KR20110090518A - 유전자 마커 및 혈청학적 마커를 이용하여 백신바이러스와 야외감염 바이러스를 감별할 수 있도록 재조합한 키메릭 페스티바이러스 ｋｄ２６_ｅ２ｌｏｍ을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합된 키메릭 페스티바이러스를 포함하는 돼지열병 예방용 생백신에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 돼지열병 예방용 백신에 있어 유전자 마커 및 혈청학적 마커를 이용하여 백신바이러스와 야외감염 바이러스를 감별할 수 있도록 재조합한 키메릭 페스티바이러스 KD26_E2LOM을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신에 관한 것이다.
현재 국내에서 사용하고 있는 돼지열병 생백신으로 사용되고 있는 LOM 바이러스는 PCR을 통해 증폭한 후 제한효소 Zho 1을 이용하여 야외감염 바이러스와 구분이 가능하나, 혈청학적 감별은 불가능하다는 점에서 집단 혈청학적 스크린이 곤란하다는 문제점이 있었다.
이에 본 발명인 유전자재조합 돼지열병 생백신용 KD26_E2LOM 바이러스는 혈청학적 마커 및 유전자마커를 가지고 있어 돼지열병 예방용 백신으로 사용될 경우, 야외바이러스와 감별이 가능하다. 나아가 상기 돼지열병 생백신용 바이러스의 변이는 쉽게 추적될 수 있다는 점에서 백신의 안전관리 또한 향상시킬 수 있다는 장점이 있다.

Description

유전자 마커 및 혈청학적 마커를 이용하여 백신바이러스와 야외감염 바이러스를 감별할 수 있도록 재조합한 키메릭 페스티바이러스 ＫＤ２６_Ｅ２ＬＯＭ을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신{Live attenuated vaccine for classical swine fever, containing KD26_E2LOM, distinguishing the virus of vaccine from the virus of infection by using serological marker and gene marker}

본 발명은 돼지열병 예방용 백신에 있어 유전자 마커 및 혈청학적 마커를 이용하여 백신바이러스와 야외감염 바이러스를 감별할 수 있도록 재조합한 키메릭 페스티바이러스 KD26_E2LOM을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신에 관한 것이다.

한편 본 발명은 바이러스 역상유전자 조작법(reverse genetics)을 통해 유전자마커를 획득하는 유전공학분야 및 이를 기초로 백신으로 제조하여 돼지열병 예방약으로 사용하는 수의학분야에 속한다.

돼지열병(classical swine fever)은 고열과 함께 식욕부진, 변비후 설사, 피부청색증, 후구마비 및 자세이상을 나타내며 높은 치사율(致死率)과 이환율(罹患率)을 가지고 있어 양돈산업에 치명적인 악성전염병이다.

돼지열병은 소, 양 그리고 돼지에 감염성이 있는 소바이러스성설사병바이러스(bovine viral diarrhea virus: BVDV)와 보더병바이러스(border disease virus: BDV)와 함께 Flaviviridae의 Pestivirus 속에 속하는 돼지열병바이러스(classical swine fever virus: CSFV)에 의해 발생하는 악성가축전염병으로 국제수역사무국(OIE)에서 신고대상질병(notifiable disease)으로 분류하고 있다.

나아가 가축의 전염성질병이 발생하거나 퍼지는 것을 막음으로써 축산업의 발전과 공중위생의 향상에 기여함을 목적으로 하고 있는 가축전염병예방법에서도 돼지열병을 제1종 가축전염병으로 규정하고 있다.

돼지열병바이러스는 소바이러스성설사병바이러스와 보더병바이러스와 달리 돼지만이 자연숙주이며 바이러스전파의 원인이다. 질병의 증상은 감염된 바이러스의 병원성과 감염돼지의 연령, 개체의 면역상태 그리고 타질병과의 혼합감염정도에 따라 다르며 급성 또는 만성형으로 나타난다.

잠복기는 보통 6~11일 정도이나 20~30일 또는 그 이상 가는 경우도 있고, OIE 기준은 40일이다. 급성일 경우는 감염후 보통 10~20일내에 폐사한다.

주된 감염경로는 감염돼지와의 접촉감염으로, 감염된 돼지는 임상증상을 보이기 전에 바이러스를 배출하기도 하고 임상증상발현기간동안 비즙, 분변, 오줌을 통해 다량의 바이러스를 배출한다. 침입한 바이러스는 편도, 림프절, 실질장기의 세포 등에서 증식하며 바이러스 혈증을 일으키며, 태반감염도 된다. 돼지콜레라는 감염돼지의 이동, 차량, 축산도구, 사람의 의복 또는 신발 등 다양한 경로를 통하여 전파된다.

본 발명에 관련된 종래기술은 한국특허등록 10-0908798(약독화 페스티바이러스를 포함하는 백신)로서 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 하나 이상의 돌연변이가 존재하고 N^pro의 암호화 서열에 하나 이상의 또 다른 돌연변이가 존재하여, 바람직하게는 당단백질 E^rns에 존재하는 RNase 활성의 불활성화 및 N^pro에 존재하는 면역조절 활성(가설)의 불활성화가 복합 유도된 약독화 페스티바이러스, 특히 약독화 BVDV에 관한 것이다.

또한 한국특허등록 10-0904772(유전자칩을 이용한 돼지콜레라 바이러스 또는 소바이러스성설사병바이러스 유전자의 검사방법 및 그를 포함하는 진단키트)로서 돼지콜레라 바이러스(Hog cholera virus; HCV 또는 Classical swine fever virus; CSFV)와 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus; BVDV) 유전자 및 이들 유전자형을 검사하는 방법 및 이를 이용한 정밀검사키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR) 방법과 유전자칩을 이용하여 동일한 페스티바이러스(Pestivirus)에 속하며 동물에 질병을 일으키는 돼지콜레라 바이러스와 소바이러스성설사병바이러스 유전자 및 이들 유전자형을 검사하는 방법, 및 이를 이용한 정밀한 진단키트에 관한 것이다. 그러나 이들 종래기술은 본 발명과 기술적구성이 다른 것이다.

돼지열병을 예방할 수 있는 생백신기술에 있어, 현재 사용되고 있는 돼지열병 생백신은 LOM 바이러스이다.

