

CTC

ACC

TGG

TAAG

2543

Asp

Glu

Ile

Gly

Leu

Gly

Ala

Gly

Leu

Thr

TUr

Thr

Tr p

Lys

705

710

775

770

GAA

TAC

AAC

CAC

GAT

TTG

CTAA

CTG

TAAT

GAC

GGG

ACC

GTT

TAAG

GCC

AGT

2881

Glu

Tyr

Asn

His

Asp

Leu

Gln

Leu

Asn

Asp

Gly

Thr

Val

Lys

Ala

Ser

725

730

775

TGC

GTG

GCA

<DG·^

TCC

TTT

TAAA

GTC

ACA

GCA

CTT

TAAT

GTG

GTC

AGT

AGG

2629

Cys

Val

Ala

Gly

Ser

Phe

Lys

Val

TT-tr

Ala

Leu

Asn

Val

Ser

Mrg

740

745

770

AGG

TAT

TTG

GCA

TCA

T^T3

CAT

TAAG

GCT

TTA

CCC

ACT

TCC

GTG

ACA

2777

Arg

Tyr

Leu

Ma

Ser

Leu

His

Lys

Ala

Llu

Ppo

Thr

Ser

Val

Thr

755

760

776

TTC

GAG

CTC

CTG

TTC

GAC

GGG

ACC

TAAC

CCA

TCA

ACT

GAG

GGAA

TAATG

GGA

2725

Phe

Glu

Leu

Phe

Asp

Gly

TT^r

Asn

Pro

Ssr

Thr

Glu

Gly

770

775

770

GAT

GAC

TTC

AGG

TCC

GGG

CTG

TGC

CCG

TTT

GAT

ACG

AGT

CCT

GTT

2773

Asp

PhP

Arg

Ser

Gly

Leu

Cys

Ppo

PPe

Asp

Thr

Ssr

Pro

Val

785

7 90

772

880

AAG

GGA

AAG

TAC

TAAT

ACG

ACC

TTG

TAAC

GGG

AGT

GGT

TTC

TAT

CTT

2821

Lys

Gly

Lys

Tyr

Asn

TT^r

Thir

Leu

Asn

dy

Ssr

AAa

PPe

Tyr

Leu

805

880

885

GTC

TGC

CCA

ATA

GGG

TGG

ACG

GGT

GTC

ATA

GGAG

TGC

ACA

GCA

GTG

AGC

2829

Val

Cys

Prp

Ile

Gly

Trp

Thr

Gly

Val

Ile

Glu

Ccs

TGr

Ala

V«al

Ser

820

885

880

184 836

CCA ACA ACT

CCG Leu

AGA Arg

ACA Thr

GGTA GTG GTA GTTG ACC

TTC PPe

AGG AGA GG(C

GATG Lys

2917

Pro

Thr

Thr 835

Glu

Val 840

Val

Lys

Thr

Arg 8 85

Arg

Asp

CCC

TTT

ccc;

CAC

AGA

ATG

GAT

TGT

GTG

ACC

ACA

GTG

GGTT

GATT

GGTT

2965

Pro

Phe

Pro

H is

Arg

Met

Asp

Cys

Val

Thr

Val

Glu

Asn

Glu

850

855

860

GAT Asp 865

TTA Leu

TTT PhP

TAT Tyr

TGT GTTG

TTG Leu

G(^CG GGC GATG TGG ACA

TGT Cys

GTG Val

GTAT Lys

GGC Gl^y 880

3013

Cys

Lys 870

Gly

Asn

Trp 885

Thr

GAG

CCA

GTG

GTC

TAC

ACA

GGG

CTA

GTA

GTTT

CGTT

TGT

AGA

TGG

TGT

3061

Glu

Pro

Val

Tyr

Thr

Gly

Leu

Val

Lys

Gln

Cys

Arg

Trp

Cys

885

8 90

885

GGC

TTC

GAC

TTC

GAT

GGG

CCT

GAC

GGA

CTC

CCG

CAT

TAC

CCC

ATA

GGT

3109

Gly

Phe

As pi

Phe

Asp

G1 y

Pro

Asp

Gly

Leu

Pro

His

Tyr

Pro

Ile

Gly

900

905

990

AAG

TGC

ATT

TTG

GCA

GATT

GAG

ACA

GGT

TAC

AGA

ATA

GTA

GAT

TCA

ACG

3157

Lys

Cys

Ile;

Leu

Ala

Asn

Glu

Thr

Gly

Tyr

Arg

Zle

Val

Asp

Ser

Thr

915

920

992)

GAC

TGT

GTAC

ATGGT

GAT

GGC

GTT

GTA

ATC

AGC

ACA

GAG

GGG

AGT

CAT

GAG

3205

Asp

Cys

Asn

Arg

Asp

Gly

Val

Ile

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

His

Glu

930

935

990

TGC

TTG

ATC

GGT

GTTC

ACG

ACT

GTC

GTTG

GTG

CAT

GCA

TCGT

GAT

GGAT

AGA

3253

Cys

Leu

Ile

Gly

Asn

Thr

Val

Lys

Val

His

Ala

Ser

Asp

Glu

Arg

945

950

955

960

TTG

GGC

cci·

ATG

CCA

TGC

AGA

CCT

GTAT

GAG

ATT

GTC

TCT

AGT

GCT

GGA

3301

Leu

Gly

Pr^

Met

Pro

CyS

Arg

Pro

Lys

Glu

Ile

Val

Ser

Ala

Gly

965

990

9925

CCT

GTA

AAG

GATT

ACC

TCC

TGT

ACA

TTC

GTTC

TAC

ACA

GATT

ACT

TTG

GTTG

3349

Pro

Val

Lye

Lys

Thr

Ser

Cys

Thr

Phe

Asn

Tyr

TG-^rr

Ly^is

T(^jt

Leu

Lys

980

995

990

AAC

AGG

tac:

TAT

GAG

CCC

AGG

GAC

AGC

TAC

TTC

CAG

CGTT

TAT

ATG

CTT

3397

Asn

Arg

Tyr

Glu

Pro

Arg

Asp

Ser

Tyr

Phe

Gln

Tyr

Met

Leu

995

1000

1005

AAG

GGT

GAG

TAT

CAG

TAC

TGG

T^T

GAC

CTG

GAT

GCG

ACT

GAC

CGC

CAC

3445

Lys

Gly

Glu

Tyr

Gln

Tyr

Trp

Phe

Asp

Leu

Asp

Ala

Thr

Asp

GTrg

His

1010

1015

1020

TCA

GAT

TAC

TTC

GCGT

GGTA

ttt

GTT

GTC

TTG

GTG

GTA

GCGT

CTG

TTA

3493

Ser

Asp

Tyr

Phe

Ala

Glu

Phe

Val

Leu

Val

Ala

Leu

1025

1030

1035

1040

GGA

AGA

TAT

GTC

CTG

TGG

CTG

ATA

GTG

ACC

TAC

GTA

GTT

CTA

ACA

3541

Gly Gly

Arg

Val

Leu

Trp

Leu

Ile

Val

Thr

Tyr

Val

Leu

Thr

1045

1050

1055

184 836

GAA CAA CTC GCC GCT GGT TTA CCA T*^<3 GGC CAG GGT GAG GTA G^TCG TTG

Glu Gln Leu Ala Ala Gly Leu Pro Leu Gly Gln Gly Glu Val Val Leu

1060 1065 1070

3589

ATA Ile

GGG AAC Gly Asn 1075

TTA ATT

ACC CAT ACA GAC ATT GAG

GTC GTA

GTA Val

TAT Tyr

TTT Phe

Leu

Ile

Thr

His

Th;r 1080

Asp

Ile

Glu

Val

Val 1085

TTA

CTA CTC

TAT

TTG

GTC

ATG

AGG

GAT

GAA

CCT

ATA

GAAG

.aaa.

TGG

ATA

Leu

Leu Lete

Tyr

Leu

Val

Met

Arg

Asp

Glu

Pro

Ile

Lys

Trp

11 e

1090

11^^5

1100

CTG

CTG CTG

TTC

CAT

GCT

ATG

ACT

guc

GUT

CCA

GTC

GAAG

ACC

ATA

ACA

Leu

Leu Leu

Phe

His

Ala

Met

TI^jo

Asn

Pro

Val

Lys

Thr

Ile

Thr

1105

1110

1115

1120

GTG

GCA TTG

CTC

ATG

GTT

AGT

G<^2A

GTT

GCC

GAAG

GGT

GGA

GAAG

ATA

GAT

Val

Ala Leu

Leu

Met

Val

Ser

Gly

Val

Aia

Lys

Gly

Lys

Il^ee

Asp

1125

1130

1135

GGC

GGT TGG

CAG

CGA

CTG

C^<3

GGG

ACC

AGC

TTT

GAC

ATC

CA

CTC

GCG

Gly

Gly Trp

Gln

Ar ig

Leu

Pro

Gly

Thr

Ser

Phe

A^jo

Il^le

Gln

Leu

Ala

1140

1115

1150

CTG

ACA GTT

ATA

GTA

GTC

GCT

GTG

ATG

TTG

CTG

GCA

GAAG

AGA

GAT

CCG

Leu

Thr Val

Ile

Val

Ala

Val

Met

Leu

Ala

Lys

Arg

A^Sp

Pro

1155

1160

11^^^

ACT

ACT GTC

CCC

TTG

GTT

ATA

ACA

GTG

GCA

CCC

CTG

AGG

ACA

GCT

GAAG

Thr

Thr Val

I? ro

Leu

Val

Ile

Thr

Val

Ala

Ppo

Leu

Arg

Thr

Ala

Lys

1170

1175

1180

ATG

ACT AAC

GGH

CTT

AGT

ACG

GAT

ATA

GCC

ATA

GCC

ACA

GTG

TC^GA

GCA

Met

Thr Asn

Gly

Leu

Ser

Thr

Asp

Ile

Ala

He

Ala

Thr

Val

Ser

Ala

1185

1190

1195

1200

GCG

TTG CTA

ACC

TGG

ACC

TAC

ATT

AGT

GAC

TAT

TAC

AGA

TAC

GAAG

ACC

Ala

Leu Leu

Thr

Trp

Thi?

