JP5377296B2

JP5377296B2 - ブタ・コレラウイルスのｅ２構造糖タンパク質中の新規毒性決定因子

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Publication number: JP5377296B2
Application number: JP2009513411A
Authority: JP
Inventors: ボルカ，マニュエル，ヴィ．; リサッティ，ギリェルモ，アール．
Original assignee: US Department of Agriculture USDA
Current assignee: US Department of Agriculture USDA
Priority date: 2006-05-30
Filing date: 2007-05-29
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2027-05-29
Also published as: WO2007143442A2; US20070280955A1; RU2451746C2; RU2008150400A; KR20090025291A; CN101478985A; GT200800269A; EP2023953A4; CN101478985B; CR10508A; BRPI0712558A2; EP2023953A2; JP2009538628A; MX2008015215A; US8846055B2; EP2023953B1; ZA200810285B; WO2007143442A3; KR101432840B1; UA98620C2

Description

本発明は、Ｅ２構造糖タンパク質中の新規ブタ・コレラウイルス（ＣＳＦＶ）の毒性決定因子の単離及び特徴付けと、ＣＳＦ弱毒性生ワクチンを設計するためのこれらの新規毒性決定因子の利用とに関する。

ブタ・コレラ（ＣＳＦ）は、本質的に急性又は慢性のいずれにもなりうるブタの高伝染性疾患である（非特許文献１）。病原体であるＣＦＳウイルス（ＣＳＦＶ）は、＋鎖１本鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープを持つ小型ウイルスであり、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）及びボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）とともにフラビウイルス科中のぺスチウイルス属の仲間として分類される（非特許文献２）。１２．５ｋｂのＣＳＦＶゲノムは１個のオープン・リーディング・フレームを含み、該オープン・リーディング・フレームはアミノ酸４０００個のポリタンパク質をエンコードし、細胞内及びウイルスのプロテアーゼによる前記ポリタンパク質の翻訳と同時のプロセッシングと、翻訳後のプロセッシングとを通じて１１個ないし１２個の最終開裂産物（ＮＨ２−Ｎｐｒｏ−Ｃ−Ｅｒｎｓ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨ）を最終的に産生する（非特許文献３）。

毒性及び宿主域の表現型は、ＣＳＦＶの単離体の間でも、ぺスチウイルスの間でも異なる。ＣＳＦＶ強毒性株の感染は感染した動物を死に至らしめるが、毒性が中程度ないし弱い単離体は遷延性慢性疾患を誘発する（非特許文献１）。さらにウシ及びヒツジの病原体であるおのおののＢＶＤＶ及びＢＶＤは、臨床疾患を誘発することなく、ブタに感染できる（非特許文献１）。異なる毒性の表現型のＣＳＦＶと、ＢＶＤＶと、ＢＤＶとに由来するゲノム配列が利用可能であるにもかかわらず、自然宿主におけるＣＳＦＶ毒性の遺伝的基礎は理解されていない（非特許文献１）。逆遺伝学の利用は、ウイルス毒性決定因子の同定を可能にし、ＣＳＦ弱毒性生ワクチン候補の開発を促進した（非特許文献４−１２）。

キャプシドタンパク質と、Ｅｒｎｓ、Ｅ１及びＥ２の糖タンパク質とは、ＣＳＦＶのビリオンの構造上の構成要素であり、Ｅ１及びＥ２はカルボキシル末端でエンベロープに固定され、Ｅｒｎｓはウイルスエンベロープと緩く結合する（非特許文献１３−１５）。３個の糖タンパク質全てが、ＣＳＦＶ毒性に関連する（非特許文献５、８及び９）。

Ｅ２遺伝子の部分的又は完全な欠損を含むウイルス突然変異体は生存できないと証明されたので、Ｅ２糖タンパク質がＣＳＦＶの複製に必須と考えられている（非特許文献１６）。Ｅｒｎｓ（非特許文献４）及びＥ１（非特許文献１７）とともにＥ２は宿主細胞へのウイルスの吸着に関与すると考えられ、確かに、ぺスチウイルスのキメラは前記Ｅ２遺伝子の供与体の感染性及び細胞親和性の表現型との一致を示す（非特許文献１２及び１６）。Ｅ２は免疫原性が最も高いＣＳＦＶの糖タンパク質であり（非特許文献１４及び１８）、中和抗体と致死性感染に対する保護とを誘導する。ＣＳＦＶのＥ２は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＷＨ３０３によって認識される８２９番目ないし８３７番目のアミノ酸残基間のエピトープ（非特許文献１９）を含み、ＢＶＤＶ又はＢＤＶのＥ２と反応せず、ＣＳＦの診断に日常的に用いられる。