상기 바이러스는 PCR로 증폭된 산물에 제한효소 Zho 1을 가하여 야외감염 바이러스와 구분이 가능하나, 혈청학적으로 감별이 불가능하다는 점에서 집단적인 혈청학적 스크린이 곤란한 단점이 있었다.

따라서 돼지열병을 효과적으로 예방하기 위해서는 유전자 마커 및 혈청학적 마커가 고정된 백신용 바이러스를 사용하는 것이 효율적이며, 나아가 국내 분리주를 이용한 돼지열병 백신이 필요한 실정이다.

한편 페스티바이러스속에 속하는 소바이러스성설사병바이러스는 주로 소에서 감염이 이루어지나 야외에서는 돼지에서도 감염이 빈번히 보고되고 있으며, 돼지열병 혈청검사에서 교차반응을 나타내기 때문에 돼지열병 혈청검사 예찰사업에서 주의가 요구되거나 돼지열병 백신접종에 따른 면역형성을 억제할 우려가 있다.

또한 돼지에서의 자연감염과 실험적 감염실험에 대한 여러 결과보고를 통해 임상증상이 불현성감염에서부터 돼지열병유사 증상을 보이는 등 다양한 결과가 보고되어 있다. 따라서 국내분리 소바이러스성설사병바이러스 또한 바이러스의 균주에 따른 돼지 감염에서의 임상증상이 다양하다고 예상되고 있다.

이에 본 발명자들은 돼지에 감염 가능한 소바이러스성설사병바이러스의 국내분리주 중에서 돼지에서 비병원성인 균주를 선택하기 위한 동물실험을 통해 보다 안전한 국내 소바이러스성설사병바이러스를 확보하고, 유전자재조합 기술을 이용하여 돼지열병을 예방할 수 있는 백신용 바이러스 개발 연구를 수행함으로써, 유전자 마커 및 혈청학적 마커가 포함된 돼지열병 생백신용 바이러스를 제작하였다. 나아가 이를 이용하여 생백신을 제조하고 돼지에서 안전성 및 면역원성을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명에서는 국내분리 소바이러스성설사병바이러스인 KD26-1 strain의 전체유전자(full-length genome)를 추출하였다. 그리고 pACYC177벡터에 full-length cDNA로 삽입한 pACBVD26의 E2유전자를 제거한 후 돼지열병 LOM주의 E2유전자로 치환하였다. 최종적으로 상기 재조합된 pACKD26_E2LOM 플라스미드를 제한효소 SacII로 자르고, 시험관내에서 genomic RNA로 전사한 후, 돼지신장세포에 투입(transfection)하여 세포내 배양한 약독화 생백신 제조용 유전자재조합 키메릭 페스티바이러스인 KD26_E2LOM strain을 제공한다.

나아가 본 발명은 생물학적 마커가 포함된 돼지열병 재조합 바이러스를 제작하여 돼지열병을 예방할 수 있는 생백신용 바이러스를 제공한다.

또한 본 발명에서는 상기 제공된 KD26_E2LOM 바이러스를 이용한 돼지열병 백신을 제공한다.

본 발명인 BVDV E2유전자를 돼지열병 E2유전자와 치환하여 혈청학적 마커 및 유전자 마커로 감별가능한 재조합 돼지열병 백신용 키메릭 페스티바이러스는 백신바이러스와 야외감염 바이러스를 감별할 수 있다는 점에 우수한 효과가 있다.

나아가 돼지열병백신 바이러스이 변이를 쉽게 추적하여 백신의 안전관리를 향상시킬 수 있다는 점에 매우 유리한 효과가 있다.

보다 상세하게 첫째, 동물실험을 통해 돼지에는 병원성이 없는 것으로 입증된 소바이러스성설사병바이러스(bovine viral diarrhea virus: BVDV) KD26-1 바이러스의 전체유전자에 대한 염기서열을 분석한 뒤 이를 클로닝하고 클로닝한 전체유전자의 E2유전자를 약독화 돼지열병 백신바이러스인 LOM주의 E2유전자와 치환하여 키메릭 페스티바이러스 전체유전자 클로닝을 하였다. 이 클론을 이용하여 작성된 키메릭바이러스 KD26_E2LOM은 혈청학적 마커 및 유전자 마커를 가지고 있어 백신바이러스와 야외감염 바이러스를 감별할 수 있는 우수한 효과가 있다.

둘째, 상기 재조합 돼지열병 백신용 키메릭 페스티바이러스를 돼지열병 예방용 백신으로 사용할 경우 돼지열병백신 바이러스의 변이를 쉽게 추적하여 백신의 안전관리를 향상시킬 수 있다는 매우 유리한 효과가 있다.

도 1는 full-length genomic KD26-1 cDNA clone의 모식도이다.
도 2는 pACBVD26 full length clone을 제한효소 SacII로 절단하여 이를 in vitro RNA 합성하고, 바이러스(BVD26)의 full-length genomic RNA 생성을 확인한 그림이다.
도 3는 RNA transfection 후 MDBK세포에서 소바이러스성설사병 특이 단클론항체를 이용한 형광항체법으로 경시별 발현 바이러스 항원 역가측정한 사진 및 그래프이다.
도 4는 pACBVD26 유래의 RNA transfection 후 얻어진 BVD26 virus의 접종량에 따른 바이러스 증식 역가 조사한 그래프이다.
도 5은 pACBVD26 clone에 CSFV LOM주의 E2 유전자 삽입 모식도이다.
도 6은 pACKD26_E2LOM의 transfection후 얻은 바이러스를 돼지신장세포에 접종후 돼지열병 특이 단클론항체를 이용하여 간접형광항체법으로 확인한 사진이다.
도 7은 KD26_E2LOM바이러스를 PK-15 세포에 2대 계대배양후 3종의 특이 단클론항체를 이용하여 형광현미경으로 확인한 사진이다. A)는 돼지열병 특이 단클론항체를 나타내고, B)는 소바이러스성설사병 E^rns 특이 단클론항체를 나타낸 것이며, C)는 소바이러스성설사병 E2를 나타낸 것이다.
도 8은 KD26_E2LOM 바이러스의 고역가 seed stock을 확보하기 위해 PK-15세포에서 11대까지 계대배양한 그래프이다.
도 9는 KD26_E2 LOM, KD26-1와 LOM 바이러스를 세포별로 접종하여 경시별 역가측정한 결과를 바이러스별로 비교한 그래프리다.
도 10은 PK-15세포에서 배양한 KD26-1과 MDBK세포에서 배양한 KD26_E2LOM을 PK-15과 MDBK세포에서 경시별로 역가측정하여 비교한 그래프이다.
도 11은 KD26_E2LOM 바이러스 접종 후 직장내 체온 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 KD26_E2LOM 바이러스 접종 후 백혈구수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 KD26_E2LOM 바이러스를 a)1회접종한 군과 b)2회접종한 군에서의 공격접종후 직장내 체온변화를 나타낸 그래프이다.
도 14는 KD26_E2LOM 바이러스를 a)1회접종한 군과 b)2회접종한 군에서의 공격접종후 백혈구수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 15는 KD26_E2LOM 바이러스를 a)1회접종한 군과 b)2회접종한 군에서의 공격접종후 돼지열병 중화항체가 변화나타낸 그래프이다.
도 16은 KD26_E2LOM 바이러스를 a)1회접종한 군과 b)2회접종한 군에서의 공격접종후 소바이러스성설사병 중화항체가 변화나타낸 그래프이다.