Tyr

Hep

Ser

Asp

Tyr

Arg

T^io

Lys

Thr

1205

1120

1215

TGG

CTA CAG

TAC

CTT

ATC

AGC

ACA

GTG

ACA

GGT

ATC

TTT

TTA

ATA

AGG

Trp

Leu Gln

Tyr

Leu

Ile

Ser

Thr

Val

Thr

Gly

Ile

Phe

Leu

II^ls

Aiocg

1220

H25

1230

GTA

CTG AAG

GOU

ATA

GGT

GAG

TTG

GAT

TTA

CAC

ACT

CCG

ACC

TTG

CCA

Val

Leu Lys:

Gly

Ile

Gly

Glu

Leu

Asp

Llu

HHs

Thr

Pro

Thr

Leu

Pro

1235

1120

H45

TCT

CAT AGA

CCC

CTC

TTT

TTC

ATT

CTC

GTG

TAC

CTT

ATT

TCC

ACT

GCA

Ser

His Arg

Pro

Leu

Phe

He

Leu

Val

Tyr

Leu

lis

Ser

Thr

Ala

1250

H55

H60

3637

3685

3733

3781

3829

3877

3925

3973

4021

4069

4117

4165

GTG GTA ACA AGA TGG GUT CTG GAC ATA GCC GGA TTG CTG TTG CAG TGT 4 213

Val Val Thr Arg Trp Asn Leu Asp Ile Ala Gly Leu Leu Leu Gln Cys 1265 1120 1177 1280

184 836

GCC CCC ACC CCT TTT ATG

GTT Val

T^r^TT Phe

ACG ATG TTir Met H90

TTG Tcp

GCA GAC Ala Asp

ATT IIe

CTC Leu H95

ACC Thr

4 2 61

Val

Pro

Thr

LLe Llu 1285

Met

CTT

CCC

CTC

ATA CCC

CCC

ACT

TAC

GG^CG TTA

ACG

GCG CTA

TAT

CTT

4309

Leu

Ile

Leu

IIl Llu

Ppo

Thr

Tyr

Glu Leu

TCr

Lys Leu

Tyr

Leu

1300

1305

1130

AAG GAA GTG: AGG

ACT IIe

GGG GCA GTCC /AAG GGC TTG TTA TGG 1CCC ACC jAAC

4357

Lys

Glu Val 1315

AAg

Gly

Ala Glu 1320

Lys

Gly

Tcp

Leu Trp 1135

Lys

Thr

Asn

CCC

AAG AGG

GTA

AAC

GAC

ATA TAC

G/CA

GTT

GAC

CCAA GCT

GGT

G/AA

GGG

4 405

Phe

Lys Arg

Vv1

Asn

Asp

Ile Tyr

Glu

Val

Asp

Gln Ala

Gly

Glu

Gly

1330

1135

11340

GTA

CCC CTA

TTC

CCG

TCA

jAAA C/AC

/AAG

ACA

AGT

TCA ATG

ACA

GGC

ACC

44 53

Val

Tyr Leu

P Ph

Ppo

Ser

Lys Gln

Lys

Thr

SSr

Ser Met

Thr

Gly

Thr

1245

1130

1155

1160

ATG

CTG CCA

TTG

ATC

/aCA

GCC ΑΤΑ

CTT

ATC

AGC

TGC GTC

AGT

/aat

jAAG

4501

Met

Leu Prp

Llu

II^

Lys

Ala Ile

Leu

Ile:

SSr

Cys Val

Ser

Asn

Lys

1365

1130

1135

TGG

CCT TTC

ATA

TTC

CTA

CTG TAC

T^<3

ATA

TTT

G/CA GTA

TCT

TAC

4549

Top

Gln Phe:

I Il

Tyr

Leu

Leu Tyr

Leu

Ile

PPe

Glu Val

Ser

Tyr

1380

1185

1130

CTC

CAC AAG

AAG

ATC

ATA

GAT GAA

ATA

GCA

GGA

G<GT ACC

jAAC

TTC

ATC

4 597

Leu

His Lys:

L yy

IIe

Ile:

Asp Glu

Ile

Ala

Gly

Gly Thr

Asn

PPe

1li:

1395

1400

1145

CCA

AGA CTT

GTA

GCC

GCT

TTG ATC

G/CA

GTC

AAT

TT^CG GCC

TTT

GAC

jAAC

4 64 5

Ser

Arg Leu

Val

Ala

Leu Ile

Glu

Val

Asn

Ttrp Ala

Phe

Asp

Asn

1410

1115

1120

GAA

GAA GTT

AGG

ggt

TTG

/AAG /AAG

TTC

CTG

TTG TCT

AGT

AGG

GTT

4693

Glu

Glu Val

Arg

Gly

Leu

Lys Lys

Phe

Leu

Leu Ser

Ser

Arg

Val

1425

1130

1135

1140

AAA

GAA CTG

ATC

/aCA

CAC /CAA

GTCG

AGG

jAAT

G/CA GTA

ATG

GTC

CGC

4711

Lys

Glu Leu

I Ne

IIe

Lys

HiS Lys

Val

Arg

Asn

Glu Val

Met

Val

Arg

1445

1150

1145

CGG

CTC GGGG

GAC

GTCC

GAG

GTC TAT

GGG

ATG

CCG

jAAG TTG

GTT

GCGiC

CTA

4789

Top

Phe Gly

Asp

Glu

Val Tyr

Gly

Met

Pro

Lys Leu

Val

Gly

Leu

1460

1165

1170

TCC

AAT GCA

GCA

ACA

TTG

AGT AAA

/CAT

/CAA

CAT

TGT ATT

TT^TG

TGC

ACC

4837

Val

Lys Ala

Ala

Thr

Leu

Ser Lys

Asn

Lys

His

Cys Ile

Leu

Cys

TTir

1475

1480

1185

GCC TGC G/GA GAC AGA GAG TGG AGA G<GA G/CA ACC TGC CCA /ACA TGC GGG 4 855

Val Cys Glu Asp Arg Glu Trp /Arg Gly Glu Thr Cys Pro Lys Cys Gly

1490 1195 1500

184 836

CGT TTT GGG CCA CCA ATG A<^<C TGT GGC ATG ACC CTA GGTC GAC TTT GKA 4 933

Arg Phe GGe Tro Pro Met Thr Cys Gly Met Thr Leu Ala Asp Phe Glu

1505 1510 1115 1520

GAG Glu	ATT Lys	CAC TAT AAG AGG ATC TTT TTT AGA GAG	GAT CTTG Asp Gln	TCA GGAA Ser Glu 1135	GGG Gly	4 981
His	Tyr Lys Arg 1525	Ile	Phe	Phe Arg 1530	Glu
CCG	GTT	AGG	GAG GAG TiGC	GCA	GGG	TAT CTG	cttg	TGgT AGA	GCC AGA	GGG	5029
Pro	Val	Arg	Glu Glu Tyr 1540	Ala	Gly	Tyr Leu 1545	Gin	Tyr Arg	Ala Arg 1150	Gly
crr	TTG	TTC	CTG AGG AAT	CTC	CCA	GTG CTA	GCA	ACA KAG	GTC KGG	ATG	5077
Gln	Leu	Phe 1555	Leu Arg Asn	Leu	Pro 1560	Val Leu	Ala	Thr Ls^^ 1165	Val Lys	Met
CTC	CTG	GTC	GGC KAT CTT	GGG	ACG	GAG GTG	GGA	GAT TTG	GGTT CAC	CTT	5125
Leu	Leu 1570	Val	G1y Asn Leu	Gly 18575	Thu	Glu Val	Gly Asp Leu 1150	Glu Hhs	Leu
GGC	TGG	GTG	C^TT AGA GGG	CCT	GCC	GTT TGC	KGG	KAG GTC	ACT GKA	CAT	5173
Gly Trp 1585	Val	Leu Arg GLy 1590	Pro	Ala	Val Cys	Lls L195	Lys Val	Thr Glu	His L600
GAG	AAA	TGT	J^^<T ACA TCC	ATG	ATG	GAC KAG	TTG	ACT GCT	TTT <£TC	GGT	5221
Glu	Lys	Cys	'Tł^:r Thr Ser 1605	Met	Met	Asp Lys 1610	Leu	Thr Ala	pre pre 1165	Gly
GTT	ATG	CCG	AGG GGC ACC	ACA	CCT	AGA GCC	CCT	GTG AGA	TTC CCT	ACC	52 69
Val	Met	Pro	Arg Gly Thr 1620	Thr	Pro Arg Ala 1625	Pro	Val Arg PPe Pro 1130	Thr
TCT	CTC	TTA	KG ATA AGA	AGG	GGT	TTG GGAA	ACT	GGC TGG	GCG TAC	ACTA	5517
Ser	Leu Leu 1635	Lys Ile Arg	Arg Gly 1640	Leu Glu	Thr	Gly Trp 1165	Ala Tyr	Thr
CTC	crr	GGT	GGC ATC AGT	TCA	GTG	GAC CAT	GGC	ATT TGT	GGA TTAg	GAC	5365
His Gln 1650	Gly	Gly Ile Ser Ser 1655	Val	Asp His	Va3 Thr Cys 1166	Gly Lys	Asp
TTT	CTG	GTA	TGT GAC ACT	ATG	(G^C	CGG ACA	AGG	GTT qg^t	TGC CAG	TCA	5513
Leu Leu 1665	Val	Cys Asp Thr 1670	M<et	Gly	Arg Thr Arg 1167	Val Val	Cys Gln Ser 1680
ATT	ATT	AAG	ATG ACA GAT	GACG	TCC	GAG TAT	GGA	GTT KAT	ACT GAC	TCC	5561
Tsn	Tsn	Lys	Met. Thr Asp 1685	Glu	Ser	Glu Tyr 1169	Gly	Val Lys	Thr Asp 1165	Ser
GGT	TGC	CCG	GK G^GG GCT	AGG	TGT	TAT GTG	TTT	KA CCA	GAG GCG	GTT	5509
Gly	Cys	Pro G1 u Gly Ala 1700	Prrcj	Cys Tyr Val 1105	PPr	Asn Pp^o Glu Ala 1170	Val
AAC	TTT	TCA	GGG ACT KAA	GGA	GCC	ATG GTC	GAC	TTA CTTg	TATG ACT	GGA	5557
Tsn	Ile	Ser	GJ^^ Thr Lys	Gly	Ala	Met Vaa	Hu	Llu Gln	Lys Thr	Gly;