ｖａｎＯｉｒｓｃｈｏｔ，Ｊ．Ｔ．ら、ＤｉｓｅａｓｅｓｏｆＳｗｉｎｅ，第６版，Ｌｅｍａｎら編集，ＩｏｗａＳｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，アイオワ州エームズ，２８９頁（１９８６）．Ｈｕｌｓｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：９５８５−９５９５（２００１）．Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，第３版，Ｆｉｅｌｄｓ及びＨｏｗｌｅｙ編，ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＲａｖｅｎ，フィラデルフィア，９３１−９５９頁（１９９６）．Ｍａｙｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ２２：３１７−３２８（２００４）．Ｍｅｙｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１０２２４−１０２３５（１９９９）．Ｍｏｏｒｍａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：７６３−７７０（１９９６）．Ｍｏｓｅｒら、ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ２３：６３−６８（２００１）．Ｒｉｓａｔｔｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：３７８７−３７９６（２００５ａ）．Ｒｉｓａｔｔｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３４３：１１６−１１７（２００５ｂ）．Ｒｕｇｇｌｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３４７８−３４８７（２００６）．Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７６８１−７６８４（１９９８）．ｖａｎＧｅｎｎｉｐら、Ｖａｃｃｉｎｅ１９：４４７−４５９（２０００）．Ｔｈｉｅｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：４７０５−４７１２（１９９１）．Ｗｅｉｌａｎｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３５６３−３５６９（１９９０）．Ｗｅｉｌａｎｄら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１５７−１１６５（１９９９）．ｖａｎＧｅｎｎｉｐら、Ｖａｃｃｉｎｅ２０：１５４４−１５５６（２００２）．Ｗａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３３０：３３２−３４１（２００４）．Ｋｏｎｉｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６４７９−６４８６（１９９５）．Ｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１６１９−１１６２５（２０００）．Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：８４９４−８５０３（２００２）．ｖａｎＧｅｎｎｉｐら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：８８１２−８８２３（２００４）．Ｚｈａｎｇら、ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ１５１（１）：３７−５４（２００６）．Ｄｏｎｇら、Ｖａｃｃｉｎｅ２３：３６３０−３６３３（２００５）．Ｈｕｌｓｔら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２７７９−２７８７（１９９７）．Ｌｉａｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．８４：１２６９−１２７４（２００３）．Ｈｕｌｓｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９５５３−９５６１（２００１）．Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３−５４６７（１９７７）．

本明細書でＣＳＦＶのＥ２のＷＨ３０３エピトープ中に生じた突然変異の効果を発明者は報告するが、前記突然変異は毒性のＣＳＦＶのブレスシア（Ｂｒｅｓｃｉａ）株のアミノ酸配列をＢＶＤＶのＮＡＤＬ株と相同なアミノ酸配列へと次第に変化させ、ブタでのウイルス毒性の相加作用とアミノ酸６個の変化後の完全な弱毒化とを示す。かかる弱毒ウイルスはＣＳＦ弱毒性生ワクチンの合理的な設計を可能にする。ワクチン接種後３日目ないし２１日目で毒性ブレスシアウイルスに感染されたとき、ウイルスの突然変異体に感染した動物は保護された。ＷＨ３０３エピトープ中のこの部位での改変は、感染動物とワクチン接種された動物とを鑑別する診断試験の開発を可能にする。

発明者はＥ２糖タンパク質中の新規毒性決定因子を同定した。

本発見に従って、改変されたＣＳＦＶのＥ２糖タンパク質をエンコードするＤＮＡを含む、組み換えブタ・コレラウイルス（ＣＳＦＶ）を提供することが本発明の目的である。

高病原性ブレスシア株のＥ２遺伝子の一部に突然変異を累積することによる改変が施されたＣＳＦＶのＥ２糖タンパク質をエンコードするＤＮＡを含む、組み換えブタ・コレラウイルス（ＣＳＦＶ）を提供することが本発明の目的であって、前記改変はＢＶＤＶ由来のＷＨ３０３エピトープ配列の相同Ｅ２遺伝子により類似させ、ＣＳＦＶを弱毒性にする。

生存能力のある組み換えブタ・コレラウイルス（ＣＳＦＶ）を含み、該ウイルスは改変されたＣＳＦＶのＥ２糖タンパク質を含む、免疫原性の組成物を提供することが本発明のさらなる目的である。

ＣＳＦの重篤度を低下する合理的に設計されたＣＳＦ弱毒性生ワクチンを提供することが本発明のさらなる目的である。

毒性ブレスシア株ＣＳＦＶに感染したとき、臨床ＣＳＦ疾患から動物を有効に保護するように合理的に設計されたＣＳＦ弱毒性生ワクチンを提供することが本発明の他の目的である。