본 발명은 유전자 마커 및 혈청학적 마커를 이용하여 백신바이러스와 야외감염 바이러스를 감별할 수 있도록 재조합한 서열번호 2의 키메릭 페스티바이러스 KD26_E2LOM을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신에 관한 것이다.

상기 유전자 마커는 서열번호 1의 pACBVD26의 E2유전자를 돼지열병 E2유전자로 치환함으로써 발현되는 것을 특징으로 하는 서열번호 2의 키메릭 페스티바이러스 KD26_E2LOM을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신일 수 있다.

상기 혈청학적 마커는 돼지열병 바이러스 감염에 의해 생성되는 E^rns 특이항체에 대한 혈청학적 마커인 것을 특징으로 하는 서열번호 2의 키메릭 페스티바이러스 KD26_E2LOM을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신일 수 있다.

상기 돼지열병 예방용 생백신은 MDBK세포 또는 PK-15세포에서 10^6.0~10^7.0TCID₅₀/mL의 역가로 배양이 가능한 것을 특징으로 하는 서열번호 2의 키메릭 페스티바이러스 KD26_E2LOM을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신일 수 있다.

본 발명은 국내분리 소바이러스성설사병바이러스인 KD26-1 strain의 전체유전자(full-length genome)를 추출하여 pACYC177벡터에 full-length cDNA로 삽입한 pACBVD26의 E2유전자를 제거하고, 돼지열병 LOM주의 E2유전자로 치환한 pACKD26_E2LOM 플라스미드를 제한효소 SacII로 절단한 후 시험관내에서 genomic RNA로 전사하고, 돼지신장세포에 투입(transfection)하여 세포내 배양한 약독화 생백신 제조용 유전자재조합 키메릭 페스티바이러스인 KD26_E2LOM strain에 관한 것이다.

그리고 본 발명은 생물학적 마커가 포함된 돼지열병 재조합 바이러스를 제작하여 돼지열병을 예방할 수 있는 생백신용 바이러스에 관한 것이다.

상기 백신을 제조하기 위하여, 소바이러스성설사병바이러스 KD26-1의 genomic RNA를 추출하여 infectious cDNA를 합성하고 이를 플라스미드화 한 pACBVD26 클론의 E2유전자를 현재 돼지열병 생백신으로 사용되고 있는 LOM 바이러스의 E2유전자와 치환한 pACKD26_E2LOM을 제한효소 SacII로 자른 다음, in vitro transcription 하여 infectious RNA를 생산하여 이를 돼지신장세포(porcine kidney 15 ; PK15)에 transfection함으로써 유전자 마커 및 혈청학적 마커가 작성된 새로운 KD26_E2LOM 바이러스를 생산하였다.

본 발명의 KD26_E2LOM 바이러스는 돼지에 접종시 면역원성 및 안전성 확인하였으며 돼지열병 생백신으로 제조하여 사용될 수 있다.

이하에서 실시예에 의거하여 구체적으로 설명한다. 그러나 이는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니다.

<실시예 1> KD26_E2LOM 바이러스 제조를 위한 전체 게놈작성용 균주선정

돼지에서 감염시 비병원성인 BVDV를 선발하기 위하여 100일령 돼지를 이용해국내분리 BVDV 분리주별(KD26-1, 32669, 95002, 95589, 32527)로 접종군을 만들었다. 그리고 비접종군 2두씩 동거시켜 접종 후 바이러스 전파여부를 관찰한 결과 모든 군에서 임상증상 및 백혈구 감소증이 나타나지 않았다.

동물실험에서 모든 국내분리 BVDV가 접종후 임상증상을 발현하지 않았기 때문에 돼지에서의 적당한 감염력을 가지고 세포 배양능력이 가장 우수하고, 세포변성효과가 뚜렸한 KD26-1을 전체 게놈작성을 위한 대상균주로 선발하였다.

하지만 KD26-1이 더 어린 자돈에서 병원성을 나타낼 우려가 있다는 점, 감염후 혈청학적 결과를 필요로 하는 점에서 40일령 자돈에서 동물실험을 실행한 결과, 역시 임상증상 및 백혈구 감소증이 관찰되지 않았고 동거감염이 확인되지 않았으며 14일이후 중화항체가가 형성되는 것을 확인하였다.

<실시예 2> 돼지열병 생마커백신 제작용 BVDV 전체유전자 cDNA 제조

소바이러스성설사병바이러스 KD26-1 바이러스에서 genomic RNA를 추출하여 전체 RNA에 대한 full-length cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 NEB로부터 분양받은 pACYC177플라스미드의 T7 promoter downstream에 클로닝하여 pACBVD26 재조합플라스미드를 제조하였다(도 1 참조).

상기 제조된 pACBVD26에서 BVDV의 전체유전자 게놈에 대한 염기서열분석을 하였다(서열목록 1 참조).