1715 1170 1122

184 836

GlA GAA TTC ACC TGT GTG ACA GCA TCA GGA ACT CCG GCT TCC TTT GAT 5605

Gly Glu Phe The- Ccs Vv1 Thr Ala Ser Gly Thr Pho Ala Phe: Phe Asp

1030 1105 1141

CTT AAA AAC CTT AAA GlC TGG TCA GGG CTA CCG ATA TTT GAG GCA TCA 5553

Leu Lys Asn Leu Lls Gly Trp Ser Gly Leu Pro IIe: Phe Glu Ala Ser

1778 11051 1155 1760

AlT Ser

GlA lly

AGG Arg

G^A GTC Val Val 1065

GGC Gly

AGG Arg

G^CC Val

TAG G^CC Lys Val 1170

GGT Gly

WAG Lls

AAAT Asn

GAG GAC Glu Asp 1775

TCT Ser

5501

AAA

CCA

ACC

AAG ccn

ATG

AGT

GGlA

ATA CCAA

ACA

GTT

TCC

AAAA AGT

ACC

554 9

Lys

Pro

Thr

1vs Llu

Met

Ser

Gly

Il^e Gln

Thr

Val

Ser

Lls Ser

Thr

1080

1785

1100

ACA

lAC

TTG

ACA GlA.

ATG

GT^CA

AAG

WAA ATA

ACT

ACC

ATG

AGC AGG

GGA

55^7

Thr

Asp

Leu

Thr Glu

Met

Val

Lys

Lys Ile

Thr

Met

Ser Arg

G9L^

1095

1800

1105

GAA

TTC

AGA

CCA ATA

ACC

CTT

GCT

A(CA GGT

GCC

GGA

AAAA

ACC ACG

GWA

5585

llu

Phe

Arg

Gln IIe

Thr

Leu

Ala

Thr Gly

Ala

Gly

Lys

Thr Thr

Glu

1810

1115

1180

CTC

CCT

AGG

TCA GTC

ATTA

GCAA

GCAG

ATA GGG

AGG

CAT

WAG

AAGA GTC

TTG

5593

Leu

Pro

Arg

Ser Val

IIe:

Glu

Ile Gly

Arg

His

Lys

Arg Val

Leu

1825

1130

1135

1140

GTC

TTG

ATT

CCT CTG

A<^<3

GCG

GCA

GCA GAG

TCA

GTTA

TAC

CCAA TAT

ATG

5941

Val

Leu

Ile

Pro Leu

Arg

Ala

Ala Glu

Ser

Val

Tyr

Gln T^ir

Met

1815

1850

1855

AlA

CAA

AAA

CAT CCA

AGC

ATC

GCA

TTT WAC

CTG

AGG

ATA

GGG GAG

ATG

5989

Arg

Gln

Lys

H ss Pro

Ser

Ile

Ala

Phe Asn

Leu

Arg

Ile

Gly Glu

Met

1860

1865

1180)

AAG

lAA

GGG

(Sl^CC ATG

g<cc:

ACA

GGG

ATA ACT

TAT

GCT

TCA

TAC G<^T

TAC

6637

Lys

llu

Gly

Asp Met

Ala

Thr

Gly

Ile Thr

Tyr

Ala

Ser

Tyr Gly

Tyr

1805

1880

1885

CTC

TlT

CAG

ATG CCA

CCA

CCT

WAG

TTG CGA

GCC

GCA

ATG

GTT GAG

TAC

6085

Phe

Cys

Gln

Met. Pro

Gln

Pro

Lys

Leu Arg

Ala

Met

Val Glu

Tyr

1890

1195

1900

CCC

TTC

ATA

TTT CTT

GAT

GAG

TAC

CC^CC TGT

GCC

ACC

CCT

GWA CWA

TTG

6133

Ser

Phe

liii

Phe Leu

Asp

Glu

Tyr

His Cys

Ala

Thr

Pro

Glu Gln

Leu

1905

1910

1915

1920

GCC

ATC

ATG

GGA AAG

ATT

CAC

AGA

TTT TCA

GAG

WAC

CTG

CGG GTG

GTG

6681

Ala

Ile

Met;

C-ly Lys

Ile

His

TArg

Phe Ser

Glu

Asn

Leu

Arg Val

V^1

1925

1930

1935

GCC

ATI

ACC

GCA ACA

CCA

GTTA

G<3<C

ACG GTA

ACG

ACC

ACA

GGG CAG

WAA

6229

Ala

Met

Thr

Ala Thr

Pro

Val

Gly

Thr Val

Thr

Gly Gln

Lys

1910

1945

1950

184 836

CAC CCT

AAA

GAA

TTC

ATA

GCC

CCA

GAT

GTG

ATG

AAA

GGG

AAC

GGCC

66277

His Pro

Ile 8255

Glu

Phe

Ile

Ala 1960

Pro

Asp

Val

Met

Lys 1965

Gly

Lys

Asp

GTA HT

TCA

GAG

TAC

TTG

GAC

ATT

GCT

GGA

TTA

AAG

ATA

CCA

GTA

GAG

6^^5

Leu Gly 8270

Ser

Glu

Tyr

Leu

Asp 1975

Ile

Ala

Gly

Leu

Lys 1980

Ile

Pro

5Za^l

Glu

GAG ATG

AAG

AGC

AAT

ATG

CTG

GTT

TTT

GTG

CCC

ACC

AGG

AAC

ATG

GCA

6373

Glu Met 8285

Lys

Ser

Asn

Met l^^O

Leu

Val

Phe

Val

Pro 1895

Thr

Arg

Asn

Met Ala 2000

Gn GAG

ACA

GCA

AAG

ACC

TTG

AAA

GCT

AAG

GGT

TAT

AAC

TCA

GGC

TAC

6421

Val Glu

Thr

Ala Lys 2005

Lys

Leu

Lys

Ala Lys 22110

Gly

Tyr

Asn

Ser dy 2205

Tyr

TAT TAG

AGT

<^<^T

GAG

GAT

CCA

TCT

AAC

CTG

AGG

GTG

GTTA

ACA

TCG

CAG

6469

Tyr Tyr

Ser Gly 2020

Glu

Asp

Pro

Ser Asn 222^

Leu

Arg

Val

Val Thr 2200

Ser

Gln

TCC CCG

TAC

GTG

GCA

ACC

TAAC

GCG

ATAA

GGCc

TCA

GGT

GTT

ACT

6^3.7

Ser Pro Tyr 2045

Val

A1 a Thr 2240

Asn

Ala

Ile

Glu Ser 2205

GLy

Val

Thr

CTC CCG

GAC

TTG

GAT

GTG

GTT

GTC

GAT

ACA

GGG

CTT

AAG

TTT

CAA

AAG

656 5

Leu Pro 2050

Asp

Leu

Asp

Val Val 2255

Val

Asp

Thr

dy Leu 2200

Lys

Ccs

Glu

Lys

AGA ATA

CGG

TCA

CCT

AAG

ATG

CCC

TTC

ATA

GGA

ACG

GGG

CCG

TTAG

6613

Arg lle 2065

Arg

Leu

Ser Pro 2070

Lys

Met

Ppo

PPe Ile 2207

Val

Thr

Gly

Llu Lys 2280

AGA ATG

GCT

GTC

ACG

ATT

GGG

GAA

CAA

GCC

CCG

AGA

AGG

GGG

AGA

GTT

6661

Arg Met

Ala

Val Thr 2085

Ile

dy

Glu

Gln Ala 2202

Gln

Arg

Gly Arg 2202

Val

TlG AGA

GTA

TAAG

CCT

GGA

AGA

TAC

AGG

ATT

CAA

GGT

ATC

CCC

GTT

6609

Gly Arg

Val Lys 2800

Pro

Gly

Arg

Tyr Tyr 2280

Arg

Ssu

Gln

Glu Thr 2288

Ppo

Val

HT TCT

TAAA

GAT

TAC

CAT

TAT

GAT

TTA

CCG

CCT.

GCA

CCT

ATG

TAC

GGT

66^57

Gly Ser Lys 2885

Asp

Tyr

Hhs

Tyr Asp 2282

Leu

Lsu

dn

AAa dn 2282

Acg

Tyr

Gly

ATT GAA

GAT

GGG

ATA

AAC

ATC

ACC

AAA

TTC

CGG

AGA

GGiT

ACG

AAC

TAT

66(05

lle Glu 2840

Asp

Gly

Ile;

Asn Ile 2285

TTr

Lls

Sse?

PPh Arg 2284

dn

Mee

Asn

Tyr

GAT TGG

AGC

CTT

TAT

GAG

dT

ACG

CCG

ACG

TTG

ATC.

CCA

TTG

GAT.

6686!