ワクチン接種された動物と、ＣＳＦＶに感染した動物とを血清学的に判別可能にする、マーカーワクチンを提供することが本発明のさらなる目的である。

合理的に設計されたＣＳＦＶ弱毒性生ワクチンの有効量を投与することによってＣＳＦに対して動物を保護する方法を提供することが本発明のさらなる目的である。

本発明の他の目的及び利点は、以下の詳細な説明から容易に明らかとなるであろう。

Ｅ２糖タンパク質のｍＡｂＷＨ３０３エピトープ領域のＣＳＦＶのブレスシア、ＢＶＤＶのＮＡＤＬ株及びＣＳＦＶのＴ１−５突然変異体ウイルスの比較を示す図。ＣＳＦＶのポリタンパク質のアミノ酸残基の位置が示される。斜字体はＮＡＤＬ株ＢＶＤＶ及びＴ１ｖないしＴ５ｖＣＳＦＶの両方と、ブレスシア株のＥ２のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基を示す。Ｔ１ｖ−Ｔ５ｖ突然変異体及びＢＩＣｖの特徴の比較を示すグラフ。図２ＡはＴ１ｖ−Ｔ５ｖ突然変異体及びＢＩＣｖのｉｎｖｉｖｏでの成長の特徴を示す。ＳＫ６の単層は、Ｔ１ｖ、Ｔ２ｖ、Ｔ３ｖ、Ｔ４ｖ、Ｔ５ｖ又はＢＩＣｖとともに感染させられ（ＭＯＩ＝０．０１）、ウイルスの生産量は感染後間隔をおいてタイター測定された。データは２回の独立の実験からの平均値及び標準偏差値を示す。Ｔ１ｖ−Ｔ５ｖ突然変異体及びＢＩＣｖの特徴の比較を示す図。図２Ｂは、Ｔ１ｖ−Ｔ５ｖ突然変異体及びＢＩＣＶのプラーク形成と、ｍＡｂの反応性とを示す。ＳＫ６の単層培養は５０ないし１００ＴＣＩＤ_５０で感染させられ、０．５％アガロースで重層され、３７°Ｃで３日間培養された。プレートは５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール−アセトンで固定され、ｍＡｂＷＨ３０３及びｍＡｂＷＨ３０８で差異が分かるように免疫組織化学染色された。組み換えウイルスのＴ１ｖ−Ｔ５ｖと、ＢＩＣｖとに感染したブタから記録された臨床スコアを示すグラフ。以前に説明されたやり方に修正を施して臨床スコアは算出され、動物２個体（Ｔ１ｖ、Ｔ２ｖ、Ｔ３ｖ及びＴ４ｖ）又は動物６個体（Ｔ５ｖ及びＢＩＣｖ）の観察に基づいている。組み換えウイルスのＴ１ｖ−Ｔ５ｖと、ＢＩＣｖとに感染したブタの末梢白血球（図４Ａ）及び血小板（図４Ｂ）の総数を示すグラフ。総数は１ｍＬあたりの細胞数として表され、各点は動物２個体（Ｔ１ｖ、Ｔ２ｖ、Ｔ３ｖ及びＴ４ｖ）又は動物６個体（Ｔ５ｖ及びＢＩＣｖ）の平均値及び標準誤差値を示す。Ｔ１ｖ−Ｔ５ｖ突然変異体か、あるいはＢＩＣｖに感染したブタの血液（図Ａ）、鼻腔ぬぐいサンプル（図５Ｂ）及び咽頭ぬぐいサンプル（図５Ｃ）でのウイルスタイターを示すグラフ。各点は動物２個体（Ｔ１ｖ、Ｔ２ｖ、Ｔ３ｖ及びＴ４ｖ）又は動物６個体（Ｔ５ｖ及びＢＩＣｖ）のＴＣＩＤ_５０／ｍＬの平均値及び標準偏差値を示す。偽ワクチンか、Ｔ５ｖかでワクチン接種され、３又は２１ＤＰＩのＢＩＣｖで感染されたブタの末梢白血球（図６Ａ）及び血小板（図６Ｂ）の総数を示すグラフ。対照動物、偽ワクチン接種動物及び感染動物の値は四角で示される。総数は１ｍＬあたりの細胞数として表され、標準誤差値を示す誤差棒を用いて４個体の平均値を示す。

ＣＳＦＶのアウトブレイクの際の疾患制御戦略の開発は保護の早期開始を必要とし、該保護の早期開始は、例えば、保護の持続期間よりも重要なワクチンの性能のパラメーターとなる。前記ワクチンの開発は合理的に設計されたＣＳＦＶ弱毒性生ワクチンの生産を伴う。

ぺスチウイルスの毒性の基礎となる遺伝的基礎及び分子機構はまだ不明瞭である。ＣＳＦＶの場合では、異なる報告が、ウイルスタンパク質又は特異的なゲノム領域と、毒性とに関連がある旨記載されている。アルフォート（Ａｌｆｏｒｔ）株ＣＳＦＶのＥｒｎｓ糖タンパク質のＲＮａｓｅ活性を消失させる１個又は２個のコドン突然変異はブタでウイルスを弱毒化した（非特許文献５）。同様の結果は、ＢＶＤＶのＥｒｎｓ糖タンパク質のＲＮａｓｅドメインに突然変異を起こすことによって観察された（非特許文献２０）。より最近、ＣＳＦＶの毒性アルフォート／１８７株及びエイストラップ（Ｅｙｓｔｒｕｐ）株からＮｐｒｏを欠失させるとブタで弱毒ウイルスが生じることが示された（非特許文献２０）。Ｅｒｎｓの３個のアミノ酸置換を伴うＣＳＦＶのＥ２糖タンパク質のアミノ酸置換は、ブタで毒性の低下につながった（非特許文献２１）。さらに、ＣＳＦＶのブレスシア株のＥ１遺伝子への１９個のアミノ酸のインフレーム挿入は、ｉｎｖｉｖｏでの弱毒性をもたらした（非特許文献９）。ＣＳＦＶのＥ２は毒性への関与が考えられている。ＣＳワクチン株に由来するＥ２遺伝子でブレスシア株ＣＳＦＶのＥ２遺伝子を置換することにより、ｉｎｖｉｖｏで非常に弱毒化されるウイルスのキメラが生じる（非特許文献８）。ブレスシア株のＥ２タンパク質の配列と比較すると、ＣＳワクチン株ウイルスのＥ２タンパク質における２２個のアミノ酸置換はいずれも、ｍＡｂＷＨ３０３エピトープに影響を与えない。ブレスシア、ＣＳ及びキメラの３種類のウイルスの全てはｍＡｂ３０３と強く反応し、ＣＳＦＶの弱毒性に関連する他の遺伝的決定因子の存在を示唆する。