작성된 pACBVD26을 제한효소 SacII로 자르고 in vitro transcription하여 BVD26 RNA를 생성하였으며 전기영동기구(electrophorator)를 이용하여 RNA를 소신장세포(Madin-Darby Bovine Kidney: MDBK)에 투입(transfection)하였다.

RNA가 트렌스펙션된 세포에서 바이러스가 생성되어 이를 증식시켜 BVD26 바이러스로 명명하였다(도 3 참조).

BVD26 바이러스가 KD26-1 바이러스의 MDBK세포에서의 증식속도를 비교한 결과 원바이러스와 증식속도가 유사함을 확인하여(도 4 참조) 키메릭 페스티바이러스를 만들기위한 바이러스 벡터로 사용가능함을 확인하였다.

<실시예 3> 유전자 마커가 생성된 KD26_E2LOM 바이러스 제조

pACBVD26 재조합플라스미드의 E2유전자를 돼지열병 E2유전자로 치환하여 pACKD26_E2LOM 재조합플라스미드를 작성하였다(도 5 참조).

pACKD26_E2LOM의 삽입된 키메릭 페스티바이러스의 전체 유전자 염기서열분석을 하였다(서열목록 2 참조).

pACKD26_E2LOM을 제한효소 SacII로 자른후 in vitro 트렌스크립션(transcription)하여 KD26_E2LOM RNA를 생성하였으며 전기영동기를 이용하여 RNA를 돼지신장세포(porcine kidney 15 : PK15)에 트렌스펙션하였다. RNA가 트렌스펙션된 세포에서 생성된 바이러스를 다시 돼지신장세포에 접종하여 증식됨을 확인하고 이를 KD26_E2LOM 바이러스로 명명하였다(도 6 참조).

상기 KD26_E2LOM 바이러스는 소바이러스성설사병 E2 특이단클론항체에는 반응하지 않고 돼지열병 E2 특이단클론항체와 소바이러스설사병 E^rns 특이단클론항체에 특이적으로 반응하는 것으로 확인되어 BVD backbone에 돼지열병 E2유전자가 삽입되었음을 간접적으로 확인하였다(도 7 참조).

상기 트렌스펙션후 상기 KD26_E2LOM 바이러스의 초기역가는 10^3.5 TCID₅₀/mL이었다. 이후 돼지신장세포(PK15)에서 11대까지 계대하여 10^6.8TCID₅₀/mL의 고역가 시드 스톡(seed stock)을 제조하였다(도 8 참조).

상기 11대까지 계대배양한 바이러스의 염기서열을 분석한 결과 4개의 점돌연변이가 있었음을 확인하였고, 그 결과를 하기의 [표 1]에 나타내었다.

KD26_E2LOM 바이러스를 PK-15 세포에서 11대 계대배양한 다음 RT-PCR로 증폭하여 염기서열을 비교 분석한 결과

번호	위치*	염기서열변이	아미노산서열변이	관련유전자
1	770	TCG	Ser	Npro
		TTG	Leu
2	3,495	TTG	Leu	E2
		GTG	Val
3	3,981	ATA	Ileu	NS2
		TTA	Leu
4	8,286	ATG	Met	NS4B
		GTG	Val

^*위치: pACKD26_ELOM기준

KD26_E2LOM 바이러스에 대한 세포친화성검사를 KD26-1과 LOM주와 비교하여 검사한 결과 경시별 역가측정결과 모두 PK-15세포보다 MDBK 세포에서 높은 역가를 나타냈다(도 9 참조).

그러나 MDBK 세포와 PK15 세포를 이용한 역가측정 비교에서 PK15세포에서 자란 KD26-1은 PK15세포보다 MDBK세포에서 전시간에 걸쳐 평균 100배이상 높은 역가를 나타냈으며 MDBK세포에서 자란 KD26_E2LOM의 경우 MDBK세포보다 PK-15세포에서 전시간에 걸쳐 평균 10배이상의 높은 역가를 나타냈다(도 10 참조).

<실시예 4> 시험백신 제조

KD26_E2LOM 바이러스를 PK15세포에 1 moi(multiplicity of infection)로 접종하여 72시간 5% 탄산까스 배양기에서 배양한 후 배양액을 실온 및 -40℃에서 3회 반복 동결융해(freezing and thawing)하여 PK15세포에서 증식된 모든 바이러스가 용출되도록 하였다.

바이러스 배양 상층액을 1000 xg에서 10분간 원심한 후 상층액을 수확하였으며 이를 PK15세포에서 역가검사(titration)을 실시하여 1x10^6.5TCID₅₀/ml 이상의 바이러스를 백신제조용 바이러스로 사용하였다.

백신제조는 다음과 같은 방법으로 하였다. 2x10^4.0TCID₅₀/ml 역가의 KD26_E2LOM 바이러스와 보호제 LPGG(lactose phophate glutamate gelatin mixture)를 동량 혼합하여 KD26_E2LOM 바이러스의 농도가 1x10^4.0TCID₅₀/ml 되게 혼합한 다음 1ml씩 소분하여 동결건조 하여 백신을 제조하였다.

<실시예 5> 시험백신의 안전성(安全性) 시험

KD26_E2LOM 바이러스의 안전성을 확인하기 위해 돼지열병 및 소바이러스성설사병에 음성인 40~50일령 자돈 13마리를 구입하여 실험하였다.

접종군은 두당 10⁷ TCID₅₀씩 40～50일령 자돈 7두에 근육접종 하였고 접종군 접종후 1일후 동거군 4마리를 접종군과 동거시켰다. 대조군으로 2두의 자돈에 멸균된 인산완충액을 주사하였다. 구체적인 실험조건은 [표 2]와 같이 하였다.

바이러스의 안전성확인을 위한 고역가 접종군의 실험조건

구분	두수	면역
		접종량	접종경로
접종군	7	107 TCID50	근육접종
동거군	4	NA*	NA
대조군	2	NA	NA

*NA: not applicable

상기와 같이 백신접종 후 혈중내 바이러스 함량, 비즙에 바이러스 배출 유무를 28일간 관찰하였다.