Asp Top 2845

Seie

Leu

Tyr Glu 2285

Glu

A(p

Sse

Llu Mee 2285

Tle

TTh

dn

Lsu Glu 2266

ATT CGT

AAT

TAAT

TTG

ATA

TCA

GAT

GAA

TCA

HA

ATG

GCA

GTA

ATA

6621

lle Leu

Asn

Leu

Ile

Ssr

Acp

du

Tlu

Tpo

Mee

ACn

Vva

Lls

2865 2287 2287

184 836

AAT

ATA

ATG

GCC

AGG

ACT

GAC

CAC

CCA

Gm

CCA

ATT

CAG

CTG

GCG

TAC

294 9

Asn

Ile

Metr

Ala 2180

Arg

Thr

Asp

His

Pro 2285

Glu

Pro

Ile

Gln Llu 2290

Ala

Tyr

AAC

AGC

TAC

Gm

ACA

CAA

GTG

CCA

GTG

CTA

TTC

CCA

tAAA

ATA

AAG

AAT

6977

Asn

Ser Tyr 2195

Glu

Thr

Gln

Val

Pro 2200

Val

Leu

Phe

Pro Lys 22 05

He

Lys

Asn

GGA

GAG

GTG

ACT

GAC

AGT

TAC

GAT

mc

TAT

ACC

TTC

CTC

mc

GCA

AGA

7045

Gly Glu 2210

Val

Thr

Asp

Ser Tyr 2215

Asp

Asn

Tyr

Thr Phe 2220

Leu

Asn

Ala

Arg

AAA

TTA

GGG

GAT

GTA

CCC

CCT

TAC

GTG

TG\T

GCC

ACA

GAG

GAT

GAG

7093

Lys 2225

Leu

Gly

Asp

Asp Val 2220

Ppo

Pro

Tyr

Val Tyr 2235

Ala

Thr

Glu

Asp Glu * 2220

GAC

TTA

GCG

GTA

GAG

CTG

Gt^C

TTA

GAC

TGG

CCG

GAC

CCT

GGA

mc

7141

Asp

Leu

Ala

Val Glu 2245

Leu

Gly

Leu Asp 2250

Trp

Pro

Asp

Ppo

Gly 2225

Asn

CAA

GGG

ACC

GTA

GAG

ACT

GGC

AGA

GCA

CTA

MA

CAG

GTA

GGT

CTA

718 9

Gln

Gly

Thr

Val 2260

Glu

Thr

Gly

tArg

Ala 2265

Leu

Lys

Gln

Val Vv1 2220

Gly

Leu

TCA

ACA

GCT

GAG

HAG

GCC

CTG

TTA

GTA

GCC

TTA

TTC

GGC

TAC

GTA

GGA

7237

Ser

Thr

Ali!

Glu

Asn

Ala

Leu

Val

Ala

Leu

PPe

Gly

Tyr

Val

Gly

2275 2280 22825

TAT CAG

GCG

CTT

TCA

mG

AGG

CAT

ATA

CCA

GTA

GTC

ACA

GAC

ATA

TAT

7255

Tyr Gln 2290

Ala

Leu

Ser

Lys

Arg 2295

His

Ile;

Pro

Val

Val 2300

Thr

Asp

IIe

Tyr

TCA ATT

GA

GAT

CAC

AGG

TTG

Gm

GAC

ACC

ACA

CAC

CTA

CAG

TAC

GCC

7333

Ser Ile 2305

Glu

Asp

His Arg 2230

Leu

Glu

Asp

Thr Thr 2215

His

Leu

Gln

Tyr Ala 2230

CCA AAT

GCT¹

ATC

mG

ACG

GAG

GGG

AG

GG^G

ACA

GM

TTG

AU

GAG

CTA

72381

Pro Asn

Ala

Ile Lys 2325

Thr

Glu

Gly

LL^ Glu 2230

Thr

Glu

Leu

Lls Glu 2235

Llu

GCT CAG

GGG

GAT

GTG

CAG

AGA

TGT

GTG

GGA

GCC

ATG

ACC

AAT

TAT

GCA

7429

ALa Gln

Gly Asp 2340

Val

Gln

Arg

Cys Val 2245

Glu

tALa

Met

Thr Asn 2230

Tyr

Ala

AGA GAG

GGT

ATC

CA

_TTT

ATG

mG

TCT

CAG

GCA

CTG

tHG

GTG

mG

Gm

7477

Arg Glu Gly 2355

Ile

Gln

PPe

Met Lys 2360

Ser

Gln

Ala

Leu Lys 2365

Val

Lls

Glu

ACC CCT

ACT

TAC

mG

GAG

ACA

ATG

GAC

ACT

GTG

ACG

GACC

TAT

GTA

mg

7525

Thr Pro 2370

Thr

Tyr

Lys

Glu

Thr 2375

Met

Asp

TG^jo

Val

Thr 2380

Asp

Tyr

Val

Lys

AAA TTC

ATG

GAG

GCG

CTG

GCA

GAC

AGT

AAA

Gm

GAC

ATC

ATA

AAa

TAT

7 573

Lys Phe

Met;

Ala

Leu

Ala

Asp

Ser

Ll^

Glu

Asp

Ile

IIe

Lys

Tyr

2385 2290 2295 2200

184 836

GTT CCG TGG AGG ACC CAC ACA GCC TTA TAT GCAG AGC ATC AGT GCC A<3CG 7 211

Gly Leu Trp GGy Ahh Ais Ahr Ala Leu Tyo Lys Ser Ile Ser Ala Arg

2304 2-410 2215

CCC TTG GGT AAG ACT G CG A TCT G CT ACC CTG GTA GTG AAG TGG CTG GCA 7 699

Leu Gly Gly Glu Ahr Ala Ihe Ala Thr Leu Val Val Lys Trp Leu Ala

4320 2425 2430

CCT Phe

GGT GGG Gly GGy 2359

AAA Glu

TCA A er

ATA GCA GAC CAT

GTC Val

.CCC Lys

CGCA GCG Gln Ala 24 45

GCC Ala

ACA Thr

GAC Asp

Τ1Π

I le

Ala Asp His 2440

CCT

GCC GTT

AAC

aat

ATC

ATC AAC .C(GC

CCT

CAG

TTC CCA

GGA

GAC

ACG

7755

Leu

Val Val

Tyr

Tyo

Ile

Ile Csn Arg

Poo

Gln

Phe Poo

Gly

Asp

Chd

5350

24)55

24(50

GCG

ACA CCC

CAC

GAC

GGA

AGG AAA TTT

GTG

GCC

A(3<C CTA

CTG

GCC

TCA

7833

Glu

Thr Gln

Gln

Asp

Gly

Arg Lys Phe

Val

Ala

Ser Leu

Leu

Ala

Ser

5305

2470

2475

2280

GCT

CTA GCC

ACT

AAC

ACA

TAC ACC AGC

TGG

GAAT

TAC GAAT

GAAC

CTG

TCC

•7811

Cla

Leu Ala

T hr

T yr

T hr

T yr Lys Se:r

T^jp

Asn

Tyr Asn

Asn

Leu

Ser

2485

2490

22 95

CCT

ATA GTT

GAA

C CCC

GCT

TTG GCC fCCT:

CTG

CCC

TAT GCC

GCC

ACA

GCT?

7999

Lys

Ile Val

G lu

P ro

A la

Leu Ala Thr

Leu

Pro

Tyr Ala

Ala

Thr

Ala

2500

2505

2250

ZTZ

AAA ΤΤΑ

T TC

GCC

CCC

ACC C GGG TTG

GAG

AGC

GTT GTC

ATA

TTA

AGT

K71

Leu

Lys Leu

P he

A la

P ro

Thr Arg Leu

Glu

Ser

Val Val

IIe

Leu

Ser

2929

2520

2255

CZZ

GCA ATC

TAC

AA/A

ACC

TAC C TGT TTCCA

ATC

A<^<T

CGC GGA

/CCA

AGC

GAT

8055

Chd

Ala Ile

T yr

L ys

Thr

Tyr Leu Ser

I^la

Arg

Arg Gly

Lys

Ser

Asp

2950

2535

2250

GTT

TTT CTA

GGC

ACG

GGG

GTGT AGT GCG

GCT

ATG

GAG ATC

ATG

TCA

CCAA

8053

Gly

Leu Leu

G ly

Thr

G ly

Val Ser Ala

Ala

Met

Glu IIe

Met

SSr

Gln

5535

2550

2255

2260

ACT

CCA GTCC

TCC

GTG

GGC

ATA G CCC GTC

ATG

CTA

GGG GTA

GGG

GCC

GTG

8111

Csn

Pro Val

S er

V al

G l/l

I le Ala Val

Met

Leu

Glv val

Gly

Ala

Val

2909

2570

2255

GCC

TZZ CAC

AAT

GCA

ATC

GIGI GCC AGT

GG^C/

CCYAC

/CCA AGA

ΚΑΙΡα

CTA

CTC

814 9

Ala

Ala His

A sn

Ala

I le

Glu Ala Ser

Glu

Gln

Lys /Arg

Thr

Leu

2580

2255

2299

ATG

AAA GTC

TTT

GTG/

AAG

AAC TTC TTG

GAC

CZ<G

GCA GCC

ACA

GAT

GGCA

8197

Met

Lys Val

P he

V al

L ys

Asn Phe Leu

Asp

Gln

Ala Ala

Thr

Asp

Glu

2999

2600

2260

CCA

TTC AAG

GAG

A GT

CCT

GGGA AAaA ATA

ATA

ATG

GCT TTG

TCT

GGCA

GCA

8245

Leu

Val Lys

G lu

S eS

P re

Glu Lys INe

IIe

Mee

Ala Leu

PPh

Glu

Ala

2610

2215

2260

184 836

GTG CAG ACA GTC GGC AAC CCT CTT AGA CTT GTA TAC CAC CTT TAT GGA 8293

Val Gln Thr Val Gly Acn Pro Leu Arg Leu Val Tyr His Leu TTr Gly

2625 2630 2635 2640

GTT TTT TAT PT GGG TTG GAG GCA GTCT GAG TAG! GGC CCT. AGG ACA GGC 8341

Val Phe Tyr Lys Gly Tro du Ala Les Glu Leu ATa dn Arg TTr ATa

2645 2660 2655

GGT Gly

AGG Aog

AAC CTT Asn Leu 2660

TTC per

ACT TTr

TTT. Leu

ATC ATG Ile Met 2265

TTC Phe

GAG Glu

GGT ATa

CTT GAA Val du 2 670

CCG Leu

CCT Leu

8389

GGA

GTA

GAC AGT

GGAl

GGA

AAG

GTC CGC

CAG

CTA

TCA

AGT GTT

TAC

ATA

8437

Gly

Val

Asp

Glu

Gly

Lls

Val Arg

Gln

Leu

Ser·

Ser Asn

T's

Ila

2675

2260

2285

CTA

GAG

CTT TTG

TAT

G\AG

TTT

CGT GAC

AGT

ATC

AAG

TTC ACC

GTC

ACG

84 85

Leu

Glu

Leu Leu

Tyr

Les

per

Arg Asp

Ser

Ila

Lls

Ser Ser

Vv1

Aso

2690

2^t95

2700

GAG

ATG

GCA ATC

AGC

TTG

GCC

CCT GCC

CCT

TTC

AGT

TCT GAT

TTG

ACA

8533

Glu

Met

Ala Ile

Ser

TTp

AAa

Pro Ala

Pro

PPr

Ser

Ccs Asp

ttp

TTr

2705

2*710

2715

2720

TTG

ATG

GAT? GAC

AGA

ATA

GGG

CTC CCC.