本明細書において、高病原性ＣＳＦＶのブレスシア株のＥ２糖タンパク質中のｍＡｂＷＨ３０３エピトープに導入された突然変異はウイルスの弱毒化をもたらすと発明者は示す。ＢＶＤＶのＮＡＤＬ株のＥ２タンパク質中の同じ部位（ＴＳＦＮＭＤＴＬＡ、配列番号２）で見られるアミノ酸残基に近似するように蓄積的な変化がＣＳＦＶのブレスシア株のＷＨ３０３エピトープ（ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ、配列番号１）に導入された。興味深いことに、ＴＳＦＮＭＤＴＬＲ（Ｔ４ｖ）又はＴＳＦＮＭＤＴＬＡ（Ｔ５ｖ）はｍＡＢＷＨ３０３への反応性を消失し、プラークが小さい形態を示し、ｉｎｖｉｖｏで非常に弱毒化される。ＢＩＣｖの感染によって誘発される急性致死疾患と異なり、Ｔ４ｖ及びＴ５ｖの感染は無症状であり、標的器官でのウイルスの複製低下と、ウイルス粒子放出の減少とによって特徴付けられる。

ファージ−ディスプレイ・ランダム・ペプチド・ライブラリーを用いてＣＳＦＶのＥ２及びＥｒｎｓに対する中和モノクローナル抗体を特徴付ける際に、主要免疫優勢エピトープと、ＷＨ３０３とに関連があることが最近観察された（非特許文献２２）。これらのモノクローナル抗体は、ＷＨ３０３エピトープ（ＳＰＴＴＬ）に位置する共通のモチーフのＳＰＴｘＬに結合することが発見された。さらに、さまざまなペプチド−ワクチンがＣＳＦＶに対する免疫を誘導し、該ペプチド−ワクチンはアミノ酸２０個ないし２５個の範囲の長さの重複するペプチド６個からなり、ＷＨ３０３エピトープを含む（非特許文献２３）。

ブタでのＴ５ｖの弱毒性は、ｉｎｖｉｖｏでの重大な標的細胞へのウイルスの接合及び／又は効率的な進入のいくつかの局面を含む場合があると考えられる。Ｅｒｎｓ、Ｅ１及びＥ２はＣＳＦＶのビリオンのエンベロープの構造糖タンパク質である（非特許文献１３）。エンベロープに固定されるとき、Ｅ２はジスルフィドの架橋によって結合されるホモ及びヘテロ二量体の両方（非特許文献１３、１４、１５）として示され、Ｅｒｎｓ（非特許文献２４）及びＥ１（非特許文献１７）とともにウイルスの感受性に重要であることが示されている。Ｅ２タンパク質のキメラを含む人工ペスチウイルスは宿主域が変わった。ヒツジ・ペスチウイルスであるボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）に由来する完全なＥ２遺伝子を有するＢＶＤＶのキメラはウシ肝臓細胞（ＭＤＢＫ）におけるプラーク形成能を消失するが、ヒツジ細胞におけるプラーク形成能は保持した（非特許文献２５）。しかしながら、感染後２４時間のウイルスの産生量の違いは野生型ＢＶＤＶの１００分の１であるにもかかわらず、ＭＤＢＫ細胞はキメラに対して許容性であった。同様に、ＢＶＤＶに由来する相同配列でのＣ株ＣＳＦＶのＥ２のアミノ末端の部分的な置換は、ブタ腎臓細胞（ＳＫ６）でウイルスの産生量を１０分の１に低下させた。ＳＫ６細胞はキメラと、ＢＶＤＶのＥ２供与体とに同程度に許容性であったが、前記キメラはＢＶＤＶのウシ胎児上皮細胞感染能を獲得できなかった（非特許文献１２）。同様に、ＢＩＣｖ、Ｔ１ｖ、Ｔ２ｖ及びＴ３ｖと比較して、Ｔ４ｖ及びＴ５ｖはＳＫ細胞でのウイルスの産生量を１０分の１に減少させ（図２Ａ）、ウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ）での効率的な複製能力を喪失する（データは示さず）。

ＳＫ細胞において親のＢＩＣｖと比較して約７０％のプラークサイズの縮小をＴ４ｖ及びＴ５ｖは示した（図２Ｂ）。プラークが小さい類似の表現型はＳＫ６細胞におけるＢＶＤＶのＮＡＤＬ株で観察され、これらのウイルスはｉｎｖｉｔｒｏでの結合及び／又は拡散の能力が改変されたことを示唆する。ｉｎｖｉｔｒｏでのプラークサイズの縮小と、ｉｎｖｉｖｏでのＣＳＦＶの弱毒性との関連はまだ確立されていないが、関係があることを示唆する複数の観察が存在する。ブタ腎臓培養細胞での継代後に獲得されるヘパリン硫酸結合依存性のブレスシア株ＣＳＦＶのバリアント（ｖａｒｉａｎｔｓ）は、プラークサイズが小さいことをＨｕｌｓｔらは観察した（非特許文献２、２５）。Ｅｒｎｓタンパク質での１個のアミノ酸突然変異を含むこれらのバリアントは、ブタで毒性があった（非特許文献２５）。しかしながら、Ｅ１（非特許文献９）及びＥ２（非特許文献８）の突然変異を含む２個の異なるブレスシア株ＣＳＦＶ由来の組み換えウイルスは、ブタ腎臓培養細胞でプラークサイズが小さい表現型を示し、ブタでの毒性が弱かった。