상기 백신접종일부터 1~7일 사이에 일시적으로 혈액, 비즙에서 백신바이러스가 PCR로 관찰되었으나, 바이러스 분리는 되지 않았고, 임상증상 발현 등의 부작용을 관찰한바 정상 대조군과 차이가 없어, KD26_E2LOM 바이러스 접종 후 부작용 현상은 관찰되지 않았다. 혈액 및 비즙에서의 RT-PCR을 이용한 바이러스 확인결과를 하기 [표 3]에 나타내었다.

혈액 및 비즙에서의 RT-PCR을 이용한 바이러스 확인

구분	시료	접종후 일자								임상증상
		0	1	4	7	11	14	21	28
접종군	혈액	0/7*	1/7	1/7	1/6	0/5	0/4	0/3	0/2	없음
	비즙	0/7	0/7	0/7	1/6	0/5	0/4	0/3	0/2	없음
동거군	혈액	0/4	0/4	0/4	0/4	0/3	0/3	0/2	0/1	없음
	비즙	0/4	0/4	0/4	0/4	0/3	0/3	0/2	0/1	없음
대조군	혈액	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	없음
	비즙	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	없음

* 양성군수/전체마리수

상기와 같이 백신접종후 접종동물에서의 병리학적 변화와 장기내 바이러스의 존재유무를 파악하기 위해 접종군은 접종후 4, 7, 11, 14, 21, 28일째 그리고 동거군은 접종군 접종후 4, 11, 14, 21, 28일째 안락사후 부검을 하고 실질장기를 적출하여 검사하였으나 바이러스성 병변은 관찰되지 않았다.

그리고 접종군에서만이 일부장기에서 PCR로 바이러스 항원을 검출할 수 있었으나 바이러스 분리는 되지 않았다. 접종군과 대조군에서의 RT-PCR을 이용한 장기내 바이러스 검출결과를 [표 4]에 나타내었다.

접종군과 대조군에서의 RT-PCR을 이용한 장기내 바이러스 검출

구분	접종군							동거군
접종후 일자	4	7	11	14	21	28	49	7	14	21	28
Tonsil	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
Lung	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Heart	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-
Spleen	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Liver	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Kidney	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Mesenteric LN	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Ileum	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Caecum	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-
Inguinal LN	+	+	-	-	-	+	-	-	-	-	-
Brain	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

한편 도 11과 같이 KD26_E2LOM 바이러스 접종 후 직장내 체온변화가 모두 정상으로 확인되었다.

또한 도 12와 같이 백혈구수 변화 관찰에서 접종군, 동거군과 대조군 모두 정상범위(10,000-50,000/㎣)로 나타났다.

즉 상기 KD26_E2LOM 바이러스의 안전성이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

<실시예 6> 시험백신의 면역원성(免疫原性) 시험

돼지에서의 면역원성을 확인하기 위해 돼지열병 및 소바이러스성설사병 항체가 음성인 40~50일령 돼지를 구입하여 실험하였다.

접종군은 1회 접종군과 2회접종군을 두어 각각 5마리 돼지를 사용했고 1회접종군은 1마리, 2회접종군은 2마리의 동거군을 두었다. 또한 대조군으로 4마리를 사용하였다. KD26_E2LOM 바이러스의 돼지에서 면역원성 및 방어효과의 확인을 위한 실험조건을 하기 [표 5]에 나타내었다.

KD26_E2LOM 바이러스의 돼지에서 면역원성 및 방어효과 실험계획

	두수	면역			공격접종
		접종량	접종경로	횟수/ 간격	접종주	접종량	접종경로	공격접종일
1회접종군	5	104TCID50	근육접종	1회/NA	상원주 (SW)	106TCID50	IM	28 dpi**
1회접종동거군	1	NA*	NA	NA	NA	NA	NA	NA
2회접종군	5	104TCID50	IM	2회/3주	SW	106TCID50	IM	35 dpi
2회접종동거군	2	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA
대조군	4	NA	NA	NA	SW	106TCID50	IM	35 dpi

*NA: not applicable, **dpi: days post immunization(접종후 일자)

KD26_E2LOM 바이러스의 접종횟수에 따른 임상증상 및 면역력과 방어력에 대한 차이는 없었고, 1차접종군과 2차접종군 모두 면역에서 공격접종후까지 체온변화가 정상이었으며(도 13 참조), 백혈구수 변화도 정상이었다(도 14 참조). 또한 KD26_E2LOM 바이러스 접종 후 혈액, 비즙 및 분변에서 KD26_E2LOM의 항원을 RT-PCR로 검출한 결과 전 실험군에서 접종 후 28일까지 검출되지 않았다.

KD26_E2LOM 바이러스 접종 후 돼지에서의 면역력을 실험하기 위해 중화항체가를 측정한 결과 1회접종군과 2회접종군 모두 4주후 평균 64배의 바이러스 중화항체가를 보였으며 2차접종군의 경우 2차접종후 2주후 평균 128배 이상의 우수한 항체가를 나타내었다(도 15 참조).

또한 항원적 감별여부를 확인하기 위해 소바이러스성설사병에 대한 중화항체가를 측정한 결과, 모두 공격접종한 다음에만 소바이러스성설사병바이러스에 대한 중화항체가 형성됨을 확인하였다. 이는 공격접종한 돼지열병 상원주에 대한 항체교차반응으로 판단된다(도 16 참조).

1차접종군은 1차접종후 4주째, 2차접종군과 대조군은 2차 접종 2주후 중병원성 돼지열병바이러스인 상원주(SW03) 바이러스를 100 MLD (median lethal dose) 농도로 근육접종을 통해 공격접종하여 방어효과 조사한 바 대조군은 모두 심각한 체온증가와 백혈구감소증을 나타냈다(도 13 및 도 14 참조).또한 대조군에서만 공격접종 5일째부터 안락사시킬때까지 혈액, 비즙, 분변에서 지속적으로 돼지열병바이러스를 검출하였고, 부검후 실질장기에서도 거의 모든 장기에서 바이러스를 검출할 수 있었다.

상기 KD26_E2LOM 바이러스를 접종한 후 돼지열병 상원주 공격접종후 혈액, 비즙 및 분변에서의 RT-PCR을 이용한 돼지열병 바이러스 항원 검출결과를 하기 [표 6]에 나타내었고, KD26_E2LOM 바이러스를 접종한 후 돼지열병 상원주 공격접종후 내부 실질장기에서 RT-PCR을 이용한 돼지열병 바이러스 항원 검출결과를 하기 [표 7]에 나타내었다.