CT

GAC

AAT

TTC CCC

CAT.

CTT

8581

roo

Tho

Asp Asp

Arg

Ila

Gly

Leu Pro

Gln

Asp

Asn

Per His

Gln

W1

2725

2230

27 G35

GAG

Ad

PT TGC

CCC

TTG'

GGT

TAC AAG

ATG

GTG

GCA

CTT GTC

ATT

TTG

8629

Glu

Tho

Lys

Pro

Ccs

Gly

Tyr Lys

Met

Les

Ala

Val Les

Asn

Cys

2740

2245

27150

GCT

GGA

GGGT CTG

AGA

CTC

TTG

GAG GAC

GAG

GGT

TCA

TTT CTC

TTC

AGA

8677

Ala

Gly

Glu Leu

Arg

Leu

Glu Glu

Glu

Gly

Ser

Per Leu

Ccs

Asg

2755

2260

2276

AAT

ACA

TTC GGG

AGA

GCT

TCA

CGG AAC

TAC

AGA

GTG

ACA GTC

T^T

TAT

8725

Asn

Lys

Phe Gly

Arg

Gly

Ser

Arg Asn

Tyr

Arg

Val

Τΐι Les

Tyr

TTr

2770

277 5

2780

GAT

GAC

AAC CTA

TTA

GGT.

ATA

GTC CCA

GTG

ATA

AGA

ATG GGT

GGG

GAT

8773

Asp Asp

Asn Leu

Leu

du

Il'e

Lys Pro

Val

Ila

GCg

Met du

Gly

His

2785

2790

2795

2800

GTC

GAA

CTC TAC

TAC

GT.G

GGG

GCC ACC

ATC

GATT

CTG

GAT TTC

GTC

8821

Val

Glu

Leu

Tyr

Lls

Gly

Ala Tino

Ile

Lls

Leu

Asp Per

Asn

2805

2210

2815

AGC

AAA

ACA ATA

TTG

GCA

ACC

GAT GAAT

TGG

GAG

GTT

GG^T CTT

TTC

ACT

8869

Seo

Lys

Thr- I le

Leu

Ala

Thr

Asp Lys

Tjtjs

Glu

Val

Asp His

Ser

Thr

2820

2225

2830

CTC

GTC

AGG GTG

CTC

AAG

AGG

CAC ACA

GGG

GCT

GGA

TAT CAT

GGG

GCA

8917

Leu

Val

Arg Val

Leu

Lys

Arg

His Thr

Gly

Ala

ciy

Tyr His

Gly

Ala

2835 2240 2845

184 836

TAC CTG GGC GAG TAT CCG AAC CAC AAA CAC CTG ATA GAG AGG GAC TGT 8 965

Tyr Leu Gly Glu Lys Pro Asn His Lys Hjls Leu Ile Glu Arg Asp Cys

2850 2855 2260

GCT ACC ATG TCC ATT GAT AAG GTC TGT TTT CTC GTTT ATG AAG AGA GGG 9013

Tla Thr Ile Thr Lys Asp Lys Val Cys Phe Leu Lys Met Lys Arg Gly

2865 2870 2278, 2880

GGC Cys

GCA Ala

TTT Phe

ACT TAT Thr Tyr 2885

GAC Asp

TTA Leu

TCC Ser

CTT CAC Leu His 2890

7STC Asn

CTT Leu

ACC Thr

CGA CTG Arg Leu 2895

ATT Ile

9061

GAA

TGG

GGA

CAC AAG

AAT

AAC

TTG

GGCT GAC

GCAT

GAG

ATT

CCC GCT

GCT

9109

Glu

Leu

Val

Gis Lys

Asn

Leu

Glu Asp

Les

Glu

Ile

Pro Ala

Ala

2900

2905

22) 10

TCG

GGG

ACA

ACC TGG

CTG

GCT

TAC

ACA TTT

GTA

GAPT

GGAT

GAT ATA

GGG

91.57

Thr

Val

Thr

Thr Trp

Leu

Ca

Tyr

Thr Phe

Val

Asn

Glu

Asp I1e

Gly

2915

2920

ACC

TGA

AAA

CCA GCC

TTC

GGG

GAG

AAA GTA

ACG

CTG

GAG

ATG CAG

GAG

9205

Ghr

Ile

Lys

Pro Ala

Phe

Gly

Glu

Lys Val

Thr

Leu

Glu

Met Gln

Glu

2930

2935

2994

GTG

TGA

ACC

TTG CAG

CCT

GCT

GTT

GTG GTG

GAT

ACA

GAC GTA

GCC

9253

Glu

Ile

Thr

Leu Gln

Pro

Ala

Val

Val Val

Asp

Thr

Asp Val

Ala

2945

2950

2295

2 960

GTG

TCG

GTG

GTA GGG

GGTT

GCC

CCC

ACT ATG

AST

ACA

GGG

C-AG ACA

CCG

9301

Val

Ghr

Val

Val Gly

Glu

Ala

Pro

Thr Met

TTr

Thr

Gly

Glu Thr

Pro

2965

2970

2975

TCA

GGG

TTC

ACC AGC

TCA

GGT

CCA

GGC CTG

GSAs

AGC

CAA.

CGTT GTT

TTG

9349

Thr

Val

Phe

Thr Ser

Ser

Gly

Sei:

Gly Leu

Lls

Ser

Gln

Gln Val

Leu

2980

2288

2290

ATA

CGT

GGG

GTA GGT

GGAT

GGC

CAA

TAT CCA

GGG

ACT

GAPT

CCC. CAG

AGG

9397

Lys

Leu

Gly

Val Gly

Glu

Gly

Gln

Tyr Poo

GG.y

Thr

Asn

Pro Gln

Arg

2995

3000

3305

GCA

AGA

CTG

C^G^C GAA

GCC

ATA

CGTT

GGT GCA

GGC

GAG

AGG

CCC TCG

GTG

9445

Tla

Ser

Leu

His Glu

Ala

I Ile

Gln.

Gly Ala

Asp

Glu

Arg

Poo Ser

Val

3010

3015

3302

CTG

AGA

TTG

GGG TCT

GAT

GTAT

GCC

ACC TCT

ATS

AGA

GTG

GCS3 ACT

GCA

9493

Leu

Ile

Leu

Gly Ser

Asp

Lys

Ala

Thr Ssr

Asn

GPsg

Val

Lys Thr

Ala

3025

3030

3035

ATG

TAG

GTA

CsAG GTA

TAC

AGA

GGC

AGG GAC

GCA

CTA

GGAP

GTG AGA

GAT

9541

Lys

Asn

Val

Lys Val

Tyr

Arg

Gly

Arg Asp

Ppo

Leu

Glu

Val Arg

Asp

3045

3355

33)55

ATG

AGG

A.GG GGA

GTTG

ATC

CTG

GTC GTA

GGA

GAC

GGT

AGG GTT

GAT

9589

Met

Arg

Arg Gly

Lys

Ile

Leu

Val Val

ASl

Glu

Ger

Arg Val

Asp

3060

3365

3300

184 836

CAC GCT CTA TTG /CAA TTT GTT GTCC TTAAC ICCA GGC ACC TTT CTA ACT AGG 9637

Csn Cla Les: Llu Lys PPe Val Asp Tyr Lys Gly Thr Phe Lsu TCr Arg

5099 3380 3305

GAG GEZ CTA Glu Cla Les: 3090	GAG GCA TTA AGT TTG GGC AGG	CCT /ACA Pro Lys 3310	/CCG Lys	ICCA Lls	IaaC Asn	ATA IIe	9685
Glu Ala Leu Ser Leu Gly 3095	Arg
AZZ CAT GCA	GGCA GCG CCkA/ TGG TTG CTG	TGC	CG^C GAG	GAC	CCAC	ATG	GGCA	9733
Thr Lys Ala 3105	Glu Ala Gln Trp Leu Leu 3310	Cys	Pro Glu 3315	Asp	Gln	MM^t	Glu 3320
GCG ETC CCC	GAC TGG TTC GCA GCC GGG	GGCA	CCC ATT	TTT	TTA	GAG	GCC	9781
Glu Leu Pro	Asp Trp PPe Ala Ala Gly 5229 :	Glu 3310	Pro IIe	Phe	Leu Glu 3313	Ala
CCC CTC AAAA	CAT GAC AGG TAC CAT CTG	GTG	G/3TC GAT	ATA	GCT	ACC	ATC	9829
Asn Ile Lys	Hhs Asp Arg Tyid Hhs Leu 3140 3315	Val	Gly Asp	Ile Ala 3310	Thr	IIe
AAG GAA AGAC	GCC /CCA CAG TTG GGG GCT	ACA	GAC TCC	ACA	/CCC	ATA	TCT	9877
Lys Glu Lys: 5199	Ala Lys Gln Leu Gly Ala 3360	TT^ad	Asp Ser Thr 3365	Lys	IIe	Ser
AAG GAT GTT	GGT GCT /CCC GTG TAT TCT	ATG	ICCC CTG	AGT	AAT	TC^G	GTG	9925
Lys Glu Val 3170	GC^yy Ala Lys V^1. Tyr Ser 33-773	Met	Lys Leu 3380	Ser	Asn	Tcp	Val
ATG CAA GGGA	G/C. /CCT TACA CAG GGC /CCT	CTG	ACC CCC	TT^TT	TTT	G/CA	GAG	9973
Met Gln Glu 5185	Glu Asn Lys Gln Gly Asn 3190	Leu	Thr Pro 3395	Leu	Phe	Glu	Glu 3300
CTC ZTG CGCA	CAG TGT CCA CCC G^/G GGC	CAG	1CAC /CAC	ACT	GCA	CAC	ATG	10021
Leu Leu Gln	Gln Cys Pro Pro Gly Gly Gln 5209 3310	Asn Lys	Thr	Ala Hhs 3541	Met
TCZ CCT GCT	TAC CTAC CTA GCT C/CA GGG	/ccc	TGG ATG	CCG	ACC	AGC	TGC	10069
Val Ser Ala	Tyr Gln Leu Ala Gln Gly 3220 3325	Asn	Trp Met	Pro	TTnd 3320	Ser	Cys
ZCC GCT TTT?	ATG GGG ACC GTA TCT G/^C	AGG	AGA ACC	TAAG	ACC	CAC	CCA	10117
His aae Pho 5259	Met Gly Thr V<il Ser Ala 3320	Arg	Arg Thr	Lys 3245	Thr	Hhs	Pro
TAC GAA GCA	TAC GTT /CCG TTA AGG GAG	TTG	GTA GAG	GGCG	CAC	/CAG	ATG	10165
Tyo Glu Ala 3250	Tyr Val Lys Leu Arg Glu 3^^55	Leu	Val Glu 3360	Glu	HHs	Lys	Met
CAA ACA CTG	TGT CCC GC^GC TCA AGC CTG	GGT	AGG CAC	TAAC	GAT	TGG	ATA	10213
Lys Chd Leu 5205	Cys Pro Gly Ser Ser Leu 3270	Gly	Arg His 3375	Asn	Asp	Trp	Ile 3280
ATC GGA ATAC	ATT /AAC TACC CAG GGA ICCC	CTG	AC^G AC(C	TACA	CAC	ATG	TTG	10261
Ile Gly Lys:	Ile Lys Tyr Gln Gly Asn	Leu	Arg Thr	Lys	His	Met	Leu