要約すると、Ｅ２糖タンパク質に関連する新規ＣＳＦＶの毒性の遺伝的因子が同定された。弱毒化の基礎となる機構は知られていないが、興味深いことに、ｍＡＢＷＨ３０３との反応性の段階的な消失はＣＳＦＶの最終的な弱毒性に繋がるｉｎｖｉｖｏでの毒性の消失に対応し、エピトープ配列の欠失と、ブタにおいて他のペスチウイルス（ＢＶＤＶ及びＢＤＶ）によって疾患が誘発できないこととの間に関連があることを示唆している。ＣＳＦＶの毒性の遺伝的基礎の理解を深めることは、安全性、有効性及び利用性が高いＣＳＦ弱毒性生ワクチンの合理的な設計を可能にするであろう。さらにＴ４ｖ及びＴ５ｖウイルスという特別な場合では、高い特異性を有し、かつ、保存されたＣＳＦＶのエピトープを認識するｍＡｂＷＨ３０３との反応性の消失は、弱毒性マーカーワクチンとしてこれらのウイルス突然変異体を使用する可能性を開く。

実施例
以上本発明を一般的に説明したが、同じ発明は複数の具体的な実施例を参照することによってより理解されるであろうが、前記実施例は本発明をさらに例示するためにのみ本明細書に含まれ、請求の範囲で定められる本発明の射程を限定することを意図するものではない。

ウイルス及び細胞の培養
ＢＶＤＶが存在しないブタ腎臓細胞（ＳＫ６）（２９）は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ＡｔｌａｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、コロラド州フォートコリンズ）とともにダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランド島）で培養された。ブレスシア株ＣＳＦＶはＳＫ６細胞で増殖され、感染性ｃＤＮＡクローンの構築のために用いられた（１７）。臨床サンプル由来のＣＳＦＶのタイター測定は、９６ウェルのプレート（Ｃｏｓｔａｒ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）中でＳＫ６細胞を用いて実施された。ＣＳＦＶのモノクローナル抗体のＷＨ３０３又はＷＨ３０８（１）と、ベクタステイン（商標）ＡＢＣキット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンガム）とを用いて免疫ペルオキシダーゼアッセイによって、ウイルスの感染性は培養４日後に検出された（２５）。タイターはリード・ミンチ（ＲｅｅｄａｎｄＭｕｅｎｃｈ）（１４）法を用いて算出され、ＴＣＩＤ５０／ｍＬとして表された。実施されたとき、試験感度は＞１．８ＴＣＩＤ５０／ｍＬであった。

ＣＳＦＶの感染性クローンＴ１−Ｔ５の構築
毒性ブレスシア株の完全長感染性クローン（ＩＣ）の単離体（ｐＢＩＣ）（１７）は鋳型として用いられ、Ｅ２の８２９番目ないし８３７番目間の前記ＷＨ３０３エピトープ（ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ、配列番号１）の６個のアミノ酸残基はＢＶＤＶのＮＡＤＬ株（ＴＳＦＮＭＤＴＬＡ、配列番号２）中に存在する６個の相同なアミノ酸残基を反映するように突然変異が起こされた（非特許文献１９）。突然変異は蓄積され、以下のウイルス突然変異体の回収のために５つのＩＣが産生され、該突然変異体は、Ｔ１ｖ（ＴＳＦＳＰＴＴＬＲ、配列番号３）、Ｔ２ｖ（ＴＳＦＮＰＴＴＬＲ、配列番号４）、Ｔ３ｖ（ＴＳＦＮＭＴＴＬＲ、配列番号５）、Ｔ４ｖ（ＴＳＦＮＭＤＴＬＲ、配列番号６）及びＴ５ｖ（ＴＳＦＮＭＤＴＬＡ、配列番号７）である（図１）。クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）ＸＬ部位直接的突然変異体の作製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、テキサス州シーダークリーク）と、表１に記載されたプラーマー及び標的プラスミドとを用いる部位直接的突然変異体の作製によって突然変異は導入され、該部位直接的突然変異体の作製は製造者の意図に従って実施された。

ブレスシア株ＣＳＦＶ又はＴ１ないしＴ５突然変異体の完全長ＩＣからｉｎｖｉｔｒｏで感染性ＲＮＡは転写され、ＳＫ６細胞にトランスフェクションするために用いられた（図１Ａ）。ウイルスは、トランスフェクション後４日目にトランスフェクションされた細胞から回収された。回収されたウイルスゲノムの核酸配列は親のＤＮＡプラスミドと同一であり、該配列はＷＨ３０３エピトープをエンコードする遺伝子座中の突然変異のみがＴ１ｖ−Ｔ５ｖに反映させられたと証明する。

ＣＳＦＶのブレスシア及びＴ１ｖ−Ｔ５ｖ突然変異体ウイルスのｉｎｖｉｔｒｏでの回収
完全長ゲノムの感染性クローンはＳｒｆＩで直鎖化され、Ｔ７メガスクリプトシステム（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースティン）を用いてｉｎｖｉｔｒｏで転写された。ＲＮＡ産物はＬｉＣｌで沈殿させられ、ＢＴＸ６３０電気穿孔機（ＢＴＸ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、５００ボルト、７２０オーム、１００ワットで電気穿孔法によってＳＫ６細胞にトランスフェクションされた。細胞は１２ウェルのプレート及び２５ｃｍ^２のフラスコに播種され、３７°Ｃ及び５％ＣＯ_２雰囲気下で４日間培養された。ＣＳＦＶのＥ２特異的モノクローナル抗体（ＷＨ３０８）を用いて免疫ペルオキシダーゼ染色によってウイルスは検出された。回収されたウイルスのストックは−７０°Ｃで保管された。導入された突然変異の精度は突然変異体ウイルスのＥ２遺伝子をシークエンスすることによって証明された。