KD26_E2LOM 바이러스를 접종한 후 돼지열병 상원주 공격접종후 혈액, 비즙 및 분변에서의 RT-PCR을 이용한 바이러스 검출

구분	시료	공격접종후 일자
		0	3	5	7	10	14	21
1회접종군	혈액	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
	비즙	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
	분변	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
1회접종동거군	혈액	0/1	0/1	0/1	0/1	0/1	0/1	0/1
	비즙	0/1	0/1	0/1	0/1	0/1	0/1	0/1
	분변	0/1	0/1	0/1	0/1	0/1	0/1	0/1
2회접종군	혈액	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
	비즙	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
	분변	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
2회접종동거군	혈액	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2
	비즙	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2
	분변	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2	0/2
대조군	혈액	0/4	0/4	4/4	4/4	4/4	4/4	3/3
	비즙	0/4	0/4	0/4	4/4	4/4	4/4	3/3
	분변	0/4	0/4	4/4	4/4	4/4	4/4	3/3

KD26_E2LOM 바이러스를 접종한 후 돼지열병 상원주 공격접종후 내부 실질장기에서 RT-PCR을 이용한 바이러스 검출

조직	1회접종군					2회접종군					동거군			대조군
	44	45	46	47	48	49	50	51	52	53	84	92	93	55	62*	90	91
편도	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+
폐	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+
심장	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+
비장	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+
간	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+
신장	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+
장간막림프절	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+
회장	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+
맹장	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+
서혜부림프절	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	+	+
뇌	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

또한 접종후 부검소견에서 대조군에서만 돼지열병에 특징적인 증상이 나타났다. 이를 확인하기 위해 KD26_E2LOM 바이러스를 접종한 후, 돼지열병 상원주를 공격접종한 돼지의 부검소견을 하기 [표 8]에 나타내었다.

KD26_E2LOM 바이러스를 접종한 후 돼지열병 상원주를 공격접종한 돼지의 부검소견

실험군	개체번호	부검소견	비고
2회접종군	49	맹장점상출혈, 회장충혈
대조군	55	폐간변, 비장종대, 서혜부림프절종대 및 충출혈, 심장점상출혈, 결장충혈, 신장점상출혈	돼지열병 전형적 소견임
	62	폐충출, 장간막림프절 종대, 서혜부림프절종대 및 충출혈, 담관폐색, 신장점상출혈(약)
	90	폐간변(소), 폐허탈(빈혈), 서혜부림프절종대(3X) 및 충출혈, 심장관상부부종, 장간막림프절 약간종대, 비장종대, 신장종대
	91	뇌막출혈의심, 폐심&첨엽간변, 심장관상부부종, 비장종대, 서혜부림프절충출혈, 신장점상출혈(약간)

지금까지 사용되고 있는 돼지열병을 예방할 수 있는 생백신은 LOM 바이러스이다. 상기 바이러스는 PCR로 증폭된 산물에 제한효소 Zho 1을 가하여 야외감염 바이러스와 구분이 가능하나, 혈청학적으로 감별이 불가능하다는 점에서 집단적인 혈청학적 스크린이 곤란한 단점이 있었다.

따라서 돼지열병을 효과적으로 예방하기 위해서는 유전자 마커 및 혈청학적 마커가 고정된 백신용 바이러스를 사용하는 것이 효율적이며 나아가 국내 분리주를 이용한 돼지열병 백신이 필요한 실정이었다.

이에 본 발명인 BVDV E2유전자를 돼지열병 E2유전자와 치환하여 혈청학적 마커 및 유전자 마커로 감별가능한 재조합 돼지열병 백신용 키메릭 페스티바이러스을 제공함으로써, 혈청학적 마커 및 유전자 마커를 이용한 백신바이러스와 야외감염 바이러스의 감별이 가능해졌다. 이로써 집단적인 혈청학적 스크린 또한 가능하게 되었으므로 산업상 가능성이 있다.

또한 상기 재조합 돼지열병 백신용 키메릭 페스티바이러스가 돼지열병 예방용 백신으로 사용될 경우, 돼지열병백신 바이러스의 변이가 쉽게 추적될 수 있어, 백신의 안전관리를 향상시킬 수 있다는 점에서 산업상이용가능성이 매우 우수하다.