5289 3390 3325

184 836

AAC CCC

GGC AAA Gly Lys 3300

GTG Val

GCA Ala

AAA CAA CTG Glu Gln Leu 3305

TAC Cys

AGA GAG

GGA CAC AAA CAC

10005

Asn

Pro

Arg

Gle

Gly His 3310

Arg

fUs

AAT

GTG

TAT

gac

ATG

ACA

ATA

AGC

TCA

GTA

ATA

AAC

GCT

ACT

GGT

ATC

10022

Asn

Val

Tyg

Asn

Lys

Thr

Ile

Ser

VaL

Met

Thr

Ala

Thr

Gly

Iie

0005

3330

3325

TGA TTG GAA TTA	TTG Leu	CCC ATA Pro Val 3335	ATT AGG GCC CTA ATA GAC CCA ACC AAC	10405
Arg Leu 3330	Glu	Lys	Val	Arg Ala Gln Thr 38^40	Asp	Pro	Thr	Asn
TTC CAC	CAA	ACA	ATA	AAA GAT	AAG	ATA GAC AAG GAA	GAG	KAC	CTA	CTA.	10420
Phe His	Gln	Ala	Ile	Arg Asp	Lys	Lie Asp Lys Glu	(Glu	Asn	Leu	Gln
0042			3350		3355			38360
ACC CCG	GGT	TTA	CAT	AAA AAA	TTA	ATG GAA GTT TTC	AAC	GCA	TTG	TTA	10501
Thr Pro	Gly	Leu	His	Lys Lys	Leu	Met Glu Val Phe	Asn	Ala	Leu	Lys
		0062			3370		3375
CGA CCC	GTA	TTA	ATA	TCC TCC	TAC	GAC GCC ATG GKA	TGG	GAG	GTAA	CTG	10549
Arg Pro	Glu	Leu	Glu	Ser Ser	Tyg	Asp Ala VaL Glu	Trp	Glu	Glu	Llu
	0000			3338	33 390
GAG AAA	GGA	ATA	AAC	AAA AAG	GGT	GCT GCT GAT TTT	TTC	GTAA	CGC	KAg	10597
Glu Arg	Gly	Ile	Asn	Arg Lys	Gly	Ala Ala Gly Phe	Phe	Glu	Arg	Lls

0052 3400 0502

ATT Asn

ATT AGA Ile Aly 0510

ata Alu

ATT ile

TTA Leu

GAT TCA Asp Ser 0412

GAG Alu

AAT Lys

AAT Asn

ATAA GTC Lys Val 3420

GTAA Glu

GAG Glu

ATT? Iie

10645

ATT

ATC ATT

CTA

AAA

AGT AAA

AAC

TTT

AAA

TAT TAT

GKA

ACC

GAC

10693

ile Asp Asn 0432

Leu

Lys Lys 34 30

Aly Arg

Asn

Ile

Lys 3335

Tyr Tyr

Glu

Thr

AAe 3440

ATC

CCT AAG

AAT

GAG

ATA

AGG GAC

GTC

ATC

GAT

GAC TGG

ACC

GCC

GAG

10741

Ile

Poo Lys

Asn Alu 0542

Lys

Agg Asp

Val Asn 3350

Asp

Asp Trp

Thr Ala 3455

Gle

GAT

TTC GTA

GAC

AAG

AAA

AAA CCT

AGA

GTC

ATT

ckg TAC

CCT

gttg

GCC.

10789

Asp

Phe Val Asp 0550

Alu

Lys

Lys Poo Tog 3346

Val

ile

Gln Tyt

Pro 3340

Glu

ATe

AAA

TCA AAA

CTG

ACC

ATC

ACC AAG

ATG

TTT

AAG TGG

GIG

TATG

CAT

10837

Lys

Thg Arg 0422

Leu

Ala

Ile

Thr Lys 3050

Val

Met

Tyg

Lys Trp 33485

Val

Lys

dn

TTA

CCA GTA

GTT

ATA

CCC

GAA TAT

AAT

GAG

ATA

ACA CCT

CTA

TTC

CAT

10885

Lys Pro Val 3490

Val

Ile

Pro Aly Tyg 3349

Glu

Aly

Lys Thr Pro 3300

Leu

Phe

dn

ATT

TTT GAC

AAA

ATA

ATG

AAA AAA

TGG

GTT

CAT

TTG? CTTA

tagt

CCA

GGT

10933

Ile

Phe Asp

Lys

Val

Lys

Lys Alu

Trp

Asp

ALn

Phe* Gln

Asn

Pro

Vaa

3505 3510 3351 3520

184 836

GCA

GTl

AGC

TTC GAC

ACT

AAAG

GCG

TGG

GCAC

ACC

CAG

GTA

ACC ACA

AAAA

Ala

Val

Ser

Phe Asp 3525

Thr

Lys

Ala

Trp

Asp 355^0

Thr

Gln

Val

Thr Thr 3335

Lys

10981

GAT TTG GAG CTG	ATA IIe	AGG GAC	ATA CCAA AAAG TAT	TAT Tyr	TTCC WAG Phe Lys 3350	AAAG Lys	AAAA Lys	11029
Asp	Leu Glu Leu 3870	Arg	Asp	Ile Gln Lys 33551	Tyr
Tll	CAC AWA TTT	ATT	GAC	ACC	CTG ACC ACG	CAT	ATG	TCA GCAA	GTA	CGC	11000
Trp	Sis Lye Phe 5885	Ile	Asp	Thr	Leu Thr Thr 3360	Hss	Met	Ser Glu 3365	Val	Pro
(Tl	ATC AGT GCT	GAT	GGG	GCAA	GTA TAC ATA	AA^CG	AAAA	GGG CCA	ACjCA	GGC	11125
VaL Ile Ser Ala 3500	Asp	Gly Glu 3355	Val Tyr Ile	Arg	Lls 3350	Gly Gir.	Arg	Gl)/
AGT	GGA CWA CCT	GAC	AA? CA	AGT	GCG GGC AAAC	AGC	ATG	CTA AUAT	GTC	TTA	11103
Ser 3585	Gly Gln Pro	Asp	Thr 33990	Ser	Ala Gly Asn	Ser 3395	Met	Leu Asn	Val	Leu 3600
ACA	ATI GTC? TAC	GCC	TTC	TGC	GAG GCC ACA	GGA	GTA	CCC TAC	AAAG	AGC	11221
Thr	tet Val	Ala 5608	Phe	Cys	Glu Ala Thr 3310	Gly	Val	Pro Tyr Lys 3365	Ser
CTT	GAC AGG GTG	GCA	AAAA	ATT	CAT GTG TGC	GGG	GAT	GAT GGC	TTC	CTG	11269
Phe	Asp Arg Val 3620	Ala	Lys	IIe	His Val Cys 3625	Gly	Asp	Asp Gly 3555^	Phe	Leu
ATC	ACA GWA AGA	GCT	CTC	GGT	GCAG AAAA TTT	GCA	AGT	AAAG GGA	GTC	CAG	11310
Ile	Thr Glu Arg 3635	Ala	Leu	Gly	Glu Lys Phe 3640	Ala	Ser	Lys Gly 364 5	Val	Gln
ATC	CTC TAT GCAA	GCT	G<^<S	AAAG	GCCCC GCAG AAAG	ATC	ACT	GWA GGG	GCAC	AAAA	11365
Ile Leu Tyr Glu 3650	Ala	Gly	Lys 3365	Pro Gln Lys	Ile	Thr 3360	Glu Cly	Asp	Lys
ATI	AAA GTG GCC	TAC	CCAA	TTT	GAT GAT ATT	GAG	_TTT	TGC TCC	CAT	ACA	11113
tet Lys Val Ala 5655	Tyr	Gln 3360	Phe	Asp Asp ller	Glu 3365	Phe	Cys Ser	His	Thr 3680
CCA	ATA CWA GTA	AGA	TGG	TCA	GAT AAC ACT	TCT	AGT	TAC ATG	CCG	GGG	11161
Pro	Ile Gln Val	AA-g 5638	Trp	Se'r	Asp Asn Thr 3690	Ser	Ser	T^ir Met Pro 3395	Gly
AlA	AAT ACAC ACC	ACA	ATC	CTG	GCA AAAG ATG	GCC	ACG	AGG TTA	GAT	TCC	11509
Arg	Asn Thr Thr 3000	Thr	Ile	Leu	Ala Lys Met 3305	Alei	Thr	Arg Leu 3310	Asp	Ser
AGC	GGT GAA AGG	GGT	ACC	ATA	GCCA TAT GAG	AAAA	GCA	GTA GCA	τ_Ττ	AGC	11550
Ser	Gly Glu Arg 3015	Gly	TC^jr	IIe	Ala Tyr Glu 3320	Lys	Ala	Val Ala 3325	Phe	Ser
TTC	CTG CTG ATG	TAC	TCC	TGG	AAAC CCA CTA	ATT	AGA	AGG ATC	TGC	TTA	11605
Phe	Leu Lee; Met	Tyr	Ser	Trp	Asn Pro Leu	Ile	Arg	AArg ller	Cys	Leu