Ｔ１ｖ−Ｔ５ｖのｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ解析
親のｐＢＩＣｖと比較してＴ１ｖ−Ｔ５ｖのｉｎｖｉｔｒｏでの成長の特徴は、多段階の成長曲線で評価された。ＳＫ６の細胞培養は、細胞あたり０．０１ＴＣＩＤ_５０の重複感染度（ＭＯＩ）で感染させられた。ウイルスは１時間で吸着され（０時間）、サンプルは感染後の７２時間を通して収集された。Ｔ１ｖ、Ｔ２ｖ及びＴ３ｖ突然変異体はｐＢＩＣｖと事実上鑑別できない成長の特徴を示めす一方で、Ｔ４及びＴ５は最終的なウイルス生産量を１０分の１の減少を示した。ＢＩＣｖ、Ｔ１ｖ、Ｔ２ｖ及びＴ３ｖと比較して、Ｔ４及びＴ５はプラークサイズの８０−９０％の減少を示した（図２Ｂ）。最終的に、ＭａｂＷＨ３０３を用いる免疫細胞化学反応は、Ｔ１ｖ、Ｔ２ｖ及びｐＢＩＣｖと同等であるが、前記反応はＴ３ｖで部分的に消失し、Ｔ４ｖ及びＴ５ｖが感染した細胞で完全に消失した（図２Ｂ）。ＣＳＦＶのｉｎｖｉｔｒｏでの複製能力に影響を及ぼすＷＨ３０３エピトープの突然変異は、ＷＨ３０３の反応に同様に影響を及ぼすとこれらの結果は示す。

ブタでＣＳＦＶの毒性に関するＷＨ３０３エピトープの突然変異の影響を調査するために、Ｔ１ｖ−Ｔ５ｖ突然変異体と、ＢＩＣｖの野生型ウイルスとの毒性の表現型は１０５ＴＣＩＤ_５０のウイルスを鼻腔内に接種されたヨークシャー・ブタの６グループで比較され、臨床疾患をモニターされた。この実験結果は表２及び図３−５で示される。ＷＨ３０３エピトープの突然変異の特徴及び安定性は、６ＤＰＩでＴ１ｖ−Ｔ５ｖに感染した動物の扁桃腺から回収されたウイルスの核酸配列解析によって証明された（データは示されていない）。

予想されたように、ブタで、高病原性、効率的に誘発される発熱、臨床の徴候及び死をＢＩＣｖはもたらしたが、Ｔ１ｖ−Ｔ５ｖ突然変異体はますます弱毒化された毒性の表現型となると示された（表２、図３）。Ｔ１ｖ及びＴ２ｖは、ＢＩＣｖと同じやり方で、高病原性、効率的に誘発される熱病及びブタでの死をもたらしたが（表２）、ＢＩＣｖと比較してＴ２ｖは臨床スコアの軽度の遅延を示した（表３）。死が４−８日後にもたらしたとき、Ｔ３ｖは致死性疾患を誘発したが、ＢＩＣｖと比較して遅延型の動態であった（表２）。顕著に、Ｔ４ｖ及びＴ５ｖは致死性疾患を誘発できず、Ｔ４ｖは中程度で一過性の発熱のみを誘発し、Ｔ５ｖはまったく臨床疾患を誘発しなかった（表２、図３）。同様に、ＢＩＣｖ、Ｔ１ｖ、Ｔ２ｖ及びＴ３ｖの感染は６ＤＰＩで白血球（ＷＢＣ）及び血小板の総数の激減をもたらし、死ぬまで低いままであったが、Ｔ４ｖ及びＴ５ｖの感染は一過的に誘発され、劇的な影響はほとんどなかった（図４）。

Ｔ１ｖ−Ｔ５ｖの弱毒化はウイルス血症及びウイルス粒子放出に反映された。Ｔ１ｖ及びＴ２ｖによって誘発されるウイルス血症を起こすタイターはＢＩＣｖによって誘導されるウイルス血症を起こすタイターに匹敵し、Ｔ３ｖは１０^１ないし１０^２ｌｏｇ_１０まで低下され、Ｔ４ｖ及びＴ５ｖによって誘発されるタイターは類似の感染後の時間でのＢＩＣｖのタイターよりもより低い１０^３ないし１０^５ｌｏｇ_１０であった（図５Ａ）。類似のパターンは鼻腔ぬぐいサンプルないし咽頭ぬぐいサンプルに由来するウイルスタイターで観察され、Ｔ３ｖ、Ｔ４ｖ及びＴ５ｖのタイターは遅延されたＤＰＩで検出可能なレベルより低く低下する（図５Ｂ及びＣの各々）。