한국미생물보존센터(국내) KFCC11478 20100121

<110> Korea (National Veterinary Research and Quarantine Service) <120> Live attenuated vaccine for classical swine fever <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12307 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KD26-1 full-length cDNA of pACBVD26 <400> 1 gtatacgaga attagaaaag gctctcgtat acgtattggg caattaaaat aataattagg 60 cctagggaac aaaagtcccc ctcagcgaag gccgaaaaga ggctagccat gcccttagta 120 ggactagcat aaagaggggg gtagcagcag tggtgagttc gttggatggc ttaagccctg 180 agtacagggt agtcgtcagt ggttcgacgc cttggaataa aggtctcgag atgccacgtg 240 gacgagggca tgcccaaagc acatcttaac ctgagcgggg gtcgcccagg taaaagcagt 300 tctaaccgac tgttacgaat acagcctgat agggtgctgc agaggcccac tgttctgcta 360 ctaaaaatct ctgctgtaca tggcacatgg agttgatcac aaatgaactt ttatacaaaa 420 cttacaaaca aaaacccgtc ggggtggaag aacctgttta tgatcaggca ggtgatccct 480 tatttggtga aaggggagca gtccaccctc aatcgacgtt aaagctccca cacaagagag 540 gggaatgcga tgtacccatc aacttggcat ctttaccaaa aaggggtgac tgcaggtcgg 600 gtaatagcag aggacctgtg agcgggatct acttgaagcc agggccacta ttttaccagg 660 actataaggg tcccgtctat cacagggccc cgctggagct ctttgaagag ggaaccatgt 720 gtgaaacgac taaacggata gggagagtaa ctggaagtga cggaaagtcg taccacattt 780 atgtgtgtat agatggatgt ataataataa aaagtgccac aagaagtcac caaagggtgc 840 ttaggtgggt ccataatagg cttaactgcc ctctatgggt cacaagttgc tcagacacga 900 aagaagaggg agcaacaaaa aagaaaacac agaaacccga cagactagag aaggggaaga 960 tgaaaatagt gcccagagaa tccgaaaaag acagcaaaac taaacctccg gatgctacaa 1020 tagtggtaga tggagttaaa taccaggtga agaagaaggg aaaaatcaag agtaagagca 1080 ctcaggacgg cttgtaccat aacaaaaaca aaccgccgga atcacgtaag aaactggaaa 1140 aagcattgct ggcatgggca ataataacta tagttttgtt tcaagttaca atgggagaaa 1200 acataacaca gtggaaccta caagacaatg ggacggaagg gatacaacgg gcaatgtttc 1260 aaaggggtgt gaatagaagt ctacatggaa tctggccaga gaaaatctgt actggtgtcc 1320 cttcccatct agccaccgat atggaactaa aaacaatcca tggtatgatg gatgcaagtg 1380 agaagaccaa ctacacgtgt tgcagacttc aacgccatga gtggaacaag catggttggt 1440 gcaactggta caatattgaa ccctggattc tagtcatgaa tagaacccaa gccaatctta 1500 ctgagggaca accaccaagg gagtgcgcag tcacttgcag gtatgatagg gatagtgact 1560 taaacgtagt aacacaagct agagatagcc ccacactctt gacaggttgc aagaaaggaa 1620 agaacttctc ctttgcaggc atactgacgc ggggtccctg caactttgaa atagctgcga 1680 gtgatgtatt attcaaagaa catgactgca ctagtatgtt ccaggatact gctcattacc 1740 ttgttgacgg gatgaccaac tccttagaaa atgccagaca aggaaccgct aaactgacaa 1800 cctggttagg caagcagctc gggatactag ggaaaaagtt ggaaaacaag agtaagacgt 1860 ggtttggagc atacgcggct tccccctact gtgatgtcga tcgaaagatt ggctacatat 1920 ggtatacaaa aaattgtacc cctgcctgct tgcccaagaa cacaaaaatt gtcggccctg 1980 ggaagtttga caccaacgca gaggacggca agatactaca tgagatgggg ggccacttgt 2040 cggaggtact actactttct ttagtggtgc tgtccgactt cgcaccggaa acagccagcg 2100 caatgtacct aatcctacat ttttccatcc cacaaagtca cgttgacata atggaatgtg 2160 ataagaccca gttgaacctc acagtggagc ttacaacagc tgatgtaata ccaggatcag 2220 tctggaacct aggcaaatgg gtatgtataa gaccaaattg gtggccttat gagacaactg 2280 tggtgttggc atttgaagag gtgagccagg tggtgaagtt agtgttgagg gcactcagag 2340 atttgacacg catttggaac gctgcaacaa ctactgcttt cttaatatgc cttgttaaga 2400 tagtcagggg ccagatggta cagggcattc tgtggctact actgataaca ggggtacaag 2460 gggacttgga ttgcaaacct gaattctcat atgccatagc aagggatgaa agaattggtc 2520 aactgggggc tgaaggcctt actaccactt ggaaggatta ctcgcctgaa atgaaactgg 2580 aagacacaat ggtcatagct tggtgcaaag atggtaagtt tacgtacctc ccaaggtgca 2640 cgagagaaac cagatatctc gcgatcttgc atacaagagc cttaccgacc agtgtggtat 2700 tcaaaaaact ttttgatggg cgaaagcaag aggatgtagt cgaaatggac gacaactttg 2760 aatttggact ctgcccatgt gatgccaaac ccatagtaag agggaaattc aatacaacac 2820 tgctgaacgg atcggccttc cagatggtat gccccatagg atggacaggg actgtaagct 2880 gtatgtcatt caatatggac accttagcca caaccgtgat acggacatat agaaggtcca 2940 aaccatttcc tcataggcaa ggctgtatca cccaaaagac tctgggggag gatctccata 3000 actgcatcct cggaggaaat tggacttgtg tgcctggaga catgctatta tacaaagggg 3060 gctctattga atcctgcaag tggtgtggtt atcaatttaa agagagcgag ggactaccac 3120 actaccccat tggcaagtgt agattagaga atgagactgg ttacagacta gtagacgata 3180 cctcttgtaa tagagaaggt gtggccatag taccacaagg gacattacgg tgcaagatag 3240 gaaaaactac tatacaggtc atagctatgg ataccaaact cgggcctatg ccttgcagac 3300 catatgaaat aatatcaagt gaggggcctg tagaaaggac agcgtgtacc ttcaactaca 3360 ctaaaacatt aaaaaataag tattttgagc ccagagacag ctacttccag caatacatgc 3420 taaaaggaaa gtatcaatac tggtttgacc tggaggtaac cgaccatcac cgggattact 3480 ttgccgagtc catattagtg gtggtggtag ccctcctggg tggcagatat gtactttggt 3540 tactagttac atacatggtc ttatcagaac agaaggcctc agggactcag tatggagcag 3600 gggaagtagt gatgatgggc aacttgctaa cccataatga cattgaagtg gtgacatact 3660 tcttgctgtt gtacctactg ctgagggaag agagcgtaaa gaagtgggtc ttacttttat 3720 accacatctt agtgtcacac ccaatcaaat