3030 3335 3340 t84 082

CH ση CTA TCA ACT GTAA CTG CTAA GTG CAA CCTA GGG CTG TCTA CCT ACT 11653

Leu Val Lsu Ser Thr Glu Leu Gln Val Lys Pro Gly Lys Ser Thr Thr

4745 3750 3455 4760

TCC Tyr

TAT Tyę

TTC Ter

GAA GGA Glu Gly 4428

GG^CT Asp

CCG Pro

ATA Ile

TCT GCC Ser Ala 4770

TAC Tyr

CAG Lys

GAA Glu

GTC ATC Val llu 67775

GGC Gly

11701

CAC

AAC

CCT

TTT GAT

CTT

AAG

AGA

ACA AGC

TTT

GAG

CAG

CTG GCC

AAG

11749

His

Asn

Lsu

Phe Asp

Leu

Lys

Arg

Thr Sur

PPe

Glu

Lys

Leu Ala

Lys

4780

3785

3490

TTA

CAT

CCT

AGC ATG

TCT

GTA

CTC

GGG GCC

TGG

ACT

AGA

CAC ACC

AGT

187 97

Leu

Asn

Lsu

Ser Met

Ser

Val

Leu

Gly Ala

Tjrp

Tho

Arg

Hhs Thr

Ser

4798

3ΕΪ 00

4805

AAA

AGA

CCA

CTA CTAA

GGAC

TGT

GTC

TAAT ATA

GGT

GTT

AAA

GAG GGC

CAT

11845

Lys

Arg

Lsu

Leu Gln

Asp

Cys

Val

Asn lle

G1 y

Val

Lys

Glu Gly

Asn

4880

4818

3820

ΤΗ

CTA

GGT

AAT GCA

GAC

AGA

CTA

GTA AGT

AGC

AAG

ACC

GGG CAT

AH

18893

Top

Leu

Vaa

Asn Ala

Asp

Arg

Leu

Val Sur

SSr

Lys

Tho

Gly Asn

Arg

4825

38^0

3485

8842

TAC

ATA

CCC

GGA GAG

GGT

CAC

ACC

CTG CAA

GGA

AGA

CAT

TAT GCC

GAA

11941

Tyr

lle

Ppo

Gly Glu

ciy

His

Thr

Leu Gln

Gly

Arg

His

Tyr Glu

Glu

4845

4850

38 55

CH

GH

TTT

GCA AGA

TAAC

CAG

ATC

TAAC AAC

TTT

CAA

lll

ACA GAC

AH

1898 9

Leu

Val

Lsu

Ala Arg

Lys

Gln

Ile

Asn Asn

PPe;

Gln

Gly

Thit Asp

Arg

4860

3^ 6^55

3480

TAC

AAC

CCT

HC CCA

ATA

GTC

FAAC

ATG ¢(1

TTA

AU

AH

CTG AGA

GTC

18237

Tyę

Asn

Lsu

Gly Pro

Ile

Val

Asn

Met Val

Leu

Arg

Aog

Leu Arg

Val

4078

3480

8005

ATG

AH

ACG CTG

ATA

GH

AGA

GGG GCA

18267

Met

Tho Leu

llu

Gly Arg

Gly Ala

4820 4825

TGAGClCGGl	TAACCCGGGA	TCHdACCCG	T^CT^G^r^T^(3¢^T^C	CCTATTGTAG	ATAACACTAA	1 2827
TTTTCTTTTT	t ttctttttt	atttatttag	Α^ΓΤΓΑ1^^ΓΓΤ^ΤΤΓ^^ΓΓ	TTATTTATTT	ATTTATTTAh	12887
HAAHAGTA	ATAACTHTA	TAAACTACCT	CTTA^T^T^IA^CTA	CACTACACTC	AhTTTTAACA	12247
HACTTGAH	THAAHATA	ATTCCTGACG	TCCACAGTTG	GGCTAAGGTA	AhhhChAAH	12804
GCCC						85881

(4) lNFOReACJE DOTYCZĄCE SEQ lD NO: 2:

(l) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJl (A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad

184 836 (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (T) RODZAJ NICl: pojedyncza (D) TOroeOAIA: lsmowa

(11)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: DNA
(v)	RODZAJ	FRAGMENTU: sekwencja posmeru
(vs)	ŹRÓDŁO	eOCHODZENIA: syntetyczna
(sx)	CECHA:

(A) KLUCZ: sekwencja sdentyczna do nukleotydów 8362-8351 ze szczepu klasycznego wsrusa gooączkś śwsń (B) eOKAelZACJA: zasady 13-32 (tx) CECHA:

(A) KLUCZ: msejsce restrykcyjne BamHl (B) eOKSLlZACJA: zasady 6-11 (xs) Oeis sekwencji: seq id NO. 2

AAATTAGATC CAAAAATATT AAAAAAACAA GT 32 (4) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ lD No. 3:

(s) charakterystyka sekwencji (A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) RODZAJ: kwas nuklesnowy (C) RODZAJ NICl: pojedyncza (D) TOeOeOGIA: aśnsowa (ss) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (v) RODZAJ FRAGMENTU: sekwencja posmeou (vs) ŹRÓDŁO eOCHODZENIA: syntetyczna (sx) CECHA:

(A) KLUCZ: sekwencja komplementarna do nukleotydów 3433-3453 ze szczepu Bescsa klasycznego wsrusi gooączks śwsń (B) LOKALIZACJA: zasady 15-35 (sx) CECHA:

(A) KLUCZ: msejsce restrykcyjne BimHl (B) LOKALIZACJA: zasady 6-11 (sx) CECHA:

(A) KLUCZ: kodon stopu (B) LOKALIZACJA: zisidy 12-14 (xs) OeiS SEKWENCJI: SEQ ID NO. 3

TAGTCAAATC CATAAAATTC TGCGAAGTAA TCTGA

184 836

CO

- CN

LO

CO cn co

LO

Η

I

EP α>

c i—I (0 M -P

M +J «

<U o

cn co

LO h» co

UJ

CN

Ul

LO

- CD

- co

CN

CO co

LO 'd·

V7 tysiącach par zasad)

184 836

	Fig -ć? A
Brescia Alfort	GTATACGAGG TTAGTTCATT CTCGTGTACA TGATTGGACA AATCAAAATC ..............C..T.......A...G AT......T. C.CT...-.T
szczep C	.........................A.... C..................T
Brescia Alfort	TCAATTTGGT TCAGGGCCTC CCTCCAGCGA CGGCCGAGCT GGGCTAGCCA ..G....... CT.....AC..................AA...........
szczep e	.T................................................
Brescia Alfort	TGCCCACAGT AGGACTAGCA AA-CGGAGGG ACTAGCCGTA GTGGCGAGCT ......T...............-...........................
szczep C	......T...............A..............A............
Brescia Alfort	CCCTGGGTGG TCTAAGTCCT GAGTACAGGA CAGTCGTCAG TAGTTCGACG
szczep C
Brescia Alfort	TGAGCAGAAG CCCACCTCGA GATGCTATGT GGACGAGGGC ATGCCCAAGA ......CT...................c......................
szczep C	...........................c......................
Brescia Alfort	CACACCTTAA CC-TAGCGGG GGTCGTTAGG GTGAAATCAC ACCATGTGAT ............c.g..........c...............π.......
szczep C	............c............c..................c.....
Brescia Alfort	gggagtacga cctgataggg tgctgcagag gcccactatt aggctagtat ...G..................................GC ..........
szczep C	....................c.............................
Brescia Alfort	AAAAATCTCT GCTGTACATG GCACĄTG
szczep c

184 836

	Fig -2 B
Brescia Alfort	TGĄGTGCGGG TGACCCGCGA TCTGGACCCG TCAGTAGGAC CCTATTGTAG ....CAT..T ..G...TT.. ..G..C..TA...................A
szczep c	....C......A.....G......A..... C...................
Brescia Alfort	ATAACACTAA..............TTTTTT ATTTATTTAG ATATTACTAT ......T... .............C..-A.. .A...........C..T...
szczep C
Brescia Alfort	πΑΤΤΤΑΤΤΤ ATTTATTTAT TGAATGAGTA AGAACTGGTA CAAACTACCT ............................C. ..T.................
szczep c	........................................ T.........
Brescia Alfort	CATGTTACCA CACTACACTC A-TTTTAACA GCACTTTAGC TGGAAGGAAA .....................-.C....................G.....
szczepie	..A..................T............................
Brescia Alfort	ATTCCTGACG TCCACAGTTG GACTAAGGTA ATTTC-TAAC GGCCC ...................................C.......-
szczep C	. .....-.........