Ｔ５ｖの病原性のより詳細な検討のために、Ｔ５ｖ及びＢＩＣｖに感染した動物は、２、４、６、８及び１４ＤＰＩで安楽死され（一個体／時点／グループ）、ウイルスタイターは、扁桃腺、顎下神経節、脾臓、血液及び腎臓の組織サンプルと、鼻腔ぬぐいサンプル及び咽頭ぬぐいサンプルとで測定された（表３）。ＢＩＣｖと比較して、Ｔ５ｖは扁桃腺で非常に低レベルのウイルス複製を示した（約１０^２ないし１０^４ｌｏｇ_１０）。Ｔ５ｖないしＢＩＣｖ間の類似の差異は、所属排出下顎リンパ節、脾臓及び腎臓に由来するウイルスタイター間で観察された（表３）。

ＣＳＦＶのＥ２のＷＨ３０３エピトープ中での突然変異の数の増大はブタに対してウイルスを弱毒化する相加作用をもたらし、Ｔ４ｖ及びＴ５ｖに存在する前記突然変異はウイルス毒性の重大な低下をもたらすとこれらの結果は示す。さらに、非常に穏やかで一過的な臨床疾患と、扁桃腺及び標的組織でのウイルスの複製低下と、ウイルス粒子放出の劇的な減少とによってＴ５ｖの感染は特徴付けられる。

ＤＮＡシークエンス及び解析
完全長感染性クローンと、ｉｎｖｉｔｒｏで回収されたウイルスと、感染動物から回収されたウイルスとはジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法によってＣＳＦＶに特異的なプライマーを用いて完全にシークエンスされた（非特許文献２７）。シークエンス反応は色素ターミネーターサイクルシークエンスキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ボストン）で調製された。反応産物は、ＰＲＩＳＭ３７３０ｘｌ自動ＤＮＡシークエンサー（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）でシークエンスされた。シークエンスデータはＰｈｒａｐソフトウェアプログラムで組み立てられ、確証的な組み立てはＣＡＰ３で実施された（ｗｗｗ．ｐｈｒａｐ．ｏｒｇ）。最終的なＤＮＡの共通配列は、塩基部位のおのおのにおいて平均で５倍の重複性を示した。シークエンスの比較はＢｉｏＥｄｉｔを用いて実施された。

動物の感染
ブレスシアウイルスと比較して、Ｔ４ｖ―Ｔ５ｖ突然変異体のそれぞれはブタでその毒性の表現型を初めに検査された。本明細書の全ての動物実験で用いられたブタは１０ないし１２週齢の４０ポンドのブタであり、１０^５ＴＣＩＤ_５０の突然変異体又は野生型のウイルスのいずれかを用いて経鼻接種された。スクリーニングのために、１２個体のブタは各２個体の６グループに無作為に配分され、各グループのブタはＴ１ｖ―Ｔ５ｖ突然変異体又はｐＢＩＣｖのうちの１つで接種された。臨床徴候（食欲不振、抑うつ状態、発熱、紫色の皮膚への変色、よろめき歩行、下痢及び咳）は実験を通じて日々観察され、以前に説明されたやり方に修正を施して記録が取られた。

感染中に異なる器官でのＴ５ｖ突然変異体のウイルス粒子放出及び分布の影響を評価するために、１０個体のブタは各動物５個体の２グループに不作為に配分され、Ｔ５ｖ突然変異体又はｐＢＩＣｖで接種された。グループあたり１個体のブタは、２、４、６、８及び１４ＤＰＩで屠殺された。血液サンプル、鼻腔ぬぐいサンプル及び咽頭ぬぐいサンプルは検死においてブタから得られた。組織サンプル（扁桃腺、下顎リンパ節、脾臓及び腎臓）はウイルスのタイター測定のために液体窒素で急速冷凍された。

保護の検討のために、１２個体のブタは各動物４個体の３グループに不作為に配分された。グループ１及び２のブタはＴ５ｖで接種され、グループ３の動物は偽感染された。３ＤＰＩ（グループ１）又は２１ＤＰＩ（グループ２）で、グループ３の動物とともに動物はＢＩＣｖに感染させられた。臨床徴候及び体温は上述したような実験を通じて日々記録された。血液、血清、鼻腔ぬぐいサンプル及び咽頭ぬぐいサンプルは感染後間隔をおいて収集され、全ての異なる白血球の総数を算出するために、ＥＤＴＡ中の前大静脈から得られた血液は管（バキュテナー）に入れられる。全ての異なる白血球及び血小板の総数は、ベックマンコールターＡＣＴを用いて得られた（Ｂｅｃｋｍａｎ、カリフォルニア州コールター）。

Ｔ５ｖの感染は病原性ＢＩＣｖの感染に対してブタを保護する。
ＢＩＣｖの感染に対する保護を誘導するＴ５ｖの能力は評価された。Ｔ５ｖでワクチン接種されたブタは３又は２１ＤＰＩで１０^５ＴＣＩＤ_５０の病原性ＢＩＣｖに感染させられた。Ｔ５ｖを全く供与されていない偽ワクチン接種された対照のブタは、ＢＩＣｖの感染後（ＤＰＣ）４日目までに、食欲不振、抑うつ状態及び発熱を発症し、感染後７日目（７ＤＰＣ）までに循環する白血球及び血小板の著しい低下を発生させ、死亡するか、あるいは瀕死となり感染後１２日目（１２ＤＰＣ）までに安楽死させられた。