ctgtaactgt gatcctattg atgattgggg 3780 atgtggtaaa ggcagactca gggggccaag ggtactttgg gcaaatagac ctctgtttta 3840 caatagttgt actaatcatc ataggtttaa tcatagccag gcgtgaccca actatagtgc 3900 cactagtaac aataatggca gcactgaggg tcactggatt gacctaccag cctggagttg 3960 acgtcgctat ggcagtcatg accataaccc tactgatgat tagctatgtg acagattact 4020 ttagatataa aagatggtta cagtgcgttc tcagcctggt gtcaggggtg ttcttgataa 4080 gaagcctaat gcacctaggt agaatagagg tgccagaggt aaccatccca aactggagac 4140 cactaacttt aatactgtta tatttgatct caacaacaat tgtaacaatg tggaaggttg 4200 acatcgctgg cttgttgttg caatgcctgc ctatcttttt actggccaca accttgtggg 4260 ccgacttctt aaccctcata ctgatcctgc ctacctatga attggttaaa ttatactacc 4320 tgaaaactgt taggactgat atagaaagaa gttggccagg ggggatagac tgtacaagag 4380 ttgactccat ctacgacatt gatgagagtg gagagggcgt atatctcttt ccatcaaggc 4440 agaaaggaca gaggagcttt tccatactct tgccccttgt caaagcaaca ctgataagtt 4500 gcgtcagcag taaatggcag ctaatataca tgagttacct aactttggac tttatgtact 4560 acatgcacag gaaagttata gaagagatat caggaggcac caacatgata tccaggttag 4620 tagcggcact catagagctg aactggttca tggaagaaga ggagagcaaa ggcctaaaga 4680 agttttatct attatctgga aggttgagaa acctaataat aaaacataaa gtaagaaatg 4740 agaccgtggc ttcttggtac ggggaggagg aagtctacgg tatgccaaag atcatgacaa 4800 taatcaaggc cagtacgctg agtaagagca agcactgcat gatatgcact gtatgtgaga 4860 gccgagagtg gaaaggcggc acctgcccaa aatgtggacg ccatgggaaa ccgataatgt 4920 gtgggatgtc gctagcggat tttgaagaaa gacactataa aagaatcttt ataagggaag 4980 gtaactttga gggtcctttt aggcaagaat acaatggctt tgtacaatat accgctaggg 5040 ggcaattact tgtgagaaac ttgcccgtac tggcaactaa agtaaaaatg ctcatggtag 5100 gcaaccttgg agaagaaatt ggtgatctgg aacatcttgg gtggatccta agggggcctg 5160 ccgtgtgtaa gaagatcaca gagcacgaaa aatgccacat caatatactg gataaactaa 5220 ctgcattttt cgggatcatg ccgaggggga ctacacccag agccccggtg aggttcccta 5280 cgagcttact aaaagtgagg aggggcctgg agactggctg ggcttacacg caccaaggtg 5340 ggataagttc agtcgaccat gtaaccgccg gaaaagacct attggtctgt gacagcatgg 5400 gacggactag agtggtttgc caaagcaaca acaggttgac cgatgagaca gaatatggcg 5460 tcaagactga ctcaggatgc ccagacggtg ccagatgtta tgtgttaaat ccagaggctg 5520 tcaacatatc aggatccaag ggggcagtcg tccacctcca aaagacaggt ggagaattca 5580 cgtgtgtcac cgcatcaggc acaccggcct ttttcgacct aaaaaacttg aaaggatggt 5640 caggattgcc tatattcgaa gcctccagcg ggagggtggt 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cccttgttca acatctttga taaagtgaga aaggaatggg 10920 acttgttcaa tgagccagtg gccgtaagtt ttgataccaa agcctgggac acacaagtga 10980 ctagtaggga tctgcaactt atcggagaaa tccagaaata ttactatagg aaggagtggc 11040 acaagttcat tgacaccatc accgaccaca tgacagaagt gccagttata acagcagatg 11100 gtgaagtata tataagaaat gggcagagag gtagtggcca accagacaca agtgcaggca 11160 acagcatgtt aaatgtccta acaatgatgt acgctttctg cgaaagcaca ggggtcccgt 11220 acaagagttt caacagggtg gcaaggatcc atgtctgtgg ggatgatggc ttcttaataa 11280 ctgaaaaagg gttagggatg aaatttgcta acaaagggat gcagattctt cacgaagcag 11340 gcaaacctca gaagataacg gaaggggaaa agatgaaagt tgcctatagt tttgaggaca 11400 tagagttctg ttcccatacc ccagtccctg ttaggtggtc cgacaatacc agtagtcaca 11460 tggccgggag agacaccgct gtgatactat caaagatggc tacaagattg gattcaagtg 11520 gagagagggg taccacagca tatgaaaaag cggtagcctt cagtttcttg ctgatgtatt 11580 cctggaaccc gcttgttagg aggatttgcc tgttggtact ttcgcaacag ccagagacag 11640 acccatccaa acaggccact tattattaca aaggtgatcc aataggggcc tataaagatg 11700 tgataggtcg gaatctaagt gaactaaaga gaacaggctt cgagaaattg gcaaatctaa 11760 acctaagcct gtccacatta gggatctgga ctaagcacac aagcaaaaga ataattaatg 11820 actgtgttgc cattgggaaa gaagaaggca actggctagt taacgccgac aggctgatat 11880 ccagcaaaac tggccactta tacatacctg ataagggctt tacattacaa ggaaagcatt 11940 atgagcaact acagctaaga acagagacaa acccggtcat gggggtcggg actgagagat 12000 acaagttagg tcccatagtc aatctgctgc tgagaaggtt gaaagttctg ctcatgacgg 12060 ccgtcggtgc cagcagctga gacaagtgta tatattgtaa ataaattaac ccatgtacat 12120 attgtatata aatatagttg ggatcgtcca cctcaagaag acgacacacc caacacgcac 12180 agctaaacag tagttaagat tatctacctc aagataacac tacatttaat gcacacagca 12240 ctttagctgt atgaggatac gcccgacgtc tacagttgga ctagggaaga cctctaacag 12300 cccc 12304

Claims (4)

1. 유전자 마커 및 혈청학적 마커를 이용하여 백신바이러스와 야외감염 바이러스를 감별할 수 있도록 재조합한 서열번호 2의 키메릭 페스티바이러스 KD26_E2LOM을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 유전자 마커는 서열번호 1의 pACBVD26의 E2유전자를 돼지열병 E2유전자로 치환함으로써 발현되는 것을 특징으로 하는 서열번호 2의 키메릭 페스티바이러스 KD26_E2LOM을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 혈청학적 마커는 돼지열병 바이러스 감염에 의해 생성되는 E^rns 특이항체에 대한 혈청학적 마커인 것을 특징으로 하는 서열번호 2의 키메릭 페스티바이러스 KD26_E2LOM을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돼지열병 예방용 생백신은 MDBK세포 또는 PK-15세포에서 10^6.0~10^7.0TCID₅₀/mL의 역가로 배양이 가능한 것을 특징으로 하는 서열번호 2의 키메릭 페스티바이러스 KD26_E2LOM을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신.

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