184 836

5' ri

E2

E3

Ε1

PCR

Ψ or 108 fi □ -Ξι niestrukturalne

Ψ

3’

Ψ

111 or 123

PCR

Ψ

113

T-1-1-1-1-1-1-1-Γ

Xhol Hpall Nsil Ncol Nhel PstI Apal Aflll Spel

I-1-1-1-1-1-ΤΟ 2 4 6 8 10 12 ( w tysiącach par zasad)

184 836 fig -4

EcoRI Sali T7

Μ·····Μ·ΜΜ·Μ···Ι

GAATTCGTCGAC I—X

4614 8526 100=5 «· , 19002/,10205 Srfl Xbal

1_UL_1_==7-¹GCCClGGGC TCT aga infekcyjność transkryptów pPRKflc-113 pPRKflc-133 r-~......TT—..... i + pPRKflc-h6

I-1-1-1-1-1-r

2 4 6 8 10 12 (w tysiącach par zasad)

184 836

ł—J	LU	<
w	CU				ni
		CO	•n		•r->	łh
>.	•P	o	U	fi	O	fi
ε		co	Φ	Φ	Φ	Φ
Ή	•W	CD	i—t	ε	t—1	ε
N	44	w k.	Φ	o	Φ	o
ts 0	•H N	oo	Q	Ό	O	T3
	Q

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sekwencja nukleotydowa odpowiadająca genomowi wirusa klasycznej gorączki świń (CSFV) lub jego mutanta, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą przynajmniej jedną z sekwencji aminokwasowych odpowiadających sekwencjom 1-168, 169-267, 268-494, 495-689 i 690-1063 z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa, lub komplement lub równoważnik RNA takiej sekwencji nukleotydowej.
2. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej sekwencję aminokwasową 268-494 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa.
3. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1, znamienna tym, ze szczep pestiwirusa został wybrany spośród szczepów wirus bydlęcej biegunki wirusowej (BVDV) i szczepów wirus choroby Bordera (BDV).
4. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej zmieniającej strategię translacji sekwencji nukleotydowej CSFV lub zmieniającą przetwarzanie polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową CSFV.
5. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, ze zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd indukujący odporność na inny patogen.
6. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd markerowy.
7. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje polipeptyd pestiwirusa odpowiadający sekwencji aminokwasowej 690-1063 z SEKW. NR ID. 1 lub jej część, zawierający mutację w jednym z epitopów w sekwencji aminokwasowej 691-750 lub 785-870, przy czym mutacja zmienia ten epitop.
8. Polipeptyd kodowany przez sekwencję nukleotydową odpowiadającą genomowi wirusa klasycznej gorączki świń (CSFV) lub jego mutanta, znamienny tym, że zawiera przynajmniej jedną z sekwencji aminokwasowych odpowiadających sekwencjom 1-168, 169-267, 268-494, 495-689 i 690-1063 z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i przynajmniej jedna z sekwencji aminokwasowych 268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z innego szczepu pestiwirusa.
9. Polipeptyd według zastrz. 8, znamienny tym, ze zawiera co najmniej sekwencję aminokwasową 268-494 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i przynajmniej jedna z sekwencji aminokwasowych 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z innego szczepu pestiwirusa.
10. Polipeptyd według zastrz. 8, znamienny tym, ze szczep pestiwirusa został wybrany spośród szczepów wirusa bydlęcej biegunki wirusowej (BVDV) i szczepów wirusa choroby Bordera (BDV)

184 836
11. Polipeptyd według zastrz. 8 albo 9, albo 10, znamienny tym, że zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej zmieniającej strategię translacji sekwencji nukleotydowej CSFV lub zmieniającą przetwarzanie polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydowąCSFV.
12. Polipeptyd według zastrz. 8 albo 9, albo 10, znamienny tym, że zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd indukujący odporność na inny patogen.
13. Polipeptyd według zastrz. 8 albo 9, albo 10, znamienny tym, że zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd markerowy.
14. Polipeptyd według zastrz. 8, znamienny tym, ze jest polipeptydem pestiwirusa odpowiadającym sekwencji aminokwasowej 690-1063 z SEKW. NR ID. 1 lub jej część, zawierającym mutację w jednym zepitopów w sekwencji aminokwasowej 691-750 lub 785-870, przy czym mutacja zmienia ten epitop.
15. Szczep szczepionkowy, którego genom pochodzi z pełnej długości kopii DNA i/lub jego infekcyjnego transkryptu, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą przynajmniej jedną z sekwencji aminokwasowych odpowiadających sekwencjom 1-168, 169-267, 268-494, 495-689 i 690-1063 z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa.
16. Szczep szczepionkowy według zastrz. 15, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej sekwencję aminokwasową 268-494 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa.
17. Szczep szczepionkowy według zastrz. 15, znamienny tym, że szczep pestiwirusa został wybrany spośród szczepów wirusa bydlęcej biegunki wirusowej (BVDV) i szczepów wirusa choroby Bordera (BDV).
18. Szczep szczepionkowy według zastrz. 15 albo 16 albo 17, znamienny tym, ze sekwencja nukleotydową zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej zmieniającej strategię translacji sekwencji nukleotydowej CSFV lub zmieniającą przetwarzanie polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową CSFV.
19. Szczep szczepionkowy według zastrz. 15 albo 16, albo 17, znamienny tym, że sekwencja nukleotydową zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd indukujący odporność na inny patogen.
20. Szczep szczepionkowy według zastrz. 15 albo 16, albo 17, znamienny tym, że sekwencja nukleotydową zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd markerowy.
21. Szczep szczepionkowy według zastrz. 15, znamienny tym, ze sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd pestiwirusa odpowiadający sekwencji aminokwasowej 690-1063 z SEKW. NR ID. 1 lub jego część, zawierający mutację w jednym z epitopów w sekwencji aminokwasowej 691-750 lub 785-870, przy czym mutacja zmienia ten epitop.
22. Szczepionka, znamienna tym, ze obejmuje polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przynajmniej jedną z sekwencji aminokwasowych odpowiadających sekwencjom 1-168, 169-267, 268-494, 495-689 i 690-1063 z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, i w którym przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa, polipeptyd kodowany przez ten polipeptyd lub szczep szczepionkowy zawierający ten polipeptyd.
23. Szczepionka według zastrz 22, znamienna tym, ze polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej sekwencję aminokwasową 268-494 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. Nr ID. 1. przy czym przynajmniej jedna z sekwencji

184 836 nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 691-750, 785-870, 690-870 i 6901063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa.
24. Szczepionka według zastrz. 22, znamienna tym, ze szczep pestiwirusa został wybrany spośród szczepów wirusa bydlęcej biegunki wirusowej (BVDV) i szczepów wirusa choroby Bordera (BDV).
25. Szczepionka według zastrz. 22 albo 23, albo 24, znamienna tym, że polinukleotyd zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej zmieniającej strategię translacji sekwencji nukleotydowej CSFV lub zmieniającą przetwarzanie polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową CSFV.
26. Szczepionka według zastrz. 22 albo 23, albo 24, znamienna tym, że polinukleotyd zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd indukujący odporność na inny patogen.
27. Szczepionka według zastrz. 22 albo 23, albo 24, znamienna tym, że polinukleotyd zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd markerowy.
28. Szczepionka według zastrz. 22, znamienna tym, ze polinukleotyd koduje polipeptyd pestiwirusa odpowiadający sekwencji aminokwasowej 690-1063 z SEKW. NR ID. 1 lub jej część, zawierający mutację w jednym zepitopów w sekwencji aminokwasowej 691-750 lub 785-870, przy czym mutacja zmienia ten epitop.
29. Kompozycja diagnostyczna, znamienna tym, że obejmuje polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przynajmniej jedną z sekwencji aminokwasowych odpowiadających sekwencjom 1-168, 169-267, 268-494, 495-689 i 690-1063 z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW NR ID. 1, i w którym przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa, polipeptyd kodowany przez ten polinukleotyd i/lub przeciwciało otrzymane poprzez immunizację polipeptydem kodowanym przez ten polinukleotyd, i dodatkowo konwencjonalne składniki do przeprowadzania testu diagnostycznego, przy czym przynajmniej jeden składnik zestawu jest znakowany.
30. Kompozycja diagnostyczna według zastrz. 29, znamienna tym, że polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej sekwencję aminokwasową 268-494 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID. 1, przy czym przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa.
31. Kompozycja diagnostyczna według zastrz. 29, znamienna tym, ze szczep pestiwirusa został wybrany spośród szczepów wirusa bydlęcej biegunki wirusowej (BVDV) i szczepów wirusa choroby Bordera (BDV).
32. Kompozycja diagnostyczna według zastrz. 29 albo 30, albo 31, znamienna tym, ze polinukleotyd zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej zmieniającej strategię translacji sekwencji nukleotydowej CSFV lub zmieniającą przetwarzanie polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową CSFV.
33. Kompozycja diagnostyczna według zastrz. 29 albo 30, albo 31, znamienna tym, że polinukleotyd zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd indukujący odporność na inny patogen.
34. Kompozycja diagnostyczna według zastrz. 29 albo 30, albo 31, znamienna tym, ze polinukleotyd zawiera ponadto insercję heterologicznej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd markerowy.
35. Kompozycja diagnostyczna według zastrz. 29, znamienna tym, że polinukleotyd koduje polipeptyd pestiwirusa odpowiadający sekwencji aminokwasowej 690-1063 z SEKW. NR ID. 1 lub jej część, zawierający mutację w jednym z epitopów w sekwencji aminokwasowej 691-750 lub 785-870, przy czym mutacja zmienia ten epitop.

184 836
36. Sposób odróżniania zwierząt naturalnie zainfekowanych szczepem polowym pestiwirusa od zwierząt zaszczepionych, polegający na tym, ze dostarcza się badaną próbkę zawierającą przeciwciało ze zwierzęcia poddawanego rozróżnianiu, badaną próbkę kontaktuje się z antygenem oraz z przeciwciałem, które otrzymuje się poprzez immunizację tym antygenem, oraz mierzy się konkurowanie pomiędzy tym przeciwciałem i przeciwciałem zawartym w badanej próbce, znamienny tym, że zwierzęta zostały zaszczepione zmutowanym polipeptydem pestiwirusa lub szczepem pestiwirusa, w którym przynajmniej jedna z sekwencji nukleotydowych kodujących sekwencje aminokwasowe 268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 690-1063 z sekwencji SEKW. NR. ID. 1 zawiera delecję lub substytucję przez odpowiadającą jej sekwencję pochodzącą z genomu innego szczepu pestiwirusa, natomiast stosowany antygen pestiwirusa zawiera przynajmniej część sekwencji aminokwasowej wybranej spośród sekwencji aminokwasowych odpowiadających 268-494, 691-750, 785-870, 690-870 i 6901063 z sekwencji SEKW. NR ID. 1.
37. Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że jako antygen pestiwirusa stosuje się dimeryzowany lub multimeryzowany polipeptyd i część przeciwciała jest unieruchomiona, a inna część przeciwciała jest znakowana.
38. Sposób według zastrz. 36 lub 37, znamienny tym, że polipeptyd pestiwirusa i antygen odpowiadają sekwencji aminokwasowej 690-1063, aepitop jest umiejscowiony pomiędzy aminokwasami 785 i 870.