特に、３ＤＰＩまでに誘導されるＴ５ｖは臨床疾患を誘発するＢＩＣｖに対する保護を達成する。全てのブタは感染に耐え、臨床的に正常であり、２個体のみが４ＤＰＩで一過的に発熱したが（表４）、ブタの血算値の重大な変化はなかった（図６）。同様に、Ｔ５ｖの感染後１２日目で感染されたブタは臨床的に正常であった（表４）。

ｍＡｂＷＨ３０３で特異的に検出されるようなＢＩＣｖの感染性ウイルスの血症及びウイルス粒子放出は、４、６、８、１４及び２１ＤＰＣで調べられた（データは示されていない）。偽ワクチン接種された対照動物で予想されたように、ＢＩＣｖのウイルス血症は５ＤＰＣで観察され、死亡するまでウイルスタイターは高いままであり（８ＤＰＣで１０^６ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）、ＢＩＣｖは４ＤＰＣでの鼻腔ぬぐいサンプル及び咽頭ぬぐいサンプルからタイター測定され、８ＤＰＣで１ｍＬあたり１０^４−１０^５ＴＣＩＤ_５０のタイターに達した。対照的に、感染後にＴ５ｖでワクチン接種されたブタ由来の全ての臨床サンプル（血液、鼻腔ぬぐいサンプル又は咽頭ぬぐいサンプル）でＢＩＣｖは存在しなかった。Ｔ５ｖはＣＳＦＶの致死性感染に対する完全な保護を急速に誘導でき、感染ウイルスに由来するウイルス血症又はウイルス粒子放出をＴ５ｖで免疫されたブタは全く検出できないとこれらの結果は示す。

したがって、Ｔ５のワクチン接種後３日目又は２８日目のいずれかで親の毒性ブレスシアウイルスに感染させられたとき、実験的にワクチン接種された動物で臨床疾患の発症及び感染ウイルスの複製の両方に対する完全な保護をＴ５ｖは誘導可能である。

文献又は特許のそれぞれが引用により取り込まれたと明確かつ個別的に示されたのと同程度に、本明細書で言及された文献及び特許の全ては引用により本明細書に取り込まれた。

本発明の前記説明と、ある代表的な実施態様及び詳細とは本発明の例示及び説明の目的のために提供されている。開示された厳密な形式は本発明を完全にするか、あるいは限定を意図するものではない。本発明の範囲から逸脱することなく、改変及び変更は本明細書にもたらされる場合があると当業者に示されるであろう。

Claims

高病原性ブレスシア株のＥ２遺伝子の領域に突然変異を蓄積することによる改変が施されたＣＳＦＶＥ２糖タンパク質をエンコードするＤＮＡを含む組み換えブタ・コレラウイルスであって、前記領域はＣＳＦＶのＥ２糖タンパク質の８２９番目ないし８３７番目のアミノ酸をエンコードし、前記ＤＮＡに突然変異を蓄積することは、ＣＳＦＶＥ２糖タンパク質の特徴である１個ないし６個のアミノ酸をＢＶＤＶのＥ２糖タンパク質の相同領域の特徴である１個ないし６個のアミノ酸に変更させ、前記改変はＣＳＦＶを弱毒性にし、該弱毒性はＣＳＦＶＥ２糖タンパク質のアミノ酸配列ＴＡＶＳＰＴＴＬＲを配列番号６（ＴＳＦＮＭＤＴＬＲ）又は配列番号７（ＴＳＦＮＭＤＴＬＡ）からなるアミノ酸配列への置換によって得られることを特徴とする、組み換えブタ・コレラウイルス。
請求項１に記載の組み換えブタ・コレラウイルスを含むことを特徴とする、合理的に設計されたブタ・コレラ（ＣＳＦ）弱毒性生ワクチン。
請求項１に記載の組み換えブタ・コレラウイルスを含むワクチンを非ヒト動物に投与するステップを含むことを特徴とする、ブタ・コレラ（ＣＳＦ）に対する免疫を付与する方法。
臨床ブタ・コレラ（ＣＳＦ）から非ヒト動物を保護するために有効な量の請求項２に記載のワクチンを前記非ヒト動物に投与するステップを含むことを特徴とする、ブタ・コレラ（ＣＳＦ）に対して非ヒト動物を保護する方法。
評価対象の動物由来の血清がｍＡｂ３０３の結合を阻害するか否かを決定するために競合ＥＬＩＳＡ法で前記血清を分析するステップを含むことを特徴とする、請求項２に記載の合理的に設計されたブタ・コレラ（ＣＳＦ）弱毒性生ワクチンでワクチン接種された非ヒト動物から、ＣＳＦＶに感染した非ヒト動物を判別する方法。
改変が施されたＣＳＦＶＥ２糖タンパク質をエンコードするＤＮＡを含む弱毒性組み換えブタ・コレラウイルスを生産する方法であって、
（ａ）高病原性ブレスシア株のＣＳＦＶＥ２遺伝子の領域に突然変異を累積するステップと、
（ｂ）前記改変の結果としてＣＳＦＶの弱毒性化を達成するステップとを含み、
前記領域はＣＳＦＶＥ２糖タンパク質の８２９番目ないし８３７番目のアミノ酸をエンコードし、前記ＤＮＡに突然変異を蓄積することは、ＣＳＦＶＥ２糖タンパク質の特徴である１個ないし６個のアミノ酸をＢＶＤＶのＥ２糖タンパク質の相同領域の特徴である１個ないし６個のアミノ酸に変更させることを特徴とする、弱毒性組み換えブタ・コレラウイルスを生産する